本发明涉及一种新化合物，具体地说，提供一 种羟基红花黄色素 A钠化合物， 以及该化合物生产方法和医药用途。 属于天然药物化学领域。

背景技术

中药红花为菊科植物 Carthamus tinctouiusL.的干燥花， 是一种常见的活 血化淤中药， 可用于冠心病、 心绞痛等诸多血液循环障碍疾病的治疗。 羟基红 花黄色素 A ( hydroxysafflor yel low A ) 是具有单查尔酮苷类结构的化合 物， 是红花药理功效的最有效水溶性部位， 可抑制血小板激活因子诱发的 血小板聚集与释放， 可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体 的结合， 是红花黄色素的活血化瘀有效成分。研究表明 ，它具有多方面的心血管药理作 用， 可抗凝、 促进纤溶、 抗血栓形成、 改善微循环等。

现有技术中已经公开了羟基红花黄色素 A及其各种提取、分离和纯化方法， 以及羟基红花黄色素 A注射液 （包括冻干粉针剂）。 然而， 现有的羟基红花黄色 素 A产品纯度和稳定性依然存在一定问题。 从现有的红花黄色素的纯度上来看， 基本都存在 10%以上的杂质， 且这类杂质的结构性质均都未能定性， 存在一定的 质量不可控性。 从红花药材提取的红花黄色素杂质谱也不能完 全保证一致。

CN102675379A中公开了一种从红花中提取精制羟基 红花黄色素 A的方法， 并具体公开了从中药红花中经过提取、弱碱性 离子交换树脂纯化、中极性大孔吸 附树脂纯化和非极性大孔吸附树脂纯化、 冷冻干燥五个歩骤， 得到含量为 80% 以上的羟基红花黄色素八， 转移率 20%以上。

CN101195647A, CN101215307A, CN1475272A中公开从红花中提取精制羟基 红花黄色素 A的方法， 得到含量高于 90%的羟基红花黄色素 A。

然而， 羟基红花黄色素 A稳定性不好， 导致羟基红花黄色素 A制剂长期放 置后纯度下降， 影响药物疗效，特别是引起对羟基红花黄色素 A注射制剂的用药 安全性担忧。

药物研究的主要内容包括药物的安全性、有效 性、稳定性和可控性， 四者缺 一不可。对己生产并临床使用的红花黄色素注 射剂， 由于经过了药效学测试、 临 床评价， 羟基红花黄色素 A化合物本身的安全性与有效性已经得到证明� � 但是， 由于羟基红花黄色素 Α的提取工艺以及化合物稳定性因素，从上市� ��现有的羟基 红花黄色素 A原料的纯度上来看， 基本都存在 10%以上的杂质， 且这类杂质的结 构性质均都未能定性，存在一定的质量不可控 性。从红花药材提取的红花黄色素 杂质谱也不能完全保证一致。 因此， 现有的羟基红花黄色素 A药品， 特别是注射 液药品， 有效成分的稳定性和纯度仍然是制约或者影响 药品安全性、质量可控性 改善的主要方面。

发明内容

为克服现有技术的缺陷， 本发明提供一种新的羟基红花黄色素 A化合物， 具体地说，提供一种羟基红花黄色素 A钠的新化合物。该新化合物是由天然药材 红花为原料， 通过优异的工艺提取、 分离和纯化步骤而获得的新化合物。经试验 研究表明， 该羟基红花黄色素 A钠比起羟基红花黄色素 A是更安全有效、更稳定 可控的单体化合物，将应用于冠心病、心绞痛 等诸多血液循环障碍疾病的治疗上。

本发明技术方案分别如下：

本发明提供了一

分子式： C ₂₇ H ₃₁ 0 ₁₆ Na

本发明的另一目的， 还提供了式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠的制备方法， 其特征在于包括由下式（Π) 的羟基红花黄色素 A制得式（I) 的羟基红花黄色素 A钠的歩骤。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中式 （II) 的羟基红花黄色素 A通过如下 方法制得式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠： 式 （II) 的羟基红花黄色素 A通过钠离 子交换树脂柱制得式（I) 的羟基红花黄色素 A钠， 或者式（Π) 的羟基红花黄色 素 A与钠盐反应制得式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠， 其中所述的钠盐选自氢氧化 钠、 碳酸钠、 碳酸氢钠中的一种或者两种以上。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述的钠离子交换树脂是用 001*7钠离 子交换树脂或大孔 HB- 8钠离子交换树脂。这两种树脂均有市售产品� �例如可购自 上海华震科技有限公司。

作为一具体实施方案， 上述所述的制备方法， 其特征在于以红花药材为原 料， 经过包括如下的提取、 转钠盐、 分离和纯化的步骤， 制得式 （I) 的羟基红 花黄色素 A钠：

