本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种人羧酸酯酶 1 (CES1 ) 的特异性荧光探针底物及其应用。

背景技术

羧酸酯酶（Carboxylesterase, CES )是机体内重要的一相水解代 谢酶， 其催化酯类化合物发生酯键断裂， 并生成具有极性基团（羟基 或羧基）的两个产物， 后者可进一步被体内 UGTs等其他代谢酶催化 代谢，使其更易排出体外。羧酸酯酶不仅参与 脂肪酸等内源性物质的 代谢， 还是多种外源性物质， 如伊立替康 （CPT-11 )、 奥司他韦 （达 菲）等酯类结构前体药物以及结构中含有酯键 的其他化合物的主要代 谢酶【J Pharmacol Exp Ther. 2006 Dec;319(3): 1477-84. & J Pharmacol Exp Then 2006 Dec;319(3):1467-76.L 许多前体药物都需要经羧戴酯 酶催化途径进行活化或代谢消除。

人体 Λ介导药物代谢釣羧酸靡酶篇前主要有 2个家族」： CES1和 CES2，其中 CES1又可继续被分为 CESlb和 CESlc两种亚 ¾【Mamm &name, 2010 Oct;21(9-10) 427-41, J _e CESl和 CES2具有不同：的组 分布特异性及底物选择性， 肝脏中主要表达 CES1 , 同时表达少量 CES2. 而小肠中则 CES2亚型为主， 只有少量的 分布 llife Sci. 2007, 81(11): 924-932 ]o 近年来有学者研究发现肝癌患者血浆中 的 CES1含量会显著升高 iPr tee ics. 2009 Αι ;9 ):39 ^99， 血 浆中 CES1有望成为 个載床肝癌诊断韵潜在标 物。

本发明提供了一类 2-(2，-羟基 -3，-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT)类 化合物 2，-羟基的酯类街生物及其作为€ES1酶探针底� ��韵应用， 其 经羧酸酯酶 CES1 水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解 产 物。该鶴促反应具有选择性高、代谢产物易检 测、酶活及抑制活性评 价快速省时等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶 1 (CES1 )的特异性荧光 探针底物及其应用，该底物原型和水解产物前 荧光发射波长具有明显 差异， 且产物更易检测。 利用该探针反应可对多种生物体系中 CES1 餅分布和功能进行定量评价。

本发明提供了一种人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物，该底物 前酯键可被€ESi特异性水解为相应水解产物并 显示与底物不伺的发 射波谱；该底物为 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΊ)类化合物 2'-羟基韵酯类衍生物， 其结构通式如式（1 )所示， 其中， R为 -H或 -CH ₃ 、 -CF ₃ 、 -C ₂ H ₅ 、 -C ₃ ¾等垸基或 -OCH ₃ 、 -OC ₂ H ₅ 中的一种，或 -Br、 -Cl -F等 素取代基申的一种。 R基团在苯环的邻、 伺或对位都可 以。

式〈i ) 当 R为 -H时，该底物为 2-(2，-轻基 -3 甲氧苯基)苯并噻唑 (ffldBT) 2'-羟基苯甲酰酯。

本发明还提供了人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物的应用，该 底物作为 CES1的特异性底物， 发生水解反应， 通过定量检测单位时 水解产翁«生成量来測定酶或细胞制备液等生� ��样品及细胞中 CES1的活性； 具体测定方法为：

——体系中以 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻睡 (HMBT)类化合 物 2，-羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；� ��物浓度选择 1/10〜10 K _m ; 单点測定財底物浓度优选 K _m 。

——在 PBS或 Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为 2()°C至 60 °C 之伺， 优选 31TC为最优反应对伺； 孵育体系 pH介手 5. ΪΘ 之伺， 优选 ρΗ7.4为最优反应 ρΗ值；

