L'invention concerne un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles. L'invention concerne donc le domaine technique de la lutte contre le développement de populations de rongeurs cibles nuisibles.

Il est connu d'utiliser des poisons sous forme d'appâts rodonticides contre des rongeurs cibles nuisibles. On sait de EP 2 090 164 que la bromadiolone est un anticoagulant de deuxième génération agissant à simple dose. On connaît aussi un appât comprenant de la bromadiolone, la proportion de la bromadiolone dans l'appât étant de 50 ppm.

Un tel appât est susceptible d'être consommé par des animaux autres que des rongeurs cibles nuisibles lorsqu'il est mis à la disposition de rongeurs cibles nuisibles. Il peut être consommé directement (consommation primaire) par des animaux domestiques ou des animaux de compagnie. Il peut aussi être consommé accidentellement par des humains. Une telle consommation peut produire chez ces animaux domestiques, chez ces animaux de compagnie ou chez des humains un empoisonnement qui peut être létal.

En outre, une fraction de la bromadiolone de ces appâts rodonticides peut être ingérée (consommation secondaire) par des animaux -notamment par des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé un tel appât rodonticide ou par des animaux charognards de rongeurs nuisibles morts d'avoir consommé un tel appât rodonticide. Cette consommation secondaire est susceptible d'entraîner à terme la mort de ces animaux prédateurs ou charognards qui peuvent être des animaux -notamment des oiseaux- appartenant à des espèces protégées.

L'invention vise donc à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont efficaces pour contrôler des populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement d'animaux non-cibles -notamment des animaux domestiques, des animaux de compagnie ou des humains- consommant accidentellement un tel appât rodonticide.

L'invention vise aussi à pallier ces inconvénients en proposant un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont efficaces pour contrôler des populations de rongeurs cibles nuisibles et qui permettent aussi de limiter les risques d'empoisonnement secondaire d'animaux domestiques (animaux de compagnie ou d'élevage) ou sauvages -par exemple des renards ou des oiseaux- prédateurs de rongeurs cibles nuisibles affaiblis ayant consommé de l'appât rodonticide ou charognards de rongeurs cibles nuisibles morts empoisonnés.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dont la mise en œuvre est en accord avec les règles de bon usage -notamment vis à vis de la protection des oiseaux, et en particulier des rapaces-.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont respectueux de l'environnement, de la santé humaine et des animaux non cibles -notamment des oiseaux, et en particulier des rapaces-.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui permettent de n'utiliser pour contrôler une population de rongeur cibles nuisibles qu'une faible dose de bromadiolone.

L'invention vise aussi à proposer un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, une composition et un appât rodonticide comprenant un tel stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles qui sont susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des rongeurs cibles nuisibles résistants à des appâts connus de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles.

L'invention vise donc à proposer une alternative à des appâts rodonticides connus.

Pour ce faire, l'invention concerne un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₁ , de la bromadiolone présentant par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention ti de valeur telle que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ ; t ₂ , t ₃ et t ₄ étant les temps de rétention des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère E ₁ , ladite analyse étant réalisée à la température de 27,3°C et dans les conditions suivantes :

- sur une colonne de chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 À ;

- en utilisant, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0, 1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de la phase mobile liquide dans la colonne de chromatographie de 0,25 mL/min ;

- par injection dans la colonne de chromatographie d'un volume de 1 de composition de bromadiolone à une concentration de 1 μg de bromadiolone par millilitre d'acétonitrile. Dans tout le texte :

- le terme « bromadiolone » désigne le composé 3-[3-(4'-bromo[l,l'- biphényl]-4-yl)-3-hydroxy-l-phénylpropyl]-4-hydroxy-2H-l-b enzopyran-2-one ou 3-[3-[4-(4-bromophényl)phényl]-3-hydroxy-l-phénylpropyl]- 2- hydroxychromèn-4-on formule (I) ci-après :

dans laquelle sont représentés les numéros des carbones 1 et 3 du groupement 3-hydroxy-l-phénylpropyle ;

- on désigne par « stéréo-isomères », des isomères de même formule semi-développée, mais dont la position relative des atomes diffère dans l'espace.

On désigne par « stéréo-isomères de configuration » les stéréo-isomères dont la conversion de l'un en l'autre de ces stéréo-isomères de configuration nécessite une rupture/reformation d'une liaison covalente interatomique. Ainsi, on désigne par « stéréo-isomères de configuration », les stéréo-isomères qui ne sont pas des isomères de conformation (ou « rotamères », dont la conversion de l'un en l'autre des isomères de conformation s'accompagne uniquement d'une rotation d'une partie de la molécule selon l'axe d'une liaison σ (sigma) formée par recouvrement axial d'orbitales) ;

- le terme « quantité » s'entend d'une quantité molaire, d'une quantité massique ou d'une quantité volumique. Les proportions sont donc des proportions d'une quantité molaire rapportée à une quantité molaire, d'une quantité massique rapportée à une quantité massique, ou d'une quantité volumique rapportée à une quantité volumique ;

- le terme « sensiblement » indique, de façon habituelle, qu'une caractéristique structurelle ou fonctionnelle ne doit pas être prise comme marquant une discontinuité abrupte, qui n'aurait pas de sens physique, mais couvre non seulement cette structure ou cette fonction, mais également des variations légères de cette structure ou de cette fonction qui produisent, dans le contexte technique considéré, un effet de même nature, sinon de même degré ;

- les expressions « chromatographie liquide à haute pression » ou « chromatographie liquide à haute performance » (« CLHP ») désignent la chromatographie « HPLC » ou « High Performance Liquid Chromatography », et ;

- l'expression « temps de rétention » désigne la durée, mesurée au sommet du pic de chromatogramme, pendant laquelle un composé est retenu sur une colonne de chromatographie.

L'invention concerne donc ledit énantiomère E ₁ à l'état isolé et qui présente la propriété de pouvoir être élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le premier par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone.

Les inventeurs ont observé que l'analyse de la bromadiolone par chromatographie liquide à haute pression dans les conditions décrites ci-dessus fait apparaître quatre signaux ou pics correspondant à quatre composés de même formule chimique développée et correspondant à la formule (I) de la bromadiolone. Deux des signaux détectés correspondent à l'un des diastéréoisomères de la bromadiolone, les deux autres signaux correspondant à l'autre diastéréoisomère de la bromadiolone. L'un des deux diastéréoisomères de la bromadiolone est un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 3-hydroxy-l-phénylpropyle sont de configurations absolues identiques. L'autre des deux diastéréoisomères de la bromadiolone est un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone dans lequel les carbones 1 et 3 du groupement 3-hydroxy-l-phénylpropyle sont de configurations absolues distinctes, lesdites configurations absolues étant déterminées selon les règles séquentielles de priorité et la nomenclature de Cahn, Ingold et Prelog (CIP).

