Stereospezifische Ketoreduktion von Bicyclooctandion- carbonsäurees ern durch Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur stereo- spezifischen Mono-Kβtorβduktion von raceraischen bicyclischen Carba- cyclin-Zwischenstufen der Formel (♦,) - II zu den entsprechenden optisch aktiven 3α-Hydroxy-Verbindungen der Formel (♦) - I.

(+) - II <+> - I (-) - II

Die Reste A, B und R in den Formeln bedeuten:

A: CH ₂ oder CH-COOR,

8: Sauerstoff,

oder weitere Ketalreste und

R: C -C _c -Alkyl. I o

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daβ man ein Keton der allge¬ meinen Formel (+.) - II, worin A, 8 und R die oben angegebenen Bedeu¬ tungen haben, mit Hikroorganismen behandelt und das dabei entstehende 3<x-Hydroxy-prostacyclin-Zwischenprodukt, das in seiner Konfiguration dem natürlichen PGI entspricht, isoliert.

In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen stereospezi¬ fischen Ketoreduktions-Verfahrens wird nicht das dem natürlichen PGI- entsprechend konfigurierte Enantiomere des racemischen Synthons (+.) - II durch die Hikroorganismen reduziert, sondern die Antipodenform. In diesem Falle wird das bei der mikrobiologischen Transformation unverändert gebliebene, natürlich konfiguriert» Keto-Enantiomere (+} - II für die Synthese von Prostacyclinen herangezogen, indem man es entweder chemisch (zum Beispiel mit Natriumborhydrid) oder mikrobio¬ logisch zu (♦) - I reduziert.

(+> - i

Die Erfindung eignet sich besonders zur mikrobiologischen stereospezi¬ fischen Reduktion der nachstehend aufgeführten Prostacyclin-Zwischen- stufen 2 - 1.

⁽ + ) - l ( + ) - 6 c± ⁾ - 1

_ ix _

Optisch aktives 6a-Carba-prostacyclin und besonders einige davon abge¬ leitete Verbindungen besitzen als stabile Analoge des natürlichen Pro- stacycliπs (PGI ) einen hohen therapeutischen Nutzen [R.C. Nickolson. H.H. Town, H. Vorbrύggen: Prostacyclin-Analogs, Hedicinal Research Reviews, Vol. 5, No. 1, S. 1-53 (1985)]. Die in dieser neueren Übersicht aufgeführten Synthesen sind lang und führen teilweise nur zu racemischen Carbacyclinen. Besonders aufwendig sind die Synthesen, die zu Carba- cyclinen in der dem natürlichen PGI entsprechenden absoluten Konfigu¬ ration führen. Das liegt daran, daβ gut zugängliche, geeignete Ausgangs¬ materialien achiral sind und die optische Aktivität erst im Synthese¬ verlauf in hierfür geeignete Zwischenstufen eingeführt werden muβ.

Mehrere Synthesen gehen bereits von optisch aktiven 7α-Hydroxy-6β- hydroκymethyl-2-oxa-bicyclol3.3.0Joctan-3-on-Derivaten aus. Damit ist zwar das Problem der Einführung der optischen Aktivität gelöst. Es müssen jedoch noch weitere vielstufige Synthesesequenzen für die Substitution der 2-0xa-Funktiσn durch eine Hethylengruppe durchgeführt werden, um zu Derivaten des 3α-Hydroxy-2ß-hydroxymethyl-bicyclot3.3.Q]- octan-7-ons zu gelangen, die sich erst für den Anbau der für die Carba- cyclin-Analoga jeweils typischen α- und »-Ketten eignen.

Eine neuere Publikation beschreibt die Verwendung von cis-Bicyclo- [3.3.0]octan-3,7-dion-Derivaten zur Synthese optisch aktiver Carba- cycline. Kojima et al. beschreiben in Chem. Pharm. Bull. 33, 2688 (1985) ein Verfahren, das die Trennung diastereomerer Salze der racemischen 7,7-Ethylendioxy-3α-hydroxy-cis-bicycloC3.3.0Joctan-2-carbo nsäure einschlieβt.

