La presente invención se enmarca en el contexto de la biotecnología de microorganismos, y trata sobre una nueva bacteria Cobetia marina; capaz de metabolizar hidrocarburos del petróleo y producir un biosurfactante con propiedades emulsificantes y biológicas que permite evitar, de manera específica, patologías infecciosas en peces y que, a diferencia de los antibióticos, no genera resistencia. Ademas la invención divulga un extracto biosurfactante y su uso como aditivo en la industria de los alimentos y en la industria de pinturas y revestimientos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Es objeto de la presente invención el aislamiento y la obtención de una nueva cepa Cobetia marina con registro de depósito CECT N ^Q 7764 bajo la Colección Española de Cultivos Tipo (arbitrariamente aquí denominada por la referencia: cepa MM1 IDA2H-1 ). La cepa bacteria de esta invención es relevante por cuanto produce y libera al medio un sobrenadante biosurfactante caracterizado, de forma separada o en una mezcla, por su capacidad de interferir con el sistema de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS) que afecta la formación de biopelículas microbianas (biofimls) y/o la conducta virulenta de bacterias patógenas. Dicho sobrenadante puede ser extraído mediante un bioproceso para la obtención de un extracto concetrado del mismo; el cual puede ser utilizado para el control de patologías microbianas. El bioproceso revelado por la presente invención consiste en cultivar Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un biorreactor bajo condiciones físicas y químicas de cultivo preferidas, utilizando dibenzotiofeno (DBT) o desechos de la industria petrolífera ricos en DBT como única fuente de carbono para el crecimiento, para posteriormente; separar, aislar y purificar un extracto extracelular tensoactivo y bioactivo, características medidas por su capacidad de (i) actuar como emulsificante y de (ii) interferir con el sistema de comunicación QS de microorganismos patógenos, afectando la formación de biopelículas microbianas y la conducta virulenta de bacterias patógenas, en particular, bacterias patógenas de peces.

El extracto del medio extracelular donde ha crecido la cepa de la Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 bajo las condiciones favorables de la presente invención, corresponde a un biosurfactante (arbitrariamente aquí denominado por la referencia: biosurfactante AAFOB-1 IDA2H), caracterizado por presentar una actividad biológica específica de alto interés y aplicabilidad, tanto para la industria acuícola como en biomedicina; para el control de pérdidas por patologías infecciosas microbianas y/o para evitar la formación de biopelículas microbianas. Además, el biosurfactante AAFOB-1 IA2H presenta propiedades emulsificantes que permiten su incorporación, por ejemplo, en alimentos y/o revestimientos de pinturas.

Adicionalmente, la presente invención, se refiere también a los usos de la cepa de presente invención en forma de probiótico en la ingesta alimenticia de especies acuículas preferidas, sin causar daños en especies aquícolas y beneficiando su inmunidad.

ESTADO DE LA TÉCNICA.

Actualmente el uso de antibióticos en la acuicultura es una medida de control de patologías infecciosas, pero que presenta complicaciones y limitantes que amenazan la estabilidad y consolidación de los productos alimenticios de consumo humano generados de esta actividad. La complicación más evidente radica en que el uso de antibióticos no ha evitado las pérdidas económicas y sociales derivadas de los brotes de bacterias y virus patógenos que afectan productivamente a la acuicultura y en especial a la salmonicultura, donde se registran grandes mortalidades. A su vez, entre las principales limitantes está el hecho de que los antibióticos utilizados en acuicultura no varían sustancialmente de los usados en la salud humana. Por esto, y al igual que en salud humana, actualmente el uso de antibióticos en salmonicultura está altamente restringido mediante normas y regulaciones que, por ejemplo, prohiben el uso de estos agentes como estrategia de engorda, o, restringen su uso continuo durante el proceso productivo para el control de patologías infecciosas. Tanto la falta de eficacia de los tratamientos antibióticos como las restricciones a su utilización, se explican por el aumento gradual de brotes epidémicos, tanto en humanos como en animales, generados por microorganismos patógenos que son resistentes a la variedad de antibióticos disponibles. Los antibióticos usados en acuicultura son del tipo bacteriolítico, bacteriostático o bactericida; todos los cuales presentan la desventaja de que su aplicación implica la selección positiva de microorganismos resistentes, lo que perjudica las terapias y, por tanto, persistencia de la patología infecciosa. Por otra parte, la práctica de terapias antibióticas en espacios abiertos en la acuicultura no es específica contra microorganismos patógenos, y puede también afectar a microorganismos beneficiosos que forman parte de las comunidades microbianas marinas y/o dulceacuícolas, alterando la estabilidad y funcionamiento de los respectivos ecosistemas. Así mismo, el uso de antibióticos en espacios abiertos puede incrementar el número de determinantes genéticos asociados a resistencia a los antibióticos seleccionados positivamente, los que eventualmente pueden llegar a especies de microorganismos patógenos para el hombre, constituyendo un riesgo para la salud humana. En la actualidad las terapias antimicrobianas usadas en acuicultura consideran la administración del principio activo en el alimento (alimento medicado). Las dosis son entregadas en función de la biomasa (kg) durante periodos de tiempo (días). Algunas de las terapias usadas se resumen en la tabla siguiente.

Antibiótico Dosis* en alimento Tiempo Recomendación

(mg/kg pez por día) Días

Amoxicilina 160 10 Amplio espectro

Flumequina 16 10 Quinolona para septicemias

Florfenicol 10 10 Amplio espectro

Eritromicina 100 21 Macrolido contra Gram +

(BKD)

Oxitetraciclina 75 21 Amplio espectro Penicilina 80 10 Amplio espectro

^* Principio activo

Los tratamientos son aplicados vía alimento para peces, por la mezcla cuantificada con el antibiótico. Una vez hecha la mezcla, el alimento es entregado a los cultivos por dispersión en el agua. En este procedimiento la ingesta no es controlada y una proporción importante del alimento no es ingerido, con la consecuente liberación del antibiótico al medio ambiente. Dado que la acuicultura es una actividad dirigida hacia la producción de alimentos de consumo humano, los actuales tratamientos antibióticos condicionan la inocuidad y seguridad de estos productos, y por tanto afectan la estabilidad y consolidación de dichos productos en sus respectivos mercados demandantes.

En este escenario, la tendencia actual es buscar alternativas al uso de antibióticos, lo que considera soluciones de origen natural que sean específicas, no generen resistencia, no sean tóxicas ni produzcan daños en el medio ambiente. Una de las aproximaciones para el reemplazo de los antibióticos comprende la búsqueda de nuevos microorganismos considerados probióticos y/o moléculas de origen natural, tales como, los biosurfactantes.

El uso de microorganismos probióticos para el control de patologías infecciosas ha sido definido como una estrategia de interés tanto en salud humana como en acuicultura. El concepto de microorganismo probiótico en acuicultura incluye a bacterias, cianobacterias, microalgas y hongos, entre otros. Así mismo, el término probiótico puede ser ampliado a "microbiota normal", "microbiota efectiva" y/o "microorganismo beneficioso". Actualmente, en acuicultura el concepto probiótico se amplia a microorganismos que al ser usados durante las faenas productivas mejoran la calidad de agua y/o inhiben a los patógenos que generan enfermedades en las especies en cultivo. En acuicultura existen prácticas destinadas a la eliminación de los microorganismos presentes en el agua de forma inespecífica mediante el uso de filtros, ozono e irradiación con luz ultravioleta. Estos procedimientos alteran los ecosistemas microbianos acuáticos generando un desequilibrio entre la microbiota beneficiosa y los microorganismos patógenos, lo que favorece la aparición de patologías infecciosas, debido a la pérdida del control biológico entre especies. En este sentido, la búsqueda de nuevos microorganismos beneficiosos antagonistas que controlan las poblaciones de microorganismos patógenos mediante un mecanismo de exclusión competitiva, es una alternativa para el control de pérdidas por patologías infecciosas.

