La présente invention concerne le traitement du myélome multiple. Le myélome multiple (MM) est un cancer hématologique (ou hémopathie maligne) dans lequel des plasmocytes clonaux (cellules de myélome) s'accumulent dans la moelle osseuse.

Les plasmocytes sont des cellules du système immunitaire dérivées de la moelle osseuse (MO) qui produisent des anticorps dans le but de protéger l'organisme contre des attaques extérieures (bactéries, virus). Pendant le développement, des anomalies génétiques (délétion, translocation chromosomique) peuvent survenir, transformant ainsi des plasmocytes sains en plasmocytes malins autrement nommés cellules de myélome multiple. A l'état normal, ces plasmocytes circulent dans le sang alors que dans la pathologie elles reviennent dans la moelle osseuse où elles causent des dommages à plusieurs niveaux.

Dans la mesure où de nombreux organes peuvent être affectés par le myélome multiple, les caractéristiques et signes de cette maladie sont variables. Les conséquences les plus fréquentes incluent des lésions osseuses dévastatrices, des niveaux de calcium élevés, une insuffisance rénale, une anémie et des capacités immunitaires altérées. Les lésions ostéolytiques affectent 80% des patients atteints de MM et demeurent une cause majeure de morbidité et de mortalité. Les dommages osseux causés chez les patients représentent les principaux problèmes sur le long terme. Ces lésions osseuses sont causées par plusieurs facteurs : i) une sécrétion importante de facteurs de différentiation (IL-3, ΜΙΡ-1 α, MIP-1 β, RANKL) permettant la transformation des monocytes en ostéoclastes qui sont les cellules responsables de la dégradation osseuse et ii) une inhibition par les plasmocytes MM (par des facteurs solubles tels que DKK1 ou TNFa) de la différentiation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes responsables de la synthèse osseuse. La destruction osseuse entraine également une augmentation du niveau de calcium dans la circulation sanguine, appelée hypercalcémie. De plus, étant donné la prolifération et l'encombrement des cellules de myélome dans la moelle osseuse, la production de cellules normales sanguines à partir du tissu hématopoïétique est également altérée. De ce fait, deux conséquences sont générées, une diminution du nombre de globules blancs (ou leucocytes, responsables de l'immunité) pouvant augmenter le risque infectieux, ainsi qu'une production réduite de globules rouges pouvant entraîner une anémie. De plus, l'excès de protéines M et de protéines de chaîne légère constituant les anticorps, produites par les cellules de myélome épaissit le sang entraînant thrombus et autres problèmes de circulation. Ces protéines peuvent également endommager les reins et affecter leur bon fonctionnement.

Le myélome multiple est le second cancer du sang le plus prévalent après le lymphome non-Hodgkinien. Il représente environ 1 % de tous les cancers, 10% des hémopathies malignes et 2% de toutes les morts dues au cancer.

Le MM est aussi caractérisé par une phase prémyélomateuse et asymptomatique désignée MGUS pour gammapathie monoclonale de signification indéterminée. Le MGUS est la plus fréquente maladie à plasmocytes clonaux et se transforme en MM avec une incidence de 1 % par an. Malgré de récentes et nombreuses avancées sur les thérapies dans la pathologie, le MM reste une maladie incurable (pas de rémission complète et durable) à ce jour avec une médiane de survie allant de quelques mois à plusieurs années (5 ans en moyenne).

Il existe donc un besoin important de nouveaux traitements contre le myélome multiple.

La présente invention vise à répondre à ce besoin.

Il est bien établi que la MO et ses constituants sont requis pour la différenciation, la maintenance, l'expansion et la résistance aux drogues des clones de plasmocytes tumoraux. Le microenvironnement de la MO est un réseau complexe de cellules hétérogènes qui inclut des ostéoclastes, cellules lymphoïdes, cellules endothéliales, cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et leur progéniture (ostéoblastes et adipocytes). Dans le MM, la balance entre les compartiments cellulaires et extracellulaires au sein de la MO est profondément perturbée. Au vue de la littérature, il est clairement établi que les CSM jouent un rôle prépondérant dans la mise en place et l'évolution de la physiopathologie. En effet, les CSM supportent la croissance des plasmocytes myélomateux en produisant de hauts niveaux d'interleukin-6 (IL-6), une cytokine majeure pour la prolifération et la survie des plasmocytes malins. Ces CSMs jouent également un rôle dans la chimiorésistance des plasmocytes MM en leur conférant des niches ou zones privilégiées protectrices contre les agents chimiothérapeutiques couramment utilisés. Les présents inventeurs ont précédemment montré que ces cellules médullaires, présentes dans le microenvironnement tumoral, présentaient des anomalies chez les patients atteints de MM, telles qu'une surexpression d'IL6 ou de GDF15 Corre et al. (2007) Leukemia 21 :1079-1088).

Toutefois, aucun médicament visant spécifiquement le microenvironnement et en particulier les CSMs de la moelle osseuse chez les patients MM n'existe à ce jour.

Les présents inventeurs ont montré de manière surprenante que la protéine TLR4

(toll-like receptor 4) récepteur de danger reconnaissant des motifs étrangers (bactériens, viraux) ou endogènes (protéines chaperones) était surexprimée dans les CSMs de patients souffrant de MM. L'activation de ce récepteur dans les CSMs par ses ligands exogènes (tels que le lipopolysaccharide, LPS) ou endogènes (tels que la protéine chaperone Heat shock protein 70, Hsp70) entraine une augmentation de l'expression de la protéine d'adhérence CD54 (responsable de l'interaction avec les plasmocytes MM) et de l'interleukine 6 (responsable de la survie et prolifération des plasmocytes MM). Après avoir mis en évidence que l'activation du TLR4 était plus forte dans les CSMs de patients MM, les inventeurs ont utilisé un antagoniste spécifique de TLR4, le composé C34, afin d'étudier l'impact sur le comportement des CSM MM. Les inventeurs ont ainsi montré qu'il était possible d'altérer la capacité de support de croissance des CSMs envers les cellules de myélome avec cet inhibiteur.

Ainsi, les inventeurs montrent ici qu'il est possible d'inhiber la croissance des cellules de myélome en agissant seulement sur les CSMs, plus particulièrement sur le fait que ces CSMs surexpriment TLR4, indépendamment de l'éventuelle expression de cette protéine par les cellules de myélome.

Par ailleurs, les inventeurs ont montré qu'une variabilité d'expression de TLR4 par les CSMs était observable parmi les patients souffrant de MM.

Par conséquent, l'utilisation d'antagonistes spécifiques de TLR4 pour altérer la capacité de support de croissance des CSMs envers les cellules de myélome est particulièrement utile pour traiter des sous-groupes de patients présentant une surexpression plus importante de TLR4 par les CSMs. De plus, cette utilisation visant uniquement les CSMs et non les plasmocytes malins, est particulièrement pertinente pour les patients dont les cellules de myélome ne surexpriment pas TLR4. Seulement un tiers des plasmocytes malins chez les patients expriment en effet le TLR4.

