MéTODO Y SISTEMA DE ANáLISIS ESTEREOLóG1CO PARA PILAS DE IMáGENES EN DOS DIMENSIONES

D E S C R I P C I ó N

CAMPO TéCNICO DE LA INVENCIóN

La presente invención trata el análisis automático por ordenador de una pila de imágenes (o serie de imágenes bidimensionales alineadas) capturadas de un espacio tridimensional, preferentemente en el ámbito de aplicación de Ia microscopía láser confocal, para producir otra pila de imágenes bidimensionales que permite obtener sin sesgo ni errores humanos, mediante Ia técnica estereológica del disector óptico, numerosos y diversos datos cuantitativos que caracterizan tridimensionalmente el/los objeto/s de estudio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

La estereología es una parte de Ia matemática aplicada que, combinando Ia probabilidad geométrica y Ia estadística, estudia Ia obtención de información cuantitativa de objetos tridimensionales a partir de secciones planas de los mismos. Existen muchas técnicas esterológicas útiles para obtener una gran diversidad de información de interés en diversos campos, como por ejemplo el biológico (en estudios histológicos, de ecología y tecnología de los alimentos), geológico (estudio de materiales) y biomédico (neurología, medicina forense,...). En este último caso, Ia estereología oferta un conjunto de técnicas que permiten Ia estimación de parámetros tales como Ia densidad de células, el volumen total de un área o núcleo cualquiera, Ia longitud de procesos, densidad celular, etc., obteniendo unos resultados fiables y precisos en dichas cuantificaciones, que pueden llegar a tener incluso, valor diagnóstico.

Entre las técnicas estereológicas, las más populares son las que se agrupan bajo el término de estereología basada en diseño, las cuales presentan Ia ventaja de dar lugar a estimaciones exactas y precisas sin necesidad de realizar presunciones acerca de Ia forma, tamaño y orientación de los objetos de interés, ni de aplicar correcciones matemáticas teóricas a posteriori.

La estereología es inseparable de la estadística porque para efectuar un análisis estereológico hay que muestrear y calcular promedios, por Io tanto, dentro de los estudios estereológicos conviene hacer hincapié en aclarar algunos términos que son utilizados comúnmente:

Precisión (en inglés, "precisión'): este término se encuentra estrechamente relacionado con la varianza encontrada en las estimaciones, de modo que cuanto menor sea Ia varianza mayor será la precisión. Exactitud, ausencia de sesgo (en inglés, "unhiased'y. se puede decir que una estimación es exacta, insesgada o no tiene sesgo si, en ausencia de error experimental, el promedio de diferentes medidas da lugar al valor real.

En definitiva, Ia precisión de un estimador y Ia ausencia de sesgo no son los mismos conceptos, pudiéndose dar distintas combinaciones entre ellos. El término "sesgo" es un término estadístico que hace referencia a si el método de estimación da lugar a resultados correctos (es insesgado: Ia estima obtenida es igual al valor real) o incorrectos (es sesgado: Ia estima obtenida no es igual al valor real). Un método es insesgado cuando el promedio de diferentes medidas de una variable (por ejemplo, Ia densidad de partículas) obtenidas en un conjunto de muestras representativas de una población, da lugar al valor real de Ia población.

Al investigador y desarrollador, lo que Ie interesa es que las estimaciones sean precisas e insesgadas, Io cual se puede lograr con los métodos estereológicos denominados métodos basados en diseño (en inglés, "design-based", "assumption-free" o "model-free"), que presentan Ia ventaja, frente a los conocidos métodos estereológicos basados en presunciones (en inglés, "assumption-based" o "model- based"), de no

producir resultados susceptibles de ser erróneos a priori [ver "Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precisión and bias", West, M. J., Trends in Neuroscience, VoI. 22, No. 2, pp. 51-61 , 1999]. Dentro de los métodos estereológicos basado en presunciones, puede recogerse el método que describe Ia patente US 5754688 y que llama "point counting", susceptible de ser sesgado, es decir, que podría dar lugar a resultados erróneos aún cuando todos los pasos definidos en ese método de "point counting" se efectuaran correctamente. En concreto, con el método de conteo de objetos expuesto en US 5754688 se obtienen resultados correctos sólo cuando las partículas a contar son esféricas e iguales en tamaño, pero en Ia medida en que las partículas se alejen de esa situación ideal o presunción, más sesgados (incorrectos) serán los resultados, porque Ia probabilidad de que un objeto sea contado depende del tamaño del objeto (cuanto más grande sea el objeto, mayor probabilidad de ser contado) y de su orientación (determinadas orientaciones al capturar Ia imagen del objeto favorecen secciones de mayor o menor tamaño). También cabe hacer notar que el método de US 5754688 trabaja exclusivamente sobre una sola imagen bidimensional (2D) que contiene el objeto u objetos a contar. Entre los métodos estereológicos basado en diseño, se conoce bien el llamado método del disector [definido por Sterío, D. C, en 1984; ver "The unbiased estimation of number and sizes of arbitrar/ partióles using the disector", Journal of Microscopy, VoI. 134, pp. 127-136, Mayo 1984]. Basándose en el método del disector definido por Sterio, posteriormente se han realizado varias adaptaciones y modificaciones (entre ellas, los llamados métodos "3D-counting", "unbiased sampling brick", "optical disector", "fraccionador"...). De entre estos métodos, el del disector óptico [ver "The new stereological tools: Disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathologícal research and diagnosis", Gundersen H. J. G. et al., Acta Pathology, Microbiólogo, and Immunology

Scandinavian (AMPIS) ₁ VoI. 96, pp. 857-881 , Octubre 1988] es el más

representativo y extendido, tanto a Ia hora de cuantificar el número de partículas por unidad de volumen o región de interés en muestras de tejido, como para ser usado como sonda de muestreo a Ia hora de obtener otros parámetros estereológicos (altura, volumen y superficie media de las partículas embebidas en una determinada estructura ...).

Para garantizar una cuantificación ¡nsesgada, el diseño del disector evita Ia necesidad de utilizar presunciones sobre Ia forma, tamaño, disposición, orientación, etc. de los objetos, de forma que cuando el disector se aplica sobre muestras obtenidas siguiendo un muestreo aleatorio uniforme y sistemático, todas las partículas de Ia población sólo pueden ser contadas una única vez y tienen igual probabilidad de ser cuantificadas. Así se evita el sesgo que poseen los métodos estereológicos basados en presunciones cuando las condiciones experimentales son distintas de las ideales, como el descrito en US 5754688, cuyo proceso de muestreo, en estas condiciones (habitualmente las más frecuentes), se traduce en Ia obtención de muestras no representativas de Ia población.

Normalmente se aplican muchos disectores sobre un tejido (en el caso de muestras biológicas) y se obtiene un valor medio de los parámetros de interés (densidad de partículas, diámetro medio de las partículas del tejido, ...).. Cuando el diseño del muestreo asegura Ia obtención de muestras representativas de Ia población, Ia única fuente de sesgo asociada al método del disector óptico son errores humanos en Ia realización del muestreo o durante el proceso de selección manual de las partículas que cumplen los requisitos teóricos del disector, o ciertos fenómenos que pueden darse durante el procesamiento del tejido.