——反应时伺为 5〜120分钟，在确保以上底物相应的水解产物� � 到定量限且底物转化率不超过 20%对终止反应；

—测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯 酶 CES1活性的 评价指标。

本发明提供的人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物的应用，所述 底物消餘率或水解产教的生成率应介于 D.1%〜2ϋ%之间。

本发明提供的人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物的应用，探针 底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧 光检测器实现产物及底 物的快速灵敏检测； 荧光检测条件为： 激发波长 304 nm， 在 450~560 mn进行荧光发射谱的检测。

本发明提供的人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物的应用，该特 异性探针底物及相应€£Si活性检测过程不会� �生物体系基质及杂癀 的干扰， 可用于各种生物体系中 CES1酶活的定量测定。

本发樹提供 人羧酸酯酶 1的特异性荧光探针底物的应用，该特 异性探针底物及其水解反应还可用于人羧酸酯 酶 CES1抑制剂的快速 筛选及抻制能力韵定量评价。

本发明提供了所述特异性荧光探针底物的应用 ，该特异性探针底 物用于重组羧酸酯酶、 人及动物组织制备液及各类组织细胞中 CES1 酶活的定量测定， 以及利用该探针反应快速筛选 CES1酶的抑制剂。

采用重组羧酸酯酶€- ESi单酶， 肝微粒体孵育体系进行考察， 通 过相关性分析， 特异性抑制实验， 重组单酶代谢反应， 以及酶反应动 力学凡方面韵 i正据， i正明 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)^并噻睡

类化合物 2，-羟基的酯类衍生物可特异性的经羧酸酯酶 CES1代谢 (如 ¾ 5-¾ «所示)， 生成€-2'位酯键断裂的水解产物。进 采用各种 哺乳动物的新鲜提取的肝细胞、 原代培养肝细胞、肝切片， 肝灌流等 代谢淨价体系进行考察， 发现该代谢反应具有非常良好的特异性。

作为高特异性的羧酸酯酶 CES1的荧光探针底物，该化合物可以 用来检测 ¾«W€ES1韵活牲， 尤其适合用于对细菌、 昆虫银胞、 哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的 羧酸酯酶 CES1重组酶 前酶活测定， 以及多种晡乳动物组织器官来源的组织微粒体 、 9等 制备物中 CES1的活性标定。

选用本发明^ 酯酶€ES 1的特异牲探针底物检 機酸酯酶 CES1酶体外活性具有以下突出优势：

(1)高特异性： 2-<2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (H BT)类化合 物 2'-羟基的酯类衍生物可被羧酸酯酶 CES1高特异性地代谢成一个 代谢产籾， 即€-2，位酯键断裂铯水解产物。

(2)廉价易得： 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT)类化合 物 2'-羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学 合成获得， 合成工 艺简单易行。

(3)高灵敏度：具有 HMBT母核结构的化合物均具有良好的荧光 发射光谱特性（430〜650 nm)，该底物及其水解代谢产物具有不同的 荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测， 同时可经比率法通过绘 制标准曲线进行定量测定。 图 1. 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT)类化合物 2，-羟基 錄酷类衍生物前结构通式；

图 2. 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基苯甲酰酯 的 ¹ H- M 谱图；

图 3 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2'-羟基苯甲酰酯 钓 ¹³ 谱懷；

图 4 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基苯甲酰酯 的高分辨质谱；

图 5 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2'-羟基苯甲酰酯 的人重组单酶筛选试 ¾ ^果；

图 6 2-(2，-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基对甲基苯 甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果；

图 7 2-(2，-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基对甲氧基 苯甲酰酯的人重组单悔筛选试验结果；

图 8 2-(2'-羟基 -3，-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基对溴苯甲 酰酯的人重组单酶筛选试验结果；

图 9 2'-羟基苯甲酰酯化取代的 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT)脱苯甲酰代谢产物的荧光发射强度〈在 304 nm进 ff激发）随 羧酸酯酶 CESlb和 CESlc两种亚型蛋白浓度的增大而增加；

握 W脱苯甲酰水解代谢产物的生成量随輕育財间� �化釣线性拟 合.