Auch dieses Verfahren erfordert noch T Reaktionsschritte, um - ausgehend von 3-0xoglutarestern - zum Startmaterial für Carbacyclin-Analoga zu gelangen. Zudem wird eine instabile B-Ketosiure-Zwischenstufe durch¬ laufen.

Für die Herstellung optisch aktiver Carbacyclin-Analoga, wie sie oben beschrieben werden, ist weiterhin kein Syntheseweg, der eine einfache Herstellung gestattet, bekannt.

Die erfiπdungsgemäβe mikrobiologische Reduktion an den vorstehend auf¬ geführten Prostacyclin-Zwischenprodukteπ wird mit folgenden Hikroorga- nismen-Stämmen oder den daraus isolierten Enzymen durchgeführt:

Rhizopus oryzae (CBS 32947) Rhizopus arrhizus (ATCC 34102) Rhizopus arrhizus (ATCC 10260) Rhodotorula spec. (ATCC 18101) Rhodotorula mucilaginosa (NCYC 63) Rhodotorula glutinis (ATCC 2527) Candida solani (IFO 968) Rhizopus stolonifer (ATCC 6227 b)

Unter den verschiedenen Arten der angegebenen Klassen von Hikro¬ organismen treten naturgemäß Unterschiede der Wirksamkeit in der erfindungsgemäβen Ketoreduktion auf.

Am 11.1 .1986 wurden die Stämme Rhizopus oryzae (DSH 3899) und Rhizopus arrhizus (DSH 3898) bei der Deutschen Sammlung von Hikro¬ organismen hinterlegt.

Aus den nach dem erfindungsgemäβen Verfahren hergestellten optisch aktiven 3α-Hydroxy-Verbindungen der allgemeinen Formel (♦) - I lassen sich pharmakologisch wirksame Prostacycline herstellen. Beispielsweise gelangt man ausgehend von (+) - I zum Wirkstoff Iloprost (beschrieben in EP 11591).

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von 3α-Hydroxy-prostacyclin-Zwischenprodukten der Formel (♦) - I

OH

(+) - I

worin

A die Reste -CH _£ - oder >CH-C00R,

B Sauerstoff oder den 2-bindigen Rest -O-X-O- mit X als geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkylen mit 1 - 7 C-Atomen und

R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 - 6 C-Atomen oder Benzyl bedeuten,

dadurch gekennzeichnet, daß man ein racemisches Bicyclooctandion der Formel (+.) - II

(+) - II

worin A, B und R die oben angegebene Bedeutung haben, mit Rhizopus-, Rhodotorula- oder Candida-Stämmen behandelt und für den Fall, daβ der eingesetzte Stamm die (-)-Form aus dem Racemat (+.) - II reduziert, eine chemische oder mikrobiologische Reduktion des unveränderten Bicyclo- octandions der Formel (+) - II anschlieβt.

Wenn X einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylenrest mit 1 - 7 C-Atomen bedeutet, so sind damit folgende Reste gemeint:

^~ ' ^CH 2 ^} n" ^{mit n = 1} " ^{7 (} Hethylen, Ethylen, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa- und Heptamethylen). -C(CH_^ ₂ -, -CH(CH ₃ )-. -CH(CH ₃ )-CH ₂ -, -C(CH ₃ ) ₂ -CH ₂ -,

^• CH ₂ -CH(CH ₃ )- CH ₂ -C(CH ₃ ) ₂ - -CH ₂ -CH(CH ₃ )-CH ₂ -, -CH ₂ -C(CH ₃ ) ₂ "CH ₂ -.

CH(C ₂ H ₅ )-, ~C(C ₂ H ₅ ) ₂ - -CH(C ₂ H ₅ )-CH ₂ - -C(C ₂ H ₅ ) ₂ -CH ₂ -, -CH ₂ -CH(C ₂ I

^• CH ₂ -C(C ₂ H ₅ ) ₂ -, •CH ₂ -CH(C ₂ H ₅ )-CH ₂ - •CH ₂ -C(C ₂ H ₅ ) ₂ - usw.

Unter R als werden Methyl. Ethyl, n-Propyl. Isopropyl, n-Butyl. Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, sek.-Pentyl, Neopentyl, n-Hexyl, Isohexyl usw. verstanden. Je nach der letztlich gewünschten Bedeutung von B können die Schutzgruppen nach an sich bekannten Methoden abgespalten werden.