(1) 提取： 红花药材用水进行提取；

(2)转钠盐： 歩骤（1)得到的红花提取液通过钠离子交换树� ��柱， 红花黄色素 生成了式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠；

(3)分离： 将步骤（2) 收集到的含式（I) 的羟基红花黄色素 A钠的洗脱液通过 大孔吸附树脂柱分离， 得到式 （I) 羟基红花黄色素 A钠的粗品； (4)纯化： 将步骤（3)得到的式（I)羟基红花黄色素 A钠的粗品用葡聚糖凝胶 柱层析分离， 再用超滤膜进行超滤， 制得式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的精品。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述歩骤 （1) 为红花用 10 30倍重量 的水在 50 100°C下提取 2 3次， 每次 0.5 24小时， 收集提取液冷却后即得。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述步骤 （2) 为将歩骤 （1) 制得的 提取液过钠离子交换树脂柱， 所述的钠离子交换树脂为 001*7钠离子交换树脂或 大孔 HB-8钠离子交换树脂， 收集含式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的洗脱液。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述歩骤 （3) 为将步骤 （2) 得到含 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的洗脱液用大孔吸附树脂 HZ801柱分离， 以水为洗 脱剂， 收集洗脱液， 得式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠粗品。

优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述歩骤 （4) 为将步骤 （3) 得到的 羟基红花黄色素 A钠的粗品用 Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离， 用纯水为 洗脱剂， 收集含式（I) 的羟基红花黄色素 A钠洗脱液， 减压浓缩得浓缩液， 再用 截留分子量 8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液� �经冷冻干燥，制得 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的精品。

作为另一具体实施方式， 上述所述的制备方法， 其特征在于以红花药材为 原料， 经过包括如下的提取、 分离、 纯化、 酸化和转钠盐的歩骤， 制得式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠：

(1) 提取： 红花药材用水进行提取， 得到红花提取液；

(2)分离： 将步骤（1)得到的红花提取液通过大孔吸附树� ��柱分离， 得到红花 黄色素粗品；

(3)纯化： 将步骤（2)得到的红花黄色素粗品用葡聚糖凝� ��柱层析分离， 再用 超滤膜进行超滤， 冻干后得到红花黄色素精品；

(4)酸化： 将步骤 （3)得到的红花黄色素精品加水， 加酸（优选为盐酸）调 pH 值为 1.5-2.5， 收集所析出的淡黄色固体， 得到式 （Π) 的羟基红花黄色素 A;

(5) 转钠盐： 将歩骤 （4) 得到的式 （II) 的羟基红花黄色素 A， 加水后用

0. lmol/flOmol/L氢氧化钠或者碳酸钠或者碳酸氢钠� �优选氢氧化钠）溶液调 pH 至 4-7， 式（II) 的羟基红花黄色素 A生成式（I) 的羟基红花黄色素 A钠， 反应产 物用超滤膜进行超滤， 滤液冻干， 得到式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的精制品。 优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述的大孔吸附树脂是用 HZ801型大孔 吸附树脂。 优选地， 上述所述的制备方法， 其中所述的葡聚糖凝胶柱层析是用 Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱层析分离， 用纯水为洗脱剂； 所述的超滤是用截 留分子量 8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤。

红花药材水提取液主要包含红花黄色素化学成 分。本发明令人意外地发现， 红花药材水提取液通过钠离子交换树脂柱 （如 001*7钠离子交换树脂或大孔 HB-8 钠离子交换树脂）， 红花水提取液中的红花黄色素将全部转化为本 发明所述的式 ( I )所示的羟基红花红色素 A钠新化合物。发明人推测， 可能在钠离子交换树脂 分离过程中， 红花黄色素游离的式 （Π ) 的羟基红花黄色素 A阴离子， 结合交换 出的钠离子进而再生成得到了式（I )所示的羟基红花黄色素 A钠。这也得到如下 实验的验证。 用含式（Π )所示的羟基红花黄色素 A的样品， 用 001*7钠离子交换 树脂， 按本发明实施例 1方法进行钠离子交换树脂分离， 收集得到的洗脱液， 经 测定含有如式 （I ) 所示的羟基红花黄色素 A钠。

同样地， 本发明还发现， 可以通过将红花黄色素精品酸化后得到羟基红 花 黄色素 A， 再用氢氧化钠、 碳酸钠或者碳酸氢钠等钠盐处理， 也可以高收率、 高 纯度获得式 （I ) 所示的羟基红花黄色素 A钠的新化合物。

作为本发明另一发明目的， 还提供了一种药物制剂， 其含有上述所述的式 ( I ) 的羟基红花黄色素 A钠作为药物活性成分和药学上可接受的载体� � 优选地， 所述的药物制剂为冻干粉针剂， 通过将上述所述的羟基红花黄色素 A钠或者按照 上述所述方法所制得的式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠的精品， 溶解于注射用水， 经采用 0. 22 的微孔滤膜或者截留分子量 8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分 装于瓶中， 冷冻干燥后， 得到式 （I ) 的羟基红花黄色素 Α钠的冻干粉针剂。