A pesar del gran interés que suscita en la ciencia básica y aplicada la cuantificación insesgada de partículas que permite el disector, su implementación en Ia práctica tardó debido a que el procedimiento experimental de muestreo y conteo de objetos resultaba muy largo y tedioso. Por ello, el uso de este método no empezó a extenderse hasta el desarrollo de sistemas informáticos y sistemas motorizados que permitieron aumentar

su eficiencia mediante Ia automatización del proceso de muestreo. No obstante, Ia automatización del procedimiento de conteo (si bien sí se han diseñado ciertos enfoques que permiten agilizar su implementación) no se ha conseguido hasta ahora, por Io que, globalmente, en el estado de Ia técnica actual sólo puede decirse que existe una semiautomatización del método estereológico del disector. Por otra parte y hasta Ia fecha, el desarrollo tecnológico que ha permitido Ia automatización del proceso de muestreo sólo se ha aplicado a Ia microscopía fotónica.

Hoy en día, es bien sabido que frente a Ia microscopía fotónica una alternativa que se presenta con ciertas ventajas es Ia microscopía confocal por cuanto que, en primer lugar, los microscopios confocales tienen una mayor resolución óptica debido a Ia eliminación de Ia luz procedente de los planos superiores e inferiores al plano focal y, en segundo lugar, permiten utilizar simultáneamente diferentes marcadores fluorescentes. Esto último permite realizar estudios de colocalización, además de contribuir a aumentar Ia eficiencia del proceso de obtención de muestras, al utilizar un protocolo experimental más corto y menos reactivos y animales de laboratorio. Además, otra particularidad interesante de Ia microscopía confocal es que permite obtener imágenes 2D altamente contrastadas (objetos fluorescentes sobre un fondo negro) y captadas como series de distintos planos focales (por consiguiente, perfectamente alineadas en planos horizontales), por Io que es muy adecuada para el muestreo en tres dimensiones (3D) que requiere Ia estereología basada en diseño.

Los avances tecnológicos que se han aplicado en el campo de Ia microscopía fotónica y que han permitido automatizar el proceso de muestreo en el método del disector óptico, aunque no el procedimiento de conteo, pueden aplicarse a Ia microscopía confocal, dando lugar a sistemas semi-automatizados que ¡mplementan Ia estereología basada en diseño, como propone Peterson, D.A. en "Quantitative Histology Using Confocal Microscopy: Implementation of Unbiased Stereology Procedures" , disponible en www.idealibrary.com [ver Methods, VoI. 18, pp. 493-507, Agosto 1999].

Por otro lado, en Ia actualidad existen algunas implementaciones de métodos estereológicos, en particular, del disector, aplicables a pilas de imágenes bidimensionales, que han intentado, sin conseguirlo, abordar Ia automatización del procedimiento de conteo. En esta línea, cabe citar el programa software DISECTOR [ver "DISECTOR program for unbiased estimation of partióle number, numerical density and mean volume", de Kubínova et al., Image Analysis Stereology, VoI. 20, pp. 119- 130, 2001], en cualquiera de sus dos versiones (una primera soportada por el programa de análisis de imagen ImageTool y otra posterior independiente del programa entorno de soporte pero con utilidades más limitadas). Aunque en Ia citada descripción se afirma que este programa DISECTOR tiene un "modo automático" para el conteo de partículas [pp.125-126] que resulta dos veces más eficiente con respecto a Ia tradicional técnica de conteo de forma manual [pp. 130], los resultados del programa DISECTOR requieren de una posterior corrección manual, debido a que el algoritmo no resuelve Ia conectividad de todas las partículas. Concretamente, dicho programa DISECTOR no toma en cuenta las partículas no convexas y, por tanto, en el caso de estructuras ramificadas, el operador debe intervenir manualmente, haciendo marcas sobre las imágenes para, corrigiendo las partes de una misma partícula que el programa contabiliza como partículas separadas, determinar Ia conectividad entre perfiles, con el riesgo de cometer errores humanos en ese proceso.

En este contexto, hay que entender que una partícula es una estructura tridimensional objetivo del conteo y análisis estereológico, localizada en un espacio también tridimensional (en el caso de muestras de interés biológico, puede estar embebida en un tejido; en el caso de una aplicación geológica, una partícula puede estar referida a una determinada fase de un mineral embebida en una matriz, etc.); mientras que un perfil es cada una de las secciones de una partícula que se visualizan al ser seccionada por un plano (por ejemplo, al tomar una fotografía con un microscopio) por tanto, un perfil es una estructura 2D. Esta diferenciación no

es trivial porque el objetivo de Ia estereología es contar partículas y no perfiles. Puesto que una misma partícula puede tener distintos perfiles en una misma imagen, determinar Ia conectividad de una partícula equivale a determinar cuántos perfiles pertenecen a una misma partícula. Este proceso es clave porque, si dos perfiles pertenecientes a una misma partícula se entienden como dos partículas distintas se introduce un sesgo, dado que se sobrestima el número real de partículas (fenómeno inconveniente que ocurre en el programa software DISECTOR y que requiere de Ia participación del operador para ser corregido, como anteriormente se ha comentado).

Otra aplicación informática que cabe mencionar es Ia implementada por F. Cordeliéres en forma de rutina compilada (en inglés "plugin") para el programa de análisis de imagen Image j y que dispone gratuitamente en http://rsb.info.nih.gov/ii/pluqins/track/obiects.html. La aplicación informática de F. Cordeliéres, que denomina "3D Objects

Counter", es meramente un algoritmo de conteo indiscriminado de objetos que no tiene en cuenta las particularidades del disector, pues no realiza ninguna discriminación previa de perfiles de los objetos o las partículas que contabiliza. Por consiguiente, en ausencia de sistemas de microscopía confocal que permitan aplicar las ventajas de Ia automatización del proceso de muestreo ya conocidas para Ia microscopía fotónica, así como ante Ia inexistencia de software que provea un conteo automático de objetos en Ia aplicación de métodos estereológicos basados en diseño, actualmente, Ia implementación de Ia estereología en microscopía confocal se lleva a cabo de forma manual o, a Io sumo, con Ia asistencia de ciertas herramientas informáticas que simplemente facilitan al operador Ia discriminación y cuantificación de objetos dentro de una imagen en dos dimensiones (por ejemplo, el ya citado el programa software DISECTOR o el sistema Sterolnvestigator [ver www.mbfbioscience.com] ).

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención viene a resolver Ia problemática anteriormente expuesta, en todos y cada uno de los aspectos comentados, concibiendo un método y sistema de análisis estereológico para pilas de imágenes, donde todas las imágenes que componen Ia pila son bidimensionales y se han tomado en una sucesión ordenada y estando alineadas con respecto a un eje transversal que atraviesa dicha pila. Un fin de la invención es derivar ciertos parámetros característicos de dicha estructura (por ejemplo, Ia densidad de partículas) a partir del análisis estereológico al que se somete Ia serie finita de imágenes suyas y que constituye Ia pila de imágenes original.

En particular y con respecto al análisis estereológico en que está basada esta invención, el método y sistema que aquí se describen permiten seleccionar de forma automática las partículas que cumplen los requisitos teóricos impuestos por el método del disector y sus derivados, permitiendo automatizar el proceso de conteo de partículas, así como el de obtención de otro tipo de información estereológica (altura, volumen, superficie,...) de forma precisa e insesgada. Esta invención pues se adapta a las exigencias de procedimientos de análisis estereológico tales como los de "3D-counting",

"unbiased sampling brick" y "optical disector" citados en los antecedentes.

En este contexto, se entiende como partícula u objeto a Ia suma de todos los perfiles que muestran contigüidad a Io largo de una pila de imágenes. La partícula se extiende en un espacio de tres dimensiones, constituyendo una parte o el total de Ia estructura 3D centro de estudio, mientras que el perfil es bidimensional. La reconstrucción de partículas a partir de perfiles no es trivial porque el objetivo de la estereología es contar partículas y no perfiles, como antes se ha comentado. La presente invención resuelve Ia conectividad de perfiles en el conteo de partículas, partiendo de unos criterios de selección que impiden cometer subestimaciones y/o sobrestimas del número de partículas, como más adelante se describe.

