Die vorliegende Erfindung betrifft enantiomerenreines DOTAP Chlorid sowie Kristallmodifikationen von racemischem und enantiomerenreinem DOTAP Chlorid, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwen¬ dung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Mit DOTAP Chlorid sind oben und im Folgenden N,N,N-trimethyl-2,3- bis[[(9Z)-1 -oxo-9-octadecenyl]oxy]-1 -propanaminiumchlorid, auch als (Z ₁ Z)-N ₁ N, N-trιmethyl-2,3-bis[(1-oxo-9-octadecenyl)oxy]-1 -propan¬ aminiumchlorid oder 1 ^-Dioleoyloxy-S-tri-methylammoniumpropanchlorid bezeichnet, und dessen Hydrate gemeint.

C ₄₂ H ₈₀ CINO ₄ , Mw 698.54

CAS Nummern: 132172-61-3 und 477274-39-8 (Racemat), 197974-73-58 (Racemat, Monohydrat) 428506-51-8 (2S-Form), 328250-28-8 (2R-Form)

Liposomen sind künstliche mehrschichtige Vesikel (kugelig in sich ge¬ schlossene Membranen) aus ambiphilen Substanzen, meist natürlichen Lipiden, in die sowohl hydrophile Substanzen in den wässrigen Innen¬ raum verkapselt, als auch lipophile Substanzen in den Innenbereich der Lipidmembran inkorporiert werden können.

Sie werden vor allem in der Kosmetik und in der Medizin, speziell in der

Dermatologie eingesetzt. Dabei werden vor allem Vitamine, Coenzyme, Haut- und Sonnenschutzmittel eingebettet. Liposomen werden in der Regel topisch angewendet.

In der pharmazeutischen Technologie gewinnen Liposomen aber zu¬ nehmend weitere Bedeutung, da durch die parenterale Applikation von

Liposomen eine spezifischere Organverteilung erzielt werden kann, als wenn die Wirkstoffe in frei gelöster Form angewendet werden.

Wenn DNA-, RNA- oder Proteine eingeschlossen werden, erhält man Li- poplexe.

Durch Zusatz von Ölen und Einsatz von Hochdruckhomogenisatoren kann man aus Liposomen die Bildung so genannter Nanopartikel (Nano- parts) erzwingen. Dabei handelt es sich um Partikel etwa gleicher Grö¬ ßenordnung wie Liposomen, die aber in ihrem Inneren keine Wasser- phase, sondern ein Ölphase besitzen. Sie eignen sich insbesondere für die Verkapselung von lipophilen Substanzen.

Mikroemulsionen sind kolloiddisperse, einphasige Systeme aus wässri- gen, lipidartigen und tensidischen Komponenten. Sie weisen eine Teil- chengrösse von 1-500 nm auf und verhalten sich ähnlich wie Flüssigkei¬ ten.

Gerade im Zusammenhang mit den normalerweise schlecht löslichen peptidischen Wirkstoffen, Nukleotiden, Vakzine und anderer Biopharma- zeutika hat der lösungsvermittelnde Effekt bei den oben beschriebenen Anwendungen eine sehr grosse Bedeutung.

Ausserdem lässt sich auf diese Weise der Abbau der Wirkstoffe im Kör¬ per bremsen und ein Sustained-Release-Effekt erzielen.

DOTAP Chlorid gehört zu der Klasse der kationischen Lipide. Diese ha¬ ben, im Gegensatz zu den natürlich vorkommenden Phospholipiden, kei¬ nen zwitterionischen Charakter. Liposomen aus kationischen Lipiden weisen, allein oder kombiniert mit Phospholipiden oder anderen lipidarti- gen Verbindungen, eine positiv geladene Oberfläche auf. Daraus ergibt sich eine hohe Affinität zu solchen Zellen, die nach Aussen eine negativ geladene Oberfläche besitzen, beispielsweise Endothelzellen.

