CRÓNICAS DE LA DIABETES

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con un péptido derivado de SOCS1 útil para la prevención y tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes, especialmente complicaciones oculares, renales, nerviosas y vasculares. Dentro del capítulo de las complicaciones oculares de la diabetes se incluyen la retinopatía diabética y el edema macular. Dado el carácter neuroprotector del péptido derivado de SOCS1 , la presente invención también se considera potencialmente efectiva para otras enfermedades de la retina, aparte de la retinopatía diabética, en las que la neurodegeneración desempeña un papel fundamental como son las enfermedades neurodegenerativas de la retina de carácter adquirido o hereditario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La diabetes mellitus es una enfermedad sistémica de gran prevalencia, que causa frecuentemente lesiones en diversos órganos, especialmente retina, riñon, nervios y el sistema vascular. Sus complicaciones suelen dividirse en: a) complicaciones agudas, como hipoglucemia, cetoacidosis y coma hiperosmolar; b) complicaciones crónicas o tardías, divididas a su vez en microangiopáticas (nefropatía, retinopatía, y neuropatía), macroangiopáticas (enfermedad cardiovascular) y pie diabético (macro y microangioangiopatía).

El enorme impacto socio-sanitario de la diabetes es debido a estas complicaciones crónicas, principalmente oculares (retinopatía), renales (nefropatía) y vasculares (aterosclerosis). Los abordajes actuales para tratar la diabetes, como el control estricto de la glucosa y la hipertensión, consiguen frenar la evolución de la enfermedad pero no evitan en muchos casos la aparición de complicaciones crónicas, en especial la retinopatía, los eventos cardiovasculares o la progresión de los pacientes a insuficiencia renal e incluso entrada en programas de diálisis y transplante. El pie diabético es una de las afectaciones más frecuentes de la diabetes que produce una importante morbilidad y un alto riesgo de amputación y cuyo tratamiento requiere abordaje multidisciplinario. La retinopatía diabética es la complicación más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. En la etiopatogenia de la retinopatía diabética interviene la hiperglucemia per se y las vías metabólicas directamente relacionadas con ella, provocando daño en el lecho capilar situado en la retina interna (lesión microangiopática). Clásicamente, la retinopatía diabética se ha considerado como una enfermedad microangiopática de la retina. Sin embargo, la evidencia actual indica que la neurodegeneración es un fenómeno precoz en la patogenia de la retinopatía diabética que participa en el desarrollo de las alteraciones microvasculares. En la actualidad no existen tratamientos específicos para las fases iniciales de la retinopatía diabética. Además, los tratamientos específicos indicados en fases avanzadas de la enfermedad (fotocoagulación con láser, inyecciones intravítreas de agentes como los anticuerpos anti-VEGF -"Vascular endothelial growth factor"- o corticoides o la vitrectomía) tienen una efectividad limitada y una elevada tasa de efectos secundarios. Para prevenir la retinopatía diabética o tratarla en fases iniciales (neurodegeneración) serían necesarios abordajes terapéuticos no invasivos. En este sentido la administración tópica ocular (colirio) sería la vía más adecuada debido a su carácter no invasivo ya que evitaría los efectos secundarios sistémicos.

Además de la retinopatía diabética existen otras enfermedades que cursan con neurodegeneración de la retina como la degeneración macular asociada a la edad (AMD), el glaucoma y la retinitis pigmentosa. Las enfermedades neurodegenerativas de la retina se refieren a las condiciones de la retina caracterizadas por la pérdida neuronal progresiva.

Un análisis en profundidad de estas enfermedades, sus sitios críticos, así como de las posibles formas de protección y caminos que conducen a la recuperación, se pueden extraer de Schmidt et al., "Neurodegenerative Diseases of the Retina and Potential for the Protection and Recovery", Current Neuropharmacology - 2008, Vol. No. 6, pp.: 164-178.

En el caso de la retinopatía diabética, la neurodegeneración (pérdida de neuronas efectivas) se produce en las primeras etapas de la enfermedad y produce anormalidades funcionales, tales como la pérdida de la discriminación cromática y la sensibilidad al contraste. Estas alteraciones pueden detectarse mediante estudios electrofisiológicos en pacientes diabéticos, incluso con menos de dos años de duración de la diabetes, es decir, antes de que las lesiones microvasculares puedan detectarse bajo examen oftalmológico. Además, el retraso en tiempo implícito de electrorretinograma multifocal (mfERG-IT) predice el desarrollo de anomalías microvasculares tempranas. Por otra parte, la degeneración neurorretinal inicia y/o activa varias rutas metabólicas y de señalización que participarán tanto en el proceso microangiopático como en la disrupción de la barrera hemato-retiniana (BRB). La BRB es una estructura del ojo de gran importancia en muchas de las enfermedades de la retina y en especial es un elemento crucial en la patogénesis de la retinopatía diabética. La BRB está constituida por la BRB interna y la BRB externa. La BRB interna está formada por las uniones estrechas de las células endoteliales. La BRB externa está constituida por el epitelio pigmentario de la retina (RPE), cuyas células también están conectadas por uniones estrechas. El edema macular diabético es debido a la disrupción de la BRB. Otra enfermedad de la retina que es frecuente debida a un deterioro de la BRB que resulta en edema retiniano es la AMD. Además, la alteración de la BRB se produce también en una amplia variedad de situaciones oculares, tales como uveítis, trauma, cirugía infraocular, retinopatías vasculares, distrofias hereditarias, etc. (Cunha-Vaz et al., "The Blood-Retinal Barrier in Retinal Disease", European Ophthalmic Review -2009, Vol. No. 3, pp.:105-108).

En los últimos años se está dedicando gran esfuerzo para conocer los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de las complicaciones de la diabetes, así como estudiar su potencial terapéutico. La vía de señalización JAK/STAT (Janus Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription) es un importante mecanismo intracelular por el que la hiperglucemia y otros factores contribuyen al desarrollo de la diabetes y sus complicaciones. JAK/STAT controla numerosos procesos celulares, como proliferación, migración y diferenciación, así como la expresión de mediadores inflamatorios. Se ha descrito un aumento en la expresión y activación de miembros de la vía JAK/STAT en placas de ateroma, en biopsias renales de pacientes diabéticos y en modelos animales de retinopatía y nefropatía diabética.

La familia de proteínas SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling) es el principal mecanismo endógeno de regulación negativa de la vía JAK/STAT y alteraciones en los niveles de expresión se han relacionado con diferentes enfermedades inmunes e inflamatorias. Estudios experimentales en animales con modificaciones genéticas para miembros de la familia SOCS han demostrado un efecto protector en las células β pancreáticas, con reducción de la incidencia de diabetes (Flodstróm-Tullberg et al., Diabetes 2003;52:2696-700) y del daño renal asociado {Ortiz-Muñoz et al., J Am SocNephrol 2010;21:763-72), así como un efecto anti-aterosclerótico (Ortiz-Muñoz et al., ArteriosclerThromb Vasc Biol 2009;29:525-531 ;Wesoly et al., Acta Biochim Pol 2010; 57 (3) .251-260; Liang et al., Int J Mol Med. 2013 May;31(5):1066-74). Esto sugiere un potencial terapéutico de estas proteínas endógenas en las complicaciones de la diabetes.