La présente invention concerne donc un antagoniste spécifique de TLR4 destiné à être utilisé dans le traitement du myélome multiple chez un sujet souffrant de cette pathologie. Les présents inventeurs ont par ailleurs montré de manière surprenante que l'antagoniste de TLR4 agissait de manière synergique avec le melphalan et le lenalidomide, deux agents chimiothérapeutiques couramment administrés chez les patients MM et agissant directement sur les plasmocytes MM.

La présente invention concerne donc également une combinaison pharmaceutique antitumorale comprenant (i) un antagoniste spécifique de TLR4, ciblant typiquement les CSMs du microenvironnement médullaire, et (ii) un agent chimiothérapeutique, ciblant typiquement les plasmocytes MM, destinée à être utilisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement du myélome multiple.

Elle a également pour objet un antagoniste spécifique de TLR4 destiné à être utilisé en combinaison avec un agent chimiothérapeutique dans le traitement du myélome multiple.

Elle concerne également un agent chimiothérapeutique destiné à être utilisé en combinaison avec un antagoniste spécifique de TLR4 dans le traitement du myélome multiple. Description détaillée de l'invention

Myélome multiple

Par "myélome multiple", on entend ici un cancer des plasmocytes. Il peut être asymptomatique ou symptomatique.

Les patients asymptomatiques ne montrent pas de troubles ou symptômes associés au myélome multiple dans leurs tissus ou organes. Les troubles de tissus ou d'organes associés au MM incluent l'hypercalcémie, une fonction rénale altérée, une anémie et des lésions osseuses dévastatrices. Le myélome asymptomatique est une phase prémyelomateuse qui inclut le myélome multiple couvant (MGUS) et le myélome multiple indolent (smoldering myeloma ou stade I du myélome multiple). Le MGUS pour gammapathie monoclonale de signification indéterminée (lg<30g/l et <10% de plasmocytes dans la MO) est la plus fréquente maladie à plasmocytes clonaux et se transforme en MM avec une incidence de 1 % par an. Le myélome multiple indolent (smoldering myeloma ou stade I du myélome multiple) correspond à lg>30g/l et >10% de plasmocytes dans la MO ainsi qu'une concentration de microglobuline β ₂ dans le sang strictement inférieure à 3,5 mg/dl et une concentration d'albumine dans le sang strictement supérieure à 3,5 g/dl. Le myélome multiple indolent se transforme en MM avec une incidence de 10% par an.

De préférence, le sujet traité dans le cadre de l'invention est un sujet souffrant de myélome multiple symptomatique.

Les patients souffrant de myélome multiple peuvent aussi être caractérisés par le statut de leur maladie. Le statut de la maladie peut être déterminé sur la base du fait que les patients ont déjà reçu ou non un traitement, et, si c'est le cas, l'effet de ce traitement. Les patients ayant suivi une thérapie peuvent être divisés en plusieurs catégories :

- Maladie répondante : le myélome répond au traitement et on observe une diminution de protéine M d'au moins 50%. - Maladie stable: le myélome n'a pas répondu au traitement (i.e. la diminution de protéine M n'a pas atteint 50%) mais n'a pas empiré.

- Maladie en progression : le myélome est actif et a empiré (i.e. augmentation de la protéine M et aggravation des troubles des tissus ou organes). Dans la plupart des cas, une rechute et/ou une maladie réfractaire peut être considérée comme une maladie en progression.

- Rechute de la maladie : le myélome qui a initialement répondu au traitement a ensuite recommencé à progresser.

- Maladie réfractaire : le myélome n'a pas répondu à la thérapie initiale.

De préférence, le sujet traité dans le cadre de la présente invention est un sujet ayant déjà reçu un traitement. De manière encore préférée, le sujet est un sujet souffrant de myélome stable ou en progression, ou d'une rechute d'un myélome ou d'un myélome réfractaire.

Par "sujet", on entend ici un mammifère, de préférence un humain.

Les présents inventeurs ont montré qu'un antagoniste spécifique de TLR4 permettait de traiter le myélome multiple en agissant directement sur les cellules stromales mésenchymateuses qui surexpriment TLR4, diminuant ainsi leur capacité de support de croissance pour les cellules de myélome.

La présente invention est donc plus particulièrement utile pour traiter un sous- groupe de sujets souffrant de MM présentant un niveau d'expression accru du gène codant la protéine TLR4 au niveau de ses CSM par rapport au niveau d'expression du gène codant TLR4 dans les CSM d'un sujet sain.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le sujet souffrant de MM traité dans le cadre de la présente invention présente un niveau d'expression accru du gène codant la protéine TLR4 au niveau de ses CSM par rapport au niveau d'expression du gène codant TLR4 dans les CSM d'un sujet sain.

Par "TLR4", "Toll Like Receptor 4" ou "CD284", on entend ici un récepteur membranaire de la famille des TLR (et plus largement des PRR, pattern récognition receptor) présent sur la majorité des cellules immunitaires et certains adipocytes. Il est codé par le gène TLR4. Le TLR4 reconnaît typiquement les lipopolysaccharides (LPS) bactériens des bactéries à Gram négatif et des ligands endogènes tels que les protéines chaperones (Hsp70).

Par "sujet sain", on entend ici un sujet ne souffrant pas de myélome multiple, symptomatique ou asymptomatique, ou d'une autre pathologie des cellules de la moelle osseuse. Par "niveau d'expression du gène codant la protéine TLR4", on entend ici le niveau d'ARNm transcrits ou de protéines traduites à partir du gène codant la protéine TLR4.

Par "niveau d'expression accru du gène codant la protéine TLR4", on entend ici de préférence un niveau significativement augmenté.

Le niveau d'expression de l'ARNm codant pour la protéine TLR4 peut être déterminé par toute technique bien connue de l'homme du métier, par exemple par PCR quantitative ou au moyen de puces à ADN.

Le niveau d'expression de la protéine TLR4 peut être déterminé par toute technique bien connue de l'homme du métier, par exemple par Western Blot, immunofluorescence ou cytométrie en flux, en utilisant des anticorps spécifiquement dirigés contre la protéine TLR4.

Les inventeurs ayant montré que l'antagoniste de TLR4 avait un effet direct sur les CSM, le sujet traité dans le cadre de la présente invention ne présente pas nécessairement de surexpression du gène codant la protéine TLR4 au niveau de ses plasmocytes tumoraux pour qu'un effet soit observé.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le sujet ne présente pas de niveau d'expression accru du gène codant la protéine TLR4 au niveau de ses plasmocytes tumoraux. Antagoniste spécifique de TLR4

Par "antagoniste spécifique de TLR4", on entend ici un composé inhibant l'activité de TLR4, tel que défini ci-dessus, sans inhiber de manière substantielle l'activité d'un autre TLR. De préférence, l'antagoniste spécifique de TLR4 n'est pas un inhibiteur de l'expression de TLR4.

