Lagermedium für Zellen

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Lagerung von insbesondere humanen Zellen, Zellmedien für die Lagerung von Zellen, sowie die Verwendung solcher Zellmedien zur Lagerung von Zellen, wobei die Vitalität der Zellen während der Lagerung erhalten bleibt.

Die Kryokonservierung stellt eine häufig verwendete Methode zur Lagerung lebender Zellen über längere Zeiträume dar. Die Kryokon- servierungstechniken wurden im Laufe des letzten Jahrzehnts stetig weiterentwickelt und verbessert. Es besteht ein Bedürfnis Zellen auch kurzfristig zu lagern, zum Beispiel unmittelbar nach Isolierung aus einem Organ, vor dem Einfrieren oder nach oder während dem Auftauen der Zellen nach Kryokonservierung. Oft ist es erforderlich, dass die Zellen nach dieser Lagerung einem Organismus, insbeson- dere einem Menschen, wieder unmittelbar zugeführt werden sollen. Dieses Zuführen der Zellen kann beispielsweise durch eine intravenöse Applikation der Zellen erfolgen. Die Applikation von, besonders mittels Kryokonservierung, gelagerten Zellen in einen Menschen kann vor allem als klinische, insbesondere als therapeutische An- wendung genutzt werden. So können beispielsweise humane Leberzelltransplantate zur therapeutischen Anwendung intravenös appliziert werden. Jedoch stellt der Einfrierprozess und der Wiederauf- tauprozess und die vorausgehende beziehungsweise direkt anschließende in vitro Lagerung in Bezug auf die Vitalität und die Le- bendzellzahl der zu lagernden Zellen besonders bei der klinischen Anwendung weiterhin ein Problem dar.

Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein einfach herstellbares und möglichst preiswertes Zellmedium für die Lagerung von tierischen Zellen, bevorzugt von humanen Zellen, insbesondere von Leberzellen oder Leberzelltransplantaten, bereit- zustellen. Die Zellen sollen bevorzugt im Zusammenhang mit der Kryokonservierung vor dem Einfrieren und/oder nach dem Auftauen gelagert werden. Der vorliegenden Erfindung liegt daher auch das technische Problem zugrunde, ein Zellmedium bereitzustellen, dass ein kurzzeitiges Lagern von tierischen Zellen, bevorzugt von huma- nen Zellen, besonders bevorzugt von Leberzellen oder Leberzelltransplantaten, bei einem möglichst geringen Verlust der Vitalität und der Lebendzellzahl der Zellen erlaubt und somit eine Alternative zu bekannten Zellmedien darstellt.

Im Zusammenhang mit der Kryokonservierung sind Zellmedien zum Lagern und Wiederauftauen bekannt. Sie enthalten jedoch Bestandteile wie 5 bis 20 % fötales Kalbserum (FCS), die für eine Applikation, insbesondere eine intravenöse Applikation, in den Menschen gesetzlich nicht zugelassen sind, oder sogar ungeeignet sind. Der vorliegenden Erfindung liegt daher weiter das technische Problem zugrunde, ein Medium zur Verfügung zu stellen, dass bei einem geringen Verlust der Vitalität und der Lebendzellzahl von Zellen, bevorzugt von humanen Zellen, insbesondere von Leberzellen oder Leberzelltransplantaten, eine risikofreie Applikation der Zellen in ein Tier, insbesondere einen Menschen, erlaubt.

So lässt sich Custodiol ^® als Zellmedium zum Beispiel für die Lagerung besonders von aufgetauten, ursprünglich kryokonservierten Zellen wie Leberzellen erfolgreich einsetzen; es wurde als Konser-

vierungslösung für die Organtransplantation von Ganzorganen entwickelt. Custodiol ^® ist jedoch für eine intravenöse Applikation beim Menschen gesetzlich nicht zugelassen. Der Erfindung liegt daher auch das technische Problem zugrunde, ein Zellmedium für die kurzzeitige Lagerung von Zellen, insbesondere im Zusammenhang mit der Kryokonservierung, zur Verfügung zu stellen, das für eine intravenöse Applikation beim Menschen zugelassen ist, und daher die Zellen beispielsweise nach dem Auftauen ohne aufwändige und die Lebendzellzahl vermindernde Waschschritte einem Menschen in diesem Zellmedium intravenös appliziert werden können.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem im Wesentlichen durch die Bereitstellung eines Verfahrens für die kurzzeitige Lagerung tierischer oder humaner Zellen gemäß der Patentansprüche. Bevorzugt wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei die Zeüen in einem flüssigen Zeümedium, das eine Saiziö- sung, ausgewählt aus insbesondere einer Salzlösung enthaltend Natriumchlorid, Natriumglukonat, Natriumacetat, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid und Natriumeitrat, und/oder einer Salzlösung enthaltend Ringer-Lactat und/oder Phosphate-Buffered-Saline und/oder eine wässrige Lösung eines hochmolekularen Zuckers, insbesondere Hydroxyethylstärke, sowie Glucose und darüber hinaus Serumalbumin und/oder Blutplasma enthält, aufgenommen werden und in diesem Zellmedium gelagert werden.