Zunächst werden unter den für die genannten Hikroorganismen üblicher¬ weise verwendeten Kulturbedingungen in einem geeigneten Nährmedium und unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratum¬ wandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Ethanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Hethanol, Ethanol, Aceton, Glykolmonomethyläther. Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulga¬ toren, wie zum Beispiel Ethylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Poly- glykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel

(R) ( I (R)

Tegin , Tagat und Span beispielsweise genannt.

Oft ermöglicht die Emulgierung der Substrate einen erhöhten Substrat¬ durchsatz und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, bei dem erfindungsgemä ^β en Ver¬ fahren andere Hethoden zur Steigerung des Substratdurchsatzes, wie sie dem Fermentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermenta¬ tionsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Hikroorganismus abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Umwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Herstellung der Ausgangsverbindungen

cis-BicvcloC3.3.0loctan-3.7-dion-2.6-dicarbonsäureester

Der Dimethylester 2 ist literaturbekannt [Weise et al., 3. Org. Chem.JZ.«. 3089 (1977)] und ausgehend von 3-0xoglutarsäuredimethylester über cis-Bicyclo[3. .0]octan-3,7-dion-2.4,6,8-tetracarbonsäure-tetramβthyl- ester in zwei Reaktionsschritten gut zugänglich:

Der Diethylester i. läβt sich aus cis-Bicydo[3.3.0]octan-3,7-dion- 2,4,6,8-tetracarbonsäure-tetraethylester (EP 33863) herstellen.

Höhere Ester können analog zu diesen Verfahren oder durch Umestern des Dimethylesters nach der Hethode von D.F. Faber et al CJ. Org. Chem. 50. 3618 (1985)] hergestellt werden.

7,7-Ethylendioxy-cis-bicyclo[3.3.0]octan-3-on-2-carbonsä ure- methylester (5)

Die Herstellung ist von verschiedenen Autoren beschrieben (vgl. I.e. Review von Nickolson et al).

7.7-{2,2-Dimethyltrimethylendioxy)-cis-bicyclo[3.3.Q]octa n-3-on-2- carbonsäuremethvlester (6)

Die Herstellung erfolgt nach dem oben genannten Literaturverfahren aus 3.3-(2,2-Dirnethyltri ethylendioxy)-cis-bicyclot3.3.0]octan-7-on [E. Carceller et el. Tetrahedron Letter» 25. 2019 (1984)].

cιs-BicvcloC3.3.03octan-3.7-dion-2-carbonsäuremethylester ( )

Die Verbindung kann zum Beispiel durch Ketalspaltung von 2 bzw. 2 mit Säuren und Wasser oder auch durch Carboxylierung und Veresterung von cis-Bicyclo[3.3.0]octan-3.7-dion, zum Beispiel mit Hagnesiummethyl- carbonat [Reagenzherstellung: H. Stiles. H.L. Finkbeiner, J. Amer. Chem. Soc. 2Lι. 616 (1963)] hergestellt werden.

Die durch die mikrobiologische Reduktion erhaltenen ( 1S,5S,6R,7R)-7- Hydroxy-bicyclo[3.3.0]octan-3-on-2.6-dicarbonsäurediester lassen sich nach herkömmlichen chemischen Verfahren in Carbacycline überführen, zum Beispiel zu ( 1S, 2R,3R,5R)-3-Hydroxy- .7-ethylendioxy-bicyclo[3.3.0]- octan-2-carbonsäuremethylester, dessen Umsetzung in optisch aktives Carbacyclin inzwischen von Kojima et al. beschrieben wurde. Selbstver¬ ständlich lassen sich aus den nach dem erfindungsgemäβen Verfahren her¬ gestellten Zwischenprodukten auch alle Carbacyclin-Analoga mit modifi¬ zierten Strukturen in der o- und/oder ω-Kette herstellen.