Par "sans inhiber de manière substantielle l'activité d'un autre TLR", on entend que l'activité d'un autre TLR est inhibée de moins de 20%, de préférence de moins de 15%, de moins de 10%, de moins de 5%, de manière encore préférée de moins de 1 % en présence de l'antagoniste.

En particulier, de préférence, l'antagoniste spécifique de TLR4 n'inhibe pas de manière substantielle TLR1 , TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 ou TLR9, en particulier TLR3.

Des techniques pour déterminer l'inhibition de l'activité d'un TLR sont bien connues de l'homme du métier et incluent par exemple la mesure de l'expression de Interferon (IFN) regulatory factor 7 (IRF7), régulateur intracellulaire de la production d'IFNa médié par les TLR1 , 2, 6, 7 et 9 (comme décrit dans Wang et al. (2016) Eur. J.l. 46:2409-2419). Des antagonistes spécifiques de TLR4 sont bien connus de l'homme du métier et incluent le composé C34 de formule (I) suivante :

(I), les composés suivants décrits dans la demande américaine

US2016/281395 l'acide (2S-2-((4aR,6R,7R, 8R, 8aS)-7-acetamido-6(2,3- bis(doddecyloxy)propoxy)-2,2-dimethylohexahydropyrano[3,2-d] [1 ,3]dioxin-8- yloxy)propanoique, le dodecyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D- glucopyranoside, le butyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-3,4-di-0-methyl-betal-D- glucopyranoside, l'isopropyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxyhexopyranoside, le cyclohexyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-alpha-D-glucpyran oside, l'hexyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glucopyran oside, le N-

[(2R,3R,4R,5S,6R)-2-[(1 'S,2'R,6'R,8'R,9'S)-dispiro[cyclohexane-1 ,4'-[3,5,7,10,12]penta- oxatricyclo[7.3.0.0 ^A {2,6}]dodecane-1 1 Ί "-cyclohexane]-8'-ylmethoxy]-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide, le (2R,3S,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-

(acetoxymethyl)-6-(((3aR,5R,5aS,8aS,8bR)-2,2,7,7-tetramet hyltetrahydro-3aH- bis[1 ,3]dioxolo[4,5-b:4'5'-d]pyran-5-yl)methoxy)tetrahydro-2H-pyr an-3,4-diyl-diacetate, la N-((2R,3R,4R,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-(((3aR ,5R,5aS,8aS,8bR)- 2,2,7,7-tetramethyltetrahydro-3a H-bis[1 ,3]dioxolo[4,5-b:4',5'-d]pyran-5- yl)methoxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl) acetamide, le propyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2- (acetylamino)-2-deoxyhexopyranoside, le 1 ,3,4,6-tetra-0-acetyl-2-deoxy-2- (palmitoylamino)hexopyranose, le 6-0-[2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glucopyranosyl]- 3-0-isopendyl-1 ,2-0-(1 -methylethylidene)-alpha-D-xylo-hexofuranose, le 6-0-[2- (acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glucopyranosyl]-1 ,2-0-(1 -methylethylidene)-3-0-propyl- alpha-D-xylo-hexofuranose, le 1 ,2-0-(1 -methylethylidene)-3-0-propyl-6-0-[3,4,6-tri-0- acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glucopyranosyl]-alpha- D-xylo-hexofuranose, le 1 ,2-0-(1 -methylethylidene)-3-0-pentyl-6-0-[3,4,5-tri-0-acetyl-2-(ace tylamino)-2-deoxy- beta-D-glucopyranosyl]-alpha-D-xylo-hexofuranose, l'octyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-beta- D-glycero-hexopyranoside, le sec-butyl 2-(acetylamino)-2-deoxyhexopyranoside, le (2S,4S,5R,6R)-5-acetamido-2-((2R,3S,4S,5R,6S)-3,5-dihydroxy- 2-(hydroxymethyl)-6- ((2R,3 S,4R,SS)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)tetrahydro-3H-pyr an-3-yloxy), le (2S,3S,4R,5R,6R)-3-((2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(h ydoymethyl)tetrahydro- 2H-pyran-2-yloxy)-4,5,6-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carb oxylate de sodium, le 2- (acetylamino)-4-0-{2-(acetylamino)-4-0-[2-(acetylamino)-2-de oxy-beta-D-glucopyranosyl]-

2- deoxy-beta-D-glucopyranosyl}-2-deoxy-D-glucopyranose, le sel de sodium de 3- acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran -2-yl dihydrogène phosphate, le composé acide sulfurique avec (2R)-4-amino-N-{(1 R,2S,3S,4R,5S)-5- amino-2-[(3-amino-3-deoxy-alpha-D-glucopyranosyl)oxy]-4-[(6- amino-6-deoxy-alpha-D- glucopyranosyl)oxy]-3-hydroxycyclohexyl]-2-hydroxybutanamide (1 :1 ), l'acide (4R)-4- ((2S)-2-((2R)-2-((3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-( hydroxymethyl)tetrahydro- 2H-pyran-4-yloxy)propanamido)propanamido)-5-amino-5-oxopenta noique, le sel de sodium d'uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine, le sel de disodium d'uridine 5'- diphospho-N-acetylgalactosamine, le 2-(acetylamino)-3-0-{4-0-[2-(acetylamino)-2-deoxy-

3- 0-alpha-D-xylo-hexopyranuronosyl-beta-D-ribo-hexopyranosyl]- beta-D-xylo- hexopyranuronosyl}-2-deoxy-D-glucopyranose, le 2-(acetylamino)-2-deoxy-3-0-(6,8- dideoxy-beta-L-glycero-octopyranosyl-7-ulose)-4-0-sulfo-L-er ythro-hexopyranose, le 2- (acetylamino)-2-deoxy-4-0-hexopyranosylhexopyranose, la N-{(1 S,2S,3R)-1 -[(beta-L- glycero-hexopyranosyloxy)methyl]-2,3-dihydroxyheptadecyl}hex acosanamide, le dimethyl 5-(acetylamino)-3,5-dideoxy-D-erythro-non-2-ulopyranosidonat e, le methyl 2- (acetylamino)-2-deoxy-3-0-hexopyranosylhexopyranoside, le 8-{[2-(acetylamino)-4-0-[2- (acetylamino)-2-deoxyhexopyranosyl]-2-deoxy-6-0-(6-deoxyhexo pyranosyl)