In bevorzugten Ausführungsformen sind die tierischen Zellen Säuge- tier-Zellen. Es kann sich beispielsweise um porcine, bovine oder murine Zellen handeln. Besonders bevorzugt handelt es sich um humane Zellen. Unter Zellen sind erfindungsgemäß auch Zellsuspensio-

nen und Zelltransplantate gemeint. Die Zellen können von einem Typ sein, es kann aber auch eine Zusammensetzung beziehungsweise Co-Kultur verschiedener Zelltypen eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei den tierischen ZeI- len um Zellen zur therapeutischen Applikation. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den tierischen Zellen um Zellen zur in vitro Kultivierung. Die tierischen Zellen können beispielsweise Hepatozyten, Pankreas Inseln, Chondrozyten, Knorpelzellen, Nervenzellen, Keratinozyten oder Lymphozyten sein. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei den für die Lagerung in einem Zellmedium vorgesehenen Zellen um Leberzellen, insbesondere Hepatozyten.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter Leberzellen eine Mischung von Zellen vorwiegend bestehend aus Hepatozyten ver- standen. Sie können jedoch auch verschiedene Mengenanteile an Lymphozyten, Endothelzellen und weiteren nicht-parenchymalen Zellgruppen enthalten.

Das Auftauen und/oder Lagern von Thrombozyten, auch Blutplättchen genannt, ist von der Erfindung ausgenommen. Thrombozyten sind keine tierischen Zellen im Sinne der Erfindung.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter kurzzeitiger Lagerung eine in vitro Lagerung in einem erfindungsgemäßen Medium über einen Zeitraum bis 24 Stunden, besonders bis 10 Stunden, bevorzugt bis 5 Stunden, besonders bis 3 Stunden verstanden.

Unter Kryokonservierung wird eine meist langfristige Lagerung von Zellen unterhalb von 0 ⁰ C, insbesondere bei -20 ⁰ C bis -200 ⁰ C verstanden. Das Einfrieren erfolgt in der Regel bei 1 °C/min.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter einem Zellmedi- um, auch Medium, Auftaumedium oder Nährmedium genannt, insbesondere eine flüssige wässrige Lösung verstanden. Das Zellmedium dient der in i/tfro-Lagerung lebender Zellen unter Beibehaltung einer möglichst hohen Lebendzellzahl, also einer möglichst geringen Sterberate der Zellen, sowie einer möglichst hohen Lebensfähigkeit be- ziehungsweise Vitalität, dem Fachmann auch als viability bekannt.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Bestandteile eines erfindungsgemäß eingesetzten Zellmediums gesetzlich für die Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation, in einen tierischen Organismus, bevorzugt in einen menschlichen Organismus, zugelassen. Erfindungsgemäß können die Zellen nach der Lagerung in einem erfindungsgemäßen Medium für eine klinische Anwendung, insbesondere einer therapeutischen Applikation, oder für in vitro Versuche verwendet werden.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter einer Salzlösung eine wässrige Lösung von einem oder mehreren Salzen verstanden. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Salzlösung enthält Natriumchlorid, Natriumglukonat, Natriumacetat, Kaliumchlorid, Magnesiumchlo- rid und Natriumcitrat, wobei die Salze in Wasser gelöst sind. Das benutzte Wasser ist steriles, bevorzugt deionisiertes Wasser zur In- jektion.

Eine erfindungsgemäß bevorzugte Salzlösung ist Composol ^® beziehungsweise eine der Zusammensetzung von Composol ^® entsprechende Lösung. Composol ^® ist eine wässrige Lösung von Natriumchlorid, Natriumglukonat, Natriumacetat, Kaliumchlorid, Magnesi- umchloridhexahydrat und Natriumeitrat. Sie enthält 173 mmol/l Natrium, 5 mmol/l Kalium, 1 ,5 mmol/l Magnesium, 98 mmol/l Chlorid, 10,9 mmol/l Citrat, 27 mmol/l Acetat und 23 mmol/l Glukonat, bevorzugt besteht sie daraus.