El uso de péptidos miméticos de proteínas SOCS se ha descrito previamente en la encefalomielitis alérgica experimental, un modelo de esclerosis múltiple (Mujtaba et ai, J Immunol 2005; 175:5077-5086; Jager et al., J Neuroimmunol2011;232:108-118) y también en modelos de daño en nervios periféricos (Girolami et al., ExpNeurol 2010;223:173-182) e infección viral por poxvirus (Ahmed et al., J Virol 2009;83:1402- 1415). Asimismo se han descrito polipéptidos SOCS como inhibidores de la señalización inducida por citoquinas, en particular en inflamación e infecciones virales o bacterianas (US2009/0209458). La publicación WO2010/151495 describe péptidos antagonistas de SOCS-1 o SOCS-3, útiles como antivirales. En US8,420,096 se describe un péptido soluble conteniendo la secuencia de SOCS1/SOCS3 y una secuencia de translocación de membrana y su potencial uso para tratamiento de enfermedades inmunes. En US2009253618 se han descrito asimismo péptidos de este tipo, para su uso en la diferenciación de neuronas. En US2009030179 se emplean como agentes antimicrobianos varios péptidos sintéticos de la región SOCS-box de estos péptidos.

A pesar de la investigación existente en este campo, y haberse postulado la relación entre la vía de señalización JAK/STAT, las proteínas SOCS y la diabetes, hasta la fecha no se ha descrito la administración efectiva de ningún péptido per se para la prevención o el tratamiento de complicaciones oculares, renales o vasculares de la diabetes. No se ha relacionado en ningún caso los péptidos miméticos SOCS con trastornos oculares.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado que un polipéptido correspondiente a una región de la proteína SOCS1 tiene eficacia para el tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes in vivo en modelos animales de diabetes. Adicionalmente, se ha encontrado que dicho polipéptido es eficiente en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que contiene

a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;

para la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido del primer aspecto, y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica

a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o

b) una variante a la secuencia de a) o b) que sea homologa en al menos el 85% a la secuencia SEQ ID NO 2; para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de un polipéptido aislado que contiene a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;

para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica

a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o

b) una variante a la secuencia de a) que sea homologa en al menos el 85% a la secuencia SEQ ID NO 2;

para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

Asimismo se refiere al uso de un polinucleótido aislado que codifica

a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o

b) una variante a la secuencia de a) que sea homologa en al menos el 85% a la secuencia SEQ ID NO 2;

para la preparación de un medicamento para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. Un último aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido del primer aspecto a un paciente con complicaciones crónicas de la diabetes y/o que padece una enfermedad neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde dicha enfermedades neurodegenerativa de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. Estos compuestos actúan como neuroprotectores tópicos de la retina. Cabe destacar que la administración tópica de péptidos para uso de acuerdo con la invención, no sólo llegan a retina, sino que también logran concentraciones eficaces para prevenir la evolución de la retinopatía diabética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Evolución de la glucemia y el peso en el modelo de retinopatía diabética. Niveles de glucosa en sangre (A) y peso corporal (B) a lo largo del estudio. El tratamiento con péptido inhibidor no afectó estos parámetros.

Figura 2: Efecto de la administración tópica (gotas oculares) del péptido derivado de SOCS1 en la activación glial: Cuantificacion de la activación glial basada en la medida de la tinción de GFAP (Glial f ¡brillar acidic protein) en la retina entre muestras representativas de un ratón diabético tratado con el vehículo [D-Sham], un ratón diabético tratado con gotas oculares que contienen el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1] y un ratón no diabético [control (db/+)].

Figura 3: Efecto de la administración tópica (gotas oculares) del péptido derivado de SOCS1 sobre la apoptosis. Porcentaje de células positivas mediante la técnica de TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick-EndLabeling) en la neurorretina de un ratón representativo de cada grupo, ratones diabéticos tratados con vehículo [D- Sham], ratones no diabéticos [control (db/+)] y ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1 S1]. Los resultados se expresan como la media ± SD. *: p<0.01 en comparación con los otros grupos.

Figura 4: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 mejora las anomalías del ERG. (A) Amplitud (panel superior) y tiempo implícito (panel inferior) de la onda a en los grupos experimentales. (B) Amplitud (panel superior) y tiempo implícito de la onda b (panel inferior) en los grupos experimentales.

Figura 5: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 impide la disrupción de la BRB inducida por la diabetes. Cuantificacion de la extravasación de albúmina en unidades arbitrarias de fluorescencia (U.A.) evaluada en un ratón diabético representativo tratado con vehículo [D-Sham], un ratón diabético tratado con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1S1] y un ratón no diabético [control (db/+)]. Los resultados se expresan como media ± DE *<0.01 en comparación con otros grupos.

Figura 6: El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 mejora el metabolismo del glutamato en ratones diabéticos. (A) Cuantificacion de la inmunofluorescencia de GLAST en unidades arbitrarias (U.A.). Los resultados se expresan como media ± DE. (B) Concentración de glutamato de la retina medida por UPLC en los grupos experimentales. Los resultados se expresan como media ± DE. *p<0.001 en comparación con los otros grupos. ** p <0.01 en comparación con el grupo control. Figura 7: El péptido derivado de SOCS1 reduce la expresión de genes inflamatorios en la retinopatía diabética. Cuantificación de la expresión del ARNm I L-1 β por RT-PCR en ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham], ratones no diabéticos [control (db/+)] y ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM1 S1]. Los resultados se expresan como media ± DE. * p<0.05 en comparación con los otros grupos. RQ: cuantificación relativa.

Figura 8: El péptido derivado de SOCS1 inhibe la activación de STAT en los ríñones diabéticos. Se inmunodetectó STAT1 y STAT3 fosforilados en secciones de riñon de ratones diabéticos. Se muestra la cuantificación de la tinción positiva en compartimentos glomerulares y tubulointersticiales. Los resultados son la media ± SD. * p<0.02 vs grupo control.

Figura 9: Efecto renoprotector del péptido derivado de SOCS1 en ratones diabéticos. (A) Evaluaciones semicuantitativas de las lesiones glomerulares (Hyper, hipercelularidad, MM, matriz mesangial; Dil, dilatación capilar), fibrosis y degeneración tubular (Tub) y la fibrosis y la inflamación intersticial (Int). (B) Análisis morfométrico del área glomerular. (C) Cuantificación del área mesangial PAS+. Los resultados son la media ± SD. * p <0.05 vs grupo control.

