OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con Ia utilización de un nuevo soporte para síntesis en fase sólida, inmovilización de moléculas orgánicas y bio-orgánicas y, Ia posibilidad de utilizarlo en Ia fabricación de arrays (matrices) y microarrays (micromatrices). Más particularmente, Ia presente invención se refiere a polímeros de poliimida como soporte sólido, preferentemente polímeros de poliimida aromática obtenidos por Ia condensación de dianhidridos con diaminas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En las dos últimas décadas Ia biotecnología ha experimentado notables avances en el desarrollo de nuevas tecnologías para aplicaciones médicas y biológicas. En este campo, el esfuerzo por obtener mejores dispositivos de investigación ha aumentado el interés por las aplicaciones de los "arrays" (matrices) y "microarrays" (micromatrices). Los "arrays" y "microarrays" son dispositivos con una alta densidad de biopolímeros (por ejemplo oligonucleótidos, proteínas, péptidos, oligosacáridos y otras pequeñas moléculas orgánicas. Algunas aplicaciones específicas de estos dispositivos son el análisis de mezclas complejas de moléculas, interacciones proteína- proteína, proteína-ADN, investigación toxicológica, descubrimiento de fármacos, etc. El trabajo con "arrays" y microarrays" requiere Ia combinación de muchos componentes. Algunos de los aspectos críticos son el soporte sólido y Ia forma de inmovilizar las biomoléculas sobre dicho soporte. Hay dos vías fundamentales para Ia inmovilización de biomoléculas sobre soportes sólidos: a) el compuesto puede ser sintetizado "in situ" sobre Ia superficie del soporte sólido (utilizando técnicas de síntesis en fase sólida) o b) sintetizar el compuesto fuera del soporte sólido y unirlo posteriormente. Cada metodología requiere soportes sólidos con propiedades diferentes, pero, en general, el soporte sólido debe mostrar un equilibrio entre una buena estabilidad bajo condiciones extremadamente desfavorables y una moderada activación superficial para pegar Ia molécula deseada o sus precursores. La inmovilización de ADN en soportes sólidos está siendo un tema muy importante en el desarrollo de sistemas de ADN. Hay muy pocos ejemplos de fabricación de arrays en superficies de plásticos. En general, Ia mayoría de los trabajos de unión de ADN en este tipo de superficies se han realizado en el formato de placas de microvaloración de 96 pocilios. En estos estudios se ha descrito Ia inmovilización de ADN por adsorción pasiva, por radiación de luz UV, por formación de enlaces covalentes con moléculas adsorbidas previamente en Ia superficie del plástico o por uniones covalentes a través de las bases nitrogenadas modificadas. Otra aproximación es modificar el soporte sólido introduciendo grupos funcionales o un conector. Existen numerosos ejemplos en los que se une el ADN de forma covalente a soportes de poliestireno modificado con grupos funcionales reactivos como hidroxilos, carboxilos, aminas, aldehidos, hidrazina, epóxidos, maleimidas, tioles, etc (U.S. Pat. No 5,474,895). Sin embargo, aunque estos soportes tienen una elevada capacidad de carga, presentan altos niveles de adsorción inespecífica de los oligonucleótidos. Más recientemente, se ha descrito Ia unión covalente de moléculas de ADN modificado a soportes de polipropileno activado superficialmente con grupos amino (U.S. Pat. N0 6,013,789), y a un polímero hidrofóbico especialmente diseñado para ello (U.S. Pat. N0 6,403,368). El material más utilizado para Ia fabricación de microarrays mediante síntesis in situ de oligonucleótidos es el "vidrio de poro controlado" (Controlled Pore Glass, CPG. U.S. Pat. N0 4,458,066). Sin embargo este material inorgánico presenta algunos problemas, entre los que se puede destacar su baja , capacidad de unión de oligonucleótidos y Ia posibilidad de obtención de falsos rendimientos de acoplamiento. Se hace necesario por tanto, Ia búsqueda de nuevos materiales, fundamentalmente de naturaleza orgánica. Entre ellos se puede destacar el polipropileno activado con grupos amino desarrollado por Beckman tanto para Ia unión covalente de oligonucleótidos como para su síntesis in situ (U.S. Pat. N0 5,554,501 ). Otro de los aspectos que hay que tener en cuenta en el desarrollo de