单位制剂中羟基红花黄色素 A钠的量可以为 50mg-200mg。 例如， 可制备成- ( 1 ) 注射用羟基红花黄色素 A钠冻干粉针剂， 每瓶含 50mg-200 _{mg ;} (2 ) 羟基红 花黄色素 A钠氯化钠注射液， 每 100ml氯化钠注射液含羟基红花黄色素 A钠

50mg-200mg _; (3 ) 羟基红花黄色素 A钠葡萄糖注射液。 每 100ml葡萄糖注射液含 羟基红花黄色素 A钠 50mg-200mg。

作为本发明一个具体实施方式， 本发明的式 （I ) 所示的羟基红花黄色素 A 钠及其冻干粉针剂， 其通过包括红花药材的提取、钠离子交换树脂 的转换、 大孔 树脂分离、 葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤的方法制备 得到， 具体是：

(1)以红花药材为原料， 加入适量的温度为 50 100Ό的水抽提， 抽提是以 水抽提 2 3次， 每次 0. 5 24小时， 抽提用水量为红花生药重量的 10 30倍。 抽提后滤除药渣， 将提取液冷却至 5— 30Ό : ， 静置 2 24小时；

(2 ) 将提取液过钠离子交换树脂， 流速 l〜30ml/min， 最后用一倍柱体积 水， 将柱子里的提取液排出；

(3)大孔吸附树脂分离：步骤（2 )得到的红花提取液用大孔吸附树脂 HZ801 柱分离， 大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为 1： 8〜15， 以纯化水为洗脱 剂， 洗脱流速 10〜30ml/min， 收集洗脱液， 减压浓缩， 得羟基红花黄色素 A钠 浓缩液粗品；

(4)葡聚糖凝胶层析分离： 步骤 （3) 得到的羟基红花黄色素 A钠浓缩液粗 品过滤或离心后用 Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离， 层析柱的径高比为 1： 5〜20， 以纯化水为洗脱剂， 洗脱流速控制线性流速为 l〜10cm/h， 收集含羟 基红花黄色素 A钠洗脱液， 减压浓缩得浓缩液；

(5)超滤：歩骤（4)所得浓缩液经过滤或离心后� ��用截留分子量 8000-10000 道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；

(6) 冻干： 步骤 （5) 所得超滤液经冷冻干燥， 即得羟基红花黄色素 A钠。

(7 ) 将步骤 （6) 得到的羟基红花黄色素 A钠精品， 溶解于注射用水， 经 采用 0. 22 的微孔滤膜或者截留分子量 8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装 于瓶中， 冷冻干燥后， 得到羟基红花黄色素 A钠冻干粉针。

其中， 所述的钠离子交换树脂是用 001*7钠离子交换树脂或大孔 HB-8钠离 子交换树脂； 所述的大孔树脂分离是用大孔吸附树脂 HZ801 ; 所述的葡聚糖凝胶 层析分离是用葡聚糖凝胶 LH- 20; 所述的超滤是用截留分子量 8000-10000道尔 顿的超滤膜。

本发明还提供了上述所述的式 （I ) 所示的羟基红花黄色素 A钠在制备药物 中的应用，其中所述药物具有抗 PAF或 ADP诱导的血小板聚集作用， 用于预防及治 疗涉及心肌缺血或脑缺血或者血栓形成所致损 伤疾病。 其临床应用剂量可以为 50- 200mg/每天。

本发明以天然药材红花为原料， 通过优异的提取方式， 提供了新型单体药 物化合物式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠， 纯度能保证达到 98. 5%以上， 杂质个 数控制在 5个以下， 更主要的是， 比起羟基红花黄色素 A, 本发明的羟基红花黄 色素 A钠更稳定， 更有利于用药安全性和可控性， 将成为应用于冠心病、 心绞痛 等诸多血液循环障碍疾病的治疗上相较于羟基 红花黄色素 A更安全有效、更稳定 可控的单体化合物。

药效学研究试验一：

试验目的： 观察羟基红花黄色素 A钠与注射用红花黄色素 （50mg/瓶） 静脉注射 对狗急性心肌梗塞的保护作用。

受试药物

注射用红花黄色素（50mg/瓶）， 来源： 浙江永宁药业股份有限公司， 含量： 50mg/瓶含羟基红花黄色素 A 42. 5m _{g o}

羟基红花黄色素 A钠冻干粉 （按照实施例 1所制得）

动物

健康杂种狗 18只， 雌雄各半， 随机分为三组。

分组 动物数 剂量 给药方法 生理盐水组 6只 生理盐水 lml/kg 静脉注射 注射用红花黄色素 6只 红花黄色素 10mg/kg 静脉注射 羟基红花黄色素 A钠组 6只 羟基红花黄色素 A钠 10mg/k _g 静脉注射 上述药物均静脉注射给药， 与临床拟用途径 (静脉注射） 一致， 给药次数为 一次。