Besonders wichtig ist jedoch die Fähigkeit von DOTAP basierten und an- deren kationischen Liposomen und Lipoplexen, in Zellen eindringen zu

können und somit die in sie eingeschlossenen Wirkstoffe in das Zellinne¬ re zu transportieren (Transfektion).

All diese Eigenschaften machen DOTAP Chlorid auch sehr interessant für die Krebstherapie. Es bietet sich durch diese Eigenschaften die Mög- lichkeit, in, kationische DOTAP-Liposomen eingeschlossene herkömmli¬ che Cytostatika zu applizieren.

Die Transfektionseigenschaften von DOTAP Chlorid und anderen DOTAP-Salzen wie beispielsweise dem Acetat, Bromid, Dihydro- genphosphat, Hydrogensulfat, lodid, Mesylat, Methylsulfat, Trifluoracetat, Sulfat oder Disulfat und Triflat sind hinreichend aus der Literatur bekannt.

DOTAP Dihydrogenphosphat und DOTAP Mesylat werden in der Litera¬ tur nur als Racemat erwähnt. Alle anderen oben genannten Salze sind jeweils als Racemat und als 2S-Enantiomer genannt, vom Chlorid und vom Methylsulfat sind zusätzlich auch die 2R-Enantiomeren erwähnt.

Bei einigen In-Vitro-Studien haben andere Salze, wie etwa DOTAP Me¬ thylsulfat, bessere Transfektionsraten erzielt als DOTAP Chlorid.

In-Vivo angewendet findet jedoch im lebenden Körper ein Anionenaus- tausch an der Liposomenoberfiäche statt, so dass die Vorteile anderer Salze hier nicht zum Tragen kommen. Deshalb sind speziell bei der me¬ dizinischen Anwendung am Menschen und insbesondere zur parentera- len Applikation DOTAP-Salze mit physiologisch unbedenklichen Anionen, wie etwa das entsprechende Chlorid oder das Acetat, vorzuziehen.

Medizinische, insbesondere parenterale Anwendungen stellen höchste Anforderungen an die Qualität und Reinheit der verwendeten Wirk- und Hilfsstoffe. So gibt es von behördlicher Seite sehr strenge Vorschriften bezüglich der Herstellung, der Reproduzierbarkeit der Herstellung sowie des Nebenproduktprofils dieser Verbindungen. Bei parenteral angewen¬ deten Substanzen kommt noch hinzu, dass mikrobiologische Verunreini¬ gungen durch pathogene Keime und Endotoxine strikt zu vermeiden und zu kontrollieren sind.

DOTAP Chlorid und andere DOTAP Salze sind extrem instabil und daher an sich schwierig in einer akzeptablen Reinheit herzustellen sind, so dass sie sich für die Verwendung zur Herstellung einer Arzneimittelfor¬ mulierung eignen.

Wie alle Lipide, die Ölsäurereste tragen, wie beispielsweise die natürli¬ chen Phospholipide DOPC und DOPE, sind alle DOTAP-Salze sehr oxi- dationsempfindlich. Die Oxidationsprodukte ungesättigter Fettsäurederi¬ vate weisen jedoch in der Regel eine hohe Toxizität auf.

Hier sind geeignete Herstell- und Reinigungsmethoden gefordert.

DOTAP Acetat liegt beispielsweise als hochsiedendes Öl vor und ist deshalb technisch nur sehr schwer in hinreichender Qualität zu erhalten.

Die üblichen Methoden zur Überwindung der Instabilität, wie z. B. die Zu- gäbe von Oxidationsschutzmitteln in Form von Ascorbinsäure oder redu¬ ziertem L-Glutathion, schränken die generelle Anwendbarkeit von DOTAP Chlorid stark ein, weil Interaktionen mit den später einzubetten¬ den Wirkstoffen nicht auszuschliessen sind. Ein vollständiger Sauer- stoffausschluss während der Herstellung, Lagerung und Verwendung ist kaum zu verwirklichen, bzw. nur mit sehr grossem Aufwand zu ermögli¬ chen.