A partir de Ia pila de imágenes original tomadas de Ia estructura 3D, Ia invención que se describe genera una pila de imágenes, también bidimensionales, donde se han seleccionado las partículas que cumplen los criterios teóricos del disector. Cuando varias pilas originales de imágenes se toman siguiendo un muestreo aleatorio uniforme y sistemático, el conjunto de pilas de salida constituyen una muestra representativa de Ia población, y permite derivar, mediante inferencia estadística, parámetros de dicha población.

En el caso de muestras de interés biológico, una partícula puede estar embebida en un tejido; en el caso de una aplicación geológica, una partícula puede estar referida a una determinada fase de un mineral embebida en una matriz, etc.

Un aspecto de Ia presente invención se refiere a un método de análisis estereológico para pilas de imágenes que cumple el principio general de Ia estereología (esto es: es posible identificar las partículas u objetos de forma no ambigua a partir del conjunto de perfiles producidos por una o más secciones a través del mismo), así como los requisitos teóricos de conteo de objetos impuestos por el método estereológico del disector (se tienen que contar todos los objetos que pertenecen a Ia muestra). Los objetos (partículas) pertenecientes a Ia muestra son aquellos cuyos transectos (en este contexto, el transecto de una partícula u objeto se refiere a Ia suma de sus perfiles y Ia línea recta que los conecta en el plano de Ia sección) están completamente o parcialmente dentro de un marco de conteo bidimensional, teniendo en cuenta que: - los transectos de las partículas no íntersectan con cualquiera de los dos lados prohibidos del marco de conteo ni con Ia prolongación de esos lados,

- dichos transectos no están presentes en un plano prohibido de Ia pila de imágenes (el plano donde queda Ia imagen superior de Ia pila). La sonda del disector, con Ia que se realiza el muestreo requerido según este método estereológico, se entiende como una sonda

tridimensional compuesta por un marco de conteo generalmente, aunque no necesariamente, cuadrangular, cuyos dos de sus cuatro lados (de forma fija, pero elegidos arbitrariamente) se extienden al infinito (lados prohibidos). El marco de conteo se superpone de forma alineada en las imágenes de Ia pila, de forma que, conociendo el área encerrada dentro de cada uno de los marcos y Ia distancia entre imágenes de Ia pila, el volumen encerrado dentro de Ia sucesión de marcos es conocido.

Esta invención no trabaja con una única imagen, sino con una pila ("stack", en inglés) de imágenes, definida como una serie ordenada y finita de imágenes binarias del mismo tamaño, paralelas entre ellas y tomadas a una distancia fija y según una alineación. Considerando cada imagen como un plano que puede ser definido mediante un eje de coordenadas cartesiano con un origen común dentro de cada una de las mismas, entonces, las imágenes están alineadas cuando un eje perpendicular a cada una de las imágenes las intersecta a todas en un mismo punto del plano definido anteriormente. El orden de las imágenes es el de captura con el equipo adecuado, suponiendo que éstas se toman consecutivamente empezando por uno de los dos extremos de Ia serie.

Para asegurar el cumplimiento del principio general de Ia estereología, Ia pila original de imágenes, o pila de entrada al sistema de Ia invención, debe cumplir una serie de requisitos: las imágenes de Ia pila deben de estar alineadas o ser susceptibles de alinearse, deben captarse en dos dimensiones y con un alto contraste (o con un nivel de contraste tal que permita binarizarlas posteriormente), y con una resolución suficiente para permitir diferenciar con claridad objetos o partículas distintas. Este tipo de imágenes puede conseguirse mediante el empleo de un microscopio confocal, aunque cualquier otro equipo (físico, óptico,...) capacitado para registrar imágenes con los requisitos anteriores de contraste y alineación es aplicable. El número mínimo de imágenes a utilizar y que componen Ia pila de entrada es de dos y, para garantizar que todas las partículas pueden aparecer en dicha pila, Ia distancia entre imágenes consecutivas tiene que

ser menor al tamaño de Ia partícula más pequeña que se va a contar.

La identificación no ambigua de objetos a partir de sus perfiles, así como el conteo de objetos siguiendo los requisitos teóricos del disector, se consigue mediante Ia combinación del diseño de pilas binarias (pilas cuyas imágenes vienen definidas por una secuencia de píxeles con uno de dos posibles valores: "0" ó "1") con el empleo de operaciones lógicas y algoritmos pertenecientes al campo del análisis de imagen. Estas operaciones y algoritmos se aplican sobre imágenes de Ia pila original, de pilas derivadas durante el proceso de Ia aplicación, y sobre las pilas binarias citadas anteriormente.

Las pilas binarias diseñadas para conseguir Ia selección de las partículas que cumplen los requisitos de conteo son dos, ambas contienen el mismo número de imágenes y del mismo tamaño que Ia pila original. La primera de las pilas binarias (en adelante pila binaria 1 ) contiene dos tipos de imágenes: Ia primera es una imagen cuyos píxeles tienen todos el valor lógico "1", el resto de imágenes son ¡guales y están diseñadas a partir del marco de conteo. Considerando que Ia línea formada por los lados prohibidos y su extensión y los lados de Ia imagen definen dos áreas cerradas, una de las cuales contiene el marco de conteo, los píxeles del área comprendida entre esta línea (incluidos los que forman dicha línea) y los lados de Ia imagen que no contienen el marco de conteo, toman valor lógico 1. El resto de píxeles toma valor lógico "0". La segunda de la pilas binarias (en adelante pila binaria 2) está constituida por un único tipo de imágenes, con los píxeles dentro del área definida por el marco de conteo con valor lógico "1".

Las herramientas típicas de los programas de análisis de imagen utilizadas en este método son las siguientes: Ia dilatación (en inglés "dilate") de las imágenes, Ia eliminación de bordes ("border-kill"), Ia reconstrucción ("reconstruct") y los operadores lógicos AND, OR y XOR. La dilatación consiste en el incremento de una fila de píxeles alrededor de un objeto. La erosión ("erode") es Ia operación complementaria

a la dilatación y consiste en Ia eliminación de una fila de píxeles alrededor de un objeto, sin embargo, nótese que el efecto de Ia erosión o dilatación dependen de Io que el programa de análisis de imagen específicamente entienda por fondo de Ia imagen y objeto. Así, el resultado de una dilatación en que se considera como objeto una agrupación de píxeles encendidos es el mismo que una erosión en Ia misma imagen, cuando se considera como objeto una agrupación de píxeles apagados. El método de Ia invención tiene en cuenta este hecho, de manera que ambos algoritmos son utilizados, dependiendo de las características de cada imagen, para producir los efectos típicos de Ia dilatación.

La operación de reconstrucción ("reconstruct") permite obtener los perfiles completos de una imagen que presentan al menos uno de sus píxeles alineados con perfiles de objetos de otra, por Io tanto, esta operación requiere dos operandos: el primero de ellos es Ia imagen binaria de Ia que se quieren recuperar los perfiles de objetos y el segundo (también denominado semilla, "seed" en inglés) Ia imagen que determinará que perfiles de la anterior serán reconstruidos. La reconstrucción se puede entender como un producto lógico "AND" en el que el resultado se extiende a los píxeles adyacentes: basta que exista coincidencia en un solo píxel para que se extraiga el perfil completo de la imagen binaria original.

