Streptogrami nes et procède de préparati on de streptogrami nes par mutasynthese

La présente invention se rapporte principalement à de nouveaux composés aappppaarreennttééss aauuxx s sttrreeppttooggrraammiinneess dduu ggrroouuppee BB eett àà uunn pprrooccééddéé ddee pprrééppaarraattiioonn ppaarr muta Ssyynntthhèessee ddee s sttrrfiepnttnogcrrraarmr.i.nτ.fiess_. E E1ll1ee c ccomncceemrnpe. ft égσaallpemmpenntt n dee* τ n.ro»u..rave->ïa)iuιγx g σè-nr~ee-s- ^~ impli [qquuééss ddaannss llaa bbiicosynthèse de précurseurs des streptogramines du groupe B ainsi q αuu ιeee llleeeuuurrrsss uuutttiiillliiisssaaatttiiiooonnnsss..,

Les streptogramines forment un groupe homogène d'antibiotiques constitués

10 d'une association de deux types de molécules chimiquement différentes; d'une part des macrolactones polyinsaturées (composants du groupe A), et d'autre part des depsipeptides (composants du groupe B). Ce groupe comprend de nombreux antibiotiques connus sous différents noms en fonction de leur origine, dont les pristinamycines, les mikamycines, les virginiamycines (Cocito 1979, 1983).

15 Les composants A et B ont une activité antibactérienne synergique qui peut atteindre 100 fois celle des composants séparés et qui, contrairement à celle de chaque composant, est bactéricide (Cocito 1979). Cette activité est plus particulièrement efficace contre les bactéries Gram-positifs, comme les staphylocoques et les streptocoques (Cocito 1979, Videau 1982). Les composants A

20 et B inhibent la synthèse protéique en se fixant à la sous-unité 50S du ribosome (Cocito 1979 ; Di Giambattista ejt ai. 1989).

La connaissance des voies de biosynthèse de chacun des composants reste partielle à ce jour, bien que des études précédentes, présentées dans la demande de brevet PCT/FR93/0923, aient permis d'identifier plusieurs protéines et les gènes de

25 structure correspondants, impliqués dans la biosynthèse des deux types de composants.

Dans le processus de biosynthèse des streptogramines du groupe B, deux parties peuvent être distinguées:

1) Biosynthèse des précurseurs, ou de leurs analogues, du macrocycle: acide 30 3-hydroxypicolinique, acide L-2-aminobutyrique, 4-diméthylamino-L-phénylalanine, acide-L-pipécolique. L-phénylglycine.

2) Formation du macrocycle à partir des précurseurs cités ci-dessus, de la L-thréonine et de la L-proline, ou de leurs analogues, avec éventuellement modification (s) subséquente(s), de type N-méthylation peptidique, épi érisation,

35 hydroxylation et oxydation.

La demande de brevet PCT/FR93/0923, a notamment pour objet les enzymes catalysant l'ύicorporation des précurseurs dans la chaîne peptidique des streptogramines B en cours d'élongation ainsi que leurs gènes de structure. Ces résultats ont permis de mettre en évidence le caractère de synthèse peptidique non ribosomale des composants de type B.

La présente invention concerne plus particulièrement de nouveaux composés apparentés aux streptogramines du groupe B et plus précisément des nouveaux composés de la famille des pristinamycines I (figures 1 et 2), désignés ci-après par PI, ou de la famille des virginiamycines S (figure 3). Le constituant majoritaire des pristinamycines I (PI) est la PI^. (figure 1) qui représente environ 94 % des PI, les environ 6 % restant étant représentés par des constituants minoritaires du depsipeptide (Plg à PIj) dont les structures sont représentées en figure 2. La PI résulte essentiellement de la condensation d'acides aminés dont certains sont indispensables pour la synthèse protéique (thréonine et proline) et dont d'autres sont originaux et considérés eux-mêmes comme des métabolites secondaires (acide L-2-aminobutyrique, 4-diméthylamino-L- phénylalanine (DMPAPA), acide Lrpipécolique et L-phénylglycine pour la PI A) ainsi que d'un précurseur aromatique, l'acide 3-hydroxypicolinique.

En ce qui concerne les dérivés de virginiamycines S, ils résultent de la condensation des mêmes acides que pour la PI à l'exception de la DMPAPA qui est remplacée par une phénylalanine (voir figure 3).

La production de ces différents composés par biosynthèse nécessite donc la synthèse préalable, par la souche productrice, des précurseurs originaux identifiés ci- dessus. La présente invention résulte précisément d'un procédé de préparation original de streptogramines qui met en oeuvre, à titre de souche productrice de streptogramines, une souche de microorganisme mutée de manière à altérer la biosynthèse des précurseurs de streptogramines du groupe B. Selon ce procédé, ladite souche mutante est cultivée dans un milieu complémenté par un précurseur original, différent du précurseur dont la biosynthèse est altérée. De manière inattendue, il s'en suit une production de nouveaux composés apparentés aux streptogramines du groupe

B, intéressants sur le plan thérapeutique.

Plus précisément, la présente invention se rapporte à de nouveaux composés représentés par la formule générale I:

dans laquelle :

-R ₂ et R ₄ représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle,

-R ₃ représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxyle,

-X représente un groupement CO, CHOH ou CH ₂ et

-Ri représente:

avec

- pour les dérivés eta :

A, C, D et E représentant un atome d'hydrogène et B pouvant représenter:

- un halogène et de préférence un atome de fluor,

-un groupement monoalkylamino ou dialkylamino avec alkyle représentant de préférence un groupement méthyle ou éthyle,

-un groupement éther. Il s'agit plus particulièrement d'un groupement OR avec R choisi de préférence parmi les groupements méthyle, éthyle, trifluorométhyle et allyle,

-un groupement thioéther représenté de préférence par un groupement alkylthio avec de préférence alkyle représentant un groupement méthyle,

-un groupement alkyle en Ci à C3 ou

-un groupement tri alogénométhyle et de préférence le trifluorométhyle.