DOTAP Chlorid ist kommerziell einzig als Chloroform-Lösung oder als amorpher Feststoff erhältlich.

Amorphes DOTAP Chlorid ist neben seiner Oxidatidationsempfindlichkeit auch noch extrem hygroskopisch und zerläuft bei normaler Luftfeuchtig¬ keit innerhalb kürzester Zeit zu einem schmierigen Film. Dies erschwert die Handhabbarkeit dieser Verbindung enorm.

So wird für amorphes DOTAP Chlorid in der Regel vom Hersteller eine Lagerung unter Schutzgas bei -2O ⁰ C empfohlen und nur eine Haltbarkeit von ca. 6 Monaten garantiert.

Aus der Literatur sind lediglich verschiedene Synthesenwege für die Her¬ stellung von amorphem, racemischem DOTAP Chlorid bekannt:

Eibel und Unger, DE4013632A1 , schildern die Synthese von DOTAP Chlorid aus DOTAP Bromid durch lonentausch im Lösungsmittelsystem Chloroform/ Methanol/wässrige HCl und anschliessende Aufreinigung mittels Chromatographie. DOTAP Bromid wird zuvor in situ aus 1-Brom- 2,3-dioleoyl-oxypropan gewonnen.

Leventis und Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, be¬ richten über die Synthese von DOTAP Chlorid aus DOTAP Jodid durch lonentausch im zweiphasigen System Lösungsmittel/NaCI-Lösung. DOTAP lodid wird vorgängig durch Methylierung von der entsprechenden Dimethylamino-Verbindung mittels Methyiodid gewonnen.

Nantz et al., Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078, beschreiben die Synthese von DOTAP Chlorid durch nichtwässrige lonenaustauscherchromatographie. Die ge¬ wünschte Verbindung wird durch Eindampfen des Eluates erhalten.

Feigner et al., US 5,264,618, nehmen die Methylierung der entsprechen¬ den Dimethylamino-Verbindung direkt zu DOTAP Chlorid mittels Methyl- Chlorid vor. Sie erhalten ein gelbes Wachs angeblich durch eine Kristalli¬ sation aus Acetonitril bei -20 ⁰ C. DOTAP Chlorid ist jedoch bei Raumtem¬ peratur in Acetonitril praktisch unlöslich. Versuche diese sogenannte Kristallisation zu reproduzieren ergaben nur amorphes Material durch Verfestigung der beim Abkühlen aus der heissen Lösung ausgeölten Substanz. Dass es sich hierbei um keine Kristallisation handelt, zeigt sich auch dadurch, dass die Autoren offenbar keinen Reinigungseffekt erzie¬ len und die Substanz chromatographisch aufreinigen müssen.

Folglich sind bisher weder Synthesewege zur Herstellung der beiden enantiomeren DOTAP Chloride noch deren charakteristischen Eigen¬ schaften bekannt. Durch Chemical Abstracts wurden zwar für beide E- nantiomere Nummern vergeben, jedoch werden in den entsprechenden Publikationen ausschliesslich Arbeiten mit dem racemischen DOTAP Chlorid beschrieben.

Insbesondere wenn die Verbindungen für die parenterale Anwendung gedacht sind, ist eine Herstellung, welche eine Behandlung mit lonentau- scherharz einschließt, äusserst problematisch im Hinblick auf mögliche mikrobiologische Verunreinigung, da entsprechende Harze ein idealer Nährboden für Keime sind und auch nach deren Abtötung noch das Risi¬ ko der Kontamination durch Endotoxine bestehen bleibt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, DOTAP Chlorid Salze und Hydrate in hoher Reinheit und mit ausreichender chemischer und physikalischer Stabilität zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung dieser Salze mit hoher Lagerstabilität, so dass sie zur Herstellung pharmazeutischer Formulie¬ rungen einsetzbar sind. Weiterhin besteht ein starkes Bedürfnis nach ei¬ nem reproduzierbaren, in technischem Maßstab durchführbaren Prozess zur Herstellung von stabilen Formen von DOTAP Chlorid Salzen und Hydraten.