hexopyranosyl]oxy}octyl acétate, l'octyl 2-(acetylamino)-2-deoxyhexopyranoside, le 2- (acetylamino)-2-deoxy-4-0-(6-deoxyhexopyranosyl)-3-0-hexopyr anosylhexopyranose, le 2-(acetylamino)-2-deoxy-alpha-D-lyxo-hexopyranose, le 2-(acetylamino)-2-deoxy-D- glucopyranose, l'allyl 3,4,6-tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-lyxo- hexopyranoside, le N-{(1 S,2R,3E)-1 -[(beta-L-ribo-hexopyranosyloxy)methyl]-2-hydroxy-3- heptadecenyljoctadecanamide, le sodium ((3S,6R)-5-acetamido-3,4,6- trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl phosphate, l'acide 2-((2R,SS)-3-acetamido-2,5- dihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-4-yloxy)propa noique, l'allyl 2- (acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyranoside, le 1 ,3,4,6-tetra-0-acetyl-2- (acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyranose, le 2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D- glycero-hexopyranose, le 4-0-[2-(acetylamino)-2-deoxyhexopyranosyl]-1 ,5-anhydro-2- deoxyhexitol, l'ethyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyranoside, l'ethyl 3,4,6- tri-0-acetyl-2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyra noside, le 5-acetamido-6- ((1 R,2R>)-3-(3-(3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-(3 ,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl)tetrahydro-2H>-pyran-2-yloxy)tetrahydro-2H -pyran-2-yloxy)-6-(4,5- dihydroxy-6-((E)-3-hydroxy-2-stearamidooctadec-4-e, le composé cyclohexanamine avec l'hydrate de 1 ,6-di-O-phosphono-beta-D-glycero-hexopyranose (4:1 ), le 4-0-(3-0-{2- (acetylamino)-2-deoxy-4-0-(6-deoxyhexopyranosyl)-3-0-[2-0-(6 - deoxyhexopyranosyl)hexopyranosyl]hexopyranosyl}hexopyranosyl )hexopyranose, le 3-0- (3-O-{2-(acetylamino)-2-deoxy-3-O-[2-0-(6- deoxyhexopyranosyl)hexopyranosyl]hexopyranosyl}hexopyranosyl )-D-arabinose, le 2- (acetylamino)-2-deoxy-3-0-(6-deoxyhexopyranosyl)-4-0-hexopyr anosylhexopyranose, le nonyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyranoside, l'octadecyl 2- (acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glycero-hexopyranoside, le 4-0-{6-0-[5-(acetylamino)-3,5- dideoxy-D-erythro-non-2-ulopyranonosyl]hexopyranosyl}hexopyr anose, le 2-deoxy-2- (propionylamino)-D-glucopyranose, le sel de potassium et magnésium de cyclohexane- 1 ,2,3,4,5,6-hexayl hexakis(dihydrogène phosphate), le 1 ,3,4,6-tetra-0-acetyl-2- (acetylamino)-2-deoxy-beta-D-glucopyranose, l'hydrate de 2-(acetylamino)-2-deoxy-D- galactopyranose, l'acétate de [(4R)-5-acetamido-3,4,6-triacetyloxy-oxan-2-yl]methyl, l'acétate de [5-acetamido-3-acetyloxy-2-(acetyloxymethyl)-6-hexadecoxy-ox an-4-yl], l'acétate de (5-acetamido-3,4-diacetyloxy-6-pentoxy-oxan-2-yl)methyl, l'acétate de (5- acetamido-3,4-diacetyloxy-6-methoxy-oxan-2-yl)methyl, le N-[2-ethoxy-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide, l'acétate de [2,5-diacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)-3- (dodecanoylamino)oxan-4-yl], ou le N-[2-(dispiro[BLAH]ylmethoxy)-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide, le (6R)-6-[[(2-Chloro-4-fluorophenyl)amino]sulfonyl]- 1 -cyclohexene-1 -carboxylic acid ethyl ester (TAK-242 ou resatorvid ref : CLI-095, Invivogen), le peptide appelé VIPER lyophilisé de séquence KYSFKLILAEYRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 1 ) (séquence de VIPER: KYSFKLILAEY (SEQ ID NO: 2)) (Ref: NBP2- 26244, Novus biologicals).

L'antagoniste spécifique de TLR4 peut alternativement être un anticorps, incluant une immunoglobuline conventionnelle, un anticorps simple chaîne, un fragment Fab, un fragment Fv, un fragment Fv simple chaîne (scFv) ou un nanocorps, qui antagonise l'activité de TLR4. Des exemples d'anticorps antagonistes incluent l'anticorps monoclonal neutralisant contre TLR4 humain, clone W7C1 1 (mabg-htlr4, Invivogen) et l'anticorps polyclonal de rat neutralisant contre le TLR4 humain (pab-hstlr4, Invivogen).

Un tel anticorps peut être produit par des techniques standard. La capacité d'un tel anticorps à agir comme antagoniste de TLR4 peut être confirmée par la capacité de l'anticorps à bloquer un indice d'activation de TLR4 induite par le LPS, tel qu'une augmentation de l'expression de CD54 (ICAM-1 , Intercellular adhésion molécule -1 ) à la surface des cellules, une augmentation de la production d'IL6 sécrétée ou une phosphorylation de NFkB (Nuclear factor kappa B) le facteur de transcription clé de la signalisation en aval de TLR4.

De préférence, l'antagoniste spécifique de TLR4 utilisé dans le cadre de l'invention est le composé C34. Traitement du myélome multiple

La présente invention concerne un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, destiné à être utilisé dans le traitement du myélome multiple chez un sujet tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également une méthode de traitement du myélome multiple chez un sujet, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un antagoniste spécifique de TLR4 tel que défini ci-dessus chez un sujet qui en a besoin tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du myélome multiple chez un sujet tel que défini ci-dessus.

Les inventeurs ont en particulier montré que l'antagoniste spécifique de TLR4, en ciblant spécifiquement les CSM, permettait d'inhiber l'effet promoteur de ces cellules sur la prolifération des plasmocytes tumoraux.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'antagoniste spécifique de TLR4 est utilisé pour inhiber l'effet promoteur des CSM sur la prolifération des plasmocytes tumoraux.

Le myélome multiple traité peut être de n'importe quelle catégorie telle que décrite ci-dessus. De préférence, le myélome multiple est un myélome multiple symptomatique, de manière encore préférée, un myélome multiple en progression, en rechute et/ou réfractaire.

Par "traitement" ou "traiter", on entend ici atteindre, partiellement ou substantiellement, un ou plusieurs des résultats suivants : réduire partiellement ou totalement l'étendue de la maladie, améliorer un symptôme clinique ou un indicateur associé à la maladie, retarder, inhiber ou prévenir la progression de la maladie, ou partiellement ou totalement retarder, inhiber ou prévenir la survenue d'une rechute de la maladie.

Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend ici une quantité de principe actif suffisante pour détruire, modifier, contrôler ou éliminer un myélome multiple. Une "quantité thérapeutiquement efficace" désigne aussi une quantité de principe actif permettant de retarder ou minimiser l'étendue du myélome multiple. Elle se réfère également à la quantité de principe actif fournissant un bénéfice thérapeutique dans le traitement ou la prise en charge du myélome multiple. Enfin, l'expression "quantité thérapeutiquement efficace" signifie une quantité de principe actif, seul, ou en combinaison avec d'autres thérapies, qui fournit un bénéfice thérapeutique dans le traitement ou la prise en charge du myélome multiple, incluant une amélioration des symptômes associés au myélome multiple.

