штамм гриба реNIсILLIUм VеRRUсоSUм, используемый для получения средства, обладающего

иммуномодулирующими свойствами, и средство- иммуномодулятор на его основе.

область техники

изобретение ^• относится к биотехнологии, в частности, к разработке новых источников получения биологически активных веществ и иммуномодулирующих средств для воздействия на живой организм.. в настоящее время большой интерес вызывают препараты природного происхождения, _. неоспоримым преимуществом которых является их физиологичность для организма и экологическая безвредность

предшествующий уровень техники

известны биологически активные препараты иммуностимулирующего действия, полученные из природных источников - на основе симбиотрофных грибов, обитающих в естественных условиях на корнях растений, например, препараты эмистим с, агроэмистим-экстра [ 1,2 ]. эти биопрепараты содержат оптимальный для стимуляции жизнедеятельности растений набор ростовых веществ (фитогормонов), витаминов, аминокислот, жирных кислот, микроэлементов. многократные испытания этих препаратов показали, что они обеспечивают повышение всхожести семян растений, устойчивость к болезням и стрессовым факторам, способствуют повышению урожая и улучшению качества продукции растениеводства, снижают содержание нитратов [3]. это происходит за счет активизации основных процессов жизнедеятельности растений — процессов фотосинтеза, дыхания, питания клеток, активизации ферментных систем. данные препараты изготовлены на природной основе, получены из грибов-эпифитов корневой системы лекарственных растений, сертифицированы и аттестованы на экологическую безопасность.

заменяющий лист (правило 26)

известно также биологически активное средство (биокорректор) «флopaвит э» на основе экстракта гриба Fusаrium sаmbusiпum, являющееся эффективным иммуномодулятором и адаптогеном [4]. данное средство широко используется в клинической медицине как при лечении различных заболеваний (сахарный диабет, трофические нарушения, заболевания суставов), так и при борьбе с вирусными инфекциями. клинически показано его гепатопротекторное действие, эффективность применения в гастроэнтерологии, акушерско-гинекологической практике и для оздоровления и омоложения организма в восстановительной медицине и кocмeтикe[5]. терапевтические возможности препарата «флopaвит э» связаны, в первую очередь, с его природным происхождением из гриба Fusаrium sаmbusiпum и уникальностью набора биологически активных компонентов, входящих в его состав. однако, изыскание природных источников для поиска и создания высокоэффективных биологически активных средств, обладающих уникальным набором входящих в них компонентов и оказывающих влияние на состояние организма человека и животных, является непростой задачей. выделение биологически активной субстанции из источника природного происхождения должно обеспечивать также максимальное сохранение полезных свойств, отсутствие токсичности и побочных эффектов. решение этой задачи возможно с помощью новых средств природного происхождения, обладающих иммуномодулирующими свойствами, позволяющими применять их при самых разных терапевтических воздействия

раскрытие изобретения

настоящее изобретение поясняется конкретными примерами, которые, однако, не являются единственно возможными, но наглядно демонстрируют возможность достижения приведенной совокупностью признаков требуемого технического результата

это достигается использованием в качестве исходного природного сырья нового штамма гриба репiсillium vеrruсоsum вкпм F-984 и выделением

заменяющий лист (правило 26)

из него препарата, обладающего иммуномодулирующими свойствами.