Figura 10: El péptido derivado de SOCS1 previene la fibrosis renal en la nefropatía diabética. (A) Análisis cuantitativo del contenido de colágeno en los compartimentos glomerular y tubulointersticial en muestras renales de ratones diabéticos (control y SOCS1). (B) Análisis RT-PCR de la expresión del ARNm de las proteínas de la matriz extracelular (fibronectina y colágeno tipo I), el factor pro-fibrótico (TGF-β) y el marcador de lesión tubular (Kim-1) en la corteza renal. Los datos son la media ± SEM. * p<0.05 vs grupo control.

Figura 11 : Efecto antiinflamatorio del péptido derivado de SOCS1 en los ríñones diabéticos. (A) Detección inmunoperoxidasa de la infiltración de macrofagos (F4/80) y linfocitos T (CD3) en muestras de riñon de ratones diabéticos. Se muestra la cuantificación de células positivas en glomérulos y túbulo intersticial. (B) Análisis RT- PCR de la expresión del ARNm de quimiocinas (CCL2 y CCL5) y la citoquina TNFa en la corteza renal. Los datos son la media ± SEM. * p<0.05 vs grupo control.

Figura 12: Efecto anti-aterosclerótico del péptido miS1 en la diabetes experimental. (A) Evolución del tamaño de las placas de ateroma a lo largo del tiempo en cortes transversales de aorta de ratones diabéticos. (B) Cuantificación del contenido inflamatorio (tinción de macrofagos Moma2) y de marcadores de estabilidad de la placa (tinción de fibras de colágeno con rojo sirio y de células vasculares con a- actina) en las lesiones ateroscleróticas de ratones diabéticos. *, p<0.05 vs grupo control.

Figura 13: Efectos in vitro del péptido derivado de SOCS1 y su control mutante inactivo. (A) Activación de STAT1 y STAT3 en macrófagos estimulados con citoquinas en presencia de diferentes concentraciones del péptido derivado de SOCS1 o del péptido mutante. (B) Producción de la proteína quimiotáctica CCL2 en macrófagos y VSMC. (C) Ensayo de migración de macrófagos. *, p<0.05 vs condiciones básales; #, p<0.05 vs estimulación con citoquinas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal y como indicado anteriormente, un primer aspecto de la invención es un polipéptido aislado que contiene

a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;

para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad, glaucoma y retinitis pigmentaria.

Uno o más de los aminoácidos de cualquiera de las secuencias mencionadas en la presente invención, en particular las SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3, pueden estar modificados, por ejemplo pueden encontrarse fosforilados. Según una realización particular, solo un aminoácido de la secuencia se encuentra modificado, preferiblemente fosforilado. Según una realización preferida, es la tirosina (Y) el aminoácido fosforilado. En el marco de la presente invención el término "% de identidad" o "idéntica en al menos un %", en relación con secuencias de aminoácidos, significa el porcentaje de identidad determinado mediante el siguiente método: el alineamiento de dos secuencias aminoacídicas se realiza mediante el servicio https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, aplicando los ajustes por defecto de este servicio. Así, por ejemplo la SEQ ID NO 1 sería una variante a la secuencia de SEQ ID NO según lo aquí definido.

El término "complicaciones crónicas de la diabetes", en el marco de la presente invención, se entenderá que engloba, pero no necesariamente se limita a, complicaciones o trastornos oculares, renales, nerviosos y vasculares, entendiéndose aquí el término "vasculares" como englobando complicaciones tanto cardiovasculares como cerebrovasculares. De manera concreta, incluiría complicaciones seleccionadas entre retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, incluyendo microangiopatías y macroangiopatías, tales como aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica.

Así, el péptido de la invención es para uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes, seleccionándose éstas del grupo formado por complicaciones o trastornos oculares, renales, nerviosos y cardiovasculares en pacientes diabéticos.

Por lo tanto, en una realización particular, las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo formado por retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica. Según una realización preferida, la complicación crónica de la diabetes es un trastorno ocular, en particular retinopatía diabética.

El péptido de la invención también es útil en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina. El término "enfermedades neurodegenerativas de la retina", en el marco de la presente invención, se entenderá que engloba aquellas patologías oculares que se caracterizan por la presencia de inflamación de la glía (activación glial o gliosis reactiva) por la muerte neuronal progresiva por apoptosis de las neuronas de la retina, en concreto de los fotorreceptores, que como consecuencia pueden ocasionar ceguera. Ejemplos de dichas enfermedades incluyen pero no se limitan a retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. De acuerdo una realización particular de la presente invención, dichas enfermedades se seleccionan de un grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria. Según una realización preferida, la enfermedad neurodegenerativa de la retina es retinopatía diabética.

En el sentido de la invención, el término "neuroprotección" se entenderá que engloba, pero no necesariamente se limita a cualquier tipo de tratamiento profiláctico o método que puede ser utilizado con el fin de que las neuronas que constituyen la neurorretina permanezcan preservadas y en un estado fisiológico correspondiente al de un sujeto animal sano (incluyendo humanos). La "neurorretina" es la parte neurosensorial de la retina y es la responsable del ciclo visual.

En particular, el péptido "para uso tópico en el tratamiento y/o prevención" de acuerdo con la invención, se entenderá que engloba, pero no necesariamente se limita al uso tópico ocular en el tratamiento y/o prevención, de manera concreta, de una enfermedad neurodegenerativa de la retina seleccionada de entre el grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.

De acuerdo con una realización particular, la variante a la secuencia SEQ ID NO 2 es idéntica en al menos un 90%, aún más preferiblemente en aproximadamente un 94%, cifra que se correspondería por ejemplo con el reemplazo de un aminoácido por otro en la secuencia SEQ ID NO 2, o la adición de un aminoácido a la secuencia SEQ ID NO 2. Según una realización particular, la variante sería la SEQ ID NO 1 (DTHFRTFRSHSDYRRI). Otras especies de mamíferos, tales como Ratus Norvergicus, G orilla g orilla gorilla, Oryctolagus cuniculus, Pan troglodytes, Pongo abelii, Cavia porcellus o Sus scrofa, presentan la SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, ya que esta secuencia está muy conservada entre unas especies mamíferos y otras.

De acuerdo con una realización preferida, tal secuencia SEQ ID NO 2, o sus variantes idénticas en un porcentaje según lo definido anteriormente, está unida a una región de permeabilidad celular. Dicha región de permeabilidad celular puede seleccionarse de entre diferentes secuencias de permeabilidad descritas, generalmente pequeños péptidos de naturaleza catiónica o hidrofóbica, como TAT (SEQ ID NO 4: YGRKKRRQRRR), Antp (SEQ ID NO 5: RQIKIWFQNRRMKW), PTD-5 (SEQ ID NO 6: RRQRRTSKLMKR), SEQ ID NO 7: 8K (K=Lys) y SEQ ID NO 8: 6R (R=Arg). Más preferentemente, la región de permeabilidad celular es lisina-palmitato. Aún más preferiblemente, la región de permeabilidad celular está unida por el extremo amino terminal de la SEQ ID NO 2 o sus variantes idénticas. En el alcance de la invención se incluye cualquier polipéptido que comprenda la mencionada secuencia o sus variantes idénticas según lo definido anteriormente. Sin embargo, según una realización preferida, el polipéptido consiste esencialmente en a) la secuencia de SEQ ID NO 2; o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia.