nuevos soportes sólidos que se pueden utilizar en Ia fabricación de microarrays, es el método de detección de los procesos que se quieren medir en cada caso. Una de las metodologías más extendidas se basa en Ia medición de Ia fluorescencia sobre el propio microarray. En general, los ensayos basados en Ia detección de fluorescencia tienen muchas ventajas frente a otras técnicas, gran sensibilidad y especificidad, posibilidad de detectar simultáneamente varias respuestas, seguridad, simplificación de Ia instrumentación, etc. Uno de los factores que afectan a Ia sensibilidad de Ia detección de Ia señal fluorescente es el ruido de fondo de Ia superficie sobre Ia que se está realizando Ia detección, por Io que es necesario validar las propiedades ópticas del soporte sólido utilizado. Recientemente se ha descrito Ia utilización de medidas de conductividad en microarrays electroquímicos para Ia detección de interacciones entre biomoléculas y/o moléculas orgánicas (WO 0121635). La ventaja fundamental de este tipo de técnica es que evita el mareaje de las muestras sin afectar a Ia sensibilidad del proceso. Sin embargo, es necesario que el soporte sólido presente ciertas propiedades conductoras. Se hace necesario por Io tanto, el desarrollo de nuevos soportes sólidos que combinen todas las propiedades necesarias para Ia fabricación de microarrays que se adapten a los continuos avances que tienen lugar en el campo de Ia biotecnología. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El objeto de Ia presente invención es un soporte sólido para Ia unión y/o síntesis química en fase sólida que incluye una poliimida capaz de reaccionar con compuestos orgánicos que contengan grupos nucleófilos en su estructura bajo condiciones aptas para Ia formación de un enlace covalente entre ambos. La poliimida incluye sustancias dopantes que modifican sus propiedades mecánicas, ópticas, en particular disminuir Ia emisión de fluorescencia, su conductividad eléctrica o su conductividad térmica. Cuando Ia sustancia dopante es grafito, carbono o sus derivados y Ia emisión de fluorescencia disminuye entre un 78% y un 95 % respecto a Ia poliimida sin dopar. La poliimida se forma mediante condensación de anhídridos de ácido carboxílico bifuncionales con diaminas aromáticas primarias seleccionándose los anhídridos entre los siguientes: anhídrido maleico, anhídrido piromelítico, anhídrido trimelítico, dianhidrido 2,3,6,7-naftalen tetracarboxílico, dianhidrido 1 ,2,5,6-napftalen tetracarboxílico, dianhidrido 2,2',3,3'-bifenil tetracarboxílico, dianhidrido 3,3',4,4'-bifenil tetracarboxílico, dianhidrido bis(2,3-dicarboxifenil) metano, dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil) metano, dianhidrido 1 ,1-bis(2,3-dicarboxifenil) etano, dianhidrido 1 ,1-bis(3,4- dicarboxifenil) etano, dianhidrido 2,2-bis(3,4-dicarboxifenil) propano, dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil) propano, dianhidrido 3,4,9,10-perilen tetracarboxílico, dianhidrido 4,4'-oxidiftalico, dianhidrido 3,3',4,4'- benzofenona tetracarboxílico, dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil) sulfona y similares. Las aminas aromáticas se seleccionan entre las siguientes: o- diaminobenceno, m-diaminobenceno, p-diaminobenceno, tolueno diamino, 1 ,5-diamino naftalene, benzidina, 3,3'-dicloro benzidina, metilendianilina, 2,2- bis(4-aminofenil) propano, oxidianilina, 4,4'-diamino difenil sulfuro, 3,3'- diamino difenil sulfona, 4,4'-diamino difenil sulfona, 4,4'-diamino difenil N- metil amina, 4,4'-diamino difenil N-fenil amina, 4,4'-diamino difenil silano, 4,4'-diamino difenil dietilsilano, óxido de 4,4'-diamino difenil etil fosfina y similares. Particularmente preferida es Ia poliimida formada mediante condensación de anhídrido piromelítico (PMDA) y oxidianilina (ODA). La poliimida puede adoptar geometría diversa tal como películas, membranas, filamentos, capilares, canales, partículas, placas de microvaloración, espumas, hilos, mallas, tamices, hojas, varillas o manguitos. Constituye otro objeto de Ia presente invención un procedimiento de utilización del soporte sólido que incluye una poliimida que incluye las siguientes etapas: - poner en contacto Ia superficie del soporte sólido que tiene grupos imida reactivos con una disolución de un