предлагается новый штамм гриба репiсillшm vеrruсоsum вкпм F-984, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами, и средство, полученное на основе штамма репiсillшm vеrruсоsа вкпм F-984, обладающее иммуномодулирующими свойствами. данное средство получено, частности, экстракцией мицелия указанного штамма, и представляет собой его водноспиртовой экстракт. технический результат заявленной группы изобретений состоит в изыскании новых природных источников биологически активных веществ и расширении ассортимента высокоэффективных средств-иммуномодуляторов природного происхождения, предназначенных для воздействия на живой организм в области медицины, ветеринарии или при комплексных оздоровительных мероприятиях. применение их позволяет более эффективно осуществлять лечение и профилактику заболеваний за счет повышения иммунитета и комплексного воздействия на организм. получаемое из штамма гриба репiсillшm vеrruсоsum вкпм F-984 иммуномодулирующее средство обладает адаптогенным действием, повышает неспецифическую резистентность организма и его адаптационные возможности. для его получения обычно осуществляют экстракцию мицелия гриба водным раствором спирта. штамм гриба репiсillшm vеrruсоsum вкпм F-984 выделен из микрофлоры корней женьшеня следующим образом. метод выделения штамма: корни женьшеня отмывают проточной водой, подсушивают на фильтровальной бумаге и отбирают корешки 4-5 порядка, 5 грамм сухих корней обрабатывают 60% H ₂ SO ₄ , измельчают и переносят в колбы с питательной средой (состав питательной среды: глюкоза - 8,0 г, K ₂ HPO ₄ - 0,5 г, KH ₂ PO ₄ - 1,0 г, MgSO ₄ - 0,2 г, K ₂ SO ₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная — до 1 литра).

для хранения и размножения эндофитного микромицета репiсillium vеrruсоsum вкпм F-984 используют агаризированную среду: глюкоза - 8,0 г,

заменяющий лист (правило 26)

K ₂ HPO ₄ - 0,5 г, KH ₂ PO ₄ - 1,0 г, MgSO ₄ - 0,2 г, K ₂ SO ₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная - до 1 литра, агар-агар 15,0 г.культуру высевают на чашки петри, инкубируют в термостате и используют для приготовления посевного мaтepиaлa.Bыдeлeнный штамм был депонирован в коллекции- депозитарии вкпм, ему присвоен регистрационный номер F-984.

Ky пьτур&пьно-морфологические свойства штамма.

макроморфологические признаки: при посеве уколом на среду с агаром на 15 день роста при +24°C развивается бородавчатая колония округлой форму серо-зеленого цвета, на периферии слабая исчерченность, размер колонии диаметр 35-40 мм, воздушный мицелий-реверс белый, поверхностное спороношение, цвет обратной стороны колонии коричневато-желтоватый. мицелий бесцветный септированный, большое количество мелких округлых зеленоватых конидий, конидиеносцы одномутовчатые моновертициллятные, споры шаровидной формы, прозрачные, оболочка гладкая.

физиолого-биохимические свойства штамма.

штамм растет в температурном диапазоне от 24 от 27 °C, температурный оптимум 25-27 °C.пpи росте на питательных средах предпочтительны слабокислые значения рн. рн-оптимум 6, 5. возможно выращивание на простых средах с использованием глюкозы в качестве источника углерода, желательно содержание в средах калия и магния. способ получения средства на основе штамма репiсillium vеrruсоsum вкпм F-984 включает следующие операции. культуральную жидкость вместе с мицелием при перемешивании обрабатывают активированным углем (5г/л жидкости), выдерживают в течение 25 часов и фильтруют. твердую.

фракцию при интенсивном перемешивании экстрагируют водным раствором спирта (70%) в течение суток. экстракт отфильтровывают. полученный отфильтрованный спиртовой экстракт является описываемым средством, обладающим иммуномодулирующими свойствами.

заменяющий лист (правило 26)

пример 1. получение иммуномодулятора из штамма

репiсillium vеrruсоsum вкпм F-984.B ферментеры в стерильных условиях добавляют посевной материал при дозе 3% от объема ферментационной среды. ферментационная среда включает: глюкоза - 8,0 г, K ₂ HPO ₄ - 0,5 г, KH ₂ PO ₄ - 1,0 г, MgSO ₄ - 0,2 г, K ₂ SO ₄ - 0,1 г, аспарагин - 20 мг, вода водопроводная - до lл. процесс ферментации заканчивают по мере созревания мицелия гриба и по достижении максимума накопления в культуральной жидкости продуктов метаболизма гриба-микромицета. полученную культуральную жидкость с мицелием при интенсивном перемешивании обрабатывают активированным углем из расчета 5 г на 1 л жидкости, выдерживают при температуре 25°C в течение 24 часов и фильтруют. твердую фракцию помещают в отдельную емкость и при интенсивном перемешивании экстрагируют расчетным количеством 75%-нoгo водного раствора этилового спирта в течение 24 часов. по окончании экстракции проводят фильтрацию и получают отфильтрованный экстракт.