- pour les dérivés para : A, B, D et E représentant un atome d'hydrogène et C pouvant représenter:

- un halogène,

-un groupement NR1R2 avec Rj et R ₂ représentant indépendamment l'un de l'autre un groupement choisi parmi - l'hydrogène,

- un groupement alkyle en Ci à C4 linéaire ou ramifié avec lorsque l'un des substituants R _j ou R2 représente un groupement méthyle, l'autre représente obligatoirement un groupement éthyle,

- un groupement alkyl-cycloalkylméthyle avec un c cloalkyle en C3 à C4 - un groupement cycloalkyle en C3 à C4 éventuellement substitué,

-un groupement alcényle en C3 à C4 linéaire ou ramifié avec lorsque l'un des substituants, Rj ou R2 ₍ représente un groupement alcényle, l'autre est différent d'un groupement méthyle ou d'un cycloalkyle en C3 à C6,

- un groupement N-pyrrolidinyle substitué ou non, -un groupement éther, il s'agit de préférence d'un groupement OR avec R choisi de préférence parmi les groupements méthyle, éthyle éventuellement substitué par un atome de chlore, trifluorométhyle et alcényle .

-un groupement thioéther représenté de préférence par un groupement alkylthio avec de préférence alkyle représentant un groupement alkyle en Cj à C ₃ .

-un groupement acyle ou alcoxycarbonyle et plus particulièrement un groupement COR avec R représentant de préférence un groupement alkyle en C _j à C3 ou un groupement alkoxy en Ci à C3. -un groupement alkyle en C _j à C , linéaire ou ramifié, et de préférence choisi parmi les groupements méthyle, isopropyle et tert-butyle,

- un groupement alkylthiométhyl et plus préférentiellement un groupement CH2SR avec R représentant de préférence un groupement alkyle en C _j à C3 -un groupement aryle et de préférence un phényle ou -un groupement trihalogénométhyle et de préférence le trifluorométhyle.

- pour les dérivés disubstitués méta-para :

A, D et E représentant un atome d'hydrogène et B pouvant représenter:

-un halogène et de préférence un atome de fluor, -un groupement monoalkylamino ou dialkylamino avec alkyle représentant de préférence un groupement méthyle ou éthyle,

-un groupement éther et de préférence un groupement OR avec R choisi de préférence parmi les groupements méthyle, éthyle et trifluorométhyle,

-un groupement thioéther et de préférence alkylthio avec alkyle représentant préférentiellement un groupement éthyle, ou

-un groupement alkyle en Ci à C3 et C pouvant représenter:

-un halogène et de préférence un atome de fluor,

-un groupement amino, monoalkylamino ou dialkylamino avec alkyle représentant de préférence un groupement méthyle à la condition que B soit différent d'un atome de brome ou de chlore, ou un groupement allyle substitué ou non,

-un groupement éther et de préférence un groupement OR avec R choisi de préférence parmi les groupements méthyle, éthyle et trifluorométhyle, -un groupement thioéther et de préférence un groupement alkylthio avec de préférence alkyle représentant un groupement méthyle,

-un groupement alkyle en Ci à C6 ou

-un groupement trihalogénométhyle et de préférence le trifluorométhyle et

- pour les dérivés disubstitués ortho-para :

B, E et D représentant un atome d'hydrogène et A et C, un groupement méthyle.

A titre de composés préférés, on peut plus particulièrement citer: la 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ _» la 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ.

la 5γ-hydroxy 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine Iy, la 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^, la 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine Ipj, la 4ζ-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1 ^, la 4ζ-mémoxyc_ur_x)nyl-dés(4ζ-diméthyl-_mino) pristinamycine 1^, la 4ζ-chloro-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^., la 4ζ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^» la 4ζ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ, la 4ζ-iodo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1 ^, la 4ζ-iodo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ _» la 4ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. la 4ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ _» la 4ζ-tert-butyl-dés(4ζ-diméthyl-_mino) pristinamycine l , la 4ζ-isopropyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ _» la 4ζ-isopropyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine Ig. la 4ε-méthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^, la 4ε-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A la 4ε-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I JJ, la 4ε-fluoro 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A la 4ζ-amino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I ^ la 4ζ-éthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-diéthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. la 4ζ-allylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. la 4ζ-diallylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. la 4ζ-allyl éthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-éthyl propylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-éthyl isopropylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA la 4ζ-éthyl méthylcyclopropylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-(l-pyrrolidinyl) -dés (4ζ-diméthylamino) .pristinamycine 1^ la 4ζ-trifluorométhoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-allyloxy-dés(4ζ-diméthylan ino) pristinamycine 1^ la 4ζ-éthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^.

la 4ζ-éthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-méthylthiométhyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ _. la 4ζ-(2-chloroéthoxy)-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. la 4ζ-acétyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-éthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ζ-éthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ la 4ε-diméthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ε-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ la 4ε-éthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^.

La présente invention vise également un procédé notamment utile pour préparer les composés de formule générale I.

Plus précisément, elle se rapporte à un procédé pour préparer des _>treptogramines caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une souche d'un microorganisme producteur de streptogramines, possédant au moins une modification génétique affectant la biosynthèse d'un précurseur des streptogramines du groupe B et en ce que ladite souche mutante est cultivée dans un milieu de culture adéquat et complémenté avec au moins un précurseur original, autre que celui dont la biosynthèse