En particular, la variante consistirá en la secuencia SEQ ID NO 1.

El término "consiste esencialmente" en el marco de la presente invención se refiere a la inclusión de un máximo de 8 aminoácidos adicionales (o sea, un máximo de un 50% más) a las secuencias definidas o sus variantes homologas, de acuerdo con realizaciones preferidas un máximo de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos adicionales, que pueden estar unidos independientemente al extremo amina de la secuencia, al extremo ácido o en cualquier lugar de la secuencia, pasando a formar parte de la secuencia.

En cualquiera de los casos anteriores, la secuencia puede o no estar unida a una región de permeabilidad celular como definida anteriormente.

Según una realización particular, el polipéptido consiste en la secuencia SEQ ID NO 2; puede o no estar unido a una región de permeabilidad celular como definida anteriormente.

En el caso de que el polipéptido sea para uso en complicaciones oculares en pacientes diabéticos, o para su uso en enfermedades degenerativas de la retina tales como retinopatía diabética, el polipéptido que contiene la secuencia de SEQ ID NO 2 o sus variantes idénticas según definido anteriormente, según una realización particular consiste esencialmente en o es:

a) la proteína SOCS1 de origen humano (UniProt: 015524);

b) la proteína SOCS1 de origen murino (UniProt: 035716); o

c) una variante a las secuencias de a) o b) que sea idéntica en al menos el 85% a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 de origen murino o a la secuencia de aminoácidos de la proteína SOCS1 de origen humano.

Al igual que cualquiera de las realizaciones particulares anteriores, al menos uno de los aminoácidos de la proteína SOCS1 de origen humano o murino, o una variante idéntica de las mismas, puede encontrarse modificado, preferiblemente fosforilado. De acuerdo con una realización preferida, el aminoácido fosforilado o uno de los aminoácidos fosforilados será una tirosina (Y). Asimismo, la proteína SOCS1 según las definiciones previas, puede encontrarse unida a una región de permeabilidad celular, preferiblemente a un grupo lisina-palmitato. De acuerdo con una realización preferida, la región de permeabilidad celular se encuentra unida por el extremo N- terminal del polipéptido, siendo más preferiblemente la región de permeabilidad celular un grupo lisina-palmitato.

La variante idéntica en al menos el 85% incluye las proteínas SOCS1 de otros mamíferos, tales como Ratus Norvergicus, Gorilla, Oryctolagus cuniculus, Pan troglodytes, Pongo abelii, Cavia porcellus o Sus Scrofa.

De acuerdo con realizaciones particulares, la variante a las secuencias de SOCS1 de origen humano o murino son idénticas en al menos un 90%, aún más preferiblemente en aproximadamente un 94%, a dichas secuencias. Todas las realizaciones preferidas indicadas para este primer aspecto de la invención son aplicables también al resto de aspectos de la invención, detallados a continuación.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de un polipéptido aislado que contiene a) la secuencia de SEQ ID NO 2 (DTHFRTFRSHADYRRI); o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85 % a la SEQ ID NO 2, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia;

para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria.. De acuerdo con otro aspecto de la invención, esta se refiere a una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores, y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables, para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, según las definiciones dadas anteriormente.

En una realización preferida de la invención la composición es adecuada o está destinada a su uso en la prevención o tratamiento de trastornos oculares en pacientes diabéticos y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina preferentemente retinopatía diabética. También podría ser utilizada para otras enfermedades de la retina que cursen con neurodegeneración, glaucoma y retinitis pigmentaria.

Así según una realización particular, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración por vía oftálmica.

Las composiciones según la presente invención comprenden al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables. El término "vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustancias o entidades moleculares junto a los cuales es administrado el péptido de la invención. Tales vehículos o excipientes serán adecuados para la vía de administración elegida, y serán evidentes a un experto de la materia dependiendo de la vía de administración. Los vehículos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo aquellos derivados de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, excipientes, disgregantes, agentes humectantes, o diluyentes. Vehículos y excipientes adecuados se describen por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin, el cual se incorpora por referencia a la presente solicitud.

Las composiciones según la presente invención pueden ser administradas por cualquier vía conocida, incluyendo vía oral, vía gastroentérica, vía parenteral, vía rectal, vía respiratoria y vía tópica, en particular por vía oftálmica. Asimismo las composiciones podrán contener otros principios activos o adyuvantes adecuados que serán evidentes al experto en la materia. Asimismo las composiciones podrían contener únicamente un solo polipéptido según la invención o dos o más polipéptidos según la invención.

En el caso de la vía oftálmica, el vehículo o excipiente debe ser adecuado para esta vía de administración. Las composiciones en este caso serán preparadas de manera conveniente, bien como una solución o una suspensión acuosa, en un vehículo o solución base oftálmico farmacéuticamente aceptable. Además del principio activo, en este caso el polipéptido según la invención, puede contener otros adyuvantes, tales como agentes antimicrobianos, conservantes, agentes quelantes, agentes reguladores de la tonicidad, agentes reguladores del pH, incluyendo soluciones tampón, agentes viscosantes, etc.

Si el sujeto recibe compuestos que ayudan a la neuroprotección de la retina (como el péptido de la invención) en las primeras etapas de la retinopatía diabética cuando las anomalías funcionales pueden ser detectadas (es decir, la discriminación cromática, la sensibilidad al contraste y las anomalías electrorretinográficas), los tratamientos agresivos de la enfermedad se pueden evitar. Así que, si la retina está protegida de las consecuencias de la hiperglucemia crónica, las complicaciones mayores se pueden minimizar o incluso no aparecer nunca, lo que supone una mejora real de la calidad de vida de los pacientes diabéticos. Por otra parte, el péptido previene la desorganización de la BRB. La administración tópica ocular de los péptidos representa una ventaja real, evitando tratamientos más agresivos.

El tratamiento en las primeras etapas de la retinopatía diabética tiene la ventaja real de que se evitan complicaciones adicionales, a saber, microaneurismas, microhemorragias, exudados duros, edema macular y neovascularización.