Enantiomerenreines DOTAP Chlorid kann aus enantiomerenreinen Edukten analog der für das Racemat beschriebenen Verfahren erhalten werden, also über (R bzw. S)-1-Chlor-2,3-dioleoyloxypropan, über (R bzw. S)-1-LG-2,3-dioleoyloxypropan und lonentausch

(LG=Abgangsgruppe) oder über (R bzw. S)-1-Dimethylamino-2,3- dioleoyloxypropan.

Als weitere Herstellmethode ist die Racemattrennung von racemischem DOTAP Chlorid zu nennen.

Durch Versuche wurde nun überraschend gefunden, dass sich sowohl racemisches, als auch enantiomerenreines, kristallines DOTAP Chlorid mit einer hohen chemischen Reinheit und einer ausgezeichneten Sta¬ bilität in einfacher Weise erhalten lassen. Die so erhaltenen kristallinen Produkte sind bei Raumtemperatur unter Schutzgas praktisch unbe¬ schränkt stabil. Sie sind daher als Bestandteil oder als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Arzneimittelformen geeignet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach enantiomerenrei- nes DOTAP Chlorid sowie stabile Kristallmodifikationen von racemi- schem und enantiomerenreinem DOTAP Chlorid.

Die stabilen Kristallmodifikationen können in kristalliner und teilkristalliner Form vorliegen. Sie weisen eine bisher nie erreichte Reinheit von > 98% zusammen mit einer bisher nie erreichten Stabilität von > 98% in Bezug auf den Ausgangswert nach 12 Monaten Lagerung unter Luftausschluss bei 25°C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit auf. (siehe dazu Tabelle 1). Die DOTAP Chlorid Kristallmodifikationen haben einen Gehalt von weni¬ ger als 1 Aequivalent Wasser oder Kristalllösungsmittel auf 1 Aequivalent DOTAP Chlorid.

Die racemischen DOTAP Chlorid Kristallmodifikationen liegen beispiels- weise in drei verschiedenen Kristallmodifikationen vor (Typ I, Typ II, und Typ III) und zeigen bei Pulverröntgendiffraktions-Messungen mittelschar¬ fe Banden (siehe dazu Abb. 1 bis Abb. 3 und Tabelle 2). Ausgewählte 2 Theta-Werte für die verschiedenen Kristallmodifikationen liegen bei 12.6, 19.5, 20.2, 21.5 und 25.2 (Typ I); bzw. 3.3, 4.9, 19.3, 20.0 und 23.5 (Typ II); bzw. 2.8, 5.8, 20.0, 21.2 und 25.1 (Typ IM).

Enantiomerenreine DOTAP Chloride werden ebenfalls in kristalliner Form erhalten. Ausgewählte 2 Theta-Werte für die gefundene Kristallmodifika¬ tion liegen bei 12.8, 19.4, 19.8, 20.2, und 21.5 (Typ IV, siehe dazu Abb. 4).

Die Enantiomeren sind optisch aktiv. So besitzt (2S)-DOTAP Chlorid ei¬ nen Drehwert von -2.12°, (2R)-DOTAP Chlorid von +2.12° ([α] _D bei 20 ⁰ C, 1%ige Lösung in Dichlormethan).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von DOTAP Chlorid Kristallmodifikationen, welches dadurch gekenn¬ zeichnet ist, dass man DOTAP Chlorid aus einem aprotischen Medium auskristallisiert. Als aprotisches Medium können zu diesem Zweck apro- tische Lösungsmittel oder deren Mischungen verwendet werden.