compuesto orgánico que tiene un grupo nucleófilo en su estructura bajo condiciones aptas para Ia formación de un enlace covalente entre ambos. - llevar a cabo el análisis objetivo de los compuestos unidos covalentemente al soporte sólido. Alternativamente, el compuesto orgánico unido covalentemente al soporte sólido constituye un producto de partida para procesos de síntesis química que dan lugar al compuesto final unido covalentemente a dicho soporte sólido. El enlace covalente se produce entre los grupos nucleófilos del compuesto orgánico que se va a unir y los carbonos carbonílicos del grupo ¡mida de Ia superficie del soporte sólido. La formación de dicho enlace covalente entre el grupo nucleófilo del compuesto orgánico y Ia superficie del soporte sólido da lugar a Ia apertura del grupo imida generando enlaces amida repartidos homogéneamente a Io largo de Ia superficie del soporte sólido. El grupo nucleófilo del compuesto orgánico tiene un par de electrones libres que son compartidos para formar un nuevo enlace y se selecciona preferentemente entre aminas, alcoholes, tioles, derivados de P, éteres y tío- éteres. La disolución del compuesto orgánico puede ser neutra o básica, en disolventes orgánicos o agua. Cuando las disoluciones son básicas incluyen bases orgánicas o inorgánicas, seleccionándose Ia base orgánica del grupo de aminas alifáticas terciarias. Cuando Ia base es inorgánica se selecciona del grupo de los carbonatos. Cuando el disolvente es orgánico se selecciona de entre DMF, NMP, CH3CN y MeOH. Opcionalmente, los compuestos orgánicos incluyen polímeros de interés biológico (biopolímeros), los productos de partida necesarios para Ia síntesis de esos biopolímeros, y pequeñas moléculas que se pueden utilizar como espaciadores y/o conectores tanto para los biopolímeros como para los productos de partida para realizar Ia síntesis en fase sólida. Los biopolímeros incluyen péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, PNAs, LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los mismos y están modificados con un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos ¡mida de Ia superficie del soporte sólido. Alternativamente, los biopolímeros están modificados con un espaciador y/o conector que contiene un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos ¡mida de Ia superficie del soporte sólido o son los propios biopolímeros los que están modificados con un grupo capaz de formar un enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o conector unido al soporte sólido. Los posibles productos de partida para Ia síntesis de biopolímeros incluyen aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, monosacáridos y los monómeros y sus derivados que se utilizan en Ia síntesis de dichos biopolímeros. Dichos productos de partida están modificados con un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos imida de Ia superficie del soporte sólido o bien con un espaciador y/o conector que contiene un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos imida de Ia superficie del soporte sólido. Alternativamente, los productos de partida están modificados con un grupo capaz de formar un enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o conector unido al soporte sólido. En este caso, los espaciadores y/o conectores incluyen moléculas orgánicas con un grupo nucleófilo que reacciona con Ia poliimida y otro grupo reactivo donde se une covalentemente el biopolímero o su producto de partida. Por útimo, también pueden los biopolímeros y sus productos de partida estar modificados con un espaciador y/o conector que contenga un grupo capaz de formar un enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o conector unido al soporte sólido. El proceso de síntesis química que se lleva a cabo sobre los productos de partida incluye las reacciones químicas específicas para Ia obtención del compuesto orgánico de interés y particularmente las reacciones químicas habituales en Ia síntesis de oligonucleótidos. Dicho proceso de síntesis química incluye uno o varios ciclos que constan de: - desprotección de Ia posición sobre Ia que se va a elongar Ia cadena. - acoplamiento del monómero concreto en cada momento. - inactivación de las posiciones libres que no han reaccionado. - oxidación a fosfato.