Erfindungsgemäß bevorzugt enthält die Salzlösung daher von 0,45 bis 0,60 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,53 Gew.-%, Natriumchlorid, von 0,45 bis 0,55 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,50 Gew.-%, Natriumglukonat, von 0,20 bis 0,25 Gew.-% , besonders bevorzugt 0,22 Gew.-%, Natriumacetat, von 0,03 bis 0,04 Gew.-% , besonders bevorzugt 0,037 Gew.-%, Kaliumchlorid, von 0,025 bis 0,035 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,031 Gew.-%, Magnesiumchloridhexahydrat, und von 0,31 bis 0,33 Gew.-% , besonders bevorzugt 0,32 Gew.-%, Natriumeitrat, bevorzugt besteht sie daraus. Die Salzlösung hat bevorzugt einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4, besonders bevorzugt von 7,2.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Salzlösung Ringer-Lactat. Die übliche Zusammensetzung von Ringer-Lactat ist dem Fachmann bekannt. Ringer-Lactat ist eine wässrige Lösung enthaltend Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natrium-Lactat. Erfindungsgemäß eingesetztes Ringerlactat hat einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4, bevorzugt von 7,2.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Salzlösung Phosphat- gepufferte-Saline (PBS). Die übliche Zusammensetzung von PBS ist

dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß verwendetes PBS hat einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4, bevorzugt von 7,2.

In einer weiteren Ausführungsform ist Bestandteil des Mediums eine wässrige Lösung mindestens eines hochmolekularen Zuckers. Erfin- dungsgemäße hochmolekulare Zucker sind beispielsweise Dextran, auch Dextranlösungen wie Perfadex, Hydroxyethylstärke (HES) und Derivate der Hydroxyethylstärke. Erfindungsgemäß bevorzugt wird als hochmolekularer Zucker Hydroxyethylstärke verwendet.

Erfindungsgemäß wird die Glucose dem Zellmedium in fester Form oder als wässrige Lösung zugegeben.

Erfindungsgemäß wird das Serumalbumin in Zellmedium gelöst oder in flüssiger Form zugegeben. Serumalbumin kann beispielsweise als fötales Kälberserum (FCS), bovines Serumalbumin (BSA) oder humanes Serumalbumin (HSA) vorliegen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist humanes Serumalbumin, da dieses für die intravenöse Applikation im Menschen zugelassen ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist Serumalbumin durch Blutplasma ersetzt oder ergänzt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist humanes, bevorzugt autologes, Blutplasma. Besonders wird Plasma und/oder HSA als Kryoprotektor, bevorzugt allein oder in Verbindung mit anderen bekannten Kryoprotektoren, insbesondere DMSO, eingesetzt.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen enthält das erfindungsgemäß eingesetzte Medium mindestens einen weiteren Bestandteil,

ausgewählt aus Aminosäuren, Hormonen, Vitaminen, Provitaminen und antiapoptotisch wirksamen Substanzen.

Die Bestandteile der Medienzusammensetzung wird der Fachmann je nach Einsatzgebiet nach seinem Fachwissen auswählen, nach- dem er durch die erfindungsgemäße Lehre dazu angehalten wird, sie entsprechend der Erfindung und in den erfindungemäßen Konzentrationen einzusetzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt mit einem vorgenannten Zellmedium mit einem pH-Wert von 6,4 bis 8, bevorzugt von 7,0 bis 7,4, insbesondere von 7,2 durchgeführt.

Bevorzugt werden die Zellen nach dem Auftauen aus der Kryokonservierung in erfindungsgemäßem Zellmedium gewaschen, vom Konservierungsmedium und dem erfindungsgemäßem Zellmedium abgetrennt und dann in frischem erfindungsgemäßem Zellmedium zur Lagerung aufgenommen. Die Abtrennung erfolgt bevorzugt durch Abzentrifugieren.