Das aprotische Medium kann auch in geringem Umfang protische Lö¬ sungsmittel, wie z. B. Wasser, enthalten. In Ausnahmefällen können un¬ ter geeigneten Bedingungen auch 25 Gew.-% protische Lösungsmittel enthalten sein. Die Kristallisation der DOTAP Chloride kann hierbei ohne vorgängige Aufreinigung direkt aus der Reaktionslösung erfolgen. Eben¬ so kann kristallines DOTAP Chlorid durch Umkristallisation von amor¬ phem, teilkristallinem oder kristallinem Material gewonnen werden.

Als aprotische Lösungsmittel eignen sich vor allem • _j Q Ether, wie z. B. Tetra hydrofu ran, Methyltetrahydrofuran, Dioxan,

Diethylether, Dipropylether, Diisopropylether und

Methyl-tert.-butylether Ketone, wie z. B. Aceton und 2-Butanon, Methylisobutylketon,

Methylisopropylketon, «15 Nitrile, wie z. B. Acetonitril und

Ester, wie z. B. Ethylformiat, Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat,

Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat,

Dimethylcarbonat, Diethylcarbonat und 1 ,3-

Dioxolidin-2-on.

20

Diese Lösungsmittel können jeweils rein oder im Gemisch verwendet werden, d. h. dass sowohl die verschiedenen aprotische Lösungsmittel einer Gruppe im Gemisch verwendet werden können, als auch aproti- schen Lösungsmitteltypen miteinander im Gemisch eingesetzt werden 25 können.

Wie oben schon angedeutet, können in dem verwendeten aprotischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch protische Lösungsmittelzusät¬ ze enthalten sein.

30 Solche protischen Lösungsmittelzusätze können typischerweise aus fol¬ genden Lösungsmitteln bestehen:

Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n- Butanol, iso-Butanol, 2-Butanol, tert-Butanol,

35 3-Methyl-1 -butanol und Ethylenglycol, Methoxy- ethanol, Ethoxyethanol, oder

- o. -

Wasser.

Bei den protischen Lösungsmittelzusätzen kann es sich wiederum um Zusätze der reinen Lösungsmittel oder von Gemischen dieser protischen Lösungsmittel handeln.

Die Kristallisation der DOTAP Chlorid Modifikationen wird in der Regel gezielt durch langsames Abkühlen der hergestellten Lösung auf Tempe¬ raturen unter 3O ⁰ C erreicht. Die Bildung der Kristalle erfolgt entweder spontan oder durch Animpfen mit der entsprechenden DOTAP Chlorid Kristallmodifikation.

Die verschiedenen DOTAP Chlorid Kristallmodifikationen lassen sich in¬ einander umwandeln. Die Umwandlungen können durch Temperatur¬

behandlungen der isolierten Kristallmodifikationen bei erhöhter Tempera- tur oder durch länger andauerndes Rühren ihrer Suspensionen unter Kristallisationsbedingungen erreicht werden.

Durch den Einsatz von amorphem oder teilkristallinem DOTAP Chlorid als Ausgangsmaterial für die Umkristallisierung erhält man durch das be- schriebene Verfahren im Wesentlichen kristalline DOTAP Chloride von bisher nie erreichter Reinheit zusammen mit einer bisher nie erreichten Stabilität.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung kristalliner DOTAP Chloride zur Herstellung von Arzneimittelformulierungen, da die kristallinen

DOTAP Chloride unter den gegebenen Bedingungen in fester Form eine ausgezeichnet Stabilität besitzen und eine zeitlich praktisch unbe¬ schränkt eine gleichbleibende und sehr gute Qualität aufweisen.

Darüber hinaus weisen enantiomerenreine DOTAP Chloride andere phy¬ sikalische Eigenschaften auf als das Racemat, insbesondere in Kombi¬ nation mit chiralen Verbindungen, wie den Phospholipiden oder Cho- lesterol.