实验方法

动物称重后 3%戊巴比妥钠 30mg/k _g 静脉注射麻醉。 气管插管， 接麻醉呼吸 机开胸后行机械通气，呼吸频率 16— 18 次 /分， 吸气与呼气之比为 1 : 2, 潮气量 350 - 550ml , 并根据血气分析结果调整通气指标。 以针状电极插入四肢及胸前 皮下， 监测标准肢导及 V I、 V3、 V5 心电图。 沿胸骨左缘第 3肋间开胸， 并 切断第 4肋骨充分暴露心脏。剪开心包并作心包吊床� �静脉注射利多卡因 2mg/kg 预防心律失常。分离左冠状动脉前降起始部位 ， 于前降支下绕两段 1号丝线打松 结， 将一段直径 lmm的钢丝插入第一松结内， 结扎第一结， 将钢丝与冠状动脉一 起结扎， 抽出钢丝。 30 分钟后结扎第二结（同吋静脉注射受试药物） 。 观察第二 结结扎后 5分、 10分、 30 分及 1、 2、 3、 4小吋心电图变化。 4小时后取心脏， 称全心重量， 沿主动脉根部左右冠状动脉开口处加压注入 10%碳素墨汁 10ml，显 示心肌非缺血区（被染黑的心肌）和缺血区（ 未被染黑区）， 剪取缺血区称重。 然 后将缺血区切成 0. 5〜lcm厚的心肌片， 用生理盐水洗净， 置 37°C 0. 025%氯化 硝基四氮唑蓝 （NBT)液染色。 染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接 触。 30 分钟后立即用水冲动多余染料。 梗死心肌不着色， 非梗死心肌被染成黑色， 剪去着色部分， 将未着色的梗死区称重。

观察指标

给药后主要观察指标为胸导联心电图 ST段抬高程度及心肌梗死范围等 定量指标， 具体如下。

1. ST段抬高程度： A ST, 以结扎前之 ST为 0点。

观察时间为给药后 5分、 15分、 30分、 1小时、 2小时、 3小时、 4小时 2心肌梗死程度

缺血区心肌重量 （g) : 即被结扎冠脉供血区的心肌重量。

梗死区心肌重量 （g) :即心肌染色的未着色部分。

心肌梗死率 （％)： (梗死区 /缺血区） *100%

试验对照

阴性对照组 生理盐水 lmg/kg

统计分析

试验结果以 X士 S表示， 采用非配对 t检验法统计， P〈0. 05为具有显著 的统计学差异。

试验结果

1.药物对麻醉犬心肌梗死后 ST段抬高程度的影响

与生理盐水比较， 静脉注射注射用红花黄色素和羟基红花黄色素 A钠从 给药后的五分钟到 4小时均可显著降低麻醉开胸犬冠状动脉结扎� �起的 ST段 抬高程度。 结果见表 1。

对麻醉开胸狗心肌梗塞后 ST段抬高程度的影响 水组 2 41 0.32 0.41 0.41 0.23 0.22 红花黄 6 0.87±0·4 1.02±0. 0.88土 0.79士 0.87士 0.76士 0.79土 色素组 3 46* 0.42* 0.42** 0.30* 0.42* 0.34* 羟基 红 6 0.84±0.3 0.81±0. 0.78土 0.72士 0.61土 0.48 + 0.33士 花黄色 4* 29* 0.56* 0.36* 0.51* 0.40* 0.42** 素 A钠组

2. 注射用红花黄色素和羟基红花黄色素 Α钠均可显著缩小麻醉开胸犬 急性心肌梗死的心肌梗死范围， 其中以羟基红花黄色素 A钠注射组效果为最 好。 结果见表 2。

表 2 对犬急性心肌梗死范围的影响

*p<0.05, **p<0.01, ***p〈0. OOlvs生理盐水组

试验结论

羟基红花黄色素 A钠与注射用红花黄色素比较， 对防止缺血区心肌坏死有 更好的作用。 药效学研究试验二：

羟基红花黄色素 A钠抗血小板聚集的作用， 对急性脑缺血有防治作用。 受试药物

羟基红花黄色素 A钠冻干粉 （按照实施例 1所制得）

实验内容 对犬离体心、 脑血管的选择性： 该实验将 Beagle 犬大脑基底动脉环和冠状 动脉环固定在离体血管测量装置上， 调整张力传感器并向浴杯液中加入 10_ ⁶ mol /L 的苯肾上腺素使血管维持适度张力， 然后每间隔 5min向浴杯液中按 每毫升 10mg的剂量加入注射用羟基红花黄色素 A钠，直到血管环反应很弱或 不再出现反应为止 （一般加药次数为 4-5次）。 计算血管收缩或舒张变化值。 实验结果， 注射用羟基红花黄色素 A钠对心脏血管环的舒张作用为 30. 9%, 而对脑血管环的舒张作用为 72. 8%， 说明注射用羟基红花黄色素 A钠对脑血 管具有非常好的选择性和舒张作用。