Ils ont déterminé, par l'analyse de préparations de bromadiolone comprenant des proportions variables des deux diastéréoisomères de la bromadiolone, que les deux composés correspondant au signal présentant un temps de rétention d'une valeur de l'ordre de 4,3 min et au signal présentant un temps de rétention (t ₂ ) d'une valeur de l'ordre de 5,0 min correspondent aux deux énantiomères de l'un des deux diastéréoisomères de la bromadiolone et que les deux composés correspondant au signal présentant un temps de rétention (t ₃ ) d'une valeur de l'ordre de 6,3 min et au signal présentant un temps de rétention (t ₄ ) d'une valeur de l'ordre de 8,8 min correspondent aux deux énantiomères de l'autre des deux diastéréoisomères de la bromadiolone.

En raison de légères variations des conditions chromatographiques -notamment des variations de température de la colonne de chromatographie- ledit énantiomère E ₁ peut présenter un temps de rétention (ti) d'une valeur comprise entre 4, 1 min et 4,4 min, le temps de rétention (ti) dudit énantiomère Ei étant inférieur au temps de rétention (t ₂ ) d'un autre stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₂ , d'un diastéréoisomère, dit diastéréoisomère D _{1 2} de la bromadiolone, le temps de rétention (t ₂ ) pouvant présenter une valeur comprise entre 4,8 min et 5,2 min.

Pour les mêmes raisons, ledit énantiomère E ₃ peut présenter un temps de rétention (t ₃ ) d'une valeur comprise entre 6,0 min et 6,6 min, le temps de rétention (t ₃ ) dudit énantiomère E ₃ étant inférieur au temps de rétention d'un autre stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₄ , d'un diastéréoisomère, dit diastéréoisomère D _{3 4} , de la bromadiolone qui est élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, en quatrième position par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone et avec un temps de rétention t d'une valeur comprise entre 8,3 min et 9,0 min.

Les valeurs des temps de rétention t _l5 t ₂ , t ₃ et t ₄ sont donc susceptibles de varier selon des variations des conditions chromatographiques et notamment avec la température de la colonne de chromatographie. Cependant, dans ces conditions chromatographiques (choix de ces phases mobile et stationnaire), l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone reste inchangé.

Ledit énantiomère Ei selon l'invention est donc obtenu sous une forme séparée des énantiomères dudit diastéréoisomère D _{3 4} et sous une forme séparée dudit énantiomère E ₂ dudit diastéréoisomère D _{1 2} . Il est possible de réaliser une telle séparation par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale LUX ^® Cellulose- 1 (00F-4458-B0, phenomenex ^® , Le Pecq, France). Le cas échéant, il est possible de réaliser successivement plusieurs étapes de chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale aux fins d'obtenir la quantité dudit énantiomère E ₁ recherchée et le niveau de pureté souhaité. Il est aussi possible de réaliser une telle séparation par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale préparative, c'est-à-dire sur une colonne de chromatographie de plus grandes dimensions -notamment de diamètre intérieur supérieur à 2 mm- et dans laquelle la phase stationnaire présente une granulométrie supérieure à 3 μπι. On obtient ledit énantiomère E ₁ purifié et isolé des autres stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par élimination de la phase mobile de la fraction collectée et contenant ledit énantiomère E ₁ .

Il n'était pas connu antérieurement de pouvoir séparer les stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone et les énantiomères dudit diastéréoisomère D _1;2 . Dans ces conditions expérimentales, les énantiomères (Ei et E ₂ ) dudit diastéréoisomère D _{1 2} sont séparés et purifiés par chromatographie liquide à haute pression.

Dans ces conditions chromatographiques, on sépare aussi et on purifie les énantiomères dudit diastéréoisomère D _{3 4} . L'un des énantiomères, dit énantiomère E ₃ , dudit diastéréoisomère D _{3 4} est élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le troisième par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone. Dans les conditions décrites ci-dessus, ledit énantiomère E ₃ présente un temps de rétention (t ₃ ) d'une valeur comprise entre 6,0 min et 6,4 min. L'autre énantiomère, dit énantiomère E ₄ , dudit diastéréoisomère D _{3 4} est élué, dans les conditions de chromatographie décrites ci-dessus, le quatrième par rapport aux quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone. Dans les conditions décrites ci-dessus, ledit énantiomère E ₄ présente un temps de rétention (t ₄ ) d'une valeur comprise entre 8,3 min et 9,0 min de sorte que les énantiomères E ₃ et E ₄ dudit diastéréoisomère D _{3 4} sont séparés et purifiés par chromatographie liquide à haute pression sur colonne chirale dans ces conditions.

L'invention concerne donc aussi un procédé chromatographique de séparation des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone -notamment des énantiomères Ei et E ₂ dudit diastéréoisomère D _{1 2} et des énantiomères E ₃ et E ₄ dudit diastéréoisomère D _{3 4} - de la bromadiolone. L'invention concerne donc un tel procédé chromatographique d'obtention dudit énantiomère E ₁ selon l'invention, dans lequel :

- on choisit une colonne de chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 Â ;

- on choisit, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0, 1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 ;

- on réalise la séparation à température ambiante ;

- on introduit en tête de la colonne de chromatographie une composition liquide contenant dudit énantiomère Ei en solution dans de l'acétonitrile, puis ;

- on fait passer la phase mobile liquide avec un débit de 0,25 mL/min dans la colonne de chromatographie et à la suite de la composition liquide, et on collecte en sortie de colonne une fraction de la phase mobile comprenant ledit énantiomère E ₁ , séparément des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère E ₁ , et avec un temps de rétention ti de valeur telle que ti < t ₂ < t ₃ < t ; t ₂ , t ₃ et t étant les temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère E _l5 et ;

- on élimine la phase mobile liquide de ladite fraction de façon à obtenir ledit énantiomère Ei. L'invention concerne aussi un stéréo-isomère de configuration -notamment ledit énantiomère E de la bromadiolone obtenu par un procédé selon l'invention.

L'invention concerne aussi une composition comprenant dudit énantiomère E _l5 à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ . L'invention concerne aussi une composition comprenant dudit énantiomère Ei dans laquelle la quantité dudit énantiomère Ei dans la composition est différente de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans la composition.