Die überzählige Carbonester-Gruppe wird als B-Ketoester nach an sich bekannten Verfahren decarbalkoxyliert. Besonders geeignet hierzu sind Umsetzungen mit 1.4-Diazabicyclo[2.2.2]octan [z.B. nach Hiles et al, J. Org. Chem. 39. 2647 (1974)] oder mit Halogenid-Ionen in Dimethyl- sulfoxid oder Dimethylformamid [Krapcho. Synthesis 1982. 805, bzw. Mc Murry. Org. Reactions ZJL*. 187 (1976)]. Man erhält so ( 1S.2R.3R.5R)- 3-Hydroxy-bicyclo[3.3.0]octan-7-on-2-carbonsäureester.

Die erhaltenen ( 1S.2R.3R,5R)-3-Hydroxy-bicyclo[3.3.0]octan-7-on-2- carbonsäureester lassen sich durch übliche Verfahren in die Ketale überführen, indem sie mit 1,2- oder 1,3-Diolen unter Katalyse mit Säure oder sauren Salzen und Entfernen des Reaktionswassers durch Azeotrop- Destillation oder Wasser aufnehmende Hittel umgesetzt werden. Bei der Verwendung von Ethylenglykol erhält man so das von Kojima beschriebene Startmaterial für Carbacyclin.

Beispiel 1

cis-BicvcloC3.3. Qloctan-3.7-dion-2.6-dicarbonsäurediethylester

Man gibt 25 g cis-Bicyclo[3. .0]octan-3,7-dion-2, ,6,8-tetracarbon- säure-tetraethylester zu einer auf 50 °C erwärmten Lösung von 14,1 g Natriumhydroxid in 68,5 ml Ethanol und 175 ml Dimethylsulfoxid und rührt 18 Stunden bei dieser Temperatur unter Stickstoff. Nach dem Abkühlen gießt man auf 750 ml Eiswasser, säuert mit Essigsäure auf pH 5-6 an, extrahiert mit Ethylacetat, wäscht dieses mit Natriumhydrogencarbonat- Lösuπg und mit Natriumchlαrid-Lösung, trocknet mit Natriumsulfat und konzentriert im Vakuum. Nach Umkristallisation aus Ethanol erhält man 13.37 g Produkt vom Schmelzpunkt 98 - 100 °C.

Beispiel 2

7,7-(2,2-Dimethyl-trimethylendioxy)-cis-bicyclo[3.3.0]oct an-3-on-2- carbonsäuremethylester

Man suspendiert 38,34 g 55 - 60 Ziges Natriumhydrid in 616 ml Dimethyl¬ carbonat. erwärmt unter Stickstoff auf 50 °C und gibt eine kleine Henge der Lösung von 49,31 g 3,3-(2.2-Dimethyltrimethylendioxy)-cis-bicyclo- [3.3.0]octan-7-on in 370 ml Dimethylcarbonat dazu. Durch Zugabe von 2 ml Hethanol induziert man die Reaktion, gibt die restliche Lösung dazu und rührt insgesamt 7,5 Stunden bei 50 °C. Han kühlt im Eisbad, zersetzt überschüssiges Natriumhydrid mit Hethanol, gibt Wasser hinzu und neutra¬ lisiert mit Essigsäure. Han extrahiert das Produkt mit Dichlormethan, konzentriert im Vakuum und kristallisiert das Produkt mit Hexan. Han erhält 53,44 g Produkt vom Schmelzpunkt 72 °C.

Beispiel 3

cis-Bicvclof .3.o]octan- .7-dion-2-carbonsäurβmethylester

a) Man löst 15 g 7,7-(2,2-Dimethyltrimethylendioxy)-cis-bicyclo[3,3. octan-3-on-2-carbonsäuremethylester in 350 ml Aceton, fügt 7,23 g Kaliumhydrogensulfat hinzu und erwärmt 1 Stunde auf 40 °C. Nach de Abkühlen neutralisiert man mit In-Kaliumhydroxid-Lösung, destillie das Aceton im Vakuum ab und extrahiert mit Dichlormethan. Man erhä 10,6 g Produkt, das aus Diisopropylether umkristallisiert werden kann (Schmelzpunkt 69 °C).

b) Man erhitzt unter Stickstoff 26,0 g cis-Bicyclo[3.3.0]octan-3,7-di mit 350 ml 2,15-molarer Magnesiummethylcarbonat-Lösung in Dimethyl formamid für 4 Stunden, kühlt ab und gibt die Mischung langsam in 500 ml auf -65 bis -50 °C gekühlte 8,8-molare methanolische Salz¬ säure. Han läßt über Nacht auf 20 °C erwärmen, konzentriert im Vakuum, versetzt mit Wasser und extrahiert mit Diethylether. Nach Trocknung mit Natriumsulfat wird im Vakuum konzentriert und der erhaltene Rückstand an Kieselgel mit Ethylacetat/Methanol 95:5 chromatographiert. Han erhält 21,31 g Produkt

(Schmelzpunkt 67 - 69 °C).