Opcionalmente se lleva a cabo tras los ciclos de elongación de Ia cadena Ia desprotección de las bases y/o Ia separación del soporte sólido. Sobre el soporte sólido de poliimida con biomoléculas unidas covalentemente se realizan experimentos de interacción entre los compuestos unidos y otras biomoléculas y/o compuestos orgánicos. Dichas interacciones se pueden medir por fluorescencia, radioactividad o cualquier otro método utilizado habitualmente. Los soportes sólidos pueden utilizarse para Ia preparación de matrices ("arrays") y micromatrices ("microarrays") de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, y cualquier tipo de librerías de compuestos químicos ordenados. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un soporte sólido formado por un polímero que contiene al menos un grupo funcional imida capaz de reaccionar con compuestos orgánicos que contengan grupos nucleófilos en su estructura bajo condiciones aptas para Ia formación de un enlace covalente entre ambos. Dicho polímero incluye sustancias dopantes que modifican sus propiedades mecánicas, ópticas, su conductividad eléctrica o su conductividad térmica y se forma mediante condensación de anhídridos de ácido carboxílico bifuncionales con diaminas aromáticas primarias. Además el polímero de Ia presente invención podría estar dopado con diferentes sustancias que modificasen alguna de sus propiedades químico- físicas. Entre estas sustancias se encuentran el carbono, Ia alúmina, mezcla de ambas, derivados de plata, oro o estaño, titanato de bario o cualquier otra sustancia que modificase las propiedades ópticas, mecánicas, Ia conductividad térmica o electrónica, etc. La geometría que pueden adoptar dichos soportes es diversa: películas, membranas, filamentos, capilares, canales, partículas, placas de microvaloración, espumas, hilos, mallas, tamices, hojas, varillas, manguitos, etc. La metodología de Ia presente invención aprovecha Ia reactividad química de los grupos funcionales imida que contiene el polímero con un nucleófilo. Este tipo de reacciones da lugar a Ia formación de un enlace covalente entre el soporte sólido de poliimida y Ia molécula que contiene el grupo nucleófilo. La formación del nuevo enlace provoca Ia apertura del grupo imida generando enlaces amida en el soporte sólido. Los enlaces amida se sitúan a Io largo de Ia superficie del polímero. Los grupos nucleófilos reactivos pueden ser aminas, tioles, derivados de fósforo, éteres, tioéteres, y otros similares bien conocidos. Constituye igualmente objeto de Ia presente invención el desarrollo de un procedimiento para unir a Ia superficie de poliimida de un soporte sólido cualquier tipo de molécula orgánica que posea funcionalidad química que Ia haga comportarse como nucleófila. Como ejemplos de estas moléculas pueden mencionarse: biopolímeros, monómeros de dichos biopolímeros, moléculas orgánicas que hagan el papel de espaciadores o conectores y en general cualesquiera otras moléculas orgánicas de interés. Una vez unida Ia molécula orgánica al soporte sólido, constituye otro objeto de Ia presente invención Ia utilización del sistema para llevar a cabo síntesis química sobre Ia molécula pegada. En relación con esto, dicha molécula pegada puede ser usada como material de partida para Ia realización de síntesis en fase sólida y/o como conector o espaciador para unir las moléculas orgánicas referidas anteriormente. Este ciclo puede llevarse a cabo todas las veces que se requiera. La presente invención puede aplicarse a Ia inmovilización sobre dichos polímeros de poliimida de ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos como LNAs, PNAs, polipéptidos, oligonucleótidos, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos, y otras macromoléculas. Más concretamente, Ia presente invención tiene como ejemplo de aplicación preferente Ia síntesis in situ de oligonucleótidos. Esta se puede llevar a cabo mediante dos aproximaciones diferentes: - unión directa al soporte sólido de un nucleótido modificado con un grupo nucleófilo terminal. - unión de un espaciador y/o conector con un grupo nucleófilo en uno de los extremos y un grupo reactivo en el otro. El grupo nucleófilo une Ia molécula al soporte sólido y el grupo reactivo se unirá al nucleótido sobre el que se alongará Ia cadena. El nucleótido podrá o no estar modificado para que reaccione con el espaciador y/o conector.