L'invention concerne donc une composition comprenant un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₁ , de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et d'un autre stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₂ , de la bromadiolone distinct dudit énantiomère Ei ;

o ledit énantiomère E ₁ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention ti ;

o ledit énantiomère E ₂ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans ces mêmes conditions, un temps de rétention t ₂ ;

ti et t ₂ étant de valeurs telles que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ ; t ₃ et t ₄ représentant des temps de rétention de stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ , ladite analyse étant effectuée à la température de 27,3 °C :

- sur une colonne de chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de - en utilisant, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0, 1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de la phase mobile liquide dans la colonne de chromatographie de 0,25 mL/min ;

- par injection dans la colonne de chromatographie d'un volume de

1 μΕ de composition de bromadiolone à une concentration de 1 μg de bromadiolone par millilitre d'acétonitrile.

L'invention concerne donc une telle composition comprenant dudit énantiomère E _l5 à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ , c'est-à-dire à l'exclusion d'une composition dans laquelle ledit énantiomère E ₁ et ledit énantiomère E ₂ sont en mélange équimoléculaire et non optiquement actif. Dans une composition selon l'invention, ledit énantiomère E ₁ et ledit énantiomère E ₂ ne sont donc pas en mélange équimoléculaire et racémique. On quantifie ledit énantiomère Ei et ledit énantiomère E ₂ par analyse chromatographie dans les conditions suscitées et en réalisant une détection des stéréo-isomères de configuration par photométrie d'absorption ou par spectrométrie d'absorption, en ajustant la concentration de la bromadiolone dans la solution de bromadiolone et le volume injecté selon la sensibilité du détecteur et en mesurant la valeur de l'aire sous le pic correspondant à chaque énantiomère E ₁ et E ₂ . Il est aussi possible de doser ledit énantiomère Ei et ledit énantiomère E ₂ de toute composition comprenant de la bromadiolone en réalisant une détection par spectrométrie de masse en sortie de colonne séparative.

Avantageusement et selon l'invention, la quantité dudit énantiomère E ₁ est supérieure à la quantité dudit énantiomère E ₂ dans la composition. Avantageusement, ledit diastéréoisomère D _{1 2} de la bromadiolone est majoritairement sous forme dudit énantiomère E ₁ dans la composition. Avantageusement, une composition selon l'invention comprend du diastéréoisomère D _{1 2} de la bromadiolone majoritairement sous forme dudit énantiomère Ei.

Dans tout le texte, l'expression « ledit diastéréoisomère Ό _{1 2} est majoritairement sous forme dudit énantiomère E ₁ » signifie que le rapport de la quantité (massique, molaire ou volumique) dudit énantiomère Ei sur la quantité (massique, molaire ou volumique correspondante) dudit diastéréoisomère D _{1 2} (sous toutes ses formes énantiomères) est supérieur à 50%.

Ainsi, en particulier dans une composition selon l'invention :

le rapport de la quantité dudit énantiomère Ei sur la somme des quantités de chaque énantiomère (Ei et E ₂ ) dudit diastéréoisomère D _{1 2} est supérieur à 0,5 (supérieur à 50 %) ;

le rapport de la concentration dudit énantiomère Ei sur la somme des concentrations de chaque énantiomère (Ei et E ₂ ) dudit diastéréoisomère D _{1 2} est supérieur à 0,5 (supérieur à 50 %), et ;

la proportion dudit énantiomère Ei dans la composition est supérieure à la proportion dudit énantiomère E ₂ dans la composition.

Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la somme de la quantité dudit énantiomère E ₁ et de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans la composition est supérieur à 50%, notamment supérieur à 60%, en particulier supérieur à 70%, plus particulièrement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, plus préférentiellement supérieur à 95%, particulièrement préférentiellement supérieur à 98%, encore plus préférentiellement supérieur à 99% ou de l'ordre de 100%.

Dans un mode particulier de réalisation, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère E ₁ telle que le rapport de cette quantité sur la somme de la quantité dudit énantiomère E ₁ et de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans la composition est supérieur à 75 %, de préférence compris entre 85 % et 100 %, plus préférentiellement compris entre 90 % et 98 %.

Dans un autre mode de réalisation, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la somme de la quantité dudit énantiomère E ₁ et de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans la composition est compris entre 98 % et 100 %.

La composition peut aussi comprendre une quantité dudit énantiomère E ₂ telle que le rapport de cette quantité sur la somme de la quantité dudit énantiomère Ei et de la quantité dudit énantiomère E ₂ est inférieur à 50 , notamment inférieur à 25 , préférentiellement compris entre 0 % et 25 , en particulier inférieur à 10 .

Avantageusement et selon l'invention, la bromadiolone est majoritairement sous forme dudit énantiomère Ei dans la composition. La composition comprend donc une quantité dudit énantiomère E ₁ telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est supérieur au rapport de la quantité dudit énantiomère E ₂ sur la quantité de la bromadiolone dans la composition et supérieur au rapport de la quantité de chaque énantiomère (énantiomère E ₃ et énantiomère E ₄ ) dudit diastéréoisomère D _{3 4} sur la quantité de la bromadiolone dans la composition.

Ainsi, en particulier, dans une composition selon l'invention :

- le rapport de la quantité dudit énantiomère E ₁ sur la quantité de la bromadiolone est supérieur à 0,25 (supérieur à 25 %) ;

- le rapport de la quantité dudit énantiomère E ₁ sur la somme des quantités des énantiomères E ₃ et E ₄ dudit diastéréoisomère D _{3 4} et des énantiomères Ei et E ₂ dudit diastéréoisomère D _{1 2} est supérieur à 0,25 (supérieur à 25 %) ;

- le rapport de la concentration dudit énantiomère Ei dans la composition sur la concentration de la bromadiolone dans la composition est supérieur à 0,25 (supérieur à 25 %) ;

- la proportion dudit énantiomère Ei dans la composition est supérieure à la proportion de chacun des énantiomères E ₃ et E ₄ dudit diastéréoisomère D _{3 4} dans la composition et supérieure à la proportion dudit énantiomère E ₂ dans la composition.

Avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère E ₁ telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est supérieur à 25%, notamment supérieur à 50%, en particulier supérieur à 70%, plus particulièrement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, particulièrement préférentiellement supérieur à 95%, plus préférentiellement supérieur à 98%, encore plus préférentiellement supérieur à 99% ou de l'ordre de 100%.

Dans un mode particulier de réalisation, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est supérieur à 70 %, de préférence compris entre 80 % et 100 %, plus préférentiellement compris entre 90 % et 100 %.

Dans un autre mode de réalisation, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est compris entre 95 % et 99 %.

Dans un autre mode de réalisation particulier, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est supérieur à 95%.