En las composiciones según la invención el péptido estará contenido en un rango de concentración de 1-12 mg/mL. En el caso particular de administración por vía ocular, el péptido estará contenido en una concentración de al menos 5 mg/mL, en realizaciones particulares estará contenido en una concentración de al menos 8 mg/mL, al menos 9 mg/mL, al menos 10 mg/mL, de acuerdo con una realización preferida en una concentración de 10mg/mL ± 5%, es decir, 10 mg/mL ± 0.5 mg/mL. En el caso particular de administración por vía intraperitoneal, el péptido estará contenido en una concentración de entre 1 y 5 mg/mL, de acuerdo con una realización particular estará contenido en una concentración de entre 1 y 3 mg/mL, de acuerdo con realizaciones preferidas, en una concentración de 2 mg/mL ± 10% o ± 5%, es decir, ± 0.2 mg/mL o ± 0.1 mg/mL. La composición de acuerdo con la invención es adecuada para la administración de una dosis diaria de entre 10 y 200 del péptido por cada ojo. De acuerdo con una realización particular, el péptido se administrará en una dosis diaria de entre 30 y 70 μg por cada ojo, de acuerdo con una realización preferida en una dosis diaria de entre 40 y 60 μg por cada ojo, preferiblemente entre 45 y 55 por cada ojo. En el caso de administración por vía intraperitoneal o vía oral, la composición será adecuada para la administración de una dosis diaria de entre 1 y 16 mg del péptido por cada kg de peso del paciente o sujeto al que se realiza la administración, según realizaciones particulares entre 2 y 10 mg del péptido por cada kg de peso del paciente o sujeto, preferiblemente entre 2,5 y 3.5 del péptido por cada kg de peso del paciente o sujeto.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2; o

b) una variante a la secuencia de a) que sea homologa en al menos el 85% a la secuencia SEQ ID NO 2;

para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria., según las definiciones anteriormente proporcionadas.

Según una realización particular, el polinucleótido aislado codifica

a) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 2 unida a un grupo lisina; o

b) una variante a la secuencia de a) que sea idéntica en al menos el 85% a la secuencia SEQ ID NO 2, unida a un grupo lisina;

para su uso en la prevención o tratamiento de complicaciones crónicas de la diabetes y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, donde las complicaciones crónicas de la diabetes se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, edema macular, nefropatía diabética, angiopatías diabéticas, microangiopatías diabéticas, macroangiopatías diabéticas, aterosclerosis diabética, pie diabético y enfermedad arterial periférica, y donde las enfermedades neurodegenerativas de la retina se seleccionan del grupo que consiste en retinopatía diabética, glaucoma y retinitis pigmentaria, según las definiciones anteriormente proporcionadas.

El polinucleótido anteriormente definido es adecuado o está destinado para uso tópico en la prevención o tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas.

Preferiblemente el polinucleótido anteriormente definido es adecuado o está destinado para su uso en la prevención o tratamiento de trastornos oculares en pacientes diabéticos y/o de enfermedades neurodegenerativas de la retina, más preferiblemente para su uso en la prevención o tratamiento de la retinopatía diabética.

A continuación se incluyen una serie de ejemplos ilustrativos, no limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

Péptidos:

Se sintetizó un péptido de 16 aminoácidos (SEQ ID NO 1 : DTHFRTFRSHSDYRRI, AspThrHisPheArgThrPheArg Ser His Ser AspTyrArgArglle), que se corresponde con la secuencia "kinase inhibitory región" de la proteína SOCS1 murina, unido a una región de permeabilidad celular (lisina-palmitato) por el extremo N-terminal de la secuencia peptídica (residuo D, ácido aspártico), en el cual la tirosina (Y) está fosforilada. A lo largo de los ejemplos se denominará miS1 o D-SOCSMIS1 al péptido derivado formado por SEQ ID NO 1 y el grupo lisina-palmitato. En algunos casos éste se conjugó con un marcador fluorescente para posibilitar su posterior seguimiento en tejidos y células. Asimismo se sintetizó también un péptido no funcional mutado (Mut) reemplazando F (Phe) por A (Ala): SEQ ID NO 3, DTHARTARSHSDYRRI, AspThrHisAlaArgThrAla Arg Ser His Ser AspTyrArgArglle; unido igualmente a la región de permeabilidad celular lisina-palmitato, para su uso como control de los experimentos. Los péptidos se disolvieron (<1 % DMSO en solución salina) y se esterilizaron por filtración.

Animales:

Se emplearon dos modelos experimentales, concretamente un modelo experimental de diabetes tipo 2 (ratones db/db) y otro de diabetes tipo 1 (inyección de estreptozotocina en ratones apoE). Los ratones se mantuvieron en jaulas de tamaño estándar en condiciones controladas de temperatura (20°C) y humedad (60%), con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y con acceso a comida (dieta estándar) y agua ad libitum. Estos estudios se han realizado según la legislación española vigente en cuanto al empleo, protección y cuidado de los animales de experimentación (Real Decreto 53/2013), siguiendo recomendaciones de la CEE (86/609/CEE) y ARVO (Associationfor Research in Vision and Ophthalmology) y han sido aprobados previamente por los Comités Éticos de las dos instituciones participantes (IIS- FundaciónJiménez Díaz/Universidad Autónoma de Madrid e Instituí de Recerca Hospital Universitari Valí d'Hebron).

Tratamiento de la neurodegeneracion de la retina causada por la diabetes mediante tratamiento tópico ocular con un péptido derivado de SOCS1

Ratones diabéticos (db/db) de 8 semanas recibieron el péptido miS1 en forma de colirio (gotas de 5 μΙ_ en cada ojo; 10 mg/mL; dos veces al día durante 15 días; n=7 ratones). Como controles se emplearon ratones diabéticos tratados con el péptido no funcional Mut (n=7), tratados con vehículo y no diabéticos (db/+). El colirio se administró directamente sobre la superficie superior de la córnea de cada ojo utilizando una micropipeta. Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorimétrico) a lo largo del periodo de estudio. En el día 15, la gota con el péptido miS1 o vehículo se administró aproximadamente dos horas antes de la necropsia. Se realizó eutanasia a los animales por dislocación cervical y los ojos enucleados se congelaron inmediatamente y se cortaron secciones dorsoventrales de 8mm para analizar la morfología de la retina y otros análisis inmunohistoquímicos.

La activación glial se evaluó mediante inmunofluorescencia de GFAP (Glial f ¡brillar acidic protein) siguiendo la metodología descrita en otros estudios (Bogdanov et al. PLoS One. 2014;9:e97302). Las secciones fijadas se bloquearon (1 % BSA y 10% suero de cabra en PBS, 2h a RT) y se incubaron con anticuerpos anti-GFAP (dilución 1 :500, 16h a 4°C) seguido de un anticuerpo secundario (cabra anti-conejo, conjugado con Alexa 488, dilución 1 :200). Las muestras se contrastaron con Hoesch y se montaron para análisis en microscopio confocal. Las imágenes de muestras de diabéticos y controles se tomaron con idénticos parámetros y se analizó la distribución topográfica del mareaje GFAP en una escala de 0 a 5 (Anderson et al. Clin Ophthalmol 2008;2(4):801-16). La puntuación 1 indica ausencia de activación glial (inmunofluorescencia positiva para GFAP restringida a la capa de células ganglionares) mientras que la puntuación 5 representa la máxima activación glial (inmunofluorescencia para GFAP se extiende desde la capa de células ganglionares hasta el margen externo de la capa nuclear externa). La apoptosis se determinó mediante inmunohistoquímica TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick-EndLabeling; kit de fluorescencia) utilizando el método descrito anteriormente (Bogdanov et al. PLoS One. 2014;9:e97302) y posterior cuantificación en un microscopio de fluorescencia. Las secciones de retina se permeabilizaron mediante incubación a temperatura ambiente durante 5 min con una solución de Proteinasa K de 20 μg/ml, recién preparada. Las células apoptóticas se identificaron utilizando fluorescencia verde [Alexa Fluor 594 goat-anti-rabbit (Invitrogen) (1 :200 dilution prepared in PBS)]. Para la evaluación por microscopía de fluorescencia, se empleó una longitud de onda de excitación en el intervalo de 450 - 565 nm (e.g., 488 nm) y para la detección se empleó el intervalo de 515 - 565 nm (verde). Los resultados se presentan como el porcentaje de células positivas TUNEL con respecto a las células de tinción Hoestchst obtenidas por Image J software.