Dans le cadre de l'invention, l'antagoniste spécifique de TLR4 peut être utilisé en combinaison avec des agents thérapeutiques de support.

Par "agent thérapeutique de support", on entend ici un agent permettant de réduire les symptômes et les complications du myélome multiple. Des exemples d'agents thérapeutiques de support incluent les biphosphonates (agissant sur les lésions osseuses), les facteurs de croissance, les antibiotiques, les diurétiques et les analgésiques.

Des exemples de biphosphonates incluent l'étidronate (Didronel), le pamidronate

(Aredia), l'alendronate (Fosamax), le risedronate (Actonel), le zoledronate (Zometa), et l'ibandronate (Boniva).

Des exemples de facteurs de croissance incluent le G-CSF, le GM-CSF, le M- CSF, le facteur de stimulation de multi-colonie, l'érythropoïétine, la thrombopoïétine, l'oncostatine M et les interleukines.

Des exemples d'antibiotiques incluent les pénicillines, les céphalosporines et des dérivés, l'acide oxolinique, l'amifloxacine, la temafloxacine, l'acide nalidixique, l'acide piromidique, la ciprofloxacine, la cinoxacine, la norfloxacine, la perfloxacine, la rosaxacine, l'ofloxacine, l'enoxacine, l'acide pipemidique, le sulbactam, l'acide clavulinique, l'acide β-bromopénicillanique, l'acide β-chloropénicillanique, le céphoxazole, la sultampicilline, le tazobactam, l'aztréonam, la sulfazéthine, l'isosulfazéthine, les norcardicines, la chlortétracycline, l'oxytétracyline, la tétracycline, la déméclocycline, la doxycycline, la méthacycline et la minocycline.

Des exemples de diurétiques incluent les dérivés thiazides tels que l'amiloride, la chlorothiazide, l'hydrochlorothiazide, la méthylchlorothiazide et le chlorothalidon.

Des exemples d'analgésiques incluent un opioïde tel que la morphine, un inhibiteur de COX-2, tel que le rofécoxib, le valdécoxib et le célécoxib, les salicylates tels que l'aspirine, le cholinetrisalicylate de magnésium, le salsalate, le dirunisal et le salicylate de sodium, les dérivés d'acide propionique tels que le fénoprofène, le calcium, l'ibuprofène, le kétoprofène, le naproxène et le naproxène sodique, les dérivés d'acide indoleacétique tels que l'indométhacine, le sulfindac, l'étodalac et le tolmétine, les fénamates tels que l'acide méfénamique et le méclofénamate, les dérivés de benzothiazine ou les oxicams tels que le mobic ou le piroxicam, ou l'acide pyrrolacétique tel que le kétorolac.

L'antagoniste spécifique de TLR4 selon l'invention et, éventuellement, l'agent thérapeutique de support peuvent être formulés dans une ou plusieurs compositions pharmaceutiques séparées comme décrit ci-dessous. L'antagoniste spécifique de TLR4 selon l'invention peut être administré par toute voie d'administration appropriée telle que par voie orale, sublinguale, buccale, sous- cutanée, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous- dermique ou intranasale. De préférence, l'antagoniste spécifique de TLR4 selon l'invention est administré par voie intraveineuse.

Combinaison pharmaceutique pour traiter le myélome multiple Les inventeurs ont également montré que l'antagoniste spécifique de TLR4, utilisé en combinaison avec un agent chimiothérapeutique conventionnellement utilisé pour le traitement du myélome multiple tel que le melphalan ou le lenalidomide, permettait d'inhiber de manière synergique la prolifération des plasmocytes MM.

Ainsi, la présente invention a également pour objet une combinaison pharmaceutique antitumorale comprenant (i) un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus et (ii) un agent chimiothérapeutique, destinée à être utilisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement du myélome multiple.

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement du myélome multiple, comprenant l'administration simultanée, séparée ou séquentielle d'une quantité thérapeutiquement efficace (i) d'un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, et (ii) d'un agent chimiothérapeutique, chez un sujet qui en a besoin tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation (i) d'un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, et (ii) d'un agent chimiothérapeutique pour la fabrication d'une combinaison pharmaceutique antitumorale destinée à être utilisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement du myélome multiple, tel que défini ci-dessus.

Dans le contexte de l'invention, le terme "combinaison", "combinaison thérapeutique" ou "combinaison pharmaceutique" désigne soit une combinaison fixe sous la forme d'une unité de dosage, ou un "kit of parts" pour administration combinée où l'antagoniste de TLR4 et l'agent chimiothérapeutique peuvent être administrés indépendamment au même moment ou séparément dans un intervalle de temps qui permet que les partenaires de la combinaison montrent leur effet synergique.

Les composés de la combinaison peuvent ainsi être formulés dans une ou plusieurs compositions pharmaceutiques séparées. La présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique antitumorale comprenant (i) un antagoniste spécifique de TLR4 tel que défini ci-dessus, et (ii) un agent chimiothérapeutique.

La présente invention concerne également un kit comprenant :

(i) une composition pharmaceutique comprenant un antagoniste spécifique de

TLR4 tel que défini ci-dessus, et

(ii) une composition pharmaceutique comprenant un agent chimiothérapeutique.

Le terme "composition pharmaceutique" tel que défini ici désigne un mélange ou une solution comprenant au moins un agent thérapeutique à administrer à un sujet afin de prévenir ou traiter une maladie particulière affectant le sujet.

Typiquement, les composés de la combinaison selon l'invention peuvent ainsi être combinés avec des excipients pharmaceutiquement acceptables pour former des compositions pharmaceutiques. Les compositions pharmaceutiques telles que définies comprennent donc de préférence en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Par "pharmaceutiquement acceptable", on entend ici des compositions et entités moléculaires qui ne produisent pas de réactions secondaires, allergiques ou autrement non-désirées quand elles sont administrées à un sujet. Un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable est ainsi une matière encapsulante, un diluant, un support, ou tout autre auxiliaire de formulation liquide, semi-solide ou solide non-toxique.

Dans les compositions pharmaceutiques utilisées dans le cadre de la présente invention, pour administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, le principe actif, seul ou en combinaison avec un autre principe actif, peut être administré au sujet dans une forme unitaire d'administration, sous forme de mélange avec des supports pharmaceutiques conventionnels. Des formes d'administration unitaires adaptées comprennent les formes pour voie orale telles que des comprimés, des capsules gélifiées, des poudres, des granulés et des solutions ou suspensions orales, des formes pour voie sublinguale ou buccale, des aérosols, des implants, des formes pour voie sous-cutanée, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-dermique et intranasale.

L'antagoniste spécifique de TLR4 et l'agent chimiothérapeutique peuvent être administrés de manière simultanée, au sein d'une même composition ou dans des compositions différentes. Alternativement, l'antagoniste spécifique de TLR4 et l'agent chimiothérapeutique peuvent être administrés de manière séquentielle, l'antagoniste spécifique de TLR4 étant administré avant ou après l'agent chimiothérapeutique. L'antagoniste spécifique de TLR4 et l'agent chimiothérapeutique peuvent être administrés par des voies d'administration identiques ou différentes.