Dans un autre mode de réalisation, avantageusement et selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère E ₁ telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est compris entre 98% et 100 % -bornes incluses-.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux selon l'invention, la composition comprend une quantité dudit énantiomère E ₁ telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans la composition est sensiblement de l'ordre de 100 %.

Une composition selon l'invention peut être sensiblement exempte dudit énantiomère E ₂ , c'est à dire que ledit énantiomère E ₂ dudit diastéréoisomère D _{1 2} peut être présent dans la composition mais seulement à l'état de traces. Une composition selon l'invention peut aussi être sensiblement exempte dudit diastéréoisomère D _{3 4} , c'est à dire que ledit diastéréoisomère D _{3 4} peut être présent dans la composition mais seulement à l'état de traces.

Avantageusement et selon l'invention, la composition est à l'état liquide et comprend un solvant liquide de la bromadiolone. Il peut s'agir d'une solution de bromadiolone dans un solvant de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ . Il peut s'agir d'une solution de bromadiolone dans un solvant de la bromadiolone et dans laquelle ledit diastéréoisomère D _{1 2} est majoritairement sous forme dudit énantiomère Ε^

Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ . Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la bromadiolone et dans lequel ledit diastéréoisomère D _{1 2} est majoritairement sous forme dudit énantiomère Ε^ Il peut aussi s'agir d'un solide comprenant de la bromadiolone et dans lequel la bromadiolone est majoritairement sous forme dudit énantiomère Ε^

L'invention concerne donc aussi une composition comprenant dudit énantiomère Ei selon l'invention, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ , ladite composition étant optiquement active. Il n'est cependant pas exclu que la composition selon l'invention, comprenant dudit énantiomère E ₁ , à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ , soit elle-même optiquement inactive.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un appât rodonticide pour des rongeurs cibles nuisibles.

L'invention concerne aussi un appât rodonticide comprenant une composition selon l'invention, et au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles. Un appât rodonticide selon l'invention comprend :

- au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles, et ;

- un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₁ , de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et d'un autre stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₂ , de la bromadiolone distinct dudit énantiomère Ei ;

o ledit énantiomère E ₁ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention ti ;

o ledit énantiomère E ₂ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans ces mêmes conditions, un temps de rétention t ₂ ;

ti et t ₂ étant de valeurs telles que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ ; t ₃ et t représentant des temps de rétention de stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ , ladite analyse étant effectuée à la température de 27,3 °C et dans les conditions suivantes :

- sur une colonne de chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 À ;

- en utilisant, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0, 1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de la phase mobile liquide dans la colonne de chromatographie de 0,25 mL/min ;

- par injection dans la colonne de chromatographie d'un volume de 1 μί de composition de bromadiolone à une concentration de 1 μg de bromadiolone par millilitre d'acétonitrile. Avantageusement, un appât rodonticide selon l'invention comprend un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles et dudit énantiomère E ₁ , à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ .

Les inventeurs ont observé que les deux diastéréoisomères

(diastéréoisomère D _{1 2} et diastéréoisomère D _{3 4} ) de la bromadiolone n'ont pas la même rémanence hépatique chez des rongeurs cibles nuisibles et que ledit diastéréoisomère D _{1 2} est en fait le diastéréoisomère de la bromadiolone qui est le plus rémanent dans le foie de rongeurs cibles, notamment de rongeurs cibles nuisibles. Ils ont observé que ledit diastéréoisomère D _{1 2} d'un appât rodonticide, lorsqu'il est ingéré par un rongeur cible nuisible, disparait du foie du rongeur cible nuisible ayant consommé un tel appât rodonticide selon l'invention moins rapidement que ledit diastéréoisomère D _{3 4} .

Les inventeurs qui sont parvenus à séparer les énantiomères dudit diastéréoisomère D _{1 2} et à isoler ledit énantiomère E ₁ , ont aussi découvert que ledit énantiomère Ei présente :

- une activité anticoagulante plus élevée que l'activité anticoagulante dudit énantiomère E ₂ et aussi plus élevée que les activités anticoagulantes desdits deux énantiomères dudit diastéréoisomère D ₃ , et ;

- une rémanence dans le foie de rongeurs cibles nuisibles supérieure à la rémanence dans le foie de rongeurs cibles nuisibles dudit énantiomère E ₂ et supérieure à la rémanence dans le foie de rongeurs cibles nuisibles de chaque énantiomère dudit diastéréoisomère D ₃ .

Ainsi, ledit énantiomère E ₁ selon l'invention permet la réalisation d'appâts rodonticides avec une efficacité élevée pour une quantité de bromadiolone ingérée réduite.

De tels appâts rodonticides comprenant dudit énantiomère Ei à titre de nouvel agent rodonticide sont susceptibles de pouvoir être utilisés pour lutter contre des populations de rongeurs cibles nuisibles résistants à des traitements rodonticides connus. Avantageusement, un appât rodonticide selon l'invention comprend une quantité massique de bromadiolone telle que le rapport (proportion massique) de cette quantité massique de bromadiolone sur la quantité massique de l'appât rodonticide est inférieur à 50 ppm -c'est-à-dire inférieur à 50 mg de bromadiolone par kilogramme d'appât rodonticide-. Avantageusement, la proportion massique de la bromadiolone par rapport à l'appât rodonticide est supérieure à 1 ppm. Avantageusement, la proportion massique de la bromadiolone par rapport à la quantité d'appât rodonticide est comprise entre 1 ppm et 50 ppm (1 mg à 50 mg de bromadiolone par kilogramme d'appât rodonticide), notamment comprise entre 1 ppm et 30 ppm (1 mg à 30 mg de bromadiolone par kilogramme d'appât rodonticide), de préférence comprise entre 1 ppm et 20 ppm (1 mg à 20 mg de bromadiolone par kilogramme d'appât rodonticide), encore plus préférentiellement comprise entre 1 ppm et 10 ppm (1 mg à 10 mg de bromadiolone par kilogramme d'appât rodonticide).

Avantageusement, un appât rodonticide selon l'invention comprend une quantité dudit énantiomère Ei telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de la bromadiolone dans l'appât est supérieur à 70%, plus particulièrement supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%, particulièrement préférentiellement supérieur à 95%, plus préférentiellement supérieur à 98%, encore plus préférentiellement supérieur à 99% ou de l'ordre de 100%, et de la bromadiolone en proportion massique inférieure à 25 ppm par rapport à l'appât rodonticide.