La eliminación de bordes ("border-kill"): elimina los píxeles con valor lógico "1" que se encuentren tocando cualquiera de los márgenes de Ia imagen y, con estos, todos los que, a su vez, tengan cualquier relación de vecindad. El resultado es la eliminación de los perfiles que se encuentren apoyados en los márgenes de Ia imagen.

El tamaño de las imágenes a utilizar, así como del marco de conteo, depende del tamaño relativo de las partículas a contar. Estos dos tamaños pueden determinarse a partir del diámetro Feret máximo de Ia partícula más grande de Ia muestra. Se entiende en el estado de la técnica, que un diámetro Feret es Ia distancia entre pares de líneas paralelas tangentes al perímetro de una partícula, considerando entre todos los

diámetros Feret posibles de una misma partícula, que el de mayor valor es el diámetro Feret máximo.

Así, en un plano XY de dos dimensiones, el tamaño del marco de conteo y de las imágenes que forman Ia pila de entrada cumple que: i) La distancia entre el borde de Ia imagen y el marco de conteo tiene que ser mayor al diámetro Feret máximo de Ia mayor de las partículas a contar. ii) El tamaño del marco de conteo tiene que ser tal que en su interior puede albergar un mínimo de uno o dos perfiles de partículas (por tanto, se puede diseñar un marco de conteo cuyo lado sea mayor al doble del diámetro Feret de Ia mayor de las partículas a contar). iii) La relación área ocupada por el perfil de Ia partícula-fondo de Ia imagen suficiente para superponer un marco de conteo como el definido en ii).

Las partículas de las imágenes que forman Ia pila de entrada, en las que se superpone un marco de conteo con las características citadas anteriormente, pueden clasificarse en los siguientes grupos:

1 - partículas que tocan lados de Ia imagen;

2- partículas presentes en Ia imagen superior de Ia pila (plano prohibido);

3- partículas que tocan lados prohibidos del marco de conteo establecido sobre Ia imagen; 4- partículas que no tocan el marco de conteo, pero tampoco tocan lados de

Ia imagen ni lados prohibidos del marco de conteo, ni están presentes en Ia imagen superior de Ia pila;

5- partículas que tocan el marco de conteo sin tocar lados de Ia imagen ni lados prohibidos del marco de conteo y no están presentes en Ia imagen superior de Ia pila.

Los tres primeros grupos de partículas no son excluyentes, pero los grupos 4-5 sí lo son con los anteriores y entre sí; es decir, una partícula puede pertenecer al grupo 4, al 5 o a uno o varios de los tres primeros grupos, pero no puede simultanear los grupos 4 y 5 o cualquiera de éstos con uno o más de los grupos 1 , 2 ó 3. El grupo 5 está compuesto por las partículas que cumplen los requisitos impuestos por el método estereológico

del disector, nótese que Ia presente invención está encaminada a discriminar las partículas que pertenecen a este grupo del resto de partículas.

En concreto, el método de análisis estereológico para pilas de imágenes en dos dimensiones que aquí se propone parte de Ia pila original de imágenes, ya ordenadas secuencialmente desde una imagen superior a una imagen inferior y una vez binarizadas las imágenes, y obtiene una pila de salida constituida por imágenes correspondientes exclusivamente a las partículas del grupo 5. Para ello, en este método se siguen los siguientes criterios de selección:

- Las partículas que tocan lados de Ia imagen se eliminan del conteo.

- Las partículas que tocan los lados prohibidos se eliminan del conteo, mientras que las partículas que tocan los otros dos lados (lados permitidos) se incluyen en el mismo. - Las partículas presentes en Ia imagen superior (Ia primera imagen o plano prohibido) de Ia pila de imágenes original o de entrada se eliminan del conteo. Nótese que, al igual que los lados prohibidos del marco de conteo, el plano prohibido se define de forma arbitraria pero constante, entre Ia primera y última imagen de Ia pila. El presente método puede adaptarse a ambas situaciones modificando el diseño de Ia pila binaria 1 , sin embargo, para el desarrollo de Ia siguiente explicación se entiende que el plano prohibido se corresponde con Ia imagen superior (primera imagen de Ia pila).

Durante el desarrollo de Ia aplicación se generan, entre otras, las siguientes pilas de imágenes: 1 ) Una pila de perfiles prohibidos que contiene los perfiles de Ia pila original que cumplen al menos uno de los siguientes criterios:

- tocan un lado de Ia imagen (perfiles pertenecientes a partículas del grupo 1 ),

- pertenecen a Ia imagen superior de Ia pila original (perfiles pertenecientes a partículas del grupo 2),

- tocan al menos un lado prohibido del marco de conteo (perfiles

pertenecientes a partículas del grupo 3).

2) Una pila preliminar de partículas prohibidas constituida por imágenes que contienen algunos de los perfiles de las partículas pertenecientes a los grupos 1 , 2 y 3, obtenidos a partir de Ia pila original y la pila de perfiles prohibidos mediante Ia aplicación de herramientas convencionales que existen en Ia mayoría de programas software actuales de análisis de imagen.

3) Una pila de partículas prohibidas que contiene todos los perfiles de todas las partículas de Ia muestra pertenecientes a los grupos 1-3. Esta pila completa de las partículas prohibidas se obtiene a partir de los perfiles de Ia pila original y Ia pila preliminar de partículas prohibidas generada anteriormente. La obtención de dicha pila de partículas prohibidas puede ser inmediata o requerir de Ia aplicación del algoritmo que Ia genera de forma iterativa, dependiendo del grado de complejidad de las partículas. 4) Una pila de partículas intermedia compuesta por las partículas pertenecientes a los grupos 4 y 5. ésta se obtiene eliminando de la pila original las partículas prohibidas pertenecientes a los grupos 1 , 2 y 3 (que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior de Ia pila original) es decir, las partículas recogidas en Ia pila de partículas prohibidas construida en Ia fase anterior.

5) Una pila de perfiles permitidos que sólo contiene los perfiles de Ia pila de partículas intermedia que tocan el marco de conteo, (es decir, los perfiles de las partículas del grupo 5 que tocan el marco de conteo).

6) Una pila preliminar de partículas permitidas constituida por imágenes que contienen los perfiles de las partículas del grupo 5 que tocan el marco de conteo y algunos de los perfiles de estas partículas que no Io hacen. Esta pila se genera a partir de Ia pila original y Ia pila de perfiles permitidos generada en el paso anterior.

7) Una pila de partículas permitidas completa, obtenida a partir de Ia pila original y Ia pila preliminar de partículas permitidas, que es Ia pila de salida del sistema y contiene todos los perfiles de todas las partículas que deben

ser objeto de análisis (partículas del grupo 5). La obtención de dicha pila de partículas permitidas completa puede ser inmediata o requerir de Ia aplicación del algoritmo que Ia genera de forma iterativa, dependiendo del grado de complejidad de las partículas. La aplicación de iteraciones en el algoritmo para Ia obtención de las pilas de partículas prohibidas y permitidas completas es necesario en el caso de análisis de partículas cóncavas y/o convexas de gran complejidad. En este caso, las pilas resultantes de Ia aplicación del algoritmo para Ia obtención de las pilas de partículas prohibidas y permitidas completas se consideran pilas de partículas prohibidas/permitidas incompletas, sometiéndose a tantos ciclos de reconstrucción como sea necesario antes de dar lugar a las pilas de partículas prohibidas y permitidas completas.