Beispiel *

Eine 4 - 8 Tage alte Schrägagarkultur des Stammes Rhizopus oryzae (CBS 32 947) wird mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemm und damit ein 2 l-Erlenmeyerkolben beimpft, der 500 ml sterile Nähr¬ lösung folgender Zusammensetzung enthält:

3 , 0 Z Glucose

1,0 Z Com steep liquor

0,2 Z NaNO

0.1 Z *H ₂ P0 ₄

0,2 Z ₂ HP0 ₄

0.05 Z HgSO _v .7H ₂ 0

0.002 Z FeS0 ₄ .7H ₂ 0

0.05 Z KC1

Die Kultur wird 56 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 30 °C geschüttelt, wobei sie meist zu großen Klumpen auswächst. Zur besseren Beimpfbarkeit werden die Klumpen im Impfkolben unter sterilen Bedingungen mit einem Ultra-Turrax T 45 zellschonend zerkleinert.

Hit der turraxierten Pilzsuspension zweier Impfkolben wird ein

40 1-Stahlfermenter beimpft, der mit 28 1 sterilisierter Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Vorkultur gefüllt ist. Gleichzeitig wird die Substratsuspension zugegeben (400 mg/1).

Substratsuspension: 12 g (+.)-cis-3,7-Dioxo-bicyclo[3.3.0]octan-2 _r 6-di- carbonsäure-dimethylester werden in 1200 ml autoklavierter 2 Ziger Tween 80-Lösung (VE-Wasser) im Substratkolben mit einem Ultra-Turrax T45 homogenisiert.

Nach einer Kontaktzeit von 52 Stunden sind ca. 50 1 des eingesetzten racemischen Ketons umgesetzt. Die Kulturbrühe wird nun über Zellstoff- Gaze abgesaugt, das Filtrat 1x mit der Hälfte und anschlieβend noch 2x mit je 1/3 des Kulturvolumens mit HiBK extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei die während der Fermentation gebildete Fumarsäure (1-1,5 g/1) auskristallisiert. Nach dem Abfil¬ trieren der Fumarsäure wird das Filtrat zur Trockne eingeengt und der Rückstand zur Abtrennung des unumgesetzten Ketons sowie zur Reinigung der 3α-0H-Verbindung über eine Kieselgelsäule mittels eines Lösungs¬ mittelgradienten Hexaπ-Essigester chromatographiert. Han erhält 4,9 g (+)-cis-3o-Hydroxy-7-oxo-bicyclo[3.3.0]octan-2,6-dicarbonsä ure-dimethyl- ester vom Schmelzpunkt 54-56 °C mit einem Drehwert [αl ♦ 51° (c=1, Chloroform), was einer Enantiomerenreinheit von über 90 1 ee entspricht.

Beispiel 5

Eine Schrägagarkultur des Stammes Rhodotorula spec. ATCC 18101 wird mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und damit ein 2 l-Erlenmeyerkolben beimpft, der 500 ml sterile Nährlösung folgender Zusammensetzung enthält:

5 Z Dextrose-Honohydrat

2 Z Com steep liquor pH 6.5

Nach 2tägigem Schütteln auf einem Rotationsschüttler bei 30 °C wird mit 250 ml dieser Vorkultur ein 5 1-Fermenter beimpft, der mit 3,5 1 steri¬ lisierter Nährlösung der gleichen Zusammensetzung wie die Vorkultur gefüllt ist. Die Kultur wird 12 Stunden unter Belüftung (3,75 1/Hin.) und Rühren (220 U/Hin.) unter Konstanthaltung des pH bei 6,5 germiniert und sodann das Substrat in Form einer steril filtrierten Lösung von 1,5 g (♦.)- ,7-(2, 2-Dimethyltrimethylendioxy)-cis-bicyclo[3.3.0]octan-3- on-2-carbonsäuremethylester in 50 ml Ethanol zugegeben. Nach einer Kontaktzeit von 12 Stunden sind 50 Z des eingesetzten racemischen Ketons umgesetzt. Oie Kulturbrühe wird nun Ix mit der Hälfte und anschlie ^β end noch 2x mit je 1/3 des Kulturvolumens mit Hethylisobutylketon extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der verbliebene Rückstand wird zur Abtrennung des redu¬ zierten (- )-Enantiomeren über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Lösungsmittelgradient Dichlormethan-Dichlormethan / 8 Z Aceton). Fraktion I enthält das natürlich konfigurierte unumgesetzte (*)-Keto- eπantiomere. Nach dem Einengen zur Trockne und Kristallisation aus Hexan erhält man 580 mg (+ )-7 ,7-(2.2-Dimethyltrimethylendioxy)-cis-bicyclo- [3.3.0]octan-3-on-2-carbonsäuremethylester vom Schmelzpunkt 64-65 °C.

Zur chemischen Reduktion werden 500 mg (+)- ,7-(2.2-Dimethyltrimethylen- dioxy)-cis-bicyclo[3.3.0]octan-3-on-2-carbonsäuremethyleste r in 10 ml Methanol gelöst und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Anschlieβend wird auf -40 °C abgekühlt, 200 mg NaBH zugegeben und 1 Stunde bei dieser Tempe¬ ratur gerührt. Danach gibt man 2 ml Aceton zu, rührt noch 30 Minuten nach, stellt mit verd. Essigsäure pH7 ein, verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Dichlormethan. Der Extrakt wird zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 10 ml Hethanol gelöst. 100 mg Natriummethylat zugegeben und 4 Stunden bei 40 °C gerührt. Nun bringt man die Lösung mit 2nH ₂ S0^ unter Eiskühlung auf pH6,5, destilliert das Hethanol ab, nimmt den Rückstand in Wasser auf und extrahiert 3x mit Dichlormethan. Der Extrakt wird neutral gewaschen, über Na SO, getrocknet und zur Trockne eingeengt. Han erhält nach Kristallisation aus Hexan 420 mg (*)-7.7-(2,2-Dimethyltrimethylendiöxy)-3α-hydroxy-cis-bicy clo[3.3.0l- octan-2-carbonsäuremethylester vom Schmelzpunkt 59-61 °C und einem Drehwert von [α] +25,1° (c=1 ,2,Chloroform) .

Beispiel 6

( 1S,2 ,3R.5R)-3-Hydroxy-cis-bicyclo[3.3.0Joctan-7-on-2-carboπsäu re- methylester .

3,41 g des im Beispiel 4 erhaltenen Produkts erhitzt man 1 Stunde unter Stickstoff mit 0,35 g Natriumchlorid und 41,2 ml Dimethylformamid, das 3 Z Wasser enthält. Han destilliert im Vakuum weitgehend ab und erhält 3,32 g des rohen Produkts, das in die Folgestufe eingesetzt wird.

Gereinigtes Produkt zeigt einen Schmelzpunkt von 55 °C und einen spezifischen Drehwert (c=1 in Chloroform) von Cot-3- +6,0°.

Beispiel 7

( 1S,2R,3R,5R)-7,7-Ethylendioxy-3-hydroxy-cis-bicyclo[3.3.0]-o ctan-2- carbonsäuremethylester

Man erhitzt das Rohprodukt aus Beispiel 6 in 50 ml Benzol mit 1.13 g Ethylenglykol und 0.35 g 4-Toluolsulfonsäure für 3 Stunden zum Rückfluß und trennt entstehendes Wasser ab. Nach dem Abkühlen versetzt man mit 0,5 g Natriumhydrogencarbonat, extrahiert mit Wasser und konzentriert im Vakuum. Man chromatographiert an Kieselgel mit Heκan-Ethylacetat- Gemischen und erhält 2,50 g Produkt als farbloses Öl. Spezifischer Drehwert (c=1 in Chloroform) [o] +26,5°.