Avantageusement et selon l'invention, l'excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles est choisi pour permettre une consommation de l'appât par des rongeurs cibles nuisibles. Avantageusement et selon l'invention, chaque excipient comestible est non létal pour des rongeurs cibles nuisibles. L'excipient comestible n'est pas rodonticide en lui-même.

Avantageusement et selon l'invention, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi dans le groupe formé des graines de céréale -notamment des graines de céréale décortiquées-, des moutures de graines de céréale, des farines de graines de céréale, des flocons de graines de céréale, du son de céréales et des graines non céréalières, par exemple des graines de luzerne -notamment sous forme décortiquée, sous forme de mouture, sous forme de farine, sous forme de flocons ou de son-. L'excipient comestible peut comprendre tout support susceptible d'être consommé par des rongeurs cibles nuisibles.

Avantageusement, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi dans le groupe formé des aliments d'origine végétale et des aliments d'origine animale. Avantageusement, l'excipient comestible comprend au moins un aliment choisi pour stimuler l'appétit des rongeurs cibles nuisibles. En particulier, cet aliment est choisi dans le groupe formé de graines d'une ou de plusieurs céréales, de graines décortiquées d'une ou de plusieurs céréales, des moutures de graines d'une ou de plusieurs céréales, des flocons de graines d'une ou de plusieurs céréales, du son d'une ou de plusieurs céréales et des farines de graines d'une ou de plusieurs céréales. À titre d'exemple, on choisit les céréales dans le groupe formé de l'avoine, du blé, de l'orge, du maïs, du soja et du riz.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des aliments sucrés. Par exemple, il peut s'agir d'aliments comprenant au moins un sucre choisi dans le groupe formé du saccharose, du lactose, du fructose et du glucose. Il peut s'agir d'un sirop de sucre -par exemple, d'un sirop de sucre obtenu par hydrolyse de l'amidon- ou d'un sirop de sucre obtenu par hydrolyse de saccharose (sirop de sucre inverti), ou d'un sirop de sucre de betterave, ou d'un sirop d'érable ou d'un sirop de canne à sucre, ou d'un sirop obtenu à partir d'une plante du genre stevia.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des flocons et de la farine de l'albumen de noix de coco (coprah). Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des noix, des noisettes et des amandes -râpées et/ou en poudre-.

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des graisses végétales, des huiles végétales (par exemple huile de colza, graisse de soja, huile de tournesol, beurre de cacao, huile d'arachides, beurre d'arachides, huile de maïs, huile de palme), des graisses animales et des huiles animales (beurre, saindoux, huile de poisson).

Avantageusement, l'aliment est choisi dans le groupe formé des protéines d'origine végétale et des protéines d'origine animale. À titre d'exemple, on peut citer par exemple le lait en poudre -notamment le lait écrémé en poudre-, les œufs -notamment les œufs en poudre-, les hydrolysats de protéines d'origine animale et les hydrolysats de protéines d'origine végétale.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide est choisi dans le groupe formé des appâts solides comprenant de la bromadiolone et un excipient comestible solide. Avantageusement, l'appât rodonticide peut être un solide à l'état divisé, par exemple sous forme de boulettes ou de granulés. Avantageusement, l'appât rodonticide peut aussi être un solide sous forme de bloc ou de pâte susceptibles d'être consommés par les rongeurs cibles nuisibles ou d'un matériau solide susceptible d'être rongé par les rongeurs cibles nuisibles. Avantageusement, l'appât rodonticide solide selon l'invention peut se présenter sous forme d'un bloc rigide, d'un bloc semi-rigide, d'une mousse, d'une poudre ou d'un gel.

Avantageusement, l'appât rodonticide se présentant sous forme d'une poudre, sous forme d'une mousse ou sous forme d'un gel est adapté pour pouvoir souiller la fourrure du(de) rongeur(s) cible(s) nuisible(s) et pour pouvoir être ingérée par celui(ceux)-ci lors de son(leur) toilettage.

Il peut s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ . Il peut aussi s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la bromadiolone et dans lequel la quantité dudit énantiomère E ₁ est supérieure à la quantité dudit énantiomère E ₂ . Il peut aussi s'agir d'un appât rodonticide solide comprenant de la bromadiolone dans lequel la bromadiolone est majoritairement sous forme dudit énantiomère Ei.

Avantageusement et selon l'invention, l'appât rodonticide est choisi dans le groupe formé des appâts liquides comprenant de la bromadiolone et un excipient comestible liquide. L'appât rodonticide est alors une boisson pour des rongeurs cibles nuisibles. Il peut s'agir d'une solution de bromadiolone dans un solvant de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ . Il peut aussi s'agir d'une solution de bromadiolone dans un solvant de la bromadiolone et dans laquelle la quantité dudit énantiomère Ei est supérieure à la quantité dudit énantiomère E ₂ . Il peut aussi s'agir d'une solution de bromadiolone dans un solvant de la bromadiolone et dans laquelle la bromadiolone est majoritairement sous forme dudit énantiomère E ₁ . Il peut aussi s'agir d'une suspension de bromadiolone à l'état solide dans un milieu liquide. Il peut aussi s'agir d'une émulsion de bromadiolone dans un milieu liquide.

L'invention concerne donc aussi un appât rodonticide dans lequel la bromadiolone est optiquement active. Il n'est cependant pas exclu que la bromadiolone de l'appât rodonticide selon l'invention soit optiquement inactive.

Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un colorant. Un tel colorant permet en particulier de donner audit appât rodonticide une couleur aisément détectable et identifiable par une personne manipulant l'appât rodonticide.

Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un conservateur apte à assurer sa conservation lors de son stockage. Avantageusement, l'appât rodonticide comprend au moins un composé amérisant de type benzoate de dénatonium, aussi connu sous le nom de « Bitrex ^® » et destiné à réduire les risques de consommation accidentelle par des organismes non cibles.

Avantageusement, dans une variante particulière, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention comprennent exclusivement de la bromadiolone -à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et dudit énantiomère E ₂ - à titre de substance rodonticide. En particulier, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention sont exempts de toute autre substance anticoagulante à usage rodonticide distincte de la bromadiolone. Cependant, dans cette variante selon l'invention, la composition et l'appât rodonticide peuvent comprendre toute substance anti-nuisible autre qu'un rodonticide, telle qu'une substance insecticide et/ou acaricide.

Avantageusement, dans une autre variante particulière, la composition et l'appât rodonticide selon l'invention comprennent de la bromadiolone à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ et au moins une autre substance distincte de la bromadiolone à titre de substance rodonticide. Cette autre substance rodonticide distincte de la bromadiolone peut être une autre substance anticoagulante -notamment du type anti-vitamine K ou non- ou une autre substance rodonticide non anticoagulante.