对急性脑缺血的影响： 实验用 SD大鼠，静脉注射羟基红花黄色素 A钠后用常 规的大脑中动脉栓塞 （MCA0) 线栓法制备急性脑缺血模型。 词养 24h后先对 其进行神经行为学评分， 然后断头处死大鼠， 取出大脑， 放入模具中切成 7 片， 予以 TTC染色， 存活脑组织被染成红色， 坏死脑组织不着色， 用图形分 析软件计算坏死脑组织占大脑半球的比例。 结果， 脑梗死面积溶剂对照组为 38%, 尼莫地平阳性对照组为 15. 4%, 注射用羟基红花黄色素 A钠低中高三个 剂量组分别为 38. 0%、 27. 2%和 21. 5%， 与溶剂对照组比较中高剂量有显著减 轻急性脑缺血引起脑组织坏死的作用。

对大鼠脑血管通透性的影响： 大鼠静脉注射给药， 每天一次， 连续 7天， 最 后一次给药后将大鼠麻醉，静脉注射伊文思蓝 50mg/kg， 5分钟后结扎双侧颈 总动脉， 3 小时后断头处死动物， 取出大脑， 称重后浸泡于甲酰胺溶液中， 置 45Ό恒温箱中 72h， 此时脑血管中的伊文思蓝能够浸出到甲酰胺溶 液中， 用分光光度计检测甲酰胺溶液中伊文思蓝析出 量的多少表示脑血管通透性的 高低。 实验结果显示： 注射用羟基红花黄色素 A钠中高剂量组有非常显著的 减少伊文思蓝从脑血管中的溢出的作用， 说明该药对降低血管通透性有较好 作用。

对犬脑血流量的影响： 实验动物用 Beagle 犬， 犬用戊巴比妥钠麻醉后手术 分离出一侧颈外静脉、 颈内静脉和椎动脉， 结扎颈外静脉， 放置流量探头在 颈内静脉和椎动脉， 两处探头记录的血流量相加乘 2代表全脑供血量， 实验 结束取出大脑称重计算每 100g大脑组织血流量。试验结果，注射用羟基� �花 黄色素 A钠在静脉给药后中高剂量两个组有明显增加� �流量的作用， 但血流 量增加维持时间较短（约 15min)， 该实验提示今后在临床用于治疗急性脑缺 血时应选用静脉滴注的方法给药。

5. 对急性脑缺氧的影响： 实验用昆明种小鼠和 SD大鼠进行，将动物放入缺氧环 境中， 记录存活时间， 了解动物用药后是否能增加对急性缺氧的耐受 性。 实 验结果： 小鼠在密闭的容器中， 溶剂对照组存活时间为 32min， 而注射用羟 基红花黄色素 A钠低中高三个剂量组的小鼠存活时间分别为 37、 37、 37min, 经统计学处理与溶剂对照组比较有显著差异（ P<0. 05〜0. 01 ); 大鼠实验在含 97%的氮气和 3%氧气的环境中进行， 动物放入容器后到呼吸停止， 各组的生 存时间为， 溶剂对照组平均 3分 43秒； 阳性对照组 （尼莫地平） 为 5分 45 秒， 两者间比较差别非常显著； 注射用羟基红花黄色素 A钠低中高三个剂量 组分别为 3分 30秒、 4分 35秒和 4分 12秒， 和溶剂对照组比较中高剂量组 存活时间差别显著。

6. 抗血小板聚积： 实验分为用仪器检测和活体实验两部分：

1 ) 仪器检测方法： 家兔静脉注射羟基红花黄色素 A钠， 每天一次连续 5天， 最 后一次给药结束 2小时内从心脏取血 ½1， 血液经低速离心得到富含血小板的血 清； 经高速离心得到贫血小板血清， 血小板聚积诱导剂选用二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate ; ADP)和血小板聚集活化因子（Platelet- Activating Factor PAF)两种， 用血小板聚集仪进行测试。 在羟基红花黄色素 A钠注射液抗 ADP和 PAF诱导的血小板聚集实验中， 均显示有非常好的抗血小板聚集作用， 在 三个剂量之间显示出有良好的量-效关系存在� �

2 )活体方法：用乳胶管在大鼠动静脉之间形成� �路,乳胶管内固定有手术用丝线， 利用血小板粘附的特点， 开放短路使血液经乳胶管跨动静脉流动 15分钟， 取出 丝线称重， 减去丝线干重即是粘附在丝线上的血小板重量 ， 实验结果， 在丝线上 粘附的血小板重量溶剂对照组为 14. 8± 1. 57mg， 阳性对照组为 8. 62 ±2. 79mg, 注射用羟基红花黄色素 A 钠低中高三个剂量组的粘附血小板重量分别为 13. 8土 1. 95mg, 9. 87± 1. 50mg和 9. 02± 1. 29mg, 中高剂量组和溶剂对照组比较 相差非常明显，说明注射用羟基红花黄色素 A钠有非常好的抗大鼠血小板聚集的 作用。

7.对血液粘滞度的影响： 家兔静脉给药， 每天一次， 连续 5天， 最后一次给药 2 小时心脏取血抗凝后直接用血液流变仪检测。 结果显示， 与溶剂对照组比较羟基 红花黄色素 A钠治疗组随着用药剂量的增加，血液粘滞度� �切、中切和高切三个 指标也随之降低， 降低幅度随剂量增加而增加， 高剂量组效果优于阳性对照药尼 莫地平注射用液组，说明注射用羟基红花黄色 素 A钠对降低血液粘滞度有显著作 用。 二、 稳定性试验

试验目的： 观察式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠与羟基红花黄色素 A稳定性以及 理化数据

受试药物

羟基红花黄色素 A 按 CN102675379A方法自制 纯度 89. 9%

羟基红花黄色素 A钠 自制 （按照实施例 1 ) 纯度 98. 6%

结果见表 3。

表 3 羟基红花黄色素 A钠稳定性试验结果

羟基红花黄色素 A 按实施例 2 中方法自制， 红花黄色素酸化后制得， 纯度 99. 2%。

羟基红花黄色素 A钠 自制 （按照实施例 2 ) 纯度 99. 2%

结果见表 4。 羟基红花黄色素 A钠稳定性试验结果

羟基红花黄色素 A钠的理化数据， 见表 5。

羟基红花黄色素 A钠理化数据结果

试验结果表明， 本发明的新颖的式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠， 与羟基红 花黄色素 A的稳定性比较试验， 说明羟基红花黄色素 A钠稳定性更好， 从而质量 更安全可靠。 羟基红花黄色素 A酸性较强， 超出人体耐受 pH， 注射时引起疼痛 等不适感觉， 且溶解性很差。 本发明的新颖的式 （I ) 的羟基红花黄色素 A钠， 有更好的耐受性和溶解性。

实施例 1所制得的羟基红花黄色素 A钠化合物，经红外光谱（IR )、质谱（MS )、 核磁共振氢谱 CH-NMR) 、 碳谱 ( ¹³ C-NMR) 、 COSY谱、 DEPT135谱以及 HSQC谱结 构确认， 结构如下：

1.红外吸收光谱

仪器型号： Bruker VECTOR- 22型红外吸收光谱仪

IR (溴化钾压片）

IR谱主要特征峰见表 6。

表 6 红外光谱特征峰

2.质谱

仪器型号： 美国 FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系（LCQ-DEC AXP) 测试条件： ESI

质谱 MS

+c ESI 635. 14 (M) ⁺

— c ESI 611. 25 (M-Na) ― 3.核磁共振氢谱和碳谱

仪器型号： BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪

测试条件： 溶剂： DMS0， 内标： TMS

式（I) 的羟基红花黄色素 A钠的核磁共振 ¹ H-剛 R (图 1) 、 ¹³ C-NMR (图 2) 、 COSY谱 （图 3) 、 DEPT135谱 （图 4) 以及 HSQC谱 （图 5) , 如说明书附图。

羟基红花黄色素 A钠的 'H-NMR数据归属如下：

化学位移 δ (ppm) 2.84〜4.14(14H)归属于糖部分氢 G广 G6和 G， 1〜G， 6； 4.39~4.77(8H)归属于糖上羟基氢; 7.26 (1H) 7.39 (1H)归属于 8 和 9； 6.75〜7.42(4H)归属于 11〜15； 18.65 (1H)归属于 3-0H; 4.70(1H)归属于 4-0H; 9.72(1H)归属于 13-0Ho

羟基红花黄色素 A钠的 ^1:i C-丽 R数据归属如下：

DEPT135显示化学位移 δ (ppm) 61.05(1C)、 61.46(10 (仲碳) 归属于糖 部分碳 G6、 G， 6； 68.60、 69.62、 69.83、 70.86、 73.80、 78.25、 79.15、 80.19、 80.62、 85.57(10C) (叔碳）归属于糖部分碳 G1〜G5和 G， 广 G， 5; 115.52(2C) (叔 碳） 归 属 于 12 和 14 ； 129.26(20 (叔碳） 归 属 于 11 和 15 ； 123.22 (1C) 135.63 (1C) (叔碳)归属于 8和 9; 化学位移 δ (ppm) 189.37、 105.96、 195.29、 85.24、 182.69、 99.24 (6C) 归属于 1〜6； 179.06(1C)、 127.27(1C)、 158.34(1C)分别归属于 7、 10、 13。 附图说明