Para investigar los mecanismos por los que el péptido miS1 produce neuroprotección se evaluó el metabolismo del glutamato. La concentración de glutamato se determinó mediante cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UPLC) (Acquity-UPLC, Waters) MassTrak aminoacid system). El GLAST (Glutamate/Aspartate transporter) se evaluó mediante inmunofluorescencia.

Las secciones de parafina se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en una serie gradual de etanol. Las secciones fueron fijadas en metanol ácido (-20 °C) durante 1 minuto y se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS) 0.01 M a pH 7.4. Después de eso, se realizó la recuperación de antígenos. Las secciones se sumergieron en una solución de recuperación antígénica (citrato sódico 10 mM, pH 6.0) y se calentó en una olla a presión a 150°C durante 4 minutos. Las secciones se incubaron en solución de bloqueo (BSA al 0.5%, y 10% de suero de cabra en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo primario, conejo anti-GLAST (1 :200, Abcam) durante la noche a 4 °C. Después de un lavado en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario Alexa 488 cabra anti-conejo (1 :200, Molecular Probes) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con Hoechst (1 :500, Sigma-Aldrich) y se colocaron en Medio de Montaje Fluorescente (Prolong, Invitrogen) con cubreobjetos. La inmunofluorescencia GLAST se cuantificó mediante microscopía confocal láser (Olympus FluoView ™ FV1000 confocal Microscopio, Hamburgo, Alemania) utilizando el software ImageJ. Se evaluó la expresión de I L- β, TNF-α e IL-6. El ARN total se extrajo con RNeasy Mini Kit with DNAse digestión (QIAGEN, Distribuidores IZASA, Barcelona, España) según las instrucciones del fabricante. El ARN (1 μg) se utilizó para la transcripción inversa con cebadores hexanucleótidos aleatorios y reactivos Applied Biosystems (Applied Biosystems, Madrid, España) en un volumen de reacción de 20 μΙ. La PCR en tiempo real se realizó en un ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Perkin- Elmer Applied Biosystems; Madrid, España) con SYBR Green Supermix; Applied Biosystems, Madrid, España). Cada muestra se ensayó por triplicado y se incluyó un control negativo en cada experimento. S18 humano se utilizó como control de la expresión del gen endógeno. Se utilizó el método AACt para obtener la cuantificación relativa (RQ).

Se realizaron registros de electrorretinogramas (ERG) en ratones anestesiados y adaptados a la oscuridad (12h durante la noche). Se midieron registros de electroretinogramas focales (Ferg) utilizando un sistema Micron III Focal ERG (Phoenix Research Labs, Pleasanton, CA). Los registros fueron tomados con un electrodo integrado en la lente corneal del ratón montado en el ERG focal, un electrodo de referencia colocado en la cabeza entre los ojos, y un electrodo de tierra colocado en la cola. Por otra parte, para asegurar que todas las retinas centrales habían sido estimuladas, los estímulos de luz se proyectaron en los discos ópticos y se utilizó el punto de luz más grande disponible (1 ,5 mm de diámetro). Las respuestas ERG de ambos ojos se registraron en respuesta a 20ms estímulos de luz blanca. Las intensidades de los estímulos de luz blanca estaban en 800, 3200 y 12800 cd ^« s ^« m-2 y para cada intensidad, se realizaron un promedio de 6-10 destellos de luz consecutivas. Las señales ERG fueron amplificadas, la banda filtrada fue entre 0.5 y 1000 Hz, y se analizó con LabScribe-2 software (BioSeb, Vitrolles, Francia) con el fin de calcular la amplitud y el tiempo implícito de la onda a y la onda b, como se recomienda por la Sociedad Internacional de Electrofisiología Clínica de la Visión (ISCEV) (Marmor et al Doc Ophtalmol 108:. 107 a 144). Los registros de ERG se realizaron al inicio y en el día antes de eutanasia. Tratamiento de la disrupción de la BRB causada por la diabetes mediante tratamiento tópico ocular con un péptido derivado de SOCS1

Ratones diabéticos (db/db) de 8 semanas recibieron el péptido miS1 en forma de colirio (gotas de 5 en cada ojo; 10 mg/mL; dos veces al día durante 15 días; n=7 ratones). Como controles se emplearon ratones diabéticos tratados con vehículo (n=7) y no diabéticos (db/+) (n=7). Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorí métrico) a lo largo del periodo de estudio. En el día 15 se realizó la eutanasia a los animales por dislocación cervical. La disrupción de la BRB se evaluó mediante la determinación de la permeabilidad a la albúmina. Las secciones de parafina se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en una serie gradual de etanol. Las secciones fueron fijadas en metanol ácido (-20 °C) durante 1 minuto y se lavó con solución PBS 0.01 M a pH 7.4. Las secciones se incubaron en una solución de bloqueo (2,5% de leche seca no grasa) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con un anticuerpo primario, ovejas anti-albúmina de suero humano (1 :500, Abcam) durante la noche a 4 °C. Después de un lavado en PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario Alexa 594 burro anti-oveja (1 :200, Molecular Probes) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con Hoechst (1 :500, Sigma-Aldrich) y se colocaron en Medio de Montaje Fluorescente (Prolong, Invitrogen) con cubreobjetos. La inmunofluorescencia de la albúmina se analizó mediante microscopía confocal láser (Olympus FluoView™ FV1000 confocal Microscopio, Hamburgo, Alemania).

Tratamiento de la nefropatía y aterosclerosis causada por la diabetes mediante tratamiento intraperitoneal con un péptido derivado de SOCS1

Ratones macho deficientes en apolipoproteína E (apoE) de 8 semanas de edad se hicieron diabéticos por inyección de estreptozotocina (125mg/kg peso en 10mM citrato pH 4.5, dos días consecutivos). Después de 2 semanas, los animales con glucemia superior a 350 mg/dL se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos (n=9 animales por grupo): tratados (péptido m¡S1 : 65 μg/día, 200μί, intraperitoneal, cada 2 días durante 8 semanas) y controles (vehículo). Se controló el peso y la glucemia (ensayo colorimétrico) a lo largo del periodo de estudio.