L'invention concerne aussi un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide comprenant :

- au moins un excipient comestible pour des rongeurs cibles nuisibles, et ;

- un stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E _l5 de la bromadiolone, à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère E ₁ et d'un autre stéréo-isomère de configuration, dit énantiomère E ₂ , de la bromadiolone distinct dudit énantiomère Ei ;

o ledit énantiomère E ₁ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans des conditions décrites ci-après, un temps de rétention ti ;

o ledit énantiomère E ₂ présentant, par analyse chromatographique d'une composition de bromadiolone comprenant quatre stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone effectuée dans ces mêmes conditions, un temps de rétention t ₂ ;

ti et t ₂ étant de valeurs telles que ti < t ₂ < t ₃ < t ₄ ; t ₃ et t représentant des temps de rétention de stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone distincts dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ , ladite analyse étant effectuée à la température de 27,3 °C et dans les conditions suivantes : ^■ sur une colonne de chromatographie liquide à haute pression de dimensions 150 x 2 mm, et renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 À ;

^■ en utilisant, à titre de phase mobile liquide, un mélange formé d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0, 1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de la phase mobile liquide dans la colonne de chromatographie de 0,25 mL/min ;

■ par injection dans la colonne de chromatographie d'un volume de 1 μΕ de composition de bromadiolone à une concentration de 1 μg de bromadiolone par millilitre d'acétonitrile.

L'invention concerne aussi un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide selon l'invention, ladite quantité d'appât étant suffisante pour être rodonticide.

Avantageusement et selon l'invention, on dissémine une quantité d'appât rodonticide comprenant dudit énantiomère E ₁ , à l'exclusion d'un mélange racémique dudit énantiomère Ei et dudit énantiomère E ₂ . On dissémine une quantité d'appât rodonticide, ledit appât rodonticide comprenant une quantité réduite de bromadiolone et étant choisi pour limiter les intoxications secondaires d'espèces non-cibles consommant des rongeurs empoisonnés. Avantageusement, la quantité dudit énantiomère Ei dans l'appât rodonticide peut être supérieure à la quantité dudit énantiomère E ₂ dans l'appât rodonticide. Dans un tel procédé, avantageusement et selon l'invention, la bromadiolone peut être majoritairement sous forme dudit énantiomère Ei.

Avantageusement et en variante selon l'invention, on choisit en combinaison :

- l'excipient comestible ;

- une quantité dudit énantiomère Ei distincte de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans l'appât rodonticide ; - une proportion dudit énantiomère E ₁ par rapport à la bromadiolone, et ;

- une proportion massique de la bromadiolone dans l'appât rodonticide, et ;

- une quantité d'appât rodonticide disséminé ;

de façon que des rongeurs cibles nuisibles consomment une quantité de la bromadiolone suffisante pour être létale pour lesdits rongeurs cibles nuisibles consommant dudit appât au cours d'une période unique de 24 heures consécutives.

Un appât rodonticide selon cette variante de l'invention est un appât mortel en une seule prise ou « one-shot » en anglais. Avantageusement et selon cette variante de l'invention, la proportion massique de la bromadiolone dans l'appât est inférieure à 50 ppm, notamment comprise entre 5 ppm et 25 ppm.

Avantageusement et dans une autre variante selon l'invention, on choisit en combinaison :

- l'excipient comestible ;

- une quantité dudit énantiomère Ei distincte de la quantité dudit énantiomère E ₂ dans l'appât rodonticide ;

- une proportion dudit énantiomère E ₁ par rapport à la bromadiolone, et ;

- une proportion massique de la bromadiolone dans l'appât rodonticide, et ; - une quantité d'appât rodonticide disséminé ;

de façon que des rongeurs cibles nuisibles consomment une quantité de la bromadiolone ;

o non létale pour des rongeurs cibles nuisibles, c'est-à-dire généralement non létale pour les rongeurs cibles nuisibles, consommant dudit appât pendant une période de 24 heures consécutives, et ;

o suffisante pour être létale pour des rongeurs cibles nuisibles consommant dudit appât pendant plusieurs périodes de 24 heures.

Avantageusement et selon l'invention, les périodes de 24 heures sont consécutives.

Cette autre variante de l'invention vise donc aussi un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles dans lequel on dissémine une quantité d'appât rodonticide létale pour des rongeurs cibles nuisibles consommant durablement cet appât rodonticide et non létale pour des rongeurs ou des animaux non cibles consommant accidentellement cet appât rodonticide. On parle alors d'un procédé de lutte « multi-doses » ou, en anglais, « multi-feeding ». Dans un tel procédé selon l'invention, la consommation d'appât rodonticide par un rongeur cible nuisible pendant une durée de 24 heures est insuffisante pour entraîner la mort dudit rongeur, alors qu'une consommation répétée d'appât rodonticide pendant au moins deux jours consécutifs permet d'entraîner la mort du rongeur cible nuisible.

Cette autre variante de l'invention vise donc un procédé de lutte contre une population de rongeurs cibles nuisibles dans lequel on met à disposition des rongeurs cibles nuisibles une quantité d'appât rodonticide susceptible d'être ingérée par les rongeurs cibles nuisibles, ladite quantité d'appât rodonticide étant suffisante pour tuer des rongeurs cibles nuisibles consommant ledit appât rodonticide pendant plusieurs jours.

Avantageusement, dans cette autre variante d'un procédé selon l'invention, on adapte la quantité d'appât rodonticide disséminé, la proportion massique de la bromadiolone par rapport à l'appât rodonticide et la proportion dudit énantiomère Ei par rapport à la proportion dudit énantiomère E ₂ pour que la consommation de l'appât rodonticide soit létale pour des rongeurs cibles nuisibles consommant quotidiennement de l'appât pendant au moins 2 périodes de 24 heures -notamment de 3 à 7 périodes-, lesdites périodes étant consécutives.

Avantageusement, dans cette autre variante d'un procédé selon l'invention, la proportion dudit énantiomère E ₁ étant supérieure à 95% -notamment de l'ordre de 100%- par rapport à la bromadiolone, la proportion massique de la bromadiolone par rapport à l'appât rodonticide peut être comprise entre 1 ppm et 25 ppm, notamment comprise entre 1 ppm et 15 ppm, en particulier de l'ordre de 10 ppm.

Dans un procédé selon l'invention, on met à disposition des rongeurs cibles nuisibles une quantité d'appât rodonticide suffisante pour satisfaire quotidiennement l'appétit des rongeurs cibles nuisibles, ledit appât rodonticide comprenant majoritairement dudit énantiomère Ei par rapport audit diastéréoisomère D _{1 2} et par rapport à la bromadiolone.