пример 2. исследование свойств полученного иммуномодулятора. для изучения влияния препарата на гематологические, биохимические и иммунологические показатели организма был поставлен эксперимент продолжительностью 6 месяцев на крысах-самцах линии вистар с исходной массой 125-130 г. крысы были разбиты на 2 группы: контрольная группа - животные получали общевиварный рацион, опытная группа - животные на фоне общевиварного рациона ежедневно вместе с кормом получали препарат- иммуномодулятор в дозе 0,25 мл/кг массы животного

проведено 2 забоя животных: через 3 и 6 месяцев от начала эксперимента . влияние препарата-иммуномодулятора на морфологические показатели организма.

заменяющий лист (правило 26)

общее состояние животных всех групп было удовлетворительным на протяжении всего эксперимента.проводили микроскопически исследования 10 органов от каждой крысы: печень, почки, легкие, семенники, лимфоидные органы (мезентериальный лимфоузел, селезенка и вилочковая железа, тимус) органы жкт (тонкая и толстая кишка, желудок). через 3 месяца от начала эксперимента отмечались небольшие дистрофические изменения печени в опытной группе по сравнению с контролем. в селезенке и мезентериальном лимфоузле в части случаев отмечалась лимфоидная пролиферация в опытной группе по сравнению с контролем. через 6 месяцев от начала эксперимента не обнаружено существенных морфологических изменений внутренних органов в опытной группе по сравнению с контролем. влияние препарата на биохимические и гематологические показатели крови и мочи.

.при изучении биохимических показателей учитывали содержание общего белка, содержание глюкозы в сыворотке крови, активность некоторых ферментов сыворотки крови и печени крыс, содержание креатинина в моче. содержание общего белка в сыворотке крови крыс, активность ферментов сыворотки крови и печени крыс при включении в их рацион иммуномодулирующего препарата, полученного по примеру 1, не отличались от контроля на протяжении всего эксперимента (через 3 и 6 месяцев). не выявлено разницы между опытной группой и контролем по таким показателям как концентрация гемоглобина, общее количество эритроцитов, гематокрит, CCO, скэ на протяжении всего эксперимента. лейкоцитарная формула у крыс при включении в их рацион исследуемого препарата существенно не отличалась от контроля.

иммунотоксические свойства препарата.

. иммунотоксические свойства препарата были изучены в опыте на белых мышах-самцах массой 18-20 г.о влиянии препарата на клеточное звено иммунитета судили по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа и аутологичным розеткообразующим клеткам (ауто-

заменяющий лист (правило 26)