Al final del estudio, los animales anestesiados se perfundieron con salino y se sacrificaron, procesando los tejidos inmediatamente. En corteza renal (cortes en parafina, 5μηι) se estudió la morfología glomerular y tubulointersticial mediante tinciones de PAS y tricrómico de Masson y las lesiones se evaluaron de forma semicuantitativa y a doble ciego en escala 0-3. La fibrosis renal se determinó mediante tinción de rojo picrosirio y las células infiltrantes inflamatorias (macrofagos F4/80+ y linfocitos T CD3+) por inmunohistoquímica. En la aorta, la zona de raíz/arco (criocortes seriados de 8 μηι desde las válvulas hasta una extensión de 1000 μηι) se tiñó con Oil- red-O/hematoxilina y se cuantifico el área de la lesión aterosclerotica (programa Metamorph). La estabilidad de la placa se valoró por tinción de fibras de colágeno con rojo picrosirio e inmunofluorescencia de α-actina. El componente inflamatorio se determinó mediante inmunohistoquímica para monocito/macrófagos (Moma2). Utilizamos el programa Image Pro-Plus para cuantificar las tinciones positivas. Los parámetros bioquímicos en suero (hemoglobina glicada, colesterol y creatinina) y orina (albúmina y creatinina) se determinaron mediante kits comerciales convencionales.

Estudios in vitro

Se emplearon macrófagos RAW264.7 y células de músculo liso vascular (VSMC) cultivadas en medio con 10% suero bovino fetal. Las células se sincronizaron (24h sin suero), se preincubaron durante 90 min con diferentes concentraciones de péptidos (miS1 o su control, 50-150 μg/mL) y se estimularon con citoquinas (IFNy 103 U/mL; IL- 6 102 U/mL). La activación de STAT se analizó mediante Western blot para las isoformas STAT1/STAT3fosforiladas. La expresión de quimioquinas dependientes de la vía JAK STAT (CCL2) se determinó mediante ELISA. La viabilidad celular se analizó por ensayo colorimétrico MTT y la migración de macrófagos por ensayo de quimiotaxis.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como la mediaierror estándar del total de animales por grupo y de al menos 3 cultivos celulares independientes. Para el análisis estadístico utilizamos el programa GraphPadPrism (test ANOVA, Tukey y t de Student; significación con P<0.05).

EJEMPLO 1 : EFECTO DEL PÉPTIDO DE LA INVENCIÓN SOBRE LA NEURODEGENERACIÓN DE LA RETINA

En el modelo de diabetes tipo 2 (ratones db/db) se administró de forma local el péptido miS1 en forma de colirio (50 μg en 5 μ\-/ο\ο, dos veces al día) durante 15 días. La evolución del peso corporal y los niveles de glucosa se muestran en la Figura 1. La activación glial se midió con el marcador GFAP (Figura 2). Como era de esperar, en ratones no diabéticos [control (db/+)] la expresión de GFAP se limita principalmente a la capa de células ganglionares de la retina (GCL) (Figura 2). Los ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham] presentaron significativamente mayor expresión de GFAP que los ratones no diabéticos equiparados por edad. Así, el 100% de los ratones diabéticos presentaron una puntuación GFAP ≥3. La administración del péptido derivado de SOCS1 durante dos semanas resultó en una disminución significativa de gliosis reactiva, y la puntuación de GFAP de los ratones tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] fue≤ 3 en todos los casos (Figura 2). El porcentaje de células apoptóticas en capas de la retina (ONL, INL, y GCL) en ratones diabéticos [D-Sham] fue significativamente mayor en comparación al observado en retinas de los controles no diabéticos [control (db/+)] de la misma edad (Figura 3). Los ratones diabéticos tratados con péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] presentaron una tasa significativamente menor de la apoptosis que los ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham]. No se observaron diferencias en el porcentaje de células apoptóticas entre los ratones diabéticos tratados con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSMIS1] y los ratones no diabéticos. El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 aminora la reducción de la amplitud de la onda a y la onda b inducida por la diabetes, así como el aumento del tiempo implícito de la onda a y la onda b (Figura 4).

GLAST es el principal transportador de glutamato expresado por las células de Müller, ya que es el responsable al menos el 50% de la captación de glutamato en la retina de mamíferos (Figura 6A panel superior). El contenido de GLAST se reguló a la baja en las retinas de ratones diabéticos tratados con vehículo [D-Sham]. En los ratones diabéticos tratados con el péptido derivado de SOCS1 [D-SOCSM 1S1], la regulación a la baja GLAST fue evitada (Figura 6A panel inferior). En consecuencia, se redujeron los niveles de glutamato intrarretinianos pero sin alcanzar significación estadística (Figura 6B). Por lo tanto, entre los mecanismos por los que el péptido miS1 es neuroprotector de la retina, cabe destacar que evita el incremento del glutamato y la reducción del trasportador del glutamato GLAST.

Además, el péptido miS1 previno el incremento de I L-1 β inducido por la diabetes (Figura 7). Cabe destacar que esta citoquina juega un papel crucial en la patogénesis de la retinopatía diabética.

En conclusión, la administración en gotas oculares del péptido miS1 en ratones diabéticos previno la neurodegeneración de la retina, determinada por una reducción significativa (aproximadamente un 80%) de la tinción de proteína glial GFAP y de la apoptosis en comparación con los grupos que recibieron péptido Mut o vehículo. El efecto neuroprotector del péptido derivado de SOCS1 también se evidenció mediante el examen funcional de la retina (ERG).

Estos resultados demuestran que el péptido de la invención es útil en el tratamiento de otras enfermedades que cursen con neurodegeneración de la retina como el glaucoma y la retinitis pigmentaria puesto que estas enfermedades, al igual que la neurodegeneración de la retina inducida por la diabetes, se caracterizan por la presencia de inflamación de la glía y muerte neuronal progresiva por apoptosis.

EJEMPLO 2. EFECTO DEL PÉPTIDO DE LA INVENCIÓN SOBRE LA PERMABILIDAD DE LA BARRERA HEMATORETINIANA

En el modelo de diabetes tipo 2 (ratones db/db) se administró de forma local el péptido miS1 en forma de colirio (50 μg en 5 μ\-/ο\ο, dos veces al día) durante 15 días. La evolución del peso corporal y los niveles de glucosa se muestran en la Figura 1. La permeabilidad vascular se evaluó midiendo la extravasación de albúmina. Se observó una extravasación de albúmina superior en ratones db/db tratados con vehículo [D-Sham] comparado con animales control [control (db/+)]. El tratamiento con el péptido derivado de SOCS1 , miS1 , previno la extravasación de albúmina en ratones db/db [D-SOCSM1S1] (Figura 5). Estos resultados demuestran que el péptido de la invención es útil en el tratamiento del edema macular diabético puesto que dicha patología se produce por la disrupción de la barrera hematoretiniana, caracterizándose por la extravasación de fluido al espacio extravascular (agua y solutos; entre los solutos el más abundante es la albúmina) y el péptido derivado de SOCS1 según la invención impide dicha disrupción.