图 1: 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的氢谱

图 2: 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的碳谱

图 3: 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的 COSY谱

图 4: 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的 DEPT135谱

图 5: 式 （I) 的羟基红花黄色素 A钠的 HSQC谱 具体实施方式

实施例 1: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12.5倍药材重量的去离子水， 于 100 Ό提取 20-25分钟， 过 滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次， 过滤。 合并 二次提取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓 加到已处理平衡好的 001*7钠离子交换树脂，柱径高比为 1 : 10，柱体积为 500ml， 流速为 3ml/min， 最后用一倍柱体积水， 将柱子里的提取液排出， 收集含羟基红 花黄色素 A钠的流出液， 缓缓加到大孔吸附树脂 （型号 HZ801 ) 分离柱中， 柱径 高比为 1： 12， 上样流速为每分钟 10ml。上样结束后， 用常温的去离子水以每分 钟 20ml的流速洗脱。 洗脱液于 60°C减压浓缩， 得羟基红花黄色素 A钠粗品浓缩 液。 以红花计每公斤红花得浓缩液 100ml。 羟基红花黄色素 A钠粗品浓缩液上 葡聚糖凝胶 LH-20柱， 柱的径高比为 1 : 5， 上样量为柱床体积的 10%， 以纯化 水为洗脱剂， 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含羟基红花黄色素 A钠部分。 收集液 经 60°C减压浓缩后， 得羟基红花黄色素 A钠精品浓缩液， 以红花计， 每公斤红 花得浓缩液 35~50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花� �色素 A钠精品粉末， 纯度为 98. 6%, 收率按红花计为 0. 45%左右。

将上述制得的羟基红花黄色素 A钠精品， 溶解于注射用水， 经采用 0. 22Hm 的微孔滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后， 得到羟基红花黄色素 A钠冻干粉针。 实施例 2: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12. 5倍药材重量的去离子水， 于 100 °C提取 20-25分钟， 过 滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次， 过滤。 合并 二次提取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓 加到大孔吸附树脂 （型号 HZ801 ) 分离柱中， 柱径高比为 1： 12， 上样流速为每 分钟 10ml。 上样结束后， 用常温的去离子水以每分钟 20ml的流速洗脱。 洗脱液 于 6(TC减压浓缩， 得红花黄色素浓縮液。 以红花计每公斤红花得浓缩液 100ml。 红花黄色素粗品浓缩液上葡聚糖凝胶 LH-20柱， 柱的径高比为 1： 5， 上样量为 柱床体积的 10%， 以纯化水为洗脱剂， 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含红花黄色 素部分。 收集液经 60°C减压浓缩后， 得红花黄色素浓缩液， 以红花计， 每公斤 红花得浓缩液 35〜50ml， 经冷冻干燥， 即得淡黄色的红花黄色素粉末， 纯度约为 90%。 红花黄色素粉末加水溶解后用 HC1酸化， 放置冷处 2 24小时析出固体。 固体过滤后加水再用 0. lmol/ iOmol/L的氢氧化钠溶液调 pH至 6. 0左右，经冷 冻干燥即得淡黄色的羟基红花黄色素 A钠精品， 纯度为 99. 2%， 收率按红花计为 0. 70%左右。

经鉴定， 所得到的羟基红花黄色素 A 钠结构如式 （I ) 所示。

将上述制得的羟基红花黄色素 A钠精品，溶解于注射用水， 经采用截留分子 量 8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中， 冷冻干燥后， 得到羟基红花 黄色素 A钠冻干粉针。 实施例 3: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12. 5倍药材重量的去离子水， 于 100 °C提取 20-25分钟， 过 滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次， 过滤。 合并 二次提取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓 加到已处理平衡好的大孔 HB- 8钠离子交换树脂， 柱径高比为 1 : 10， 柱体积为 500ml , 流速为 3ml/min， 收集流出液， 缓缓加到大孔吸附树脂（型号 HZ801 )分 离柱中， 柱径高比为 1： 12， 上样流速为每分钟 10ml。 上样结束后， 用常温的去 离子水以每分钟 20ml的流速洗脱。 洗脱液于 60Ό减压浓缩， 得羟基红花黄色素 A钠粗品浓缩液。 以红花计，每公斤红花得浓缩液 100ml。 羟基红花黄色素 A钠 粗品浓缩液上葡聚糖凝胶 LH-20柱， 柱的径高比为 1： 5， 上样量为柱床体积的 10% , 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含羟基红花黄色素 A钠部分。 收集液经 60°C 减压浓缩后， 得羟基红花黄色素 A钠精品浓缩液， 以红花计， 每公斤红花得浓缩 液 35〜50ml， 经冷冻干燥， 即得淡黄色的羟基红花黄色素 A 钠精品粉， 纯度为 98. 7%, 收率按红花计为 0. 50%左右。