Los mecanismos de exclusión competitiva entre microorganismos pueden ser variados y van desde la producción de moléculas que matan (antibióticos) a los competidores, hasta complejos sistemas de modulación que consideran la producción de metabolitos que alteran el programa genético de los competidores, alterando por ejemplo, la conducta virulenta de microorganismos patógenos. Estos compuestos no tienen como función exclusiva la competencia, y por lo general pueden ser producidos por el metabolismo microbiano bajo variadas circunstancias.

Por otra parte los mencionados microorganismos probióticos, tales como bacterias prebióticas, pueden producir moléculas naturales de origen microbiano, tensoactivas y/o emulsificantes, con estructuras hidrofóbicas e hidrofílicas; y de esta forma se particionan en la interfase entre fases fluidas con diferentes grados de polaridad, tales como, las interfases aire-agua o aceite-agua. Dichas moléculas o mezclas de las mismas son conocidas como biosurfactantes.

A pesar de que los surfactantes de mayor uso son sintetizados químicamente, en las últimas décadas el desarrollo y producción de surfactantes de origen biológico han incrementado. Este alto interés se explica por las potenciales aplicaciones en la protección ambiental, industria del petróleo, salud humana y en la industria de los alimentos. Las aplicaciones se basan principalmente en su comportamiento físico- químico, inocuidad ambiental y baja toxicidad. Los ejemplos de utilidad van desde la depuración de ambientes contaminados hasta la formulación de productos destinados al área de salud. Por ejemplo, en la industria farmacéutica los biosurfactantes son utilizados en cosmética como agentes emulsificantes no tóxicos. Los biosurfactantes se clasifican de acuerdo a su composición química y de acuerdo a su origen microbiano. La clasificación general de los biosurfactantes de acuerdo a sus componentes, les agrupa en: glicolípidos, lipopéptidos, fosfolípidos, ácidos grasos y finalmente surfactantes poliméricos o particulados. Dentro del grupo glipopéptidos, los más conocidos de ellos corresponden a los ramnolípidos, descritos por primera vez en la bacteria Pseudomonas aeruginosa, los cuales se caracterizan por presentar una o dos moléculas de ramnosa asociadas a una o dos moléculas de ácido β-hidroxidecanoico. Entre los lipopéptidos, destaca el surfactin producido por B. subtilis ATCC 213322). Otros biossurfactantes conocidos corresponden al liposan {Candida lipolytica y emulsan (Acinetobacter calcoaceticus cepa, RAG-1 ), ambos surfactantes poliméricos formados por complejos polisacárido-proteína.

El desarrollo de nuevos biosurfactantes y estudios a nivel molecular, indican que estos compuestos tienen importantes funciones fisiológicas y ecológicas para el microorganismo que los produce. Por ejemplo, se ha determinado la función de los surfactantes en la motilidad bacteriana, procesos de señalización celular y diferenciación celular. La producción de biosurfactantes por microorganismos se asocia a mecanismos de competencia con otros microorganismos. Es así que algunos de ellos pueden ser una alternativa al uso de compuestos sintéticos o agentes antimicrobianos (antibióticos) por su efectividad, especificidad terapéutica y baja toxicidad. De acuerdo a las investigaciones realizadas, las actividades biológicas exhibidas por los biosurfactantes no están referidas a sus propiedades detergentes, sino más bien a mecanismos moleculares y fisiológicos específicos. En este contexto, las propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras son muy atractivas en la actualidad, existiendo una gran variedad de aplicaciones. Por ejemplo, se ha establecido que los surfactantes tienen la capacidad de modificar el comportamiento microbiano al relacionarse con la comunicación entre células, en donde ciertos genes relacionados con la síntesis de compuestos de naturaleza surfactante, responden a la presencia de señales químicas específicas. Más específicamente se sostiene que los biosurfactantes pueden interrumpir el sistema de comunicación Quorum Sensing (QS); evitando así la patogenicidad de microorganismos que afectan a otros organismos de interés. En particular, se ha determinado que la formación de biofilms y la virulencia de patógenos microbianos dependen, en muchos casos, del mecanismo molecular denominado Quorum Sensing (QS), caracterizado por corresponder a un mecanismo dependiente de la densidad microbiana y por usar moléculas químicas específicas como señales entre células. Dichas señales químicas son producidas constantemente induciendo una respuesta grupal coordinada cuando la densidad celular es alta. Las moléculas que median la señal de QS, se denominan auto inductores, y son producidas a niveles básales en el microorganismo. Se han identificado una gran variedad de moléculas señal, siendo las más estudiadas la familia de las homoserina lactonas (AHLs).

Dado que la patogenicidad de microorganismos esta relacionada a la expresión de factores de virulencia que les permite acceder, colonizar, diseminarse y proliferar en el hospedero causando el daño asociado. En muchos casos los factores de virulencia se producen sólo bajo condiciones específicas, por lo que en los distintos microorganismos patógenos existen diferentes mecanismos destinados a coordinar la expresión de estos factores con la presencia y características eco-fisiológicas del organismo hospedero. Bajo estas condiciones, algunas bacterias patógenas además de desencadenar la conducta patógena, forman biopelículas, y pueden ser resistentes a la presencia de antibióticos.

En este contexto y dado que el sistema de comunicación denominado Quorum Sensing (QS) está efectivamente presente en bacterias patógenas de peces como Listonella anguillarum y Aeromonas salmonicida; en la actualidad, se propone que una de las alternativas al tratamiento de enfermedades infecciosas en peces debiera enfocarse en la inhibición y/o estimulación del sistema QS de bacterias patógenas.

Los tratamientos de enfermedades infecciosas que afectan a peces son realizados por los procedimientos de: (i) inmunización vía vacunación, (ii) terapia antimicrobiana y (iii) procedimientos de manejo profiláctico e higiene durante todo el proceso productivo; todos los cuales no constituyen procedimientos específicos y generan daños a los ecosistemas microbianos, además de exhibir una limitada eficacia, cuantificable por las perdidas económicas producidas debido a la mortalidad de los peces por infecciones; actualmente existe una demanda creciente para la búsqueda de nuevos productos capaces de combatir las patologías infecciosas con mayor eficiencia.

De esta forma, el mecanismo de inhibición de la comunicación celular dependiente de Quorum Sensing es una de las alternativas a los actuales tratamientos para evitar y tratar patologías infecciosas, puesto que esta estrategia de control es selectiva, no genera resistencia y es ambientalmente compatible pues no elimina microorganismos de importancia ambiental. La búsqueda y desarrollo de inhibidores naturales del sistema Quorum Sensing está basada en la competencia existente entre microorganismos en sus ecosistemas, donde, en muchos casos, se ha evolucionado a una interacción basada en los sistemas de comunicación de QS. Así, la interferencia en el circuito QS, con la consecuente modificación del programa genético del microorganismo contrincante, se denomina Quorum Quenching (QC). Artificialmente, es posible generar QC mediante (i) el uso de moléculas similares a las AHLs que imitan su estructura uniéndose al receptor correspondiente, evitando así la respuesta del circuito, o (ii) mediante la degradación de la señal AHLs respectiva utilizando enzimas lactonasas y/o acilasas que, respectivamente rompen el anillo lactónico o hidrolisan la cadena lateral del mismo anillo.