рок). определение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (гзт) проводили на 40 мышах линии CBA. первой группе животных вводили исследуемый препарат в дозе 0,25 мл/кг, 2-й - группе в дозе 0,5 мл/кг, 3-й группе - 1 мл/кг в течение 5 дней перорально, всем опытным группам на 5-й день параллельно с ведением препарата вводили суспензию эритроцитов барана (эб) внутрибрюшинно (10% суспензия) в дозе 0,3 мл/кг. животным контрольной группы вводили только 10% суспензию эб. через 5 дней после сенсибилизации всем подопытным животным вводили разрешающую дозу 2% суспензии эб в количестве 0,02 мл в правую лапку, а в левую физраствор - 0,02 мл. контрольным животным вводили только 2% суспензию эб и учитывали индекс стимуляции. при учете индекса стимуляции установлено, что исследуемый препарат обладает иммуностимулирующими свойствами во всех испытанных дозах (0,25;0,5;l,0 мл/кг живой массы) и индекс стимуляции (ис) составил 9,8±0,7;10,l±0,2;9,45±0,4 соответственно по группам опытных животных, в контроле ис = 4,5. изменения в динамике ауто- POK у животных на фоне введения препарата изучали на 75 мышах линии CBA. 1-я группа мышей получала препарат в дозе 0,25 мл/кг, 2-я - в дозе 0,5 мл/кг перорально в течение 5 дней, 3-я группа служила контролем. исследования проводили на 5,10,15,20 дни после последнего введения препарата. кинетика ауто-рок характеризовалась повышением как абсолютного, так и относительного количества розеткообразующих клеток в крови мышей.изменения в динамике показателей аутологичных розеткообразующих клеток у мышей дает представление о влиянии препарата на клеточный иммунитет, что выражается в повышении функциональной активности т-лимфоцитов. оценку в-клеточного звена иммунной системы проводили по определению количества антителообразующих клеток в селезенке и кинетике в-лимфоцитов.определение антителообразующих клеток (AOK) в селезенке проводили в опыте на 30 мышах линии CBA. первой группе животных препарат вводили в дозе 0,25 мл/кг, 2-й - 0,5 мл/кг, одновременно внутрибрюшинно вводили эб. число AOK считали в одной пробе среди 200

заменяющий лист (правило 26)

лимфоцитов. препарат индуцирует трансформацию в-лимфоцитов в AOK в селезенке, индекс стимуляции (ис) равен 1,4, в контрольной группе ис составил 0,9. кинетика в-лимфоцитов определялась в опыте на 60 мышах линии CBA. содержание еас-розеткообразующих клеток в крови мышей кон- трольной группы существенно не отличалось от опытной группы в течение всего периода исследований и составило 19,4±2,6 - 20,9±l,4.B динамике относительного количества в-лимфоцитов после ведения препарата в дозе 0,25 мл/кг наблюдали достоверное увеличение EAC-POK на 10-й и 15-й дни исследования, в то время как во 2-й группе животных (доза препарата 0,5 мл/кг) на 5-й, 10-й, 15-й дни наблюдений, содержание EAC-POK составило 23, 6± 1,18 - 22,6±1,13. полученные данные позволяют сделать заключение о том, что исследуемый препарат в дозе 0,5 мл/кг, введенный перорально, в течение 5 дней повышает клеточный иммунный ответ. определение титров гемагглютининов в сыворотке крови животных после введения препарата проводили на 30 мышах линии CBA (2 опытные группы, 1 — контрольная группа). на 7-й день после иммунизации все животные были забиты и определены титры общих антител и антитела классов M и о. содержание иммуноглобулинов M и о в опытных группах было выше, чем в контрольной. иммунологические исследования на крысах определение иммунного статуса организма оценивали по компетентности клеточного и гуморального иммунного ответа на крысах-самцах линии вистар с исходной массой 125- 13 Or в хроническом токсикологическом эксперименте продолжительностью 6 месяцев. крысы были разбиты на 2 группы: контрольная группа - животные получали общевиварный рацион, опытная группа, животные на фоне общевиварного рациона вместе с кормом получали исследуемый препарат в дозе 0,25 мл на кг массы крысы. компетентность клеточного иммунитета оценивали по индуцированной фитогемаглютинином (фга) и специфическим антигеном, приготовленным из исследуемого препарата, реакции стимуляции лимфоцитов периферической крови, по

заменяющий лист (правило 26)