Das Verfahren wird bevorzugt bei einer Temperatur von 2 bis 40 °C durchgeführt. Das Zellmedium hat bevorzugt eine Temperatur von 2 bis 40 °C. Besonders bevorzugt wird das Verfahren bei 4 °C durch- geführt und/oder das verwendete Medium hat eine Temperatur von 4 ⁰ C. In einer weiteren bevorzugten Variante wird das Verfahren bei 10 ⁰ C durchgeführt und/oder das verwendete Medium hat eine Temperatur von 10 ⁰ C. In einer weiteren besonders bevorzugten Variante wird das Verfahren bei 25 ⁰ C durchgeführt und/oder das verwendete Medium hat eine Temperatur von 25 °C. In einer weiteren besonders

bevorzugten Variante wird das Verfahren bei 37 ⁰ C durchgeführt und/oder das verwendete Medium hat eine Temperatur von 37 ⁰ C.

Gegenstand der Erfindung ist selbstverständlich auch das spezielle Zellmedium für die kurzzeitige Lagerung von, insbesondere nach Kryokonservierung aufgetauten, tierischen oder humanen Zellen, insbesondere ein flüssiges Zellmedium, welches Natriumchlorid, Natriumglukonat, Natriumacetat, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid und Natriumeitrat, sowie Glucose und darüber hinaus Serumalbumin und/oder Blutplasma enthält, und worin die genannten Bestandteile in Wasser gelöst sind.

Ein bevorzugtes Zellmedium besteht aus Natriumchlorid, Natriumglukonat, Natriumacetat, Kaliumchlorid, Magnesiumchloridhexa- hydrat und Natriumeitrat, sowie Glucose und darüber hinaus Serumalbumin und/oder Blutplasma, wobei die genannten Bestandteile in Wasser gelöst sind. Ein besonders bevorzugtes Zellmedium enthält von 0,45 bis 0,60 Gew.-% Natriumchlorid, von 0,45 bis 0,55 Gew.-% Natriumglukonat, von 0,20 bis 0,25 Gew.-% Natriumacetat, von 0,03 bis 0,04 Gew.-% Kaliumchlorid, von 0,025 bis 0,035 Gew.-% Magne- siumchloridhexahydrat, und von 0,31 bis 0,33 Gew.-% Natriumeitrat, sowie Glucose und darüber hinaus Serumalbumin und/oder Blutplasma, wobei die genannten Bestandteile in Wasser gelöst werden.

Bevorzugt enthält das Zellmedium 0,01 bis 0,5 Gew-% Glucose, besonders bevorzugt von 0,1 bis 0,2 Gew-% Glucose.

Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Zellmedium Humanserum- albumin. Das Humanserumalbumin kann erfindungsgemäß durch humanes, insbesondere autologes, Blutplasma ersetzt werden. In

einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Medium von 0,5 bis 50 Gew-% Serumalbumin, besonders bevorzugt von 3 bis 5 Gew-% Serumalbumin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Medium von 0,5 bis 50 Gew-% Blutplasma, besonders be- vorzugt von 3 bis 5 Gew-% Blutplasma.

Das erfindungsgemäße Zellmedium hat vorzugsweise einen pH-Wert von 6,4 bis 8, bevorzugt von 7,0 bis 7,4, insbesondere von 7,2.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Bestandteile eines erfindungsgemäßen Zellmediums gesetzlich für die Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation, in einen tierischen Organismus, bevorzugt in einen menschlichen Organismus, zugelassen.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch Kombinationen erfindungsgemäßer Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Zellmediums.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des vorgenannten erfindungsgemäßen Zellmediums zur kurzzeitigen Lagerung von nach Kryokonservierung aufgetauten tierischen Zellen, insbesondere nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Figuren zeigen:

Figur 1 : Vitalität der gelagerten Zellen (nach Kryokonservierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit, dem verwendeten Lagerungsmedium und der Lagerungstemperatur, Legende: „HH142": Nummer der individuellen Zellpräparation (Charge), „warm":Lagerungstemperatur von 18 ⁰ C, „kalt": Lagerungstem-

peratur von 4 ⁰ C, „HES": Medium 2, „PBS": Medium 5, „Custodiol ^® ": Medium 1 , „Composol ^® ": Medium 4, „RingerLactat": Medium 3, „humanes Plasma": Medium 6;

Figur 2: Wiederfindung der gelagerten Zellen (vor Kryokonser- vierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit, dem verwendeten Lagerungsmedium und der Lagerungstemperatur, Legende siehe Figur 1 ;

Figur 3: Vitalität gelagerter Zellen (nach Kryokonservierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit, dem verwendeten Lagerungs- medium und der Lagerungstemperatur, Legende siehe Figur 1 ;