Vorteilhafter Weise können die gefundenen neuen Eigenschaften der enantiomerenreinen DOTAP Chloride dazu genutzt werden, allein oder

im Zusammenwirken mit geeigneten Phospholipiden, Cholesterol und de¬ ren Derivaten neue Liposomen-Qualitäten zur Verfügung zu stellen, die im Vergleich zu herkömmlichen Formen einerseits dichtere Packungen der Lipide darstellen und andererseits einheitlicher aufgebaut sind. So zeigen Liposomen, die aus den reinen Enantiomeren hergestellt werden, im Vergleich mit den Liposomen aus racemischem DOTAP Chlorid eine um 5°C höhere Hauptphasenübergangstemperatur. Diese ist ein Mass für die Packungsdichte. Liposomen aus DOTAP Chlorid Enantiomeren weisen deshalb auch ein vermindertes Leaking der in sie eingeschlosse¬ nen Verbindung auf.

Dieses hat zur Folge, dass mit pharmazeutisch aktiven Verbindungen be- ladene Liposomen in der Wechselwirkung mit dem Stoffwechsel im menschlichen oder tierischen Körper Wirkstoffe verzögert abgeben wer¬ den. Vorteilhafter Weise können so insbesondere empfindliche Wirkstof- fe gezielter an den gewünschten Ort, bzw. zu dem Organ transportiert werden, wo die Arzneimittelwirkung erwünscht ist.

Auch zeigen die DOTAP Chlorid Enantiomeren besonders in Verbindung mit chiralen Lipiden wie Phospholipiden, Cholesterol und deren Derivate zeillinienspezifisch unterschiedliche Transfektionseigenschaften.

Dem Fachmann ist es möglich, zur Herstellung dieser neuen Liposomen gezielt eine Form oder ein bestimmtes Mischungsverhältnis der hiermit zur Verfügung gestellten DOTAP-Chloride auszuwählen, um Liposomen mit bestimmten neuen Eigenschaften herzustellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind folglich auch die aus der Verwendung der beanspruchten DOTAP Chlorid Formen resultierenden pharmazeutischen Zusammensetzungen. Solche pharmazeutischen Zu- sammensetzungen können die Kristallmodifikationen von (2R,S)-, (2S)- und (2R)-DOTAP Chlorid enthalten zusammen mit anderen pharmazeu¬ tischen Wirkstoffen und bekannten üblicherweise in der Arzneimittelzube¬ reitung eingesetzten Hilfsstoffen sowie einem oder mehreren Lösemit¬ teln.

Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise

als Liposomen, Lipoplexe, Mikroemulsionen und Nanopartikel vorliegen und beispielsweise einen Wirkstoff aus der Gruppe der Peptide, Nukleo¬ tide, Vakzine oder Zytostatika beinhalten.

Die vorliegende Beschreibung ermöglicht es dem Fachmann die Erfin- düng umfassend anzuwenden. Die folgenden Beispiele dienen darüber hinaus zum besseren Verständnis und zur Veranschaulichung möglicher Varianten der Erfindung. Diese Beispiele sind daher in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.

Alle in den folgenden Beispielen erwähnten Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Wo nicht anders bezeichnet sind Gehaltsangaben als Gew.-% aufgeführt.

Beispiele zur Illustrierung der Erfindung

Beispiel 1 Stabilitäten

Zur Stabilitätsbestimmung der kristallinen DOTAP Chloride werden die Substanzen zusammen mit Vergleichsmustern bei 25 ⁰ C und 60% relati¬ ver Feuchte unter Luftausschluss gelagert. In periodischen Abständen wird der verbleibende Gehalt an DOTAP Chlorid gemessen und im Ver¬ gleich zum Ausgangswert angegeben.

Reinheit und Gehalt an DOTAP Chlorid werden mit HPLC bestimmt. Für Typ I werden folgende Werte gefunden:

Die Stabilitätsbestimmung kann zu einem beliebigen Zeitpunkt wiederholt werden, die in Tabelle 1 angegebenen Werte sind reproduzierbar.