De préférence, en particulier lorsque les compositions pharmaceutiques sont pour administration parentérale, les compositions pharmaceutiques contiennent des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation pouvant être injectée. Il peut s'agir en particulier de solutions salines, stériles, isotoniques (phosphate de monosodium ou disodium, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, et les mélanges de ces sels) ou de compositions sèches, en particulier des compositions lyophilisées qui, après ajout, selon le cas d'eau stérilisée ou de solution saline physiologique, peuvent être reconstituées en solutions injectables.

Les formes pharmaceutiques adaptées pour une utilisation injectable incluent les solutions ou dispersions aqueuses stériles, les formulations incluant l'huile de sésame, l'huile d'arachide ou le propylène glycol aqueux, et les poudres stériles pour une préparation extemporanée de solutions ou de dispersions stériles injectables. Les solutions comprenant les composés selon l'invention sous forme de base libre ou de sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être préparées dans de l'eau de manière adaptée avec un surfactant tel que l'hydroxypropylcellulose. Les dispersions peuvent également être préparées dans du glycérol, des polyéthylène glycols liquides, et des mélanges de ceux-ci, et dans des huiles. Dans des conditions ordinaires de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent de préférence un conservateur afin d'empêcher la croissance des microorganismes.

Le véhicule peut également être un solvant ou un milieu de dispersion contenant, par exemple, de l'eau, de l'éthanol, un polyol (par exemple du glycérol, du propylène glycol, du polyéthylène glycol liquide), des mélanges adaptés de ceux-ci et des huiles végétales. Une fluidité acceptable peut être maintenue, par exemple, en utilisant un revêtement, tel que de la lécithine, par le maintien d'une taille de particule requise dans le cas des dispersions et par l'utilisation de surfactants. La prévention de l'action de microorganismes peut être apportée par des agents antibactériens et antifongiques variées, tels que des parabènes, du chlorobutanol, du phénol, de l'acide sorbique, de thimerosal, etc. Dans de nombreux cas, il est préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple des sucres ou du chlorure de sodium. Une absorption prolongée des compositions injectables peut être apportée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, tels que le monostéarate d'aluminium ou la gélatine.

Des solutions injectables stériles peuvent être préparées en incorporant le composé actif dans une quantité requise du solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients mentionnés ci-dessus, si nécessaire, puis en stérilisant par filtration. De manière générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux cités ci-dessus. Dans le cas des poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les méthodes de préparation préférées sont les techniques de séchage sous vide et de lyophilisation.

Par "agent chimiothérapeutique", on entend ici un agent qui est toxique pour les cellules cancéreuses. Des exemples d'agents chimiothérapeutiques pouvant être utilisés dans le cadre de l'invention incluent le bortezomib (Velcade ^® , Millennium), le melphalan, le lenalidomide, le predisone, la vincristine, la carmustine, la cyclophosphamide, la dexamathasone, la thalidomide, le pomalidomide, la doxorubicine, la cisplatine, l'étoposide et la cytarabine. De préférence, l'agent chimiothérapeutique est un agent conventionnellement utilisé suivant le stade ou la réponse au traitement du MM tel que le melphalan, le lenalidomide, le bortezomib, le thalidomide et le pomalidomide.

Dans un mode de réalisation particulier, l'agent chimiothérapeutique est le melphalan ou le lenalidomide, de préférence le lenalidomide.

L'agent chimiothérapeutique utilisé en combinaison avec l'antagoniste spécifique de TLR4 selon l'invention peut être administré par toute voie appropriée. De préférence, l'agent chimiothérapeutique, en particulier le melphalan ou le lenalinomide, est administré par voie orale.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'antagoniste spécifique de

TLR4 selon l'invention est administré par voie intraveineuse et l'agent chimiothérapeutique, en particulier le melphalan ou le lenalinomide, est administré par voie orale.

Comme indiqué ci-dessus l'antagoniste spécifique de TLR4 et l'agent chimiothérapeutique peuvent être administrés simultanément ou de manière décalée dans le temps, c'est-à-dire à différents moments et à des intervalles de temps égaux ou différents pour chacun des membres de la combinaison.

Le ratio des quantités totales des membres (i) et (ii) de la combinaison peut varier par exemple en fonction des besoins du patient.

La présente invention concerne également un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, destiné à être utilisé en combinaison avec un agent chimiothérapeutique, tel que défini ci-dessus, dans le traitement du myélome multiple, tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à être utilisé en combinaison avec un agent chimiothérapeutique, tel que défini ci-dessus, dans le traitement du myélome multiple, tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement du myélome comprenant l'administration, chez un sujet qui en a besoin, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un antagoniste spécifique de TLR4 tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un agent chimiothérapeutique tel que défini ci-dessus.

La présente invention concerne également un agent chimiothérapeutique, tel que défini ci-dessus, destiné à être utilisé en combinaison avec un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci-dessus, dans le traitement du myélome multiple, tel que défini ci- dessus.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un agent chimiothérapeutique, tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à être utilisé en combinaison avec un antagoniste spécifique de TLR4, tel que défini ci- dessus, dans le traitement du myélome multiple, tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement du myélome comprenant l'administration, chez un sujet qui en a besoin, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent chimiothérapeutique tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un antagoniste spécifique de TLR4 tel que défini ci-dessus. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.

Brève description des figures Figure 1 : Niveau d'expression des ARNm des différents variants (a), (b), (c) et (d) de TLR4 par les CSMs de sujets sains, de patients souffrant de MGUS (stade pré MM) ou de patients souffrant de MM.

Statistiques : ^* p<0.05 ^** p<0.01 , ^*** p<0.001 Figure 2: Expression de la protéine TLR4 à la surface des CSMs de sujets sains et de patients souffrant de MM.

* p<0.05

Figure 3: Expression de différentes molécules d'adhérence impliquées dans l'interaction avec les plasmocytes MM (CD49d, CD49e, CD54 et CD106) à la surface des CSMs de sujets sains et de patients souffrant de MM, stimulées ou non avec du LPS. ^* p<0.05 ^** p<0.01

Figure 4 : Niveau de sécrétion de Hsp70 après une semaine de culture par la lignée MOLP-6 (plasmocytes MM stroma dépendants), les CSMs de donneurs sains ou provenant de patients souffrant de MM.

^* p<0.05

Figure 5 : Expression de CD54 par les CSMs de donneurs sains ou provenant de patients souffrant de MM, stimulées ou non avec le Hsp70.

* p<0.05

Figure 6 : Sécrétion d'IL6 par les CSMs de donneurs sains ou provenant de patients souffrant de MM, stimulées ou non avec du LPS.

^* p<0.05 ^** p<0.01

Figure 7 : Sécrétion d'IL6 par les CSMs de donneurs sains ou provenant de patients souffrant de MM, stimulées ou non avec le Hsp70.