Figur 4: Lebendzellzahl (LZZ) gelagerter Zellen (nach Kryokonservierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit und dem verwendeten Lagerungsmedium, Legende siehe Figur 1 ;

Figur 5: Lebendzellzahl (LZZ) gelagerter Zellen (vor Kryokon- servierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit und dem verwendeten Lagerungsmedium, Median über drei individuelle Zellpräparationen (Chargen); Legende siehe Figur 1 ;

Figur 6: Lebendzellzahl (LZZ) gelagerter Zellen (vor Kryokonservierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit und dem verwen- deten Lagerungsmedium, Median über vier individuelle Zellpräparationen (Chargen); Legende siehe Figur 1 ;

Figur 7 A-C: Wiederfindung, Lebendzellzahl (LZZ) gelagerter Zellen (vor Kryokonservierung) in Abhängigkeit von der Lagerungszeit und dem verwendeten Lagerungsmedium, Median über 3 individuelle

Zellpräparationen (Chargen); Figur 7C: Vergleich mit Custodiol (=100%) , Mittelwert über vier Lagenrungszeiten, Median über 3 individuelle Zellpräparationen (Chargen), Legende siehe Figur 1.

Beispiel

Es wurden kryokonservierte Leberzellen aus speziellen Kryobeu- teln/Kryoröhrchen verwendet. Da die Anzahl der vorhandenen Kryo- röhrchen aus einer individuellen Zellpräparation für den Umfang der Studie nicht ausreichend waren, wurden sie nur zum Vergleich der Ergebnisse hinzugezogen. Alle Arbeitsschritte wurden unter asepti- sehen Bedingungen durchgeführt. Die Zellsuspension war vor Zugabe des Zellmediums vollständig aufgetaut. Das Auftauen der Kryo- röhrchen erfolgte zeitlich unabhängig vom Auftauen der Beutel. Das Zellmedium wurde langsam zu den vorgelegten Zellen gegeben.

Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, wurden die verschiedenen Versuche parallel von mindestens 2, gegebenenfalls 3 Personen durchgeführt.

Folgende Auftaumedien wurden hergestellt:

Medium 1 : Custodiol ^® (Vergleichsbeispiel)

Medium 2: Hydroxyethylstärke (HES) + 1 g/l Glucose + 4% HSA (erfindungsgemäß)

Medium 3: Ringer-Lactat + 1 g/l Glucose + 4% HSA (erfindungsgemäß)

Medium 4: Composol ^® + 1 g/l Glucose + 4% HSA (erfindungsge- mäß)

Medium 5: Phosphatgepufferte Saline (PBS) + 1 g/l Glucose + 4% HAS (erfindungsgemäß)

Medium 6: humanes Blutplasma (Vergleichsbeispiel)

Pro Durchlauf (ein aufgetauter Beutel) wurden ca. je 50 ml Zellmedium benötigt. Humanes Blutplasma wurde im 37 ⁰ C warmen Wasserbad aufgetaut.

Bei drei Versuchen wurden die Medien im 37 ⁰ C warmen Wasserbad für mindestens 15 min temperiert (= „warm"). Bei 2 Versuchen wurden die Zellmedien im Kühlschrank für mindestens 15 min. gekühlt (= „kalt").

Sechs entsprechend den Lösungen etikettierte 50 ml-Röhrchen wurden vorgelegt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Es wurde bei „warmen" Versuchen für 5 min bei 18 ⁰ C und 50 g zentrifugiert und bei „kalten" Versuchen für 5 Minuten bei 4 ⁰ C und 50 g zentrifugiert.

Kryobeutel wurden vorsichtig aus der Aluminiumkassette herausgenommen. Die Kryosuspension wurde 2 bis 5 min unter ständigem Schwenken aufgetaut bis keine Eiskristalle mehr zu sehen waren. Der gesamte Vorgang dauerte nicht länger als 5 min.

Die gelbe Kappe wurde vom Beutel entfernt und das Septum mit Anstechdorn eines Benjamix durchstochen. An den Benjamix des Kry-

obeutels wurde eine 60 ml Spritze angeschlossen und 60 ml Zellsuspension wurden entnommen.

Jeweils 10 ml Zellsuspension wurden in den sechs vorbereiteten Röhrchen überführt. Dazu wurden jeweils 40 ml von den entspre- chenden Zellmedien langsam zugegeben. Der gesamte Vorgang dauerte nicht länger als 5 min.