El análisis posterior de Ia pila de salida o pila de partículas permitidas completa mediante el empleo de algoritmos de análisis de imagen ya conocidos, permite Ia obtención de parámetros (número de partículas por unidad de volumen, área, superficie, longitud, media de las partículas, etc.) de forma automática, sin sesgo ni necesidad de intervención manual que puede inducir a errores humanos. Por Io tanto, nuestro método permite automatizar Ia implementación del método del disector y todas sus variaciones ("disector óptico", "3D-counting", "unbiased sampling brick, etc.), así como Ia obtención de parámetros utilizando muéstreos fundamentados en Ia sonda del disector.

Por otra parte, una consideración importante a tener en cuenta al realizar Ia reconstrucción de las partículas a partir de sus perfiles es qué se entiende exactamente por contigüidad. Se puede considerar que dos perfiles son contiguos, por Io tanto, pertenecen a Ia misma partícula, cuando comparten al menos un píxel que ocupa las mismas coordenadas en dos imágenes consecutivas de una serie alineada de imágenes. Según este criterio, en el caso extremo en que dos perfiles se tocan por los vértices de sus vóxeles nos encontramos ante dos partículas distintas. No obstante, en

ocasiones es lógico suponer que dos perfiles que se tocan por los vértices de alguno de sus vóxeles pertenecen a Ia misma partícula: esto es así, por ejemplo, cuando se realizan operaciones que implican erosión o eliminación de píxeles durante el procesado de Ia imagen para eliminar ruido. El método de Ia invención puede adaptarse a ambos criterios, en el desarrollo siguiente se ha adoptado el segundo, sin embargo el primero de ellos se puede adoptar fácilmente eliminando las dilataciones durante el proceso.

Otro aspecto de Ia presente invención consiste en un sistema de análisis estereológico para pilas de imágenes en dos dimensiones que implementa el método anterior, constituyendo un sistema enteramente automatizado que permite Ia obtención de información de interés estereológico (como por ejemplo el conteo de partículas), según el método estereológico del disector y sus derivados, aplicado a Ia práctica en equipos actuales de obtención de imágenes, incluyendo el microscopio confocal. Este sistema comprende medios de captación de imágenes, tales como las que proporciona un equipo de microscopía confocal, que contienen al menos un perfil de al menos una partícula tridimensional. Dichos medios de captación de imágenes pueden estar equipados con un soporte motorizado x-y-z (una platina en el caso del microscopio confocal) para el objeto de imagen y un controlador electrónico, programado para desplazar dicho soporte en cualquiera de los tres ejes del sistema de coordenadas espacial (x-y-z). El control del desplazamiento del soporte motorizado x-y-z posibilita Ia captación de imágenes de manera que, de forma automática, se realiza Ia captura de pilas de imágenes siguiendo estrategias de muestreo compatibles con los requisitos teóricos del método del disector. Dicho muestreo automático requiere de Ia información espacial necesaria para que Ia unidad de control pueda ejecutar el muestreo. Tal información se puede obtener de una pila o imagen de referencia que contenga el núcleo o región de interés completo con su contorno delimitado, o por cualquier otro medio. Las pilas de imágenes obtenidas pueden ser procesadas, posteriormente o de forma simultánea a su obtención, por una unidad central de proceso

(CPU) configurada básicamente para la binarización de las imágenes y Ia selección de partículas según el criterio del disector, a fin de dar lugar a un archivo conteniendo diversos datos estereológicos y/o a una pila de salida procesada y/o una pila de entrada. Los medios de procesamiento informático (CPUs) utilizados suelen estar conectados a correspondientes monitores para Ia visualización de los datos e imágenes obtenidos en cada paso.

Opcionalmente, el controlador electrónico puede proporcionar a su salida una señal de video analógica o digital y que forma la pila original de imágenes que es entrada al método descrito anteriormente.

Adicionalmente, el sistema comprende medios de procesamiento informático conectados al controlador electrónico para binarizar las imágenes manejadas por el método, que pueden consistir en un procesador de propósito general (CPU) y que en el entorno de los sistemas estereológico se conoce como ordenador confocal [ver el artículo de Peterson en

Methods, VoI. 18, pp. 493-507, Agosto 1999; citado en los antecedentes]. Aparte del monitor del ordenador confocal, el sistema puede comprender otro monitor de vídeo conectado al controlador de los medios de captación de imágenes para visualizarlas. En dichas imágenes, recibidas desde dicho controlador, los medios de procesamiento informático o CPU normalmente de otro ordenador, el conocido como ordenador de esterología, están programados para establecer el marco de conteo que se requiere para contar partículas en el disector óptico u otros métodos estereológicos derivados del disector. Esta misma CPU u otros procesadores conectados a ella también pueden estar configurados para ejecutar los pasos descritos del método de análisis estereológico para pilas de imágenes bidimensionales, pudiendo visualizar las imágenes en el monitor del ordenador de esterología (por tanto, Ia presente invención viene a complementar los sistemas semi- automáticos descritos en el el artículo de Peterson citado antes). La funcionalidad de los ordenadores de estereología y confocal puede programarse en una sola CPU conectada al controlador electrónico del

microscopio confocal o del equipo óptico que se utilice según Ia aplicación práctica.

Algunos posibles campos de aplicación de Ia invención son Ia microscopía confocal, la microscopía óptica en cualquiera de sus vertientes (fluorescencia, fotónica, interferencial o Nomarski, contraste de fases, campo claro y oscuro,...), Ia microscopía electrónica, la radiología (Ia resonancia magnética, la radiografía por rayos x, ecografía, ultrasonidos, tomografía computerizada, tomografía por emisión de positrones,...), Ia fotografía (analógica y digital) y sistemas de video, en cualquiera de sus aplicaciones (diagnóstico, investigación, industrial,...) y campos (biología, geología, medicina, ...).

Un último aspecto de la presente invención se refiere a un programa de ordenador que comprende medios de código de programación adaptados para realizar el método descrito anteriormente.

DESCRIPCIóN DE LOS DIBUJOS

Para complementar Ia descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de esta descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado Io siguiente:

La figura 1.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas), que contienen los perfiles de las partículas en el proceso de análisis que, según una realización preferida de Ia invención, realiza Ia selección de perfiles que tocan lados de Ia imagen.

La figura 2.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas), que contienen los perfiles de las partículas en el proceso de análisis que, según una realización preferida de Ia invención, realizan Ia selección de perfiles que tocan lados prohibidos

y/o están presentes en Ia imagen superior de Ia pila original.

La figura 3.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas, respectivamente: pila original, pila de perfiles prohibidos y pilas resultado de una reconstrucción directa e inversa), que contienen los perfiles de una partícula (dibujados detalles de los píxeles en negro) en las respectivas pilas de imágenes (interrelacionadas por un diagrama de flechas que indica las operaciones entre imágenes) usadas para Ia reconstrucción de partículas a partir de perfiles, según una realización preferida de Ia invención. La figura 4.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas, respectivamente: pila original, pila preliminar de partículas prohibidas incompleta usada para Ia reconstrucción de partículas a partir de perfiles y pilas resultado de una reconstrucción directa e inversa), que contienen los perfiles de una partícula (dibujados detalles de los píxeles en negro) en las respectivas pilas de imágenes (interrelacionadas por un diagrama de flechas que indica las operaciones entre imágenes) usadas para dar lugar a una pila de partículas prohibidas reconstruidas al completo (generada por Ia suma de las pilas representadas en las dos últimas columnas), según una realización preferida de Ia invención.