Existen patentes referidas al mecanismo Quorum Sensing, algunas de ellas tratan sobre métodos para inhibir este sistema y evitar así las patologías microbianas. Entre dichos documentos se encuentra la solicitud de patente WO/2002/00035 A1 , que se refiere a un alimento y el método para producirlo con la finalidad de utilizarlo en la industria acuícola para el control de patologías infecciosas en peces. Dicha solicitud trata del uso de bacterias de los géneros Bacillus, Paenibacillus y Alteromonas como microorganismos probióticos para el control de patógenos por el mecanismo de exclusión competitiva. Así mismo, la patente describe la incorporación en el alimento de furanonas como compuestos destinados a inhibir el sistema de QS. En ambos casos se considera el uso de agentes surfactantes sintéticos como método de formar emulsiones con las bacterias y/o principios activos. En dicha solicitud no se menciona a bacterias del género Cobetia ni tampoco se sugiere el mecanismo por el cual biosurfactantes producidos pudisesen generar un efecto en las señales involucradas en Quorum Sensing. Así mismo no existen documentos de patente que indiquen el uso de biosurfactantes y/o moléculas tensoactivas capaces de realizar un secuestro molecular de las señales involucradas en Quorum Sensing.

Por otra parte, otros documentos del arte previo mencionan o describen el uso de microorganismos similares a la cepa de la presente invención. La solicitud de patente JP2009034094, por ejemplo, describe un nuevo microorganismo del género Cobetia, cepa FERM P-21295, y cepas mutantes de la misma. En esta solicitud se revela un método para la producción de polisacáridos, tras el aislamiento y cultivo de la cepa FERM P-21295. Dichos polisacáridos obtenidos a partir de esta cepa, comprenden componentes estructurales tales como N-acetilo-D-glucosamina, ácido D-galacturónico, N-acetilo-D-galactosamina, D-galactosa, ácido pirúvico y D-alanina. En este documento se revela el uso de los polisacáridos en cosméticos, medicinas, y como aditivo alimenticio; resaltándose el grado de estabilidad de los mismos y un notorio efecto en la supresión de la producción de melanina. La solicitud de patente JP2008194026A, por su parte, describe un nuevo microorganismo Cobetia (FERM P-21 101 ), que cultivado bajo condiciones convenientes produce un ácido mucopolisacárido. Esta solicitud también enseña sobre un método, que consiste en cultivar el microorganismo de Cobetia marina, produciendo el mucopolisacárido en el medio de cultivo, obtener la solución de cultivo, y aislar el mucopolisacárido ácido sin realizar la eliminación selectiva del polisacárido sulfatado de la solución de cultivo.

El microorganismo de Cobetia marina es útil para producir el mucopolisacárido que es útil como medicamento dermatológico, cosméticos, útil para prevenir la pigmentación, punto de hígado, pecas, cloasma, quemadura del sol. Puede también ser utilizado en prodrogas y productos farmacéuticos. Sin embargo, ninguno de los documentos JP2009034094 o JP2008194026A enseña características similares o cercanas a las del extracto de la presente invención, es más, los productos de utilidad divulgados en dichas solicitudes, corresponden a polisacáridos o mucopolisacáridos, y no a ácidos grasos en un extracto con características de tipo surfactante, como es el caso de la presente invención. Además ninguno de ellos hace referencia al uso de Cobetia marina como cepa productora de compuestos inhibidores de QS, a diferencia de la presente invención, donde se utiliza Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 como fuente productora de moléculas tenso-activas que forman estructuras lipídicas capaces de interactuar con las señales de QS inhibiendo las conductas de microorganismos patógenos y/o estimulando la inmunidad de animales en cultivo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

La presente invención se apoya en las siguientes figuras, las cuales a continuación de describen brevemente:

La Figura 1 corresponde a un Bioensayo en placa de agar para la detección de inhibidores del sistema de comunicación Quorum Sensing con el biosensor Chromobacterium violaceum. La fotografía muestra el cultivo en placa de agar nutritivo de doble capa de la bacteria C. violaceum produciendo el pigmento violaceina dependiente de la presencia de moléculas señales del sistema de QS. La zona clara sin color azul-violeta indica una zona de inhibición (+) de la producción del pigmento violaceina, el cual es producido por la inducción del sistema de QS por señales del tipo homoserina lactonas dada la actividad del sobrenadante filtrado de las cepas de la invención en el pocilio 2. El pocilio 4 corresponde al control negativo (-) que corresponde a medio de cultivo sin crecimiento bacteriano.

La Figura 2 corresponde a un Bioensayo en microplaca para la detección de bacterias productoras de inhibidores del sistema Quorum Sensing. El bioensayo fue realizado con cultivos líquidos del biosensor C. violaceum crecidos en la presencia del sobrenadante filtrado de un cultivo de la cepa MM1 IDA2H-1 crecida en medio Bushnell-Hass con DBT como única fuente de energía y carbono. Como control (c) se utilizaron cultivos de C. violaceum expuestos a medio de cultivo Bushnell-Hass sin inocular con la cepa MM1 IDA2H-1 . El color azul-violeta indica la presencia del pigmento violaceina (signo -), el cual se produce cuando determinadas señales químicas activan el sistema de QS. La presencia de inhibidores del sistema QS se determina por la pérdida del color azul-violeta (signo +).

La Figura 3 corresponde a un Bioensayo en microplaca para evaluar el efecto inhibidor sobre el sistema de comunicación Quorum Sensing del extracto extracelular biosurfactante de la cepa MM1 IDA2H-1 . Los cultivos de C. violaceum fueron crecidos en la presencia del extracto extracelular biosurfactante (AAFOB) producido por la cepa MM1 IDA2H-1 crecida en medio Bushnell-Hass con DBT como única fuente de energía y carbono (donde la actividad inhibitoria, se simboliza con el signo

+) ^■

La Figura 4 corresponde a Bioensayo en microplaca para evaluar el efecto inhibidor del extracto surfactante AAFOB de señales de Quorum Sensing generadas por la bacteria patógena de peces Aeromonas salmonicida. (donde la actividad inhibitoria, se simboliza con el signo +).

La Figura 5 muestra gráficamente la actividad antivirulencia del extracto contra la bacteria patógena Aeromonas salmonicida. Actividad medida en relación a la expresión de genes de virulencia: aerolisina (A), serina proteasa (B) y lipasa (C) de dicha cepa patógena, en condiciones control (sin tratamiento) y al ser tratada con el extracto biosurfactante de la presente invención. La Figura 6 muestra una microfotog rafia electrónica de transmisión de las células bacterianas de la cepa MM1 IDA2H-1 fueron crecidas en medio mínimo Bushnell-Hass con succinato (30 mM) como única fuente de energía y de carbono (A) o en medio mínimo Bushnell-Hass con DBT (1 % p/v) como única fuente de energía y de carbono (B). (C) y (D) corresponden a microfotog rafias de epifluorescencia, equivalentes a (A) y (B), usando la tinción con BODIPY para visualizar ácidos grasos. La Figura 7 muestra en un bioensayo de microplaca la inhibición del fenotipo dependiente de Quorum Sensing usando Cobetia marina MM1 IDA1 H-1 . (A) Muestra la respuesta del fenotipo púrpura de C. violaceum a diferentes concentraciones ^g ml/L) del biosurfactante (BS) producido. (B) Se observa tensión superficial de agua (ST) a diferentes concentraciones (mg l/L en escala logarítmica) del biosurfactante (□), y su efecto sobre la formación de biopelícula de L anguillarum (O). La concentración micelar crítica fue establecida en 80 mg l/L. Los valores máximos de inhibición de fenotipos dependientes de Quorum Sensing fueron a concentraciones de formación de micelas.