^* p<0.05 Figure 8: Nombre de cellules de myélome (MOLP-6) après 7 jours de coculture. Sont indiquées les MOLP-6 seules (sans coculture), ou en coculture avec un stroma de CSMs issus de donneurs sains ou de MM.

^* p<0.05 Figure 9: Nombre de cellules de myélome (MOLP-6) après culture de MOLP-6 seules non traitées (NT) ou traitées avec 1 μΜ ou 10 μΜ de C34 (antagoniste TLR4), ou en coculture avec un stroma de CSMs issus de donneurs sains ou de MM, non-traités ou traités avec 1 μΜ ou 10 μΜ de C34.

* ^* p<0.01

Figure 10: Expression de la protéine TLR4 à la surface des CSMs de différents patients souffrant de MM.

Figure 11 : Pourcentage d'inhibition de la croissance de plasmocytes MM (MOLP6) dans des cocultures avec des CSMs issus de donneurs sains (H ; n=4) ou de MM (MYE ; n=5) non traitées (NT), traitées avec 1 μΜ de C34 (C34 1 μΜ), avec du melphalan seul à 100 nM (Mel 100 nM), ou avec une combinaison de C34 à 1 μΜ et de melphalan à 100 nM

(Mel 100 nM + C34 1 μΜ),.

ns : non-significatif ; ^* : p < 0.05 ; ^** : p < 0.01

Les tests statistiques ont été réalisés avec le logiciel Prism v5.02 (t test de Student).

Figure 12: Pourcentage d'inhibition de la croissance de plasmocytes MM (MOLP6) dans des cocultures avec des CSMs issus de donneurs sains (H ; n=4) ou de MM (MYE ; n=5) non traitées (NT), traitées avec 1 μΜ de C34 (C34 1 μΜ), avec du lenalidomide seul à 100 nM (Len 100 nM), ou avec une combinaison de C34 à 1 μΜ et de lenalidomide à 100 nM (Len 100 nM + C34 1 μΜ).

ns : non-significatif ; ^* : p < 0.05 ; ^** : p < 0.01

Les tests statistiques ont été réalisés avec le logiciel Prism v5.02 (t test de Student).

Exemples

Exemple 1 : Surexpression de TLR4 dans les CSMs de patients souffrant de MM Suite à l'analyse transcriptomique réalisée conformément à la méthode décrite dans Corre et al. (2007) Leukemia 21 :1079-1088, les inventeurs ont montré des différences claires dans l'expression des ARNm des TLR4 entre d'une part des CSMs de donneurs sains (MSC sain) et de patients souffrant de gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS) (MGUS MSC), un état pré-myélome multiple, et d'autre part de patients souffrant de myélome multiple (MM MSC).

Ils ont par conséquent étudié le niveau de TLR4 dans les CSMs et ont remarqué que le niveau d'ARNm de 4 variants différents de TLR4 était significativement plus élevé dans les CSMs de patients souffrant de MM, par rapport aux donneurs sains et aux patients souffrant de MGUS (Figure 1 ).

Les inventeurs ont ensuite analysé l'expression protéique de TLR4 à la surface des CSMs de sujets sains ou de patients souffrant de MM après une primoculture de 21 jours de CSMs. Ils ont montré que l'expression de TLR4 était plus élevée à la surface des CSMs de MM comparativement aux CSMs de donneurs sains (MFI 10,3 v.s. 2.6, Figure 2).

Ainsi la molécule TLR4 est surexprimée à la fois au niveau transcriptionnel

(ARNm) et au niveau protéique dans les CSMs MM. Exemple 2: La stimulation de TLR4 sur les CSMs MM se traduit par une plus forte expression de CD54 et sécrétion d'IL6 comparée aux CSMs de donneurs sains Les inventeurs ont ensuite étudié l'activation différentielle de TLR4 dans les CSMs de donneurs sains ou de patients MM. Ils ont analysé l'effet de la stimulation par le LPS, le ligand référence de TLR4 largement décrit dans la littérature, sur l'expression de plusieurs molécules d'adhérence (CD49d/VLA-4, CD49e/VLA-5, CD54/ICAM-1 et CD106/VCAM-1 ) impliquées dans l'interaction entre les CSMs et les plasmocytes malins. Le niveau d'expression (MFI : moyenne d'intensité de fluorescence) de chaque molécule est montré sur l'histogramme de la Figure 3.

Les inventeurs ont observé que la stimulation de TLR4 par le LPS n'avait pas d'effet sur l'expression de CD49d ou CD106 mais augmentait de manière significative l'expression de CD49e et CD54 dans les CSMs saines et MM (Figure 3). En effet, la stimulation de TLR4 par le LPS augmente fortement l'expression de CD54 dans les CSMs saines (CD54 MFI 9,6 vs 148.7) et à plus grande échelle dans les CSMs de MM (CD54

Un certain nombre d'études ont évalué l'expression de molécules d'adhérence dans les CSMs de MM, mais les résultats concernant la comparaison de l'expression de CD54 dans les CSMs saines et MM étaient contradictoires. Ici, les inventeurs ont montré que, dans des conditions basales, l'expression de CD54 était plus faible dans les CSMs de MM que dans les CSMs saines (MFI 4,3 vs. 9,6) mais qu'après stimulation de TLR4 par le LPS, l'expression de CD54 était plus élevée dans les CSMs de MM que dans les CSMs saines (MFI 216 vs. 149), ce qui suggère une plus forte sensibilité du TLR4 ou une signalisation en aval de la molécule plus soutenue dans les CSMs de MM. Par conséquent, la régulation de l'expression de CD54 dans les CSMs est perturbée dans le contexte du MM.

Afin d'étudier plus en détail le rôle de TLR4 dans le contexte du MM et se rapprocher de la physiopathologie, les inventeurs ont stimulé les CSMs avec Hsp70, un ligand endogène de TLR4 activement libéré dans le microenvironnement du MM et sécrété par la lignée cellulaire de MM MOLP-6 (jusqu'à 200ng/ml) (Figure 4). De plus ce ligand endogène a été décrit dans la littérature pour avoir un rôle chimioprotecteur pour les plasmocytes malins MM (Nimmanapalli et al. (2008) Br. J. Haematol. 142:551 -561 ). De manière intéressante, la stimulation par Hsp70 augmente de manière significative l'expression de CD54 seulement dans les CSMs de MM (Figure 5) confirmant leur plus grande sensibilité au niveau du TLR4. En effet le Hsp-70 est une molécule monomérique et induit donc une stimulation moins importante que le LPS (multimérique). Malgré tout, une nouvelle fois, les CSM MM répondent mieux que les CSM saines. Les inventeurs ont également évalué l'effet de la stimulation de TLR4 sur les facteurs solubles IGF-1 et IL6 impliqués dans la survie et la prolifération des cellules de myélome.