En general y salvo que se indique otra cosa, todos los términos científicos y técnicos que se emplean en este documento tienen el mismo significado que Io que se entiende habitualmente cuando se utilizan en entornos relacionados con Ia química de polímeros, química orgánica, bioquímica y biología molecular. El soporte sólido de poliimida tiene suficiente estabilidad térmica, compatibilidad con solventes y es químicamente inerte frente a un amplio espectro de reactivos. En particular, el polímero de poliimida es estable frente a todas las condiciones de reacción requeridas en los distintos pasos de Ia síntesis de oligonucleótidos. Constituye un objeto de esta invención Ia utilización de polímeros de poliimida como soportes sólidos óptimos para Ia utilización de diversos métodos de detección de resultados. Más concretamente, Ia utilización de poliimidas dopadas con distintas sustancias, que se pueden incluir en Ia síntesis del polímero de forma individual o como mezclas, que les confieran distintas propiedades físico-químicas útiles en el proceso de detección final. Alguna de las propiedades que se pueden optimizar teniendo en cuenta Ia posterior aplicación del sistema del que forma parte el soporte sólido, son: las propiedades ópticas, Ia opacidad del sustrato aumenta Ia sensibilidad en Ia detección de Ia fluorescencia; - Ia conductividad eléctrica, pudiéndose utilizar el soporte en Ia fabricación de microarrays electrónicos, etc. Constituye el último objeto de Ia presente invención el uso de estos soportes sólidos para Ia fabricación de "arrays" y "microarrays" y para sus aplicaciones.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1 El presente ejemplo muestra Ia fluorescencia (ruido de fondo) de 2 polímeros de poliimida medida en un Typhoon 9410 (Amersham Pharmacia Biotech). La tabla I presenta los valores relativos de Ia fluorescencia (ruido de fondo) emitida por kapton® HN (25μm) y kapton® CB (25μm), respecto a Ia fluorescencia emitida por un portaobjetos de vidrio estándar (filas 1 y 2) y relacionándolas entre sí (fila 3). El valor por debajo de 1 de Ia razón entre el kapton® CB (25μm) y el vidrio indica su menor fluorescencia en todas las combinaciones de radiaciones de excitación y emisión usadas. Otras variantes de material como el kapton® HN muestran mayor fluorescencia que el vidrio salvo cuando se usa luz de excitación de 532 nm y se registra Ia luz emitida con un filtro de 526 nm.

Tabla I. λ exc 532 532 532 532 633 λ em 526 555 560 610 670 kapton® HN/ 0.47 1.57 1.44 5.75 8.36 vidrio kapton® CB/ 0.07 0.16 0.32 0.29 0.59 vidrio kapton® CB/ 0.14 0.10 0.22 0.05 0.07 kapton® HN

EJEMPLO 2 Unión de oligonucleótidos 1 El presente ejemplo muestra como se puede inmovilizar covalentemente un oligonucleótido sobre un polímero de poliimida. Para realizar el ejemplo se puede obtener un oligonucleótido sintético de 60 bases modificado en Ia posición 3' con un grupo amino y se marca radiactivamente con 32P. Una lámina de kapton® CB de 25μm (DuPont) a temperatura ambiente, se impregna con una disolución acuosa 0.16 mM del oligonucleótido anterior. Pasadas 5 h se elimina Ia solución de Ia lámina, se lava con agua 5 veces y se mide Ia radiactividad. La unión obtenida es de 31.1 pmol/cm2, Io que corresponde a una densidad de moléculas de 1.87x1013 moléculas/cm2.

EJEMPLO 3 Unión de oligonucleótidos 2 Un oligonucleótido sintético de 60 bases modificado en Ia posición 3' con un grupo amino, se marca radiactivamente con 32P. Se prepara una disolución 0.23 mM del oligonucleótido marcado en tampón carbonato pH 8.5. Con esta disolución se impregna una lámina de kapton® CB de 25μm (DuPont). Pasadas 5 h se elimina Ia solución con el oligonucleótido de Ia lámina, se lava con agua 5 veces y se mide Ia radiactividad como indicación de las moléculas unidas a Ia superficie. La unión obtenida es de 4.9 pmol/cm2, Io que corresponde a una densidad de moléculas de 2.97x1012 moléculas/cm2.