La figura 5.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas), que contienen los perfiles de las partículas en el proceso de análisis que, según una realización preferida de Ia invención, realiza Ia eliminación de perfiles prohibidos. La figura 6.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas), que contienen los perfiles de las partículas en el proceso de análisis que, según una realización preferida de Ia invención, realiza Ia selección de perfiles que tocan el marco de conteo. La figura 7.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas, respectivamente: pila original,

pila de perfiles permitidos y pilas resultado de una reconstrucción directa e inversa), que contienen los perfiles de una partícula (dibujados detalles de los píxeles en negro) en las respectivas pilas de imágenes (interrelacionadas por un diagrama de flechas que indica las operaciones entre imágenes) usadas para Ia reconstrucción de partículas a partir de perfiles, según una realización preferida de Ia invención.

La figura 8.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas, respectivamente: pila original, pila preliminar de partículas prohibidas incompleta usada para Ia reconstrucción de partículas a partir de perfiles y pilas resultado de una reconstrucción directa e inversa), que contienen los perfiles de una partícula (dibujados detalles de los píxeles en negro) en las respectivas pilas de imágenes (interrelacionadas por un diagrama de flechas que indica las operaciones entre imágenes) usadas para dar lugar a una pila completa de partículas permitidas (generada por Ia suma de las pilas representadas en las dos últimas columnas), según una realización preferida de Ia invención.

La figura 9.- Muestra una serie de imágenes pertenecientes a distintas pilas (representadas en columnas, respectivamente: pila original, pila de partículas prohibidas y pila intermedia que contiene las partículas de Ia pila original que no pertenecen a la pila de partículas prohibidas, tal como se representa en Ia figura 5) e ilustrando al final (última columna) Ia pila completa de partículas permitidas, según una realización preferida de Ia invención.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

Puede describirse una realización preferida de Ia invención como un método para el análisis estereológico de una pila de imágenes 2D, obtenidas por ejemplo mediante un microscopio confocal. Utilizando las facilidades de programación software de una herramienta convencional de análisis de imagen, como puede ser el programa gratuito image j que se cita

en los antecedentes, es posible implementar los principales pasos del método que se propone aquí concretamente para su aplicación, entre otras, en el contaje automático de partículas en un volumen. Los pasos son:

1) Obtener una serie de imágenes con las partículas que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior:

1. 1) Selección de perfiles prohibidos

1. 1.1) Que tocan lados de Ia imagen

1. 1.1) Que tocan lados prohibidos y/o están presentes en Ia imagen superior

1.2) Reconstrucción de las partículas a partir de sus perfiles

2) Eliminar de Ia serie original las partículas que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior.

3) Obtener una serie de imágenes que contenga sólo las partículas permitidas:

3. 1 ) Selección de perfiles que tocan el marco de contaje 3. 2) Reconstrucción de partículas a partir de perfiles

4) Contaje de partículas

A continuación, se pasa a detallar Ia implementación de cada uno de los pasos indicados.

1 ) Obtener una serie de imágenes con las partículas que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen y/o que están presentes en Ia imagen superior. Se parte de una pila original (AO) de imágenes previamente binarizadas, donde se asigna el valor "1" a los objetos, Le., las partículas, que aparecen en las imágenes y dando el valor "0" al fondo contrastado, por ejemplo, si las partículas aparecen en negro, al fondo blanco Ie corresponde el "0". Estas imágenes, que se toman de una estructura 3D, forman Ia pila original (AO) estando ordenadas secuencialmente desde una imagen superior a una imagen inferior que contienen al menos un perfil (P) de al

menos una partícula. Cada imagen de dicha pila original (AO) y, por tanto, de cada pila que se genera mediante este método a partir de Ia misma, puede enmarcarse visualmente en un cuadro de lados (L), que no forma parte de las imágenes y dentro del cual se puede establecer un marco de conteo (M). Tal marco de conteo (M), en el que se definen dos lados prohibidos (L1) y dos lados permitidos (L2), tampoco es parte de las imágenes y sólo aparece en las figuras a modo ilustrativo para explicar su aplicación al análisis estereológico siguiendo los criterios del disector óptico. 1.1) Selección de perfiles prohibidos La selección de perfiles que tocan lados prohibidos y/o están presentes en Ia imagen superior se realiza conjuntamente y de forma independiente de Ia selección de los perfiles que tocan lados (L) de Ia imagen. Obtenido el par resultante de series ordenadas de imágenes, una serie con los perfiles de las partículas que tocan lados prohibidos (L1) y/o están presentes en Ia imagen superior y otra con los perfiles que tocan lados (L) de

Ia imagen, se suman las imágenes ordenadas de una serie con Ia otra, mediante un operador OR, para obtener una serie de perfiles prohibidos a partir del cual se reconstruyen las partículas que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior. 1.1.1 ) Selección de perfiles prohibidos que tocan lados de Ia imagen

La selección de perfiles prohibidos que tocan alguno de los cuatro lados (L) de Ia imagen se realiza usando una aplicación de Ia herramienta image j de análisis de imagen llamada "Borderkill", que selecciona los perfiles de las partículas de Ia serie de imágenes que no tocan lados prohibidos (L1 ) del marco de conteo (M). El resultado de aplicar "Borderkill" sobre Ia pila original (AO) es una primera pila intermedia (B1). Posteriormente, estos perfiles se restan de Ia pila original (AO), mediante Ia operación lógica XOR, obteniéndose una primera pila de perfiles prohibidos (C1 ) con todos aquellos perfiles que tocan lados (L) de Ia imagen, como se muestra en Ia Figura 1.

La Figura 1 muestra tres pilas de imágenes binarias, de cinco

imágenes cada una, en tres columnas y dos filas. Cada una de las imágenes está representada por un cuadrado, sin formar parte de las imágenes que componen las pilas, cuyos lados (L) representan los lados de cada imagen. La primera de las columnas representa Ia pila original (A ₀ ) o pila de entrada de Ia invención, y contiene imágenes que incluyen perfiles (P), dibujados en negro y que tienen un valor "1". Las dos columnas restantes son pilas fruto de Ia aplicación de las operaciones lógicas encaminadas a realizar Ia selección de perfiles (P) que tocan lados (L) de Ia imagen. Las filas superiores se corresponden con las imágenes superiores de cada pila y viceversa. El fondo se representa en blanco y toma valor "0". De forma ilustrativa, se dibuja en Ia Figura 1 el marco de conteo (M) sobre Ia pila de imágenes original (A ₀ ), con sus dos lados prohibidos (L1) en trazo continuo y los lados permitidos (L2) en trazo discontinuo.

Nótese que esta forma de representación gráfica para las imágenes, perfiles (P) de partículas, lados (L) de las imágenes y lados prohibidos (L1 ) o permitidos (L2) del marco de conteo (M) es igualmente utilizada en el resto de Figuras 2-9.

1.1.2) Selección de perfiles prohibidos que tocan lados prohibidos y/o están presentes en la imagen superior La selección de perfiles que tocan lados prohibidos (L1 ) del marco de conteo (M) y/o están presentes en Ia imagen superior de Ia pila original (AO) se realiza empleando una serie de imágenes que se construye a modo de máscara binaria diseñada a tal efecto a partir del marco de conteo (M), cuya aparición sobre Ia pila original (AO) en Ia Figura 2 y en las restantes figuras es sólo con efecto ilustrativo, como se ha explicado anteriormente.

En Ia Figura 2 se muestra esta serie de imágenes de Ia que se hace uso como una primera pila binaria (B2), cuya primera imagen es una imagen toda negra, Le., de valor "1 ", y el resto de Ia serie está formada por una misma imagen y que es Ia del contorno de los lados prohibidos, representado en negro, es decir atribuyéndosele el valor "1 " al mismo.