La stimulation de TLR4 par le LPS n'a pas d'effet sur la sécrétion d'IGF-1 dans les CSMs saines et MM mais induit la sécrétion d'IL6 (cytokine majeure de la survie et prolifération des cellules MM) dans les CSMs saines et dans une plus forte mesure dans les CSMs de MM (CSMs saines 0,02 v.s. 0,1 pg/cellule, CSMs de MM 0,08 v.s. 0,7 pg/cellule) (Figure 6).

Comme pour l'expression du CD54, Hsp70 augmente la sécrétion d'IL6 de manière plus forte et spécifiquement dans les CSMs de MM (Figure 7).

Par conséquent, la sécrétion d'IL6 est plus élevée dans les CSMs de MM dans lesquelles TLR4 est stimulé, confirmant l'hypersensibilité de TLR4 dans ces cellules.

Ainsi, suite à la stimulation de TLR4, les CSMs saines et dans une plus grande mesure les CSMs de MM régulent à la hausse les facteurs solubles et d'adhérence impliqués dans le support de la croissance des cellules de myélome. Dans la moelle osseuse des patients souffrant de MM, les CSMs pourraient donc être activées de manière chronique par des ligands endogènes de TLR4 tels que Hsp70. Ce dernier est libéré d'une part par les cellules abîmées dans les lésions osseuses (cellules apoptiques ou lésées) mais également activement par les plasmocytes MM (comme vu dans figure 4) induisant la régulation à la hausse d'IL6 par les CSMs du microenvironnement, qui par conséquent favorise la prolifération des cellules de myélome.

Exemple 3: TLR4 joue un rôle pivot dans le support des CSMs de MM pour la croissance des plasmocytes MM

Pour évaluer le rôle de TLR4 dans l'interaction CSM/cellule de myélome, les inventeurs ont utilisé un antagoniste spécifique de TLR4, le composé C34, commercialisé par Tocris, et une lignée de cellules de myélome dépendante du stroma, la lignée MOLP- 6. Certaines études ont utilisé des lignées de cellules de myélome indépendantes du stroma telles que MM1 S ou RPMI8226. Dans cette étude, afin de se rapprocher de la pathologie et mimer de réelles interactions entre CSM et plasmocytes, les inventeurs ont utilisé une lignée cellulaire dépendante du stroma pour sa prolifération. En effet, durant le MM (dans les phases d'établissement et d'entretien de la maladie), les cellules de myélome adhèrent fortement aux CSMs du stroma, ce qui confère une chimiorésistance et des signaux de survie favorisant l'évolution du MM.

Les inventeurs ont tout d'abord confirmé que les MOLP6 utilisés pour l'étude étaient bien stroma dépendantes (Figure 8). En effet, les cellules MOLP-6 seules ne peuvent pas proliférer mais entrent en cycle quand co-cultivées avec un stroma. Il a pu être noté que le stroma de MM supportait plus la croissance de MOLP-6 que le stroma sain comme préalablement décrits dans la littérature (nombre de cellules MOLP-6 à J7 : 7,04x10 ⁵ vs 4,64x10 ⁵ ).

Avant d'utiliser l'antagoniste de TLR4 sur le stroma, les inventeurs ont vérifié que C34 n'affectait pas directement les cellules MOLP-6 (Figure 9). Ensuite, ils ont traité les CSMs saines et de MM avec le C34 avant et en co-culture avec les MOLP-6. Avec le stroma sain, l'antagoniste de C34 (à 1 et 10 μΜ) n'a pas d'effet sur le support de la croissance de MOLP-6, alors qu'avec le stroma de MM, l'antagoniste de TLR4 affecte la croissance des cellules MOLP-6 aux deux doses utilisées (33% de diminution, Figure 9).

Par conséquent, les CSMs de MM sont plus sensibles à l'antagoniste de TLR4 que les CSMs saines en terme de support de la prolifération des cellules MOLP-6. L'originalité des résultats est aussi dans la spécificité de l'effet du produit sur les CSMs pathologiques.

Par conséquent, ces résultats confirment qu'un antagoniste de TLR4 peut être utilisé pour traiter le myélome multiple en agissant préférentiellement sur les CSMs pathologiques, affectant leur capacité de support de croissance des plasmocytes malins.

Exemple 4: Etude de l'expression de TLR4 sur les CSMs de patients souffrant de MM

Les inventeurs ont étudié les niveaux d'expression de TLR4 dans les CSMs de différents patients souffrant de MM (patients Mye161 , 165, 1 10, 168 et 106) par cytométrie en flux.

Ils ont montré que l'expression de TLR4 était homogène au sein d'un même patient et qu'il n'existait donc pas de sous-population de CSMs exprimant différemment TLR4 au niveau du patient. En revanche, ils ont pu observer des fluctuations sur l'intensité d'expression du TLR4 entre les patients souffrant de MM (Figure 10). Cette étude montre donc qu'il est possible de catégoriser les patients souffrant de MM en fonction de l'expression forte ou faible de TLR4 par les CSMs.

Exemple 5: Etude d'une bithérapie combinant un agent chimiothérapeutique et un antagoniste de TLR4 sur une coculture de CSMs/plasmocvtes de MM

Les inventeurs ont mis en coculture des CSMs provenant de 4 donneurs sains (H) ou de 5 patient souffrant de MM (MYE) ainsi que des plasmocytes stroma-dépendants MOLP6 :

sans traitement (NT)

- en présence de C34 seul à 1 μΜ (C34 1 μΜ),

en présence de melphalan seul à 100 nM (Mel 100 nM),

en présence de lenalidomide seul à 100 nM (Len 100 nM),

- en présence d'une combinaison de C34 à 1 μΜ et de melphalan à 100 nM (Mel

100 nM + C34 1 μΜ), ou

- en présence d'une combinaison de C34 à 1 μΜ et de lenalidomide à 100 nM (Len 100 nM + C34 1 μΜ).

Après 7 jours de culture, ils ont calculé le pourcentage d'inhibition de la croissance des plasmocytes (Figures 11 et 12).

Les statistiques ont été évaluées par le t test de Student entre les différentes conditions.

Ils ont ainsi observé un effet synergique de C34 sur l'inhibition de la prolifération des plasmocytes de MM cocultivés avec des CSM MM en combinaison avec de faibles doses de melphalan (100nM) (Figure 11 ). Les mêmes résultats ont été notés avec le lenalidomide à 100nM (Figure 12). De manière intéressante, aucun effet synergique significatif du C34 n'a pu être observé dans les cocultures CSM saines/MOLP6 en présence d'agents chimiothérapeutiques.

De manière intéressante et parallèlement aux résultats avec le C34 seul (figure 9), cet effet synergique ne s'observe que sur les plasmocytes cocultivés avec des CSMs de MM. De plus, l'effet du C34 est soutenue en présence d'agents chimiothérapeutiques à faible concentration (100nM). Ainsi, un autre intérêt de la bithérapie est le fait que grâce à l'action combinée du C34, il est possible de diminuer les doses des agents chimiothérapeutiques (melphalan et Lenalidomide à 100nM) entraînant potentiellement moins d'effets secondaires chez les patients.