EJEMPLO 4 Unión directa de nuclβótidos modificados 1 El ejemplo siguiente presenta como se puede unir a un sustrato de poliimida oligonucleótidos marcados. Sobre una superficie de kapton® CB de 25μm (DuPont), se hace circular una disolución 0.33 mM de dT-Tamra-Nhb comercial en DMF con un 0.09% DIPEA. Transcurridas 5h se lava Ia lámina con DMF y se mira Ia fluorescencia en un microscopio Leica DMR (modelo DC-350F). Se obtiene una superficie repleta de puntos fluorescentes discretos distribuidos homogéneamente por Ia zona donde se hizo pasar Ia solución del oligonucleótido marcado. Para descartar Ia adsorción se realiza el mismo experimento pero sin añadir DIPEA a Ia disolución. En este caso no se observa nada de fluorescencia en Ia superficie.

EJEMPLO 5 Unión directa de nucleótidos modificados 2 En un primer paso se sintetiza dT-fluoresceína modificada en 3' con un grupo amino a partir de dT-fluoresceína comercial. Sobre una superficie de kapton® CB de 25μm (DuPont), se hace circular una disolución 0.33 mM de dT-fluoresceína-NH2 en DMF con un 0.09% DIPEA. Transcurridas 5h se lava Ia lámina con DMF y se mira Ia fluorescencia en un microscopio Leica DMR (modelo DC-350F). Se obtiene una superficie fluorescente homogénea en Ia zona dónde se hizo pasar Ia solución del oligonucleótido marcado. EJEMPLO 6 Unión de nucleótidos modificados a través de un conector El siguiente ejemplo muestra como Ia unión al sustrato de distintas moléculas puede hacerse a través de un conector intermediario. Más concretamente, como puede unirse un conector a Ia superficie del polímero de poliimida para posteriormente realizar enlaces a las moléculas de interés, como puede ser un oligonucleótido. Las láminas de kapton® HN 125μm (DuPont) se sumergen, con agitación, en una disolución 1OmM de N1N'- dimetil-1 ,6-hexanodiamina en CH3CN. Transcurridas 22h 30 min, Ia superficie se lava con CH3CN, se secan a vacío y se guardan a 40C bajo argón. Sobre el grupo amino introducido en el paso anterior se lleva a cabo Ia reacción de acoplamiento de un nucleótido mediante Ia aproximación del fosforamidito. Una lámina de kapton "activado" según se ha explicado anteriormente, se impregna con una disolución de dT-Tamra (1.4 mM) y 5- etiltio-1 H-tetrazol (9.25 mM) en CH3CN. Transcurridos 30 min se lava Ia superficie con MeOH y CH3CN y se seca a vacío. Se impregna entonces Ia lámina con una disolución 1 M de 4BUOOHZCH3CN con agitación constante. Pasados 15 min, se lava con CH3CN, se seca a vacío y se mira en el microscopio de fluorescencia. Se obtiene una superficie fluorescente homogénea en Ia zona donde se hizo pasar Ia solución del oligonucleótido marcado.

EJEMPLO 7 Síntesis sobre kapton El siguiente ejemplo muestra como puede realizarse un proceso de síntesis, preferentemente de oligonucleótidos sobre el sustrato de poliimida. Las reacciones se llevan a cabo sobre las láminas de kapton® CB de 25 μm de espesor del ejemplo 5, a las que se ha unido a su superficie dT-fluoresceína- NH2 preparada sintéticamente. La lámina se introduce en un sistema fluídico especialmente diseñado para el proyecto. Los reactivos circulan sobre Ia muestra con flujo constante que puede ser diferente en cada paso. Los pasos de reacción se realizan consecutivamente, bajo Argón y separados por etapas de lavado con CH3CN. Las condiciones de reacción de cada paso se indican a continuación: - Desprotección del OH-5: 3% CI2CHCO2HZ(CICH2) 2, 5 min - Acoplamiento: dT-tamra (1.4 mM), 5-etiltio-1 H-tetrazol (9.2 mM) en CH3CN, 20 min - Oxidación: 1 M tBuOOH en CH3CN, 10 min Tras el último lavado, se saca Ia lámina del sistema y se mira Ia fluorescencia en condiciones de excitación y detección específicas para Ia rodamina, que es el fluoróforo introducido en el paso de elongación de Ia cadena. Se obtiene una superficie con puntos fluorescentes discretos distribuidos homogéneamente en Ia zona bañada por los reactivos.