En un primer aspecto, la invención provee una nueva bacteria probiótica denominada Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 para evitar o tratar patologías infecciosas en acuicultura. La cepa bacteriana de la presente invención fue aislada y seleccionada entre microorganismos autóctonos del ambiente marino capaces degradar o metabolizar compuestos orgánicos insolubles y que forman parte del petróleo, que pueden ser dañinos para el ambiente. Los compuestos sustratos útiles para ser degradados son de los tipos aromáticos y/o alifáticos, los que son solubilizados en el medio acuático para ser asimilados por el microorganismo. Dichos sustratos son utilizados por el microorganismo para producir su energía, material celular y metabolitos secundarios. La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , de esta invención corresponde a una cepa autóctona del ambiente marino, capaz de crecer en un amplio rango de concentración salina (cloruro de sodio), un amplio rango de temperatura de 10 ^Q a 35 ^Q C y utilizar compuestos orgánicos aromáticos o alifáticos que son componentes orgánicos del petróleo, como fuente de energía y de carbono, y por tanto sobrevive en el ambiente marino. En una realización preferida la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 fue crecida con dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de carbono y energía, donde el rango para la utilización de dicha fuente de carbono varía entre 0,75 y 1 ,5 % p/v; y donde preferentemente la concentración de DBT utilizada es de 1 % p/v en los medios de cultivo y selección. La cepa de la presente invención fue identificada entre bacterias pertenecientes al género Cobetia por comparación y determinación de la identidad del genoma de la secuencia de la región correspondiente al ADN ribosomal 16S, en particular al polinucleótido de la región 16S del ARN ribosomal de la secuencia del microorganismo Cobetia spp. De esta forma se aisló un nuevo microrganismo, el cual fue depositado en el Centro Español de Cultivos Tipo (CECT) con número de registro 7764 con fecha 5 de Julio del año 2010 {Cobetia marina cepa MM1 IDA2H- 1 ). Dadas dos secuencias muy similares o idénticas, la discriminación se realizó con la técnica de evaluación de paramámetros fisiológicos/bioquímicos, tales como; capacidad de utilizar diferentes hidrocarburos, la sensibilidad a antibióticos y actividades enzimáticas. Como patrón para comparación se utilizó en los ensayos de caracterización la bacteria de referencia denominada Cobetia marina CECT 4278.

A diferencia de la especie de referencia Cobetia marina CECT 4278, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 A2DAIH-1 de la presente invención es capaz de crecer en hidrocarburos del tipo DBT, generar un extracto capaz de disminuir la tensión superficial, actuar como emulsificante y generar un extracto con capacidad inhibidora de QS cuando crece en un medio de cultivo sólo con DBT como fuente nutricional, esto es, como fuente de energía y carbono. En los ensayos realizados con la cepa de referencia Cobetia marina CECT 4278 utilizando métodos propios de la técnica, no se estableció su capacidad de utilizar DBT y producir tensoactivos. A su vez, a partir de ensayos bioquímicos para determinar la existencia de enzimas y/o metabolismos caracterizadores se establece que existen características diferenciadoras entre Cobetia marina cepa de referencia y Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de esta invención. En particular es posible diferenciar, de forma simple y efectiva ambas bacterias, debido a que Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 tiene una reacción positiva a la reacción de oxidasa, mientras que Cobetia marina CECT 4278 arroja resultados negativos para dicha prueba. Por otra parte, es de especial interés el hecho de que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 no presenta características de patogenicidad, es decir, es inocua; ya que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 no presenta actividad hemolítica cuando se crece en un medio de cultivo conteniendo sangre. En este sentido, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de esta invención presenta entre sus características novedodas: usar compuestos derivados del petróleo, tales como, hidrocarburos aromáticos cíclicos sulfurados; y generar biosurfactantes con actividad física y biológica específica. En razón de esto es posible determinar que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es parte del grupo de microorganismos beneficiosos o también denominado probiótico para la acuicultura.

En un segundo aspecto, la invención provee un método para producir el biosurfactante AAFOB-1 IDA2H utilizando la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de la presente invención, el cual comprende las etapas de:

(a) crecer Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de cutivo conteniendo entre 0,75 a 1 ,5% p/v de DBT u otro hidrocarburo aromático cíclico azufrado como único sustrato de carbono disponible para la bacteria, el medio además comprende al menos: 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todo ellos disueltos en agua destilada;

donde, alternativamente, se puede crecer la cepa de la invención en condiciones similares a las ya descritas, reemplazando un 75% del volumen de agua destilada por un 75% de agua de mar como agente solubilizante;

agitar entre 100 a 400 rpm, durante 24 a 48 horas bajo condiciones de pH entre 6 y 8; temperatura entre 10 ^Q y 35 ^Q C; saturación de oxígeno entre 10-21 %;

(b) separar las células de la cepa crecida mediante centrifugación y posterior filtración;

donde la etapa de centrifugación se lleva a cabo entre 4.000 a 8.000 rpm durante 15 a 20 minutos; y tras descartar la fase sedimentada, se recupera el sobrenadante, el cual es filtrado por filtro de corte entre 0,22 y 0,45 μηι;

(c) liofilizar el sobrenadante filtrado a -80 ^Q C y 10 militorr (1 ,33 Pa);

(d) tamizar el polvo obtenido den la etapa (c) mecánicamente, bajo agitación en posición horizontal, para desprender impurezas y sales; y (e) secar el polvo tamizado obtenido en la etapa (d) a una temperatura entre 30 y 50 °C durante 20 a 30 horas, logrando un polvo seco de color amarillo tenue constituido de ácidos grasos que tiene propiedades emulsificantes y bioactivas. La condiciones mas preferentes son, secar el polvo a 40 ^Q C por 24 horas.

La realización preferida de la presente invención involucra un método donde se lleva a cabo el crecimiento de la cepa bacteriana en un medio comercial Bushnell-Hass (Difco) (medio que comprende las sales mencionadas en el paso (a)) ó un medio formado en un 25% por dicho medio y un 75 % en volumen por agua de mar; donde el valor de la concentración de la fuente única de carbono (DBT) preferido es de 1 % p/v.

En un tercer aspecto, la invención provee un extracto concentrado biosurfactante y tensioactivo de propiedades emulsificantes y bioactivas. Dicho extracto biosurfactante es caracterizado por su composición química, su capacidad de emulsificar y su actividad biológica.

Las propiedades bioactivas del extracto biosurfactante de la invención (AAFOB- 1 1DA2H) son determinadas en cuanto a su actividad sobre la formación de biofilms y la patogenicidad bacteriana, actividades dependientes del sistema QS.

La actividad biológica del extracto biosurfactante se determinó sobre bacterias patógenas de peces tales como Listonella anguillarum que forma biopelículas que favorecen su diseminación. En particular, la exposición de Listonella anguillarum a la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 y/o al extracto biosurfactante de esta invención, resulta en la inhibición de la formación de biopelículas del patógeno señalado.

Asi mismo, se puede utilizar la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 como bacteria beneficiosa para evitar las patologías causadas por Listonella anguillarum. Además, se determinó el efecto del extracto biosurfactante de la presente invención sobre las bacterias del género Aeromonas que producen y secretan proteínas extracelulares líticas que son factores de virulencia, controlados por QS, tales como proteasas y lipasas, especialmente se logra inhibir la virulencia que depende del mecanismo de QS de bacterias y hongos patógenos, preferentemente la inhibición de la virulencia de la bacteria patógena Aeromonas salmonicida.

Por otra parte, las propiedades tensoactivas del extracto biosurfactante de esta invención son medidas de acuerdo a la disminución de la tensión superficial o por su actividad como emulsificante. Dichas propiedades tensoactivas permiten la incorporación de estos productos en la forma de aditivos cosméticos, alimentarios y/o cualquier otra fórmula alimentaria o farmacéutica.

La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es utilizada en la presente invención para producir un extracto biosurfactante que tiene propiedades físicas al actuar como un agente emulsificante, con un valor de tensión superficial de entre 66 a 70 dinas/cm, y con una alta estabilidad de emulsión.