Nach der Zentrifugation erfolgte das Waschen der Zellen. Es wurden die überstände mit Pasteurpipette abgesaugt. Die Zellpellets wurden durch vorsichtiges Schwenken in 5 ml des entsprechenden Zellme- diums vollständig resuspendiert.

Es erfolgte eine Zellzählung nach Zellzahl und Vitalität und nach jeder Zellzählung wurde eine Leberzell-Kultur angelegt.

Für eine Gesarntiagerdauer von 3 Stunden wurden jeweils nach 60 min die beiden letztgenannten Schritte wiederholt.

Es wurden nur Leberzellen mit einer Vitalität größer als 40% vor der Kryokonservierung verwendet. Der Versuch wurde mindestens 3 mal mit unterschiedlichen individuellen Zellpräparationen (Chargen) wiederholt. Dabei wurde pro Charge mindestens 1 Beutel aufgetaut. Zum Vergleich wurden die Ergebnisse vom Auftauen von Kryoröhr- chen der verwendeten Chargen herangezogen.

Es wurden vier individuelle Zellpräparationen (Chargen) hinsichtlich des Einflusses der Auftaulösung getestet. Die Ergebnisse wurden hinsichtlich der Parameter Vitalität und Lebendzellzahl (LZZ) nach Auftauen sowie Vitalitäts- und Lebendzeilzahlerhalt bei Lagerung in

Suspension getestet. Die Temperatur des Mediums und für die Zentrifugation wurde bei Leberzelltransplantaten auf 4 ⁰ C festgelegt. Der Versuch mit Charge HH 142 wurde einmal „warm" durchgeführt und dann „kalt" wiederholt (siehe Figur 1 und Figur 2). Für die weite- re Auswertung wurden die Mittelwerte von beiden Versuchen genommen und als HH142 bezeichnet.

Die einzelnen Ergebnisse sind in den Figuren 3 und 4 dargestellt.

Um eine chargenunabhängige Auswertung zu gewährleisten, wurde der Parameter Wiederfindung der Lebendzellzahl bei der Lagerung in den getesteten Lösungen definiert. Dieser wurde auf zwei verschiedenen Ausgangspunkte bezogen. Zum einen die Wiederfindung bezogen auf die Lebendzellzahl vor Einfrieren (Figur 5a ). Zum anderen die Wiederfindung bezogen auf die Lebendzellzahl nach Waschen (Stunde 0 in spezifischen Lagermedium) (Figur 5b). Zum Vergleich der fünf Lösungen wurden Medianwerte für die genannten Parameter aus den drei getesteten Chargen berechnet und in Figur 5 graphisch dargestellt.

Die beiden ausgewählten Lösungen - Composol ^® und HES - wurden zusätzlich anhand der Medianwerte von vier Chargen ausgewer- tet und in Figur 6 graphisch dargestellt:

Für eine bessere Analyse der dargestellten Ergebnisse wurde folgende Annährung gemacht. Der Parameter Wiederfindung der eingefrorenen LZZ wurde beim Custodiol ^® 100% gesetzt. Für die getesteten fünf Ansätze (Vergleichsbeispiel/erfindungsgemäße Beispiele) wurde die prozentuale Abweichung dieses Parameters im Vergleich mit Custodiol ^® berechnet (siehe Figur 7a und Figur 7b).

Direkt nach dem Waschen der Zellen zeigten drei der Lösungen (PBS, Composol ^® und HES) eine vergleichbare (übereinstimmung größer 80%) mit Custodiol ^® hinsichtlich des Parameters Wiederfindung der LZZ. Dabei zeigte Composol ^® sogar bessere Ergebnisse als Custodiol ^® (Wiederfindung größer 100%). Während nach 1 h PBS die besten Ergebnisse aufwies zeigten Composol ^® und humanes Plasma nach 2 Stunden wiederum etwa 10% bessere mediane Ergebnisse als Custodiol ^® .

Zum weiteren Vergleich wurde eine weitere Auswertung durchge- führt. Für jede Lösung wurde der Mittelwert aus allen 4 Zeitpunkten berechnet (Stunde 0 bis 3, Figur 7c).

Unabhängig von Zeitvorlauf des Versuchs zeigten HES und Ringer- Lactat ca. 20% Verlust der LZZ im Vergleich mit Custodiol ^® , wobei PBS, Composol ^® und humanes Plasma vergleichbare (Abweichung kleiner 10%) Ergebnisse wie Custodiol ^® zeigten.