Para seleccionar los perfiles que tocan lados prohibidos (L1) del

marco de conteo (M) y/o están presentes en Ia imagen superior, se realiza una operación lógica AND entre Ia primera pila binaria (B2) y Ia pila original (AO), cuyo resultado es una segunda pila intermedia (C2) que se utiliza como semilla en una operación "Reconstruct" con Ia pila original (AO) como "máscara". De estas dos operaciones se obtiene una segunda pila de perfiles prohibidos (D2) con todos aquellos que tocan lados prohibidos (L1 ) y/o están presentes en Ia imagen superior de Ia pila original (AO).

Sumando, mediante un OR, Ia primera y Ia segunda pila de perfiles prohibidos (C2, D2) obtenidas, resulta una pila de perfiles prohibidos (A1 ) que se pasa junto con Ia pila original (AO) al siguiente paso.

1.2) Reconstrucción de partículas a partir de perfiles El proceso utilizado para reconstruir partículas a partir de perfiles se ilustra en las Figuras 3 y 4, donde se ha hecho un "zoom" sobre las imágenes, ilustrando perfiles a nivel de píxeles para una mejor apreciación de las operaciones realizadas durante el proceso. Es decir, Ia partícula que aparece en Ia pila original (AO) de las Figuras 3 y 4 es Ia misma que hay en Ia pila original (AO) del resto de figuras, pero aquí está vista en un detalle de las imágenes que se representan en las restantes figuras para esta pila original (AO). Lo mismo puede decirse de las figuras 7 y 8, donde también se ven detalles o "zoom" de las imágenes.

En una primera etapa, representada en la Figura 3 se seleccionan algunos de los perfiles que forman parte de partículas que van a ser eliminadas mediante el conjunto de operaciones que, obteniéndose una serie de imágenes con algunos de los perfiles prohibidos. Este procedimiento se repite invirtiendo su dirección para obtener una serie de imágenes con más perfiles prohibidos.

Hay que tener en cuenta que Ia diferencia entre perfil y partícula no es trivial ya que basta que un solo perfil de una partícula cumpla uno de los requisitos que Io excluyen del contaje para que Ia partícula entera deba ser eliminada de dicho contaje. En ocasiones ocurre que un perfil de una

partícula incumple uno de los requisitos del contaje y, sin embargo, el perfil anterior y/o siguiente de Ia misma los cumple todos. Si no se resuelve correctamente esta conectividad de perfiles, da lugar a resultados erróneos. El programa DISECTOR presenta esta deficiencia e intenta solventarla requiriendo al operador del programa que haga las correcciones manualmente, mientras que el presente método logra Ia resolución automática de Ia conectividad de perfiles en todos los casos.

Por ejemplo, en Ia pila original (AO) mostrada en Ia Figura 3, hay una partícula que toca un lado prohibido (L1) en uno de sus perfiles, pero no

Io hace en el perfil anterior y siguiente. El perfil intermedio a estos dos es seleccionado durante el anterior paso de selección perfiles que tocan lados prohibidos (L1 ), pero aún quedan por seleccionar los perfiles de Ia misma partícula en las imágenes anterior y siguiente de Ia pila original (AO), que están contenidos en una tercera pila (C3) dibujada en Ia Figura 3. Las imágenes que aparecen en dicha Figura 3 con el marco engrosado son las que pertenecen a Ia tercera pila (C3), antes de realizar una dilatación de esas imágenes, por ejemplo mediante el comando "dilate". Si no se generara esta tercera pila (C3), los mencionados perfiles de una misma partícula en las imágenes anterior y siguiente de Ia pila original (AO) serían contados al final como dos partículas independientes, Io cual es incorrecto.

El perfil de Ia partícula de Ia Figura 3 en Ia tercera imagen de Ia pila original (AO) puede ser seleccionado de la siguiente manera: - ejecutar un AND entre Ia primera imagen de Ia pila de perfiles prohibidos (A1 ) y Ia segunda imagen de Ia pila original (AO), - ejecutar un "Reconstruct" de Ia partícula usando Ia imagen resultante como semilla y Ia segunda imagen de Ia pila original (AO) como máscara, - sumar al resultado la segunda imagen de Ia pila de perfiles prohibidos (A1 ) mediante Ia operación lógica OR.

Este proceso de la Figura 3, que da lugar a Ia tercera pila (C3), se repite para cada imagen consecutiva de Ia pila original (AO). Nótese que hasta aquí no se obtiene Ia partícula mostrada reconstruida en su totalidad, ya que el perfil de Ia primera imagen de Ia pila original (AO) no se selecciona. Para resolver este problema, una forma es repetir el proceso anterior pero invirtiendo su dirección, es decir:

- ejecutar un AND entre Ia última imagen de Ia pila de perfiles prohibidos (A1) y Ia penúltima imagen de Ia pila original (AO),

- reconstruir Ia totalidad de Ia partícula usando Ia imagen resultante como semilla para ejecutar un "Reconstruct" con Ia penúltima imagen de Ia pila original (AO) como máscara,

- sumar al resultado la penúltima imagen de la pila de perfiles prohibidos (A1 ) mediante la operación lógica OR.

Repitiendo consecutivamente este proceso inverso hasta llegar a Ia primera imagen de Ia pila original (AO), se obtiene una cuarta pila (D3).

Otra alternativa de realización del proceso de reconstrucción inversa es usar Ia tercera pila (C3) en vez de Ia pila de perfiles prohibidos (A1 ) en las operaciones anteriores: AND, "Reconstruct" y OR.

La aplicación directa e inversa del proceso anterior, pese a reconstruir Ia mayoría de partículas, no resuelve algunas de las partículas más complejas, por ejemplo, nótese que el perfil más pequeño de Ia partícula de la Figura 3 no ha sido seleccionado. Sin embargo, sí proporciona Ia herramienta necesaria que va a permitir reconstruir Ia totalidad de las partículas.

La suma, mediante una operación OR, de Ia tercera y cuarta pilas

(C3, D3) que contienen los perfiles prohibidos seleccionados y reconstruidos respectivamente de forma directa e inversa da lugar a una pila preliminar de partículas prohibidas (A2) que es incompleta por lo comentado arriba. Si se repite el algoritmo anterior, de Ia Figura 3, en ambas direcciones, directa e

inversa, usando en esta ocasión Ia pila original (AO) junto con pila preliminar de partículas prohibidas (A2) en lugar de Ia pila de perfiles prohibidos (A1 ), tal como se indica en Ia Figura 4, se consigue Ia reconstrucción total de todas las partículas. Con Ia operación de "Reconstruct" directa que indica Ia Figura 4 se genera una quinta pila (C4). Las imágenes que aparecen en dicha Figura 4 con el marco engrosado son las que pertenecen a Ia quinta pila (C4), antes de realizar una dilatación de esas imágenes, por ejemplo mediante el comando "dilate". Dicha quinta pila (C4) se suma mediante un OR a una sexta pila (D4) generado como resultado de aplicar Ia misma operación de "Reconstruct" en dirección inversa, resultando una pila de partículas prohibidas (A3) ya completa. Opcionalmente, las operaciones de reconstrucción inversa para llegar a dicha pila de partículas prohibidas (A3) pueden realizarse usando Ia quinta pila (C4) en el lugar de Ia pila preliminar de partículas prohibidas (A2).