Tabelle 1:

Beispiel 2 [Pulverröntgendiagramme]

Zur Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften (Kristallmodifikati¬ onen) der kristallinen DOTAP Chloride werden von diesen Substanzen Pulverröntgendiagramme (Beugungsspektren) aufgenommen.

Kristalline DOTAP Chloride ergeben für Lipide relativ gut aufgelöste Spektren mit mittelscharfen Banden. Die Spektren weisen auf hohe kri¬ stalline Anteile hin. Unter dem Polarisationsmikroskop sind keine amor¬ phen Anteile sichtbar.

Beispiele von Spektren sind in Abb. 1 (Typ I), Abb. 2 (Typ II), Abb. 3 (Typ III) und Abb. 4 (Typ IV ) ersichtlich.

Zum Vergleich ist ein Spektrum einer kommerziell erhältlichen, amorphen Probe in Abb. 5 (amorph) aufgeführt.

In Tabelle 2 sind ausgewählte 2 Theta-Werte für die verschiedenen Kris¬ tallmodifikationen der racemischen und enantiomerenreinen DOTAP Chloride aufgelistet:

Tabelle 2:

Beispiel 3 Hauptphasenübergangstemperaturen

Differential Scanning Caliometry (DSC) Messungen werden an multila- mellaren Liposomen in Wasser vorgenommen. Von den berechneten Mengen an racemischem oder enantiomerenreinem DOTAP Chlorid wer¬ den Liposomen nach der Dünnfilmmethode hergestellt. Die Lipidkon- zentration beträgt dabei jeweils 0.1g/ml. Geeignete Mengen dieser

Dispersionen werden dann in verschliessbare Aluminiumtiegel verbracht und mit einem Kalorimeter 204 Phoenix (Netzsch, Selb, Deutschland)

vermessen. Jeweils drei aufeinanderfolgende Heiz/Kühl-Veriäufe von - 5O ⁰ C bis +2O ⁰ C werden mit 1 °C/min durchgeführt.

Für alle drei DOTAP Chlorid Varianten werden Phasenübergangstempe- raturen unterhalb von O ⁰ C gefunden. Für die Kühlzyklen liegt diese je¬ weils bei -23°C bis -24 ⁰ C. Unterschiede zwischen racemischem und e- nantiomerenreinem DOTAP Chlorid sind jeweils bei den Heizzyklen zu sehen. (2R)-DOTAP Chlorid und (2S)-DOTAP zeigen beide einen endo- thermischen Phasenübergang um -12.5 ⁰ C, während für das Racemat der Phasenübergang bei -17.5 ⁰ C liegt (siehe Abb. 6).

Beispiel 4

Transfektionseigenschaften an COS-7 -Zellen

Racemisches und enantiomerenreines DOTAP Chlorid sowie racemi- sches DOTAP Methylsulfat werden jeweils mit der gleichen Menge Cho- lesterol im Transfektionsmedium dispergiert und ultrabeschallt. Die- Liposomen und GFP-Plasmid-Lösung werden gemischt und 15 Minuten inkubiert,

Mengen pro 6well: 2 μg Plasmid/8 μg Lipid.

Nach 5 Std. Inkubation wird von den Zellen bei 37 °C/5 % CO2 der Über¬ stand abgesaugt, 2 ml frisches Medium zugesetzt und weitere 20 Stun¬ den inkubiert. Die FACS-Analyse ergibt nach der Aufarbeitung für alle Lipoplexe eine effiziente Transfektion. Ein signifikanter Unterschied zwi¬ schen den Transfektionsraten für die einzelnen Lipidmischungen ist fest¬ zustellen:

(R)-DOTAP Chlorid/Cholesterol-Komplex: 32.4 % (S)-DOTAP Chlorid/Cholesterol-Komplex: 11.0 %

(R ₁ S)-DOTAP Chlorid/Cholesterol-Komplex: 25.9 %

(R ₁ S)-DOTAP Methylsulfat/Cholesterol-Komplex: 20.2 %