图 11 ² ，-羟基来甲耥酯化取代的 2-(2，-羟基 -3，-甲氧苯基)^并噻 唑 (HMBT)被 CES1催化水解的代谢通路； m 12 2-(2，-羟基 -3，-甲氧苯基库并 ί*¾Η ΒΤ) 2，-羟基苯甲酰酷 的合成步骤。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制 本发對。

实施例 1. 2-(2，-羟基 -3，-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2，-羟基苯甲酰酯 雌学合成

( 1 ) 向 10 mL含有 0.5 mmol的 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻 睡 和 0.625 mmol三乙胺的西氢块喃溶液申， 缓慢滴加 .6 mmol的苯甲酰氯（溶于 5mL的四氢呋喃中）， 控制温度在 0°C _;

(2 ) 混匀 i h后， 加热反应溶液至室温， 过夜反应（见图 12);

(3 ) 反应液经过减压除去溶剂， 残留的固体采用硅胶色谱法进 行纯化， 采用乙酸乙酯-正己烷（ i: 3 v/v)进行洗脱， 得 H3 mg白色 固体粉末状纯品；

<4)采用高分辨质谱和核磁进行化合物结构的 表征（见图 2-m

4)。

实施倒 2.重组 的人单酶中的选择性

( 1 )预先准备 99 μΐ代谢反应体系，包括 ρΗ 7.4的 PBS缓冲液 ( !O toM).重组表达的人 CESlb (5 ) /Α清 白蛋白 （500 g/ml) /血浆（1%) /丁酰胆碱酯酶（25U/L) /磷酸缓冲 液， 于 37°C条件下震荡预孵 10分钟；

(2 ) 向反应体系中加入 1 μΐ终浓度为 25 μΜ的 2-(2'-羟基 -3'- 甲氧苯基)苯并噻睡 (HMBT) 2'-羟基苯 ¥酰酯 /对甲基苯甲酰酯 /对甲 氧基苯甲酰酯 /对溴苯甲酰酯起始反应；

(3) 30分钟后， 加入 ΙΟΘ μΙ冰乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应；

(4)进行荧光检测 （Ex=304 nm， Em=490 nm); 计算各体系中 荧光强度（见懷 5-图 8);

实施例 3.重组单酶中 CESlb或 CESlc的线性蛋白浓度

( 1 )预先准备 μΐ CES1代谢反应体系， 包括 ρΗ 7.4的 PBS 缓冲液（10 mM)、重组人 CESlb或 lc (0-100 ug/ml)， 于 37°C条件下 震荡预孵 ½分钟；

(2) 向反应体系中加入 1 终浓度为 25 μΜ的 2- (？ Λ羟基 -3'- 甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΤ) 2'-羟基苯甲酰酯起始反应；

(3 ) 30分钟后， 加入 100 μΐ冰乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应； 4 >¾行费光检測 < Ex=304 nm， Em=490 nm )；计算重组人€ES 1% 或 lc酶的线性蛋白浓度（见图 9)。

实施例 4.重组单酶 CESlb或 CESle中的线性孵育財伺

( 1 )预先准备 99 μΐ CES1代谢反应体系， 包括 ρΗ 7.4的 PBS 缓冲液（i0 mM)、重组人 CESib或 ie (5/i0/i5/20ug/mi)， 于 37°C条 件下震荡预孵 10分钟；

(2) 向反应体系中加入 1 μΐ终浓度为 25 μΜ韵 2<2'-羟基 -3'- 甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΤ) 2，-羟基苯甲酰酯起始反应；

(3 )每镉 5分钟进行 次荧光扫描检測 (Ex=304 nm, Em=490 nm); 计算重组人 CESlb或 lc酶的线性反应时间 （见图 10)。 实施例 5.体外定量测定重组单酶中 CESifc或 CESie的酶活