EJEMPLO 3: EFECTO DEL PÉPTIDO DE LA INVENCIÓN SOBRE LA NEFROPATÍA Y LA FORMACIÓN DE PLACAS DE ATEROMA EN RATONES DIABÉTICOS

En el modelo de diabetes tipo 1 (estreptozotocina en ratones apoE) se realizó el tratamiento sistémico con péptido miS1 (65 μg/día, cada 2 días) durante 8 semanas. En la Tabla 1 se muestran los parámetros clínicos y metabólicos al final del estudio. Todos los ratones diabéticos presentaron niveles equivalentes de hiperglucemia (glucosa y hemoglobina glicada (HbA1c) y colesterol, lo que indica que el efecto protector del péptido no es debido a una posible acción sobre el control de la glucemia de estos animales. El tratamiento con miS1 también mejoró significativamente la función renal de los ratones diabéticos, observándose un 28% de descenso en los niveles de albuminuria. Además, la pérdida de peso originada por la diabetes crónica fue menos acusada en el grupo tratado con péptido miS1.

El análisis histológico en cortes renales de los ratones diabéticos demostró una disminución en la activación renal de STAT1 y STAT3 (Figura 8) junto con una mejora de las lesiones glomerulares (hipercelularidad, expansión mesangial e hipertrofia glomerular) y tubulointersticiales (atrofia, degeneración e infiltrado) en el grupo tratado con péptido miS1 en comparación con los diabéticos que recibieron vehículo (Figura 9). El péptido miS1 redujo significativamente la fibrosis tubulointersticial (Figura 10) y el infiltrado inflamatorio de linfocitos y macrófagos (Figura 1 1). En otra serie de experimentos estudiamos las propiedades anti-ateroscleróticas del tratamiento con péptido miS1 en los ratones diabéticos. La tinción de las placas de ateroma con Oil- red-O/hematoxilina y su posterior cuantificación mostraron una significativa reducción en el tamaño y extensión de las lesiones en los ratones diabéticos tratados con péptido miS1 (50% reducción en comparación con el grupo control que recibió vehículo; Figura 12A). El análisis de la composición de la placa demostró una disminución en el número de macrófagos en las lesiones de los animales tratados, así como un mayor contenido de colágeno y células vasculares (Figura 12B), indicando por tanto que el tratamiento redujo la inflamación y mejoró la estabilidad de las placas de ateroma de los animales diabéticos.

Tabla 1 : Datos metabólicos y renales en ratones con diabetes tipo 1

Parámetro Control SOCS1

Peso (g) 21.3 ± 0.9 21.9 ± 0.6

Glucosa en sangre (mg/dL) 528 ± 12 549 ± 29

GHbAl c (ug/mL) 470 ± 74 503 ± 76

Colesterol total (mg/dL) 583 ± 19 611 ± 59

Colesterol LDL (mg/dL) 557 ± 19 597 ± 61 Colesterol HDL (mg/dL) 12 ± 1 1 1 ± 1

Triglicéridos (mg/dL) 72 ± 5 89 ± 23

AST (U/L) 226 ± 16 176 ± 20

ALT (U/L) 106 ± 6 97 ± 17

Relación riñón-masa corporal (mg/g) 20.5 ± 1.1 16.4 ± 1.3 (p<0.05)

Creatinina sérica (mg/dL) 0.40 ± 0.04 0.24 ± 0.04 (p<0.02)

Relación albúmina urinaria-creatinina

22.6 ± 1.4 16.2 ± 6 1.1 (p<0.01) (ug/umol)

EJEMPLO 4: ESTUDIOS IN VITRO

En los estudios in vitro se emplearon macrófagos murinos y cultivos primarios de células de músculo liso vascular de ratón (Figura 13). En ambos casos la activación de la vía JAK STAT se indujo por estimulación con las citoquinas proinflamatorias IFNy e IL-6. La preincubación de macrófagos con concentraciones crecientes (50-150 ug/mL) del péptido inhibidor miS1 redujo de forma dosis-dependiente la activación de STAT1 y STA3 (determinada por los niveles de fosforilación de ambas proteínas en un ensayo de Western blot). Por el contrario, una dosis similar de péptido Mut (150 ug/mL) no causó ningún efecto, confirmándose así la especificidad del péptido inhibidor miS1. De forma similar, el péptido miS1 previno la activación de STAT1 y STAT3 en VSMC, como puede verse en las imágenes de inmunofluorescencia. Para determinar las consecuencias funcionales de la inhibición por el péptido miS1 se analizó la secreción de la proteína quimiotáctica de monocitos CCL2, cuya expresión depende de la vía JAK/STAT. La preincubación con el péptido inhibidor miS1 , pero no con el péptido Mut, logró reducir significativamente (30-40%) la producción de CCL2 inducida por citoquinas, tanto en VSMC como en macrófagos. Por último, mediante ensayos de quimiotaxis se comprobó el efecto anti-migratorio del péptido inhibidor miS1 en macrófagos. No se observaron variaciones en la viabilidad celular de VSMC y macrófagos en ninguna de las condiciones experimentales estudiadas, lo que indica la no-toxicidad del péptido a las concentraciones empleadas. EJEMPLO 5: JUSTIFICACIÓN DE QUE LOS DATOS APORTADOS SON EXTRAPOLABLES A HUMANOS

Los modelos animales y celulares usados en los ejemplos de la presente invención son aceptados en el sector médico y farmacéutico como modelos que permiten extrapolar los datos obtenidos mediante su uso a enfermedades humanas. Por un lado, el ratón deficiente en el gen de apolipoproteína E se caracteriza por tener un transporte reverso de colesterol deficiente que determina una hipercolesterolemia sistémica con alta acumulación de lípidos y colesterol en tejidos adiposos y periféricos. Este modelo de ratón desarrolla espontáneamente (de forma acelerada si se alimenta con dieta grasa) lesiones ateromatosas con algunas características similares a las lesiones humanas. Por ello, es uno de los modelos más ampliamente utilizado en investigación cardiovascular. En segundo lugar, la inducción de diabetes tipo 1 en los ratones apoE es un modelo experimental que combina hiperglucemia e hiperlipidemia (dos factores de riesgo en estas patologías) y que se caracteriza por un desarrollo rápido de aterosclerosis y nefropatía como consecuencia de la diabetes. Por último, el ratón db/db se caracteriza por una deficiencia en el receptor de leptina, desarrollo espontáneo de diabetes tipo 2 y obesidad a las 4-8 semanas de edad y un posterior proceso de neurodegeneración de la retina muy similar al que ocurre en las etapas iniciales de la retinopatía diabética en los pacientes diabéticos.