Dans un procédé selon l'invention, on adapte la quantité d'appât rodonticide disséminé, la quantité dudit énantiomère Ei par rapport audit énantiomère E ₂ et par rapport à la bromadiolone et la proportion massique de la bromadiolone par rapport à l'appât rodonticide de façon à permettre une consommation d'appât rodonticide pendant plusieurs jours par des rongeurs cibles nuisibles, tout en limitant :

- les risques d'intoxication primaire de mammifères et oiseaux non cibles susceptibles de ne consommer qu'occasionnellement et accidentellement un tel appât rodonticide ;

les risques d'intoxication secondaire, par exemple des prédateurs des rongeurs cibles, susceptibles de consommer des rongeurs -morts ou vifs- cibles ayant ingéré une quantité dudit appât.

L'invention concerne également un stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone, un procédé d'obtention de ce stéréo-isomère de configuration, une composition comprenant ce stéréo-isomère de configuration, un appât rodonticide et un procédé de lutte contre les rongeurs cibles nuisibles caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre uniquement non limitatif et qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles :

- la figure 1 représente une analyse chromatographique d'un mélange des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone sur colonne chirale et de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone sur la même colonne chirale ;

- la figure 2 est une représentation graphique en histogramme de l'évolution de la concentration hépatique de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone chez des rats gavés avec de la bromadiolone ; - la figure 3 est une représentation en histogramme du temps de coagulation (temps de quick) de rats gavés avec chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone, et ;

- la figure 4 est une représentation graphique en histogramme de la concentration hépatique de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone chez des rats gavés avec un unique stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone.

Séparation des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone

On réalise une séparation des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par chromatographie liquide à haute pression sur une colonne chirale LUX ^® Cellulose- 1 (phenomenex, Le Pecq, France) renfermant une phase stationnaire chirale constituée de particules de cellulose tris(3,5-diméthylphénylcarbamate), lesdites particules étant d'une taille moyenne de 3 μπι et présentant une taille moyenne de pores de 1000 A. On utilise, à titre de phase mobile, un mélange formé de d'acétonitrile (A) et d'eau comprenant 0,1% en volume d'acide formique (B), avec un rapport volumique A/B de 80/20 et avec un débit de 0,25 mL/min dans la colonne de chromatographie. La concentration de la composition à analyser est de 1 μg de bromadiolone par millilitre d'acétonitrile et le volume injecté sur la colonne est de 1 μL·. La détection est effectuée par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) en mode d'ionisation négative par électronébulisation (ESI, « ElectroSpray Ionization »). La température du gaz nébuliseur est de 350°C et son débit est de 8 L/min. La pression du gaz nébuliseur est portée à 2700 hPa. En particulier, on détecte les transitions MRM {« Multiple Reaction Monitoring » m/z 525,1→ 250,1 et m/z 525,1 → 181 correspondant au signal de la bromadiolone. Un exemple de chromatogramme est présenté en figure 1.

Les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone sont de :

- pour l'énantiomère E ₁ dudit diastéréoisomère D _1;2 , ti = 4,3 min ;

- pour l'énantiomère E ₂ dudit diastéréoisomère D _{1 2} , t ₂ = 5,0 min ; - pour l'énantiomère E ₃ dudit diastéréoisomère D _{3 4} , t ₃ = 6,3 min, et ;

- pour l'énantiomère E ₄ dudit diastéréoisomère D ₃ , t = 8,8 min.

Les valeurs de temps de rétention t _l5 t ₂ , t ₃ et t ₄ sont susceptibles de varier selon les conditions chromatographiques. Cependant, en tout état de cause, dans ces conditions (choix de ces phases stationnaire et mobile), l'ordre d'élution des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone reste inchangé. Â titre indicatif, les valeurs des temps de rétention de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone peuvent varier avec une variation de quelques degrés Celsius de la température de la colonne de chromatographie. Pour ledit énantiomère E ₁ , le temps de rétention ¾) peut varier entre 4,1 min et 4,4 min. Pour ledit énantiomère E ₂ , le temps de rétention (t ₂ ) peut varier entre 4,8 min et 5,2 min, Pour ledit énantiomère E ₃ , le temps de rétention (t ₃ ) peut varier entre 6,0 min et 6,6 min. Pour ledit énantiomère E ₄ , le temps de rétention (t ) peut varier entre 8,3 min et 9,0 min.

Extraction de la bromadiolone de foies de rats traités à la bromadiolone

Homogénéisation de l'échantillon de foie

On pèse avec précision de l'ordre de 0,525 g (±0,025 g) de foie de rat que l'on place dans un tube en polypropylène de 50 mL. On ajoute 10 mL d'acétone et on soumet la suspension à une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur/disperseur Ultra- Turrax ^® pendant une durée de l'ordre de 30 sec. On rince la tige de l'homogénéisateur/disperseur à l'eau chaude puis 2 fois avec 20 mL d'acétone dans un tube en polypropylène. On centrifuge l'homogénat pendant 5 min à une vitesse de centrifugation de 3000 rpm (rotation par minute). On collecte et on transvase le surnageant dans un tube à essai. On soumet l'échantillon à une évaporation sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40° C de façon à former un extrait sec.

Élimination des lipides

Dans le tube contenant l'extrait sec, on ajoute 1 mL d'acétonitrile de façon à solubiliser l'extrait sec. On lave la solution d'acétonitrile 2 fois successivement avec 1 mL d'hexane. L'extrait débarrassé des lipides est séché sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40°C, puis repris avec 0,5 mL de méthanol et solubilisé par agitation sous vortex. On ajoute ensuite 0,5 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q). L'échantillon est homogénéisé sous vortex.

Extraction de la bromadiolone sur phase solide (« SPE,

Solid Phase Extraction »)

On fait passer 1 mL de dichlorométhane (CH ₂ C ₂ ), puis 1 mL de méthanol (CH ₃ OH), puis 1 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) sur une cartouche Oasis HLB lcc (WAT094225, Waters). On dépose ensuite l'extrait de foie débarrassé des lipides (lmL MeOH/H ₂ O Milli-Q) et contenant la bromadiolone en tête de la cartouche préalablement conditionnée. L'extrait de foie pénètre dans la cartouche par gravité au contact de la phase solide de la cartouche. On dépose en tête de cartouche 1 mL de solution de lavage formée de méthanol (CH ₃ OH) et d'eau ultra-pure (H ₂ O) en proportion volumique de 90/10. On sèche la cartouche par aspiration sous vide connectée en partie basse de la cartouche. On dépose ensuite en tête de cartouche 1 mL de solution d'élution formée de dichlorométhane (CH ₂ Ct ₂ ) et de méthanol (CH ₃ OH) en proportion volumique de 90/10 et on collecte en bas de cartouche un éluat comprenant la bromadiolone. On évapore le solvant de Γ éluat sous un flux d'azote (N ₂ ) à la température de 40°C. On reprend l'échantillon dans avec 0,5 mL d'acétonitrile (NC-CH ₃ ) et on filtre la solution d'acétonitrile contenant la bromadiolone sur filtre 0,2 μ m.