( 1 )预先准备 99 μΐ CES1代谢反应体系， 包括 ρΗ 7.4的 PBS 缓冲液 < 10 mM)、 重组人 CESlb或 ie (2 ug mi)， 于 37°C条件下震 荡预孵 10分钟；

(2)向反应体系中加入 i μΐ终浓度为 25 μΜ的 2-(2'-羟基 -3'- 甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΤ) 2'-羟基苯甲酰酯起始反应；

(3) 30分钟后， 加入 Η)β μ 水乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应；

(4)进行荧光检测（Ex=304 nm, Em=490 nm);计算重组人 CESlb 或 ie酶的最大催化速率为 140i ± 33ϋ nmoi/min/mg和 245i ± 135

实施例 6.体外定量测定人肠微粒钵中 CES1的酶活

( 1 ) 预先准备 99 μΐ人小肠微粒体代谢反应体系， 包括 ρΗ 7.4 的 Tris-HCi缓冲液〈5 mM)、 人小肠微粒体（20 iig/mi)， 于 37°C条 件下震荡预孵 10分钟；

(2) 向反应体系中加入 i μΐ终浓度为 25 μΜ的 2-<2，-羟基 -3，- 甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΤ) 2'-羟基苯甲酰酯起始反应；

(3 ) 30分钟后， 加入 Η)θ μί冰乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应；

(4)进行荧光检测 （Ex=304 nm， Em=490 nm); 计算人小肠中 对该探针化合物的最大催化速率为 442 ± 43靈 Ol/m½ mg。

实施例 7.定量测定人肺腺癌 A549细胞中 CES1的活性

( i )人肺腺癌 A549细胞系培养于盖玻片上， 采用的培养基是 DMEM培养基（含 10%小牛血清）以及 100 ug/ml的双抗， 培养环境 为 37°C的 5%二氧化碳培养箱 。

(2)使用之前， 贴壁细胞采用不含血清的 DMEM培养基冲洗 3 次，加入终浓度为 IO uM的 2-(2'-羟基 -3'-甲氧苯基)苯并噻唑 (HMBT) 2'-羟基苯甲酰酯， 于 37°C温孵 30分钟。

3)之后， 采用 PBS缓冲液沖洗 3次。 在激光共聚焦显徼镜下 观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细 胞中 CES1的分布及其 相对含量多少。

实施例 8.定量测定人血中 CES1含量

( 1 ) 向 3SO μΐ的经 PBS稀释的 1ϋ%ϊΕ常人血菜中加入 CESlc 重组表达单酶（100 g/mL) 20 μΐ, 于 37°C条件下震荡预孵 10分钟；

(2)向反应体系中加入 1 μΐ终浓度为 25 μΜ的 2-<2'-羟基 -3'- 甲氧苯基)苯并噻唑 (ΗΜΒΤ) 2'-羟基苯甲酰酯起始反应；

(3 ) 3ϋ分钟后， 加入 400 μί冰乙腈， 剧烈震荡后， 终 Α反应；

(4 ) 进行荧光检测 （Ex=304 ran, Em=490 ran); 计算信噪比 S/N>W, 血浆中 CESi的定量限为 5 tg/mL。

实施例 9.体外快速筛选 CES1的抑制剂

( 1 ) CESife CESle重组表达单德（5 pg mL) ίΜ≠, 于 37t条 件下震荡预孵 10分钟；

(2)向反应体系中加入 2 μΐ中药 95%乙醇提取液， 继续孵育 ½ 分钟；

<3)加入 2pi的终浓度为 1ύ μΜ前 2-(2，-羟基 -3，-甲氧苯基) ¾并 噻唑 (ΗΜΒΤ) 2，-羟基苯甲酰酯起始反应； (3) 30分钟后， 加入 200 μϊ冰乙腈， 剧烈震荡后， 终 it反应；

(4)进行荧光检测（Ex=304 nm， Em=490 nm); 计算荧光强度， 根据中药提取液组 490 mi下的荧光强度与 组的荧光强度比值 计算 CES1的抑制强度。