Nótese que en el caso extremo en que dos perfiles se tocan por los vértices de sus vóxeles y pertenecen a Ia misma partícula, es necesario hacer una dilatación/erosión, mediante Ia operación "dilate" o "erode" del programa de análisis de imagen, de los perfiles, según se señala en las Figuras 3 y 4, antes de realizar Ia operación AND entre las correspondientes imágenes. El efecto de Ia dilatación o erosión dependen de Io que el programa de análisis de imagen entienda por fondo y objeto. Así, el efecto de una dilatación en que se considera como objeto una agrupación de píxeles encendidos es el mismo que una erosión en Ia misma imagen, cuando se considera como objeto una agrupación de píxeles apagados. El programa image j varía su criterio de discriminación de objetos, de manera que durante todo el proceso de reconstrucción de partículas prohibidas se utiliza el comando "erode" para dilatar los objetos, mientras que durante el proceso de reconstrucción de partículas permitidas se utiliza el comando "dilate" con el mismo fin.

2) Eliminar de Ia serie original las partículas que tocan lados prohibidos, lados de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior

Una vez obtenido Ia pila de partículas que tocan lados prohibidos (L1 ), lados (L) de Ia imagen o que están presentes en Ia imagen superior de

Ia pila original (AO), estas partículas se pueden eliminar de dicha original

(AO) mediante una operación XOR entre ambos, conforme ilustra Ia Figura

5, resultando una pila de partículas intermedia (A4) constituida por imágenes que sólo contienen los perfiles de las partículas que no pertenecen a Ia pila de partículas prohibidas (A3) completa obtenida en el paso anterior.

3) Obtener una serie de imágenes que contenga exclusivamente las partículas permitidas

El objetivo de este paso es el de discriminar de Ia pila de partículas intermedia (A4) obtenida en el paso 2, aquellas partículas que tocan el marco de conteo (M) de aquéllas que no Io hacen. Para ello, se seleccionan primeramente los perfiles de las partículas que tocan el marco de conteo (M) y posteriormente se reconstruyen las partículas completas a partir de estos perfiles, siguiendo las dos etapas que se explican a continuación.

3.1 ) Selección de perfiles que tocan el marco de contaje

Para Ia selección de perfiles que tocan el marco de conteo (M) se utiliza una segunda pila binaria (B3) compuesta por una única imagen repetida para igualar el número de imágenes que forman Ia pila original (AO) y que hace de máscara binaria con el área del marco de contaje, asignada con valor "1" y representada en negro, conforme se dibuja en Ia Figura 6.

La obtención de una pila de perfiles permitidos (A5), esto es, que

contiene todos los perfiles que tocan el marco de conteo (M), se logra haciendo una operación AND entre Ia pila de partículas intermedia (A4) y Ia segunda pila binaria (B3) construida como se define arriba, Io que resulta en una tareera pila intermedia (C5) que se utiliza a su vez como semilla en una operación "Reconstrucf con dicha pila de partículas intermedia (A4) como máscara.

3.2.- Reconstrucción de partículas a partir de perfiles

Una vez obtenida Ia pila de perfiles permitidos (A5), con algunos de los perfiles de las partículas que cumplen los requisitos de contaje, se procede a Ia reconstrucción de las partículas completas a partir de dichos perfiles, en un proceso similar al descrito en el paso 1.2) y que se muestra en las Figuras 7 y 8, diferenciándose en que se manejan otras pilas distintas a las de las respectivas Figuras 3 y 4.

Brevemente, a partir de Ia pila original (AO) y Ia pila de perfiles permitidos (A5) conseguida en el paso anterior, se realiza una reconstrucción de perfiles en una primera etapa, ilustrada en Ia Figura 7, en direcciones directa e inversa obteniéndose una séptima pila (C6) y octava pila (D6) cuya suma, con el operador lógico OR, da lugar a una pila preliminar de partículas permitidas (A6). Las imágenes que aparecen en dicha Figura 7 con el marco engrosado son las que pertenecen a Ia séptima pila (C6), antes de realizar una dilatación de esas imágenes, por ejemplo mediante el comando "dilate". La pila preliminar de partículas permitidas

(A6), obtenida tras operar con las séptima y octava pilas (C6, D6), es incompleta porque tales partículas no quedan reconstruidas en su totalidad. Por eso, ya en una segunda etapa, mostrada en Ia Figura 8, se repite el proceso de reconstrucción de perfiles, tanto en dirección directa como inversa, obteniendo respectivamente una novena pila (C7) y décima pila

(D7). Las imágenes que aparecen en dicha Figura 8 con el marco engrosado

son las que pertenecen a Ia novena pila (C7), antes de realizar una dilatación de esas imágenes, por ejemplo mediante el comando "dilate". La suma de las novena y décima pilas (C7, D7) con OR resulta finalmente en una pila de partículas permitidas (A7) completa.

Como en el paso 1.2) de reconstrucción de partículas prohibidas, en este paso 3.2) de reconstrucción de partículas permitidas, otra posibilidad de realizar las operaciones de reconstrucción inversa es usar las pilas sétima (C6) y novena (C7) respectivamente en las Figuras 7 y 8, reemplazando correspondientemente Ia pila de perfiles permitidos (A5) y Ia pila preliminar de partículas permitidas (A6) en dichas operaciones de AND, "Reconstruct" y OR.

Sobre Ia pila de partículas permitidas (A7) resultante, como Ia que ilustra Ia Figura 9, conteniendo todas las partículas totalmente reconstruidas y que reúnen los requisitos del método estereológico del disector, puede realizarse ya directa y automáticamente un conteo de partículas con toda Ia garantía de que el resultado es correcto e insesgado, independiente del usuario y por tanto libre de errores humanos.

4- Contaje de partículas

Con Ia pila de partículas permitidas (A7) completa que se obtiene de seguir todos los pasos anteriores, se puede ejecutar en el entorno del programa image j Ia aplicación software "3D objects counter" diseñada por

Fabrice Cordeliéres, que se cita en los antecedentes y realizar de una manera absolutamente automática el contaje de partículas u objetos de dicha pila de partículas permitidas (A7), ilustrada en Ia última columna de Ia Figura 9.

El conteo de partículas en Ia aplicación del disector con el método

aquí propuesto es aproximadamente 140 veces más rápido que el procedimiento manual, dependiendo Ia eficiencia de Ia complejidad de las imágenes por Io que esta comparación sería aproximada. En una evaluación estadística del método que revela este incremento de velocidad respecto al método tradicional que hace el conteo de partículas manualmente, se analizaron 24 series de imágenes, las cuales contenían un total de 296 partículas, anotándose el tiempo empleado, volumen, superficie, número y posición de las partículas, tanto de forma manual, como utilizando este método implementado como aplicación informática. Durante este análisis, además, sólo se detectó un error de contaje achacable al método automatizado, frente a un total de 43 errores atribuibles al observador en el método manual. Dicho error fue eliminado mediante Ia introducción de una iteración en el proceso de reconstrucción de partículas prohibidas a partir de perfiles. Finalmente, no se observó variaciones en Ia forma de ninguna de las partículas analizadas.

Los términos en que se ha redactado esta memoria deberán ser tomados siempre en sentido amplio y no limitativo.

En este texto, Ia palabra "comprende" y sus variantes (como "comprendiendo", etc.) no deben interpretarse de forma excluyente, es decir, no excluyen Ia posibilidad de que Io descrito incluya otros elementos, pasos etc.

Por otra parte, Ia invención no está limitada a las realizaciones concretas aquí descritas sino que abarca también cualquier variante que puede ser realizadas por el experto medio en Ia materia y que cae dentro de

Io que se desprende de las reivindicaciones que se incluyen seguidamente.