Rémanence hépatique des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone chez le rat

On administre par gavage ("per os") à des rats SD

« Sprague Dawley » mâles et femelles, âgés de 8 semaines et pesant de l'ordre de 200 g, un mélange de diastéréoisomères (diastéréoisomère D _{1 2} et diastéréoisomère D _{3 4} ) de la bromadiolone en solution dans un mélange d'huile végétale et de DMSO à 5 . La proportion molaire dudit diastéréoisomère D _{1 2} est de 56% et la proportion molaire dudit diastéréoisomère D _{3 4} est de 44%. On administre (à J0) de la solution de gavage de façon que la quantité de bromadiolone ingérée par chaque rat soit de l'ordre de 13 mg par kilogramme de rat. Pour éviter l'hémorragie, les rats gavés sont traités quotidiennement par administration par voie sous cutanée d'une dose de vitamine Kl (à titre d'antidote vis-à-vis de l'hémorragie) à raison de 0,1U pour 200g de poids de rat vif.

À Jl (J+l), J3 (J+3) et J7 (J+7) après le gavage, on euthanasie 4 rats préalablement anesthésiés à l'isoflurane, on prélève le foie des rats euthanasiés puis on extrait la bromadiolone du foie et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression sur une colonne chirale comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on quantifie chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone par comparaison avec une courbe d'étalonnage.

Les résultats sont représentés en figure 2. L'énantiomère E ₁ est représenté par des colonnes blanches, l'énantiomère E ₂ est représenté par des colonnes noires, l'énantiomère E ₃ est représenté par des colonnes à hachures obliques et l'énantiomère E ₄ est représenté par des colonnes à hachures horizontales. L'énantiomère Ei présente la rémanence dans le foie des rats la plus élevée des quatre énantio mères E ₁ , E ₂ , E ₃ et E ₄ . Cette propriété fait de l'énantiomère Ei le candidat préférentiel pour la réalisation d'un appât rodonticide faiblement dosé en agent rodonticide -en particulier pour son utilisation dans un procédé « multi-feeding »-.

Pouvoir anticoagulant de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone

On administre par gavage à J0 à des rats de laboratoire (OFA, Sprague Dawley de 200 g) mâles, soit :

- une composition comprenant de l'énantiomère Ei à raison de 1 ,5 mg dudit énantiomère E ₁ par kilogramme de rat, soit ;

- une composition comprenant de l'énantiomère E ₂ à raison de 1 ,5 mg dudit énantiomère E ₂ par kilogramme de rat, soit ; - une composition comprenant de l'énantiomère E ₃ à raison de 1 ,5 mg dudit énantiomère E ₃ par kilogramme de rat, soit ;

- une composition comprenant de l'énantiomère E ₄ à raison de 1 ,5 mg dudit énantiomère E ₄ par kilogramme de rat.

Sur ces rats, on prélève du sang à Jl, J3, J7 et J14 et on réalise une mesure du temps de coagulation (temps de Quick, exprimé en secondes) du plasma au moyen du kit "Neoplastine CI Détermination of Prothrombin Time" (Diagnostica Stago, Asnière, France) par mesure sur un appareil Thrombotimer option 2 plus (Behnk Electronik, Norderstedt, Allemagne).

Les résultats obtenus sont donnés en figure 3 dans laquelle :

- les barres d'histogramme blanches correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère Ei selon l'invention ;

- les barres d'histogramme noires correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E ₂ ;

- les barres d'histogramme à hachures obliques correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E ₃ , et ;

- les barres d'histogramme à hachures horizontales correspondent au temps de coagulation des rats traités avec ledit énantiomère E ₄ .

A titre indicatif, la valeur normale du temps de coagulation de rats non traités est de l'ordre de 10 à 20 secondes.

L'ingestion d'une dose de 1,5 mg par kilogramme de rat dudit énantiomère E ₁ selon l'invention est suffisante pour maintenir un effet anticoagulant jusqu'à J7.

Rémanence hépatique de chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone

On prélève le foie des rats traités ci-dessus aux fins d'analyse comparative du pouvoir anticoagulant des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone puis on extrait la bromadiolone du foie et on dose la quantité de chacun des stéréo-isomères de configuration de la bromadiolone par analyse par chromatographie liquide haute pression sur une colonne chirale comme décrit ci-dessus. On mesure l'aire sous les pics du chromatogramme obtenu et on quantifie chaque stéréo-isomère de configuration de la bromadiolone par comparaison avec une courbe d'étalonnage. On dose les énantiomères E _l5 E ₂ , E ₃ et E ₄ de la bromadiolone présents dans le foie des rats. On exprime la rémanence hépatique de chaque énantiomère en microgramme ^g) d' énantiomère par gramme (g) de foie de rat.

Les résultats sont représentés en figure 4 dans laquelle :

- la barre d'histogramme blanche correspond à la rémanence dudit énantiomère E ₁ selon l'invention dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E ₁ ;

- la barre d'histogramme noire correspond à la rémanence dudit énantiomère E ₂ dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E ₂ ;

- la barre d'histogramme à hachures obliques correspond à la rémanence de Γ énantiomère E ₃ dudit diastéréoisomère D _{3 4} de la bromadiolone dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E ₃ , et ;

- la barre d'histogramme hachurée horizontalement correspond à la rémanence de Γ énantiomère E ₄ dudit diastéréoisomère D _{3 4} de la bromadiolone dans le foie de rats traités avec ledit énantiomère E ₄ .

Ledit énantiomère E ₁ selon l'invention présente la plus forte rémanence hépatique parmi les énantiomères de la bromadiolone. Cette propriété fait de Γ énantiomère E ₁ le candidat préférentiel pour la réalisation d'un appât rodonticide comprenant une faible proportion de substance rodonticide -en particulier pour son utilisation dans un procédé « multi-feeding »-.

II va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un appât rodonticide et un procédé de lutte contre des rongeurs cibles nuisibles sont sujets à des infinités de variantes tant dans la formulation de l'appât que dans les modes de mise en œuvre du procédé.