经鉴定， 所得到的羟基红花黄色素 A钠结构如式 （I ) 所示。 实施例 4: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12. 5倍药材重量的去离子水， 于 100 Ό提取 20-25分钟， 过滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次，过滤。合并二次提 取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓加到大 孔吸附树脂（型号 HZ801 )分离柱中，柱径高比为 1： 12，上样流速为每分钟 10ml。 上样结束后， 用常温的去离子水以每分钟 20ml的流速洗脱。洗脱液于 6(TC减压浓 缩， 得红花黄色素粗品浓缩液。 以红花计每公斤红花得浓缩液 100ml。 红花黄色 素粗品浓缩液上葡聚糖凝胶 LH-20柱， 柱的径高比为 1： 5， 上样量为柱床体积的 10% , 以纯化水为洗脱剂， 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含红花黄色素部分。 收 集液经 60°C减压浓缩后， 得红花黄色素浓缩液， 以红花计， 每公斤红花得浓缩液 35~50ml , 经冷冻干燥， 即得淡黄色的红花黄色素粉末， 纯度约为 90%。 红花黄色 素粉末加水溶解后用 HC1酸化，放置冷处 2 24小时析出固体。固体过滤后加水再 用 0. lmol/lTlOmol/L的碳酸钠溶液调 pH至 6. 0左右， 经冷冻干燥即得淡黄色的羟 基红花黄色素 A钠精品， 纯度为 99. 1%， 收率按红花计为 0. 75%左右。

经鉴定， 所得到的羟基红花黄色素 A钠结构如式 （I ) 所示。 实施例 5: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12. 5倍药材重量的去离子水， 于 100 °C提取 20-25分钟， 过滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次， 过滤。合并二次提 取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓加到大 孔吸附树脂（型号 HZ801 )分离柱中，柱径高比为 1： 12，上样流速为每分钟 10ml。 上样结束后，用常温的去离子水以每分钟 20ml的流速洗脱。洗脱液于 60°C减压浓 缩， 得红花黄色素粗品浓缩液。 以红花计每公斤红花得浓缩液 100ml。 红花黄色 素粗品浓缩液上葡聚糖凝胶 LH-20柱， 柱的径高比为 1： 5， 上样量为柱床体积的 10% , 以纯化水为洗脱剂， 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含红花黄色素部分。 收 集液经 60°C减压浓缩后， 得红花黄色素浓缩液， 以红花计， 每公斤红花得浓缩液 35^50ml , 经冷冻干燥， 即得淡黄色的红花黄色素粉末， 纯度约为 90%。 红花黄色 素粉末加水溶解后用 HC1酸化，放置冷处 2 24小时析出固体。固体过滤后加水再 用. lmol/L〜10mol/L的碳酸氢钠溶液调 pH至 6. 0左右，经冷冻干燥即得淡黄色的羟 基红花黄色素 A钠精品， 纯度为 99. 3%， 收率按红花计为 0. 69%左右。

经鉴定， 所得到的羟基红花黄色素 A钠结构如式 （I ) 所示。 实施例 6: 羟基红花黄色素 A钠

称取红花， 加 12. 5倍药材重量的去离子水， 于 100 Ό提取 20-25分钟， 过滤， 滤渣加 10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提� ��一次，过滤。合并二次提 取液， 冷却至室温， 用离心机离心后， 取离心液备用。 将上述离心液缓缓加到大 孔吸附树脂（型号 HZ801 )分离柱中，柱径高比为 1： 12，上样流速为每分钟 10ml。 上样结束后，用常温的去离子水以每分钟 20ml的流速洗脱。洗脱液于 60°C减压浓 缩， 得红花黄色素粗品浓缩液。 以红花计每公斤红花得浓缩液 100ml。 红花黄色 素粗品浓缩液上葡聚糖凝胶 LH- 20柱， 柱的径高比为 1： 5， 上样量为柱床体积的 10% , 以纯化水为洗脱剂， 洗脱流速为每分钟 5ml， 收集含红花黄色素部分。 将 收集液加入平衡好的强酸性 H型阳离子交换树脂， 收集流出液。 收集液经 60Ό减 压浓缩后， 得羟基红花黄色素 A浓缩液， 放置冷处 2 24小时析出固体。 固体过滤 后加水再用 0. lm _O l/L〜10m _O l/L的氢氧化钠溶液调 pH至 6. 0左右， 经冷冻干燥即得 淡黄色的羟基红花黄色素 A钠精品， 纯度为 99. 8%， 收率按红花计为 0. 68%左右。

经鉴定， 所得到的羟基红花黄色素 A钠结构如式 （I ) 所示。