EJEMPLO 8 Hibridación de oligonucleótidos sobre kapton 1 El siguiente ejemplo muestra como puede realizarse un proceso de hibridación y su posterior detección, sobre el sustrato de poliimida. La hibridación se lleva a cabo sobre las láminas de kapton® CB de 25 μm de espesor a las que se ha unido a su superficie un oligonucleótido de 60 bases modificado con un grupo amino. En Ia hibridación se utilizan dos oligonucleótidos diferentes de 40 bases cada uno: el antisense como complementario del oligo previamente unido, y el sense como blanco para detectar Ia adsorción. Ambos oligos están marcados con 32P. La hibridación se realiza en 1 x SSC a 660C durante 14h. La radiactividad se detecta con un phosphoroimager (FUJI FLA-3000) durante 24h con el fin de visualizar los resultados de Ia hibridación. En el experimento que se híbrida con el oligonucleótido complementario se observan altos niveles de radiactividad, mientras que en el que se híbrida con el "sense" se observan niveles de ruido de fondo. EJEMPLO 9 Hibridación de oligonucleótidos sobre kapton 2 El siguiente ejemplo muestra como puede realizarse un proceso de hibridación de oligonucleótidos y su posterior detección con muestras biológicas, sobre el sustrato de poliimida. La hibridación se lleva a cabo sobre dos láminas de kapton® CB de 25 μm de espesor a las que se ha unido a su superficie los oligonucleótidos Gal1-NH2, ACTI-NH2 respectivamente; una tercera lámina de kapton® CB se utiliza como blanco. En Ia hibridación se utilizan dos muestras de ARN provenientes del cultivo de una estirpe silvestre de Saccharomyces cerevisiae en dos medios diferentes, YPD (medio rico con glucosa, el gen GAL1 se encuentra reprimido) e YPGAL (medio rico con galactosa, el gen GAL1 se encuentra activado). Antes de su extracción el ARN se marca radiactivamente tras permeabilizar las células y añadir UTP marcado con 32P en su fosfato α. Cada uno de los fragmentos de kapton se dividió en dos partes iguales, para hibridar una de ellos con Ia muestra proveniente del cultivo crecido en YPD y Ia otra con Ia proveniente de YPGAL. Tras una prehibridación realizada durante 1 h. a 650C en un horno de hibridación rotatorio, se lleva a cabo Ia hibridación con las muestras radiactivas durante 12 h (SSCIx, SDS 0'1 %, tRNA 100μg/ml). La radiactividad se detecta y cuantifica con un phosphororimager FUJI FLA- 3000. Los datos de radiactividad, detraído en nivel de fondo, se muestran en Ia tabla Il y están representados en Ia figura 1.

Tabla Il

Kapto n con GAL1 ACT1 ARN GLUCOSA 1 ,88 170,4 proveniente del cultivo con GALACTOSA 31 ,62 73,27 EJEMPLO 10 Unión de una proteína al kapton El siguiente ejemplo muestra como puede realizarse un proceso de unión de una proteína sobre el sustrato de poliimida. Se prepara una disolución 1 mg/mL de BSA MaxiBind (Abkem Iberia) en tampón borato pH 9.23 (Panreac). Con esta disolución se impregna una lámina de kapton® CB de 25μm (DuPont). Pasadas 15 h a TA se elimina el líquido con Ia proteína, se lava 3 veces con Tween-20 (1%) durante 30 seg y 3 veces con agua durante 30 seg. La detección de Ia unión de Ia proteína a Ia superficie del kapton® CB se realiza de forma indirecta por fluorescencia. Una lámina de Kapton con proteína unida a su superficie obtenida según se ha explicado anteriormente, se sumerge en una disolución de isotiocianato de fluoresceína en tampón borato pH 9.23 (1 mg/mL). Pasados 75 min se elimina Ia disolución sobrante y Ia lámina se lava con tampón borato pH 9.23 y agua. La fluorescencia se mide en un microscopio Leica DMR (modelo DC- 350F), obteniéndose una superficie fluorescente en Ia zona que estuvo en contacto con Ia proteína. Como blanco se utiliza una lámina de kapton® CB de 25μm (DuPont) sometida al mismo proceso de unión del isotiocianato de fluoresceína. En este caso, en el que Ia lámina no ha estado en contacto con Ia proteína, no se observa fluorescencia en el microscopio en las mismas condiciones utilizadas anteriormente.