El extracto AAFOB-1 IDA2H de la presente invención corresponde a una mezcla de moléculas orgánicas compuesta de al menos ácidos grasos de los tipos palmítico, miristico y linoléico, específicamente está constituido por 2,52 a 9,22 % de ácido láurico C12:0; 5,97 a 10,13 % de ácido miristico C14:0; 2,4 a 2,88 % de ácido pentadecanoico; 19,27 a 24,39 % de ácido palmítico C16:0; 7,81 a 9,83 % de ácido palmitoleico C16:1 ; 8,37 a 10,43 % de ácido esteárico C18:0; y 1 1 ,32 a 16,25 % de ácido oleico C18:1 cis. Este extracto es obtenido por la biosíntesis llevada a cabo por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 crecida en un medio mínimo sumplementado con DBT como única fuente de carbono.

Las propiedades tensoactivas de productos de origen microbiano medidas por su capacidad de disminuir la tensión superficial o actuar como emulsificantes son de gran importancia tecnológica en formulaciones cosméticas, alimentarias y/o farmacéuticas. En particular las emulsionantes provistas por el extracto biosurfactante de la presente invención entregan estabilidad a las formulaciones en las que se incorpora un principio activo que requiere ser dosificado o entregado para usos cosméticos, farmacéuticos y alimentarios, entre otros. La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce un sobrenadante tensoactivo capaz de disminuir la tensión superficial, siendo capaz de de mantener emulsiones estables de soluciones agua aceites orgánicos, utilizados en la industria de los alimentos y también en soluciones con hidrocarburos usados en la industria de pinturas y/o revestimientos. Por otra parte la actividad biológica del extracto biosurfactante se evaluó en peces en cultivo para determinar su toxicidad y potencial efecto sobre la inmunidad de peces. En este sentido el producto extracto AAFOB-1 IDA2H no resultó ser tóxico (con una sobreviciencia del 78 %) para peces y de acuerdo al análisis de inmunidad con diferentes marcadores se observó que fue capaz de estimular la actividad del agente inmunológico TNF-alfa en branquias de truchas.

La utilización del extracto AAFOB-1 IDA2H biosurfactante producido extracelularmente por la nueva cepa bacteriana marina, con propiedades físicas emulsificantes, y propiedades biológicas asociadas a la inhibición selectiva de mecanismos de virulencia de microorganismos patógenos de peces, implica una línea de desarrollo de productos antimicrobianos para la acuicultura de alto valor por ser selectivo, no tóxicos, no generar resistencia y ser ambientalmente inocuos.

Así un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso del extracto bioactivo con propiedades tensoactivas emulsificantes como un aditivo alimentario y/o revestimiento de pintura. En particular, el biosurfactante puede ser utilizado como un aditivo alimentario en una formulación alimentaria que otorga funcionalidad al alimento; o este aditivo alimentario se usa para evitar y tratar patologías infecciosas dependientes del sistema QS. Otra realización alternativa utiliza el extracto AAFOB- 1 IDA2H en la formulación de revestimientos y/o pinturas bioactivas de superficies sumergidas, siendo de especial interés su utilización para el control de biopelículas microbianas.

EJEMPLOS DE APLICACION

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento.

Las cepas de bacterias aisladas desde muestras de aguas de mar fueron enriquecidas en medio líquido Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT (Merck, Hohenbrunn, Germany) como única fuente de energía y de carbono. La temperatura de crecimiento fue de 20 ^Q C. Los bioensayos para determinar la presencia de inhibidores o estimuladores del sistema QS fueron realizados utilizando a las cepas Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) y Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E-82808)(Chu et ai, 201 1 ) las que fueron crecidas a 26 ^Q C en medio Luria Bertani. Para la cepa C. vilaceum CV026 se adicionó al medio de cultivo el antibiótico Kanamicina (25 μg ml).

Aislamiento de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 .

La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de la presente invención fue aislada desde muestras de agua de mar tomadas de pozas litorales intermareales en la zona de Reñaca, Viña del Mar en la región de Valparaíso, Chile. Las muestras de agua fueron utilizadas para realizar un enriquecimiento selectivo inoculando matraces con medios de cultivos y DBT como única fuente de energía y de carbono. Los matraces fueron incubados a 20 ^Q C durante 2 semanas. Los cultivos con crecimiento fueron seleccionados para realizar el aislamiento en medio de cultivo sólido Difco™ Agar Marino de ZoBell 2216 (Becton Dickinson and Co. USA). Las placas fueron incubadas a 20 ^Q C y de ellas se seleccionaron colonias aisladas para los posteriores análisis.

Caracterización microbiológica.

La identificación y caracterización de la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 se realizó mediante estudios: 1 ) moleculares (amplificación, secuenciación, análisis de la secuencia de la región ADNr 16S); 2) fisiológicos (crecimiento en diferentes concentraciones de cloruro de sodio); y 3) por ensayos bioquímicos y metabólicos (con los sistemas Api 20 NE de Biomerieux y Ecoplate de BIOLOG). La secuenciación y análisis de la región del ADNr 16S se realizó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Para todos los estudios comparativos se utilizó la cepa de referencia Cobetia marina (CECT 4278; ATCC 25374).

Dada la necesidad de clasificar adecuadamente a los nuevos microorganismos presentes en la familia Halomonadaceae, la ubicación taxonómica de la bacteria Cobetia marina MM1 IDA2H-1 utilizada en la presente invención se basa en métodos de biología molecular y en métodos que determinan características propias de los microorganismos, tales como su metabolismo y requerimientos de sales del tipo NaCI. Todas estas técnicas son reproducibles y forman parte del estado de la técnica.

Tabla 1 . Diferencias entre bacteria Cobetia cepa MM1 IDA2H-1 , bacteria Cobetia marina y Halomonas halodurans.

Halomonas

Cobetia marina halodurans MM1 IDA2H-1

Crecimiento en:

Lactulosa - - +

Xylitol - - +

Acido Fórmico - - -

Acido D-Glucosaminico - + +

Dibenzotiofeno ND ^* ND ^* +

Antraceno ND ^* ND ^* +

Fenantreno ND ^* ND ^* +

Naftaleno ND ^* ND ^* +

Hexadecano ND ^* ND ^* -

Rango de crecimiento en NaCI

0,5-20 3-20 1 -18

(%)

Reacción de:

Oxidasa - + +

Reducción de nitrato - - -

ONPG + - +

Lisina decarboxilasa + + -

Sensibilidad a:

Nitrofurantoina + - - Rifampicina - + -

Trimetroprima-sulfametoxazol + + -

16S rADN similitud a Cobetia

100 100 100 marina

16S rADN similitud a Halomonas

100 100 100 halodurans

Producción de extracto

tensoactivo biosurfactante (BS) ND ^* ND ^* + utilizando DBT.

Producción de extracto BS con

propiedades contra A. - ND ^* + salmonicida

Producción de extracto BS

inhibidor de sistema de QS de C. - ND ^* + violaceum.

ND ^* No descrito en la literatura

La evaluación del extracto biosurfacante producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 se realizó mediante la evaluación de propiedades tensoactivas. En particular se evaluaron 12 colonias de cepas aisladas en cultivo puro, crecidas independientemente en medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono a 20 ^Q C durante 72 horas. Los cultivos obtenidos fueron centrifugados a 4.000 rpm durante 20 minutos a 4 ^Q C. Los sobrenadantes de las 12 cepas obtenidas fueron filtrados con filtros de celulosa de 0,22 μηι y almacenados a 10 ^Q C para el análisis de las propiedades tensoactivas. El análisis de la propiedades tensoactivas fueron realizadas utilizando un tensiómetro de DuNóy para lo cual se utilizó los sobrenadantes de los microorganismos aislados. Tabla 2. Valores de Tensión Superficial.

La Tabla 2 de arriba muestra las 12 cepas de bacterias de origen marino que fueron aisladas desde muestras de agua de mar mediante un procedimiento de enriquecimiento selectivo utilizando un medio mínimo de cultivo conteniendo un hidrocarburo derivado del petróleo como única fuente de energía y carbono. El compuesto para el crecimiento de la cepa fue dibenzotiofeno, insoluble en la fase acuosa. Una vez aislados, los microorganismos fueron evaluados para determinar su capacidad de producir compuestos tensoactivos, para lo cual fueron crecidos en medio líquido Bushnell-Hass desde donde se obtuvieron muestras de 20 ml_ que fueron filtradas y centrifugadas a 8.000 g. Los sobrenadantes finales fueron utilizados para medir la tensión superficial con un equipo tensiómetro de Dunoy. Los valores representan la caída en la tensión superficial del agua (TS). Evaluación propiedades bioactivas.

Una vez determinada la propiedad tensoactiva de los sobrenadantes se procedió a realizar un bioensayo destinado a establecer la capacidad de inhibir o estimular el mecanismo de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS). El bioensayo para determinar la existencia de inhibidores del sistema QS utilizó a la cepa Chromobacterium violaceum y consistió en exponer a este microorganismo a la presencia del sobrenadante de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1. La bacteria Chromobacterium violaceum tiene un circuito de QS que al estar activado induce la expresión de los genes que codifican para la síntesis de violaceína, un compuesto que otorga a esta bacteria un fenotipo de color violáceo característico. Por otra parte, como ensayo para determinar la existencia de una estimulación del sistema QS se utilizó a Chromobacterium violaceum CV026. Este microorganismo deriva de la cepa silvestre Chromobacterium violaceum y a diferencia ha sido mutada en su capacidad de producir moléculas autoinductoras con la inserción de un mini transposón con resistencia al antibiótico kanamicina (miniTn5::Km). De esta forma este microorganismo requiere de señales químicas externas para poder activar el circuito de QS y generar el fenotipo de color violeta. Para los bioensayos de interferencia con el sistema QS se utilizó el sobrenadante de las bacterias degradadotas de DBT seleccionadas.

Como resultado de Crecimiento de la a Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT (Merck, Hohenbrunn, Germany) se produce un sobrenadante que reduce la tensión superficial del agua ultrapura (agua de alta pureza completamente libre de sólidos disueltos y suspendidos) a 68 Dinas/cm (Tabla 2). Esta reducción es comparativamente menor al obtenido por las cepas que fueron asiladas por su característica de crecer en la presencia de DBT como fuente de carbono. Durante su crecimiento en estas condiciones es posible apreciar mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión, la formación de estructuras lipídicas que son secretadas al exterior de la célula (Figura 6).

El sobrendante producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT inhibe el fenotipo de color violeta que depende de QS en la bacteria Chromobacterium violaceum (ver 2 en Figura 1 y Figura 7). Por otra parte no se observó un efecto inductor del sistema de QS de la bacteria Chromobacterium violaceum CV026. El medio de cultivo sin inocular no produjo efecto inductor o inhibidor en los respectivos bioensayos (ver 1 en Figuras 1 y 7).

La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es de forma bacilo corto, Gram negativa, oxidasa positiva, que crece en un amplio rango de cloruro de sodio (Tabla 1 ). No posee actividad hemolítica y por tanto no es considerada una bacteria patógena. En comparación a lo descrito en la cepa de referencia del arte previo, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 metaboliza como fuente de carbono antraceno, naftaleno y fenantreno.

Durante el crecimiento en un medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce un sobrenadante de características de biosurfactante y que es bioactivo al ser capaz de inhibir el mecanismo de comunicación intercelular de QS de la bacteria Chromobacterium violaceum. No existen reportes de bacterias de este género que sean capaces de utilizar DBT como fuente de carbono y sintetizar biosurfactantes que tengan actividad biológica. Tanto la degradación de este tipo de compuestos como la producción de surfactantes bioactivos son consideradas características positivas en bacterias de origen marino y por tanto explican su beneficio en el uso en acuicultura.

Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce el extracto AAFOB-1 IDA2H con propiedades emulsionantes de interés en la formulación de alimentos, y en la formulación de revestimientos y/o pinturas bioactivas de superficies sumergidas.

Obtención de extracto AAFOB-1 IDA2H.

Para obtener un extracto tensoactivo desde el sobrenadante producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , se procedió a inocular la bacteria en 1 litro de medio Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono. El crecimiento fue llevado a cabo utilizando un biorreactor Fermentor Liflus modelo GX con control automático de pH, oxígeno, temperatura y agitación. Las condiciones de incubación fueron: temperatura de 30 ^Q C, aireación 100 % y agitación con aspas giratorias a 200 rpm durante 48 horas. El cultivo obtenido fue centrifugado a 5.000 rpm durante 20 minutos en una centrifuga Eppendorf modelo 5810R y el sobrenadante fue filtrado en filtros estériles de 0,22 μηι. El sobrenadante libre de células fue tratado con acetona (JT Backer, USA) fría en una proporción de 2:1 para la precipitación. La mezcla sobrenadante/acetona se almacenó a -10 ^Q C durante 24 horas. El precipitado obtenido fue separado de la solución acetona/agua por centrifugación a 10.000 rpm a 4 ^Q C en una centrifuga Eppendorf modelo 5810R. El precipitado obtenido se secó a temperatura ambiente durante 48 horas. Ensayos de índice de emulsificación y estabilidad de emulsión.

Se determinó el índice de emulsificación del extracto seleccionado con diferentes fases orgánicas. El extracto obtenido se disolvió en agua ultra pura a una concentración de 100 mg/mL. Los ensayos de emulsificación fueron llevados a cabo con hexadecano (Merck, Germany), gasoil comercial, aceite de pescado comercial y aceite de cañóla comercial. Las proporciones de fases orgánica:acuosa utilizadas fueron de 1 :1 . Las emulsiones fueron formadas mediante la agitación en vortex durante 2 minutos dejando los tubos en reposo durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de reposo se procedió a medir el índice de emulsificación a las 24 horas (E ₂₄ ) para lo cual se midió la altura de la emulsión en centímetros respecto a la altura total de las fases, expresando el resultado en porcentaje. La estabilidad de la emulsión fue determinada mediante la medición de la constante de decaimiento (K _d ). Para esto se realizaron emulsiones como se describió previamente con diferentes fases orgánicas midiendo la turbidez de la fase acuosa a una longitud de onda de 540 nm. Las proporciones para las fases orgánicas y acuosas fueron de 4:25, respectivamente. Las mediciones fueron realizadas a los tiempos 10, 20, 30 40, 50 y 60 minutos después de haber formado la emulsión. La constante de decaimiento (K _d ) fue calculada a partir de la pendiente de los datos obtenidos en las lecturas de turbidez versus tiempo.

El extracto AAFOB-1 IDA2H producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 durante su crecimiento en DBT como fuente de carbono, posee la propiedad de actuar como un emulsificante y es capaz de mantener estables emulsiones de aceite de pescado y cañóla (Tablas 3 y 4).

Tabla 3. Actividad emulsificante del extracto denominado AAFOB con aceites de pescado y de cañóla.

Extracto AAFOB IE ₂₄ (%)

(mg/mL) Aceite de pescado

200 71 ,4

400 69,6

Control 0 Los compuestos denominados tensoactivos pueden actuar como emulsionantes lo que representa variadas ventajas en muchos procesos productivos de los sectores industriales farmacéutico y de los alimentos. En este caso se muestra que el extracto denominado AAFOB producido por la cepa MM1 IAD2H cuando crece en dibenzotiofeno puede ser utilizado como un agente emulsionante de aceites tales como el de Cañóla o el de pescado. El índice de Emulsificación (IE) medido en porcentaje indica la estabilidad de la emulsión formada por el aceite y el agua en presencia de un agente emulsionante, en un tiempo determinado en este caso 24 horas a 20 ^Q C.

Tabla 4: Estabilidad de emulsión aceite de pescado-agua en la presencia de AAFOB medida por la Constante de Decaimiento (K _d ).

La composición química del extracto biosurfactante de esta invención fue determinada, encontrándose que el perfil por cromatografía de gas- masa (GC-M) muestra una alta contribución de ácidos grasos de 12 a 18 átomos de carbono (Tabla 5). Tabla 5. Porcentajes de ácidos grasos presentes en el extracto producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IA2H-1 .

Perfil Acidos Grasos Muestra Muestra Muestra

AAFOB-A AAFOB AAFOB-MM

% Ac. Láurico C12:0 9,22 2,52 3,87

% Ac. Mirístico C14:0 10,13 5,97 6,83

% Ac Pentadecanóico C15:0 2,88 2,54 2,40

% Ac. Palmítico C16:0 24,39 20,98 19,27 % Ac. Palmitoleico C16:1 9,83 8,46 7,81

% Ac. Esteárico C18:0 10,43 9,65 8,37

% Ac. Oléico C18:1 cis 13,29 16,25 1 1 ,32

Actividad del extracto biosurfactante AAFOB-1 IDA2H producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 sobre la virulencia de Aeromonas salmonicida y la formación de biofilms de Listonella anguillarum. Para los ensayos de formación de biofilms se utilizó la bacteria Listonella anguillarum (CECT 522; ATCC 19264) crecida a 20 ^Q C en DifcoTM Agar Marino de ZoBell 2216 (Becton Dickinson and Co. USA). La cepa Listonella anguillarum fue crecida a 20 ^Q C en medio líquido marino conteniendo: Extracto de levadura 10 g; Peptona 10 g; agua de mar filtrada 750 mi; agua destilada 250 mi. Los ensayos de inhibición de virulencia fueron llevados a cabo utilizando la cepa Aeromonas salmonicida (CECT 894 T; ATCC 33658) crecida a 24 ^Q C en medio caldo nutritivo o medio sólido TSA. Tanto A. salmonicida como Listonella anguillarum fueron manipuladas en una cabina de bioseguridad ESCO Streamline modelo SC2 Class II BS. Los bioensayos fueron realizados utilizando a las cepas Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) y Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E- 82808) las que fueron crecidas a 26 ^Q C en medio Luria Bertani. Para la cepa C. vilaceum CV026 se adicionó al medio de cultivo el antibiótico Kanamicina (25 μg ml). Ambas cepas fueron adquiridas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , fue crecida a 30 ^Q C en medio Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono, durante 48 horas con agitación a 200 rpm.

Bioensayo de inhibición del sistema de QS con extracto AAFOB-1 IDA2H.

Con el extracto obtenido se procedió a realizar un bioensayo destinado a establecer la capacidad de inhibir o estimular el mecanismo de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS). El bioensayo para determinar la existencia de inhibidores y/o estimuladores del sistema de QS fue llevado a cabo con la cepa Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026 al igual que lo descrito previamente. La bacteria Chromobacterium violaceum fue crecida en medio de cultivo liquido Luria Bertani en placas de microtitulación de 96 pocilios a 30 ^Q C. Para determinar si el extracto obtenido interfiere con la presencia de señales de QS, una vez alcanzada una densidad óptica de 0,3 (600 nm) a los pocilios se les adicionó 50 μΙ de sobrendantes provenientes de cultivos líquidos de la misma bacteria Chromobacterium violaceum y el extracto obtenido de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 (Figura 2). El extracto fue utilizado en concentraciones de 300 mg/ml disuelto en el medio de cultivo LB.

Para determinar si el extracto producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce efectos en el sistema de QS durante el crecimiento, Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026 fueron crecidas en la presencia del extracto de la presente invención (Figura 3).

Ensayo de inhibición del biofilms de Listonella anguillarum con el extracto AAFOB- 1 IDA2H.

El ensayo de formación o inhibición de biofilms fue desarrollado con la bacteria Listonella anguillarum CECT 522 adquirida en la Colección Española de Cultivos Tipo. Esta bacteria puede formar biofilms lo cual es una conducta dependiente de Quorum Sensing (QS). El protocolo utilizado fue evaluar la adherencia de Listonella anguillarum a placas de microtitulación de 96 pocilios, para lo cual se utilizó el método de tinción con cristal violeta. Este método permite teñir las células que se han adherido a una superficie cuando se forma una biopelicula. La cuantificación se realizó diluyendo con etanol-acetona los pocilios teñidos y leyendo las densidades ópticas a una absorbancia de 575 nm.

Ensayo de inhibición de factores de virulencia en Aeromonas salmonicida.

Para determinar el efecto de la bacteria Cobetia marina de esta invención sobre los factores de virulencia dependientes de QS en Aeromonas salmonicida se realizó un ensayo para cuantificar la expresión de genes de virulencia expuestos al extracto biosrufactante. Los genes evaluados fueron: 1 ) aerolisina, 2) proteasa de serina, y 3) lipasa. Dichos genes dependen del mecanismo QS en Aeromonas salmonicida. El ensayo fue llevado a cabo creciendo a Aeromonas salmonicida en un medio de cultivo líquido Caldo Nutritivo (Oxoid, UK) en presencia o ausencia del estímulo. Para los efectos y condiciones favorables de este estudio el estímulo corresponde al resultado de la exposición a compuestos producidos por la bacteria Cobetia marina. Los cultivos de Aeromonas salmonicida fueron crecidos en matraces Erlenmeyer en un incubador orbital Companion modelo SK-300 a 20 ^Q C y 200 rpm hasta llegar a una densidad óptica de 0,8 (Abs ₆ oonm)- A este tiempo los cultivos fueron centrifugados a 8.000 rpm a 4 ^Q C y se realizó la extracción y purificación de ARN con el sistema RNeasy ^® Mini Kit (Quiagene Ambion Inc. Texas, USA). La reacción de formación de cADN y amplificación fueron realizadas con el sistema de un solo paso Brillan. III Ultra Fast SYBR ^® Green QRT-PCR Master Mix (Agilent Technologies, USA). El RNA total extraído fue cuantificado en espectrofotómetro NanoDrop modelo DN-1000 y posteriormente se verificó en su integridad en una electroforesis en gel de agarosa (0,8 % p/v) teñido con bromuro de etidio.

La amplificación se realizó utilizando los siguientes cebadores:

Aero-F 5'-GAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAACC, y

Aero-R 5 ^X - TTCCAGTCCCACCACTTCACTTCAC para Aerolisina;

Lip-F 5'-GACCCCCTACCTGAACCTGAGCTAC, y

Lip-R 5'-AGTGACCCAGGAAGTGCACCTTGAG para Lipasa; y

Ser-F 5'- ACGGAGTGCGTTCTTCCTACTCCAG, y

Ser-R 5'- CCGTTCATCACACCGTTGTAGTCG para proteasa de serina.

Para la cuantificación relativa se utilizó como secuencia de referencia la región de ADNr 16S utilizando los cebadores 1492-R y 27-F. La reacción se llevó a cabo en un termociclador de tiempo real Aligent Technologies Stratagene modelo Mx3000P y la cuantificación relativa y análisis estadístico se realizó con el software MxPro (Aligent Technologies). Los resultados indican que el extracto producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 interfiere con señales de QS producidas por C. violaceum (Figura 2). Cuando este microorganismo se expone a la presencia de señales de QS y al extracto AAFOB-1 IDA2H no se forma el fenotipo de color violeta en esta bacteria. La ausencia de este extracto restituye el fenotipo violeta en los cultivos expuestos a las señales de QS (Figura 2). Para determinar si el extracto AAFOB-1 IDA2H actúa durante el desarrollo de C. violaceum, se expuso a este microorganismo diferentes concentraciones de extracto. En este caso, tampoco fue posible apreciar la formación del fenotipo violeta en las diferentes concentraciones evaluadas (Figura 3). Así, es posible establecer que el extracto AAFOB- 1 IDA2H posee la capacidad biológica de interferir con el sistema de QS existente en Chromobacterium violaceum.

Para determinar si la interferencia con el sistema de QS afecta la conducta patógena de microorganismos, se evaluó el efecto del extracto sobre la expresión de virulencia de la bacteria Aeromonas salmonicida (Figura 4), y en la inhibición de la formación de biofilm de la Listonella anguillarum (Tabla 6). Tabla 6. Actividad inhibitoria de la formación de biofilms de Listonella anguillarum.

Los resultados indican que el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con las señales de QS producidas por el patógenos Aeromonas salmonicida. Esta bacteria produce, durante su crecimiento, señales de QS que pueden ser detectadas por la bacteria Chromobacterium violaceum CV026, encendiendo su fenotipo de color violeta. La exposición de un sobrenadante con señales de QS en la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H evita la formación del fenotipo de color violeta en la bacteria Chromobacterium violaceum CV026 (Figura 4). De esta forma es posible establecer que el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con las señales de QS producidas por Aeromonas salmonicida. Para determinar si el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con el sistema de QS de Aeromonas salmonicida, y afecta el despliegue de factores de virulencia asociados, se realizaron ensayos de cuantificación de transcritos provenientes de Aeromonas salmonicida expuesta a los productos de la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 (Figura 5). Los resultados indican que los genes asociados a virulencia de Aerolisina (Figura 5A) y proteasa de serina (Figura 5B), son reprimidos significativamente cuando Aeromonas salmonicida crece en presencia de los productos generados por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 .

Por otra parte, se estudió la formación de biofilm de Listonella anguillarum en la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H. En esta bacteria patógena de peces, la conducta de formación de biopelículas es dependiente del sistema de QS y se considera que es de importancia para el desarrollo de patologías causadas por este microorganismo. Los resultados obtenidos indican que la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H, a una concentración de 75 mg/ml, inhibe la formación de biofilm hasta en un 86,5% (Tabla 6).

Los resultados indican que el extracto AAFOB-1 IDA2H producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 interfiere con el sistema de QS, y puede ser utilizado para evitar el despliegue de mecanismos de virulencia en bacterias patógenas de peces.

Ensayo de toxicidad y de inmunidad con peces.

Adicionalmente se ejecutó un ensayo de toxicidad y de inmunidad con peces de la especie Oncorhynchus mykiss en cultivo a través de un alimento que incorporó como principio activo al producto denominado AAFOB-1 IDA2H.

El ensayo de campo se realizó con 12 estanques de 0,18 metros/cúbicos agua salada en los cuales se colocaron 15 peces de aproximadamente 120 gramos cada uno de la especie O. mykiss, lo cual respresentó una densidad por estanque de 10 kilos por metro cúbico. Los estanques fueron separados en tres tipos de dietas, de los cuales dos fueron alimento en la forma de pellets elaborado con AAFOB-1 IDA2H en las dosis de 4,17 y 8,34 gramos de AAFOB-1 IDA2H por kilogramo de alimento entregado. La tercera dieta fue un control negativo, sin AAFOB-1 IDA2H. Para su mantenimiento en condiciones axénicas, las dosis elaboradas fueron tratadas con radiaciones ionizantes. Los peces fueron alimentados por al menos 30 días para evaluar los siguientes parámetros: 1 . Sobrevida a la dieta basada en AAFOB, 2. Actividad antimicrobiana de plásma sanguíneo sobre el patógeno Aeromonas salmonicida, 3. Efecto de las dietas sobre la microflora intestinal a nivel metabólico, 4. Efecto sobre la actividad inmunológica a nivel intestinal. Luego de someter a los peces a las respectivas dietas, los estanques fueron muestreados para obtener muestras de suero sanguíneo e intestinos para sus respectivos análisis.

Como resultados de este ensayo se obtuvo que el producto: 1. Por si sólo afecta el despliegue de factores de virulencia de patógenos de peces, 2. Es capaz de inducir una respuesta inmune específica mediada por Tnf-alfa en riñon e IL-1 B en branquias, 3. No representa toxicidad al ser incorporado directamente en peces en cultivo, 4. Presenta propiedades físicas que le permiten formar emulsiones estables con mezclas de aceites y así, ser adicionado a alimento de peces en la forma de pellets durante el proceso productivo de elaboración, 5. El alimento elaborado con el principio activo AAFOB-1 IDA2H al ser utilizado en una dieta para peces de la especie de O. mykiss de 120 gramos no resulta tóxico y estimula su sistema inmunológico, lo cual fue medido por una mayor actividad antimicrobiana de plasma sanguíneo de peces sometidos a la dieta comparados a una dieta control sin aditivo AAFOB-1 IDA2H.

Esto representa que la dieta formulada en base al producto AAFOB-1 IDA2H presenta un efecto a nivel de microflora y por tanto a niveles fisiológico e inmunológico. De esta forma, entre las ventajas de la presente invención se pueden destacar:

i) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención no se genera resistencia;

ii) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención actúa de forma selectiva sobre conductas que determinan virulencia en los microorganismos patógenos;

iii) el extracto de la invención muestra actividad en concentraciones similares a los antibióticos; iv) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención, y dado que es producto natural; su utilización no esta sujeta a las mismas regulaciones ambientales, sanitarias, o de otra índole;

v) al igual que los antibióticos usados en acuicultura, el extracto puede ser añadido a los alimentos en el proceso de extrusión;

vi) a diferencia de los antibióticos, otros antimicrobianos e incluso otros inhibidores del Quorum Sensing no se requiere de pasos de síntesis o hemisíntesis química;

vii) el extracto de la invención no es tóxico para diferentes líneas celulares ni peces;

viii) el extracto de la invención proviene de una bacteria marina no patógena para peces.

ix) el extracto de la invención es una mezcla de compuestos biodegradables y por tanto es ambientalmente seguro;

x) el extracto de la invención producido por la cepa corresponde a una mezcla de ácidos grasos que presenta una actividad que interfieren con el sistema de QS; xi) las características y propiedades físicas del extracto de la invención, tales como la de emulsificante, permiten su adición en alimentos secos durante o después del proceso de extrusión.

La tabla 7 resalta las propiedades distintivas entre el uso del extracto biosurfactante de la presente invención y dos antibióticos ampliamente usados en acuicultura.

Tabla 7. Propiedades del biosurfactatnte producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 y de algunos antibióticos seleccionados.

Extracto

Ampicilina Tetraciclina

Biosurfactante

SI NO SI NO SI NO

Actividad

bactericida,

bacteriostática, • O • O O • bacteriolítica. ¹ Inhibición de

O o

sistema de QS. ² • • • o

Inhibición selectiva

de virulencia O • o • • o bacteriana. ³

Generación de

resistencia • o • o o •

Origen natural O • o • • o

Origen sintético • o • o o •

¹ Medida sobre la bacteria Chromobacterium violaceum

² Medida sobre la bacteria Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026.

³ Medida sobre la bacteria patógena Aeromonas salmonicida.

La tabla 8 muestra las principales ventajas del uso del método de la presente invención para la obtención de un biosurfactante, basado en la biosíntesis de un extracto extracelular por parte de la cepa de la presente invención.

Tabla 8. Ventajas del proceso de producción del extracto BS usando la bacteria Cobetia cepa MM1 IDA2H-1 .

SI NO

Reducción de consumo de agua. • O

Proceso inducible o controlable. • O

Independiente de síntesis química. • o

Producción selectiva • o

Problemas de contaminación O o