выраженности реакции торможения лейкоцитов в присутствии фга и специфических антигенов и по степени т-зависимой клеточной цитотоксичности. митогенный ответ периферических лимфоцитов крыс на фга и специфический антиген (CA) оценивали по процентному содержанию трансформированных клеток. в результате изучения влияния препарата на митогенную стимуляцию периферических лимфоцитов крыс было установлено, что он способен повышать пролиферативную активность т-клеток. величина индекса цитотоксичности крыс опытной группы через 3 месяца составила 0,35±0,02, через 6 месяцев 0,32±0,03, а в контрольной группе соответственно 0,28±0,04 и 0,24±0,01. полученные данные указывают на иммуностимулирующую роль исследуемого препарата по отношению к тимусзависимым лимфоцитам.компетентность гуморального иммунитета оценивали по содержанию в сыворотке крови крыс иммуноглобулинов основных классов. исследования содержания иммуноглобулинов сыворотки крови крыс при включении в их рацион препарата позволили установить общую направленность к стимуляции гуморального звена иммуногенеза. через 3 месяца концентрация иммуноглобулинов класса о, A, M, E составила в контроле 743±37,2;138±6,8;8±3,9;0,45±0,01; в опытной группе 861±43,05; 132±6,6; 87±4,5; 0,42±0,03 соответственно. через 6 месяцев после начала эксперимента в контроле - 723±36,14; 131±6,5; 80±3,5; 0,45±0,01; в опытной группе -83б±41,8; 136±6,8; 86±4,3; 0,46±0,02 соответственно по классам иммуноглобулинов.

состояние неспецифических защитных показателей изучали по содержанию в сыворотке крови некоторых компонентов комплемента и по уровню отдельных сывороточных белков «ocтpoй фaзы» воспаления. содержание компонентов комплемента сз, C4, C5, C9 в контроле составило

заменяющий лист (правило 26)

551+27,5; 239+12,0; 107+5,35: 38±1,9; в опытной группе 567±28,35; 269+43,45; 116+5,8; 46±2,3 соответственно.

в результате проведенных экспериментов выявлено модулирующее влияние исследуемого препарата на клеточные иммунные реакции (повышение пролиферативного ответа периферических лимфоцитов на митогены (фга), усиление интенсивности цитотоксичности). отмечается стимулирующее влияние на синтез иммуноглобулинов (l ^λ 0 и 1 ^л M), компонентов комплемента (C4 и C9), белков «ocтpoй фазы воспаления)) (трансферин, с-реактивный белок).

в ходе исследований было выявлено, что исследуемый препарат не обладает иммунотоксическим действием по отношению к функциональной активности T- и в- клеток.

промышленная применимость

препарат использовался в птицеводческих хозяйствах для оптимизации обмена веществ, активизации иммунитета и повышения продуктивности. при выпойке препарата с водой птице наблюдали интенсивное наращивание массы цыплят-бройлеров, повышение сохранности поголовья цыплят. препарат активизирует специфический антителогенез против болезни ньюкасла у птиц, не выявлено побочного действия на клиническое состояние цыплят-бройлеров. белковый показатель качества мяса повышается на 3,7%. таким образом использование иммуномодулирующего препарата способствует улучшению зоотехнических показателей выращивания птицы.

проведенные производственные испытания исследуемого препарата в животноводческих хозяйствах показали его высокую эффективность как лечебно-профилактического средства при диспепсиях новорожденных телят, диареях неинфекционной этиологии, бронхопневмониях.

заменяющий лист (правило 26)

выпаивание новорожденным телятам раствора препарата в течение 3-10 дней в дозе 0,17 - 0,25 мл/кг способствовало снижению количества заболевших телят в 1,6-4,5 раза и продолжительности болезни в 2-4 раза. прирост живой массы в опытных группах превосходил контрольных животных на 3,2-6,2 кг в 30-дневном возрасте, в 60-дневном возрасте на 4,4-8,1 кг. выпаивание препарата в дозе 1 мл в сутки новорожденным телятам является эффективным средством против диареи животных. сохранность поголовья в опытных группах достигала 90-100%.

таким образом, описываемый иммуномодулятор не является токсичным, оказывает лечебно-профилактический эффект на живой организм, может эффективно применяться в животноводстве и ветеринарии для воздействия на иммунитет животных, увеличение привесов и повышение сохранности поголовья животных.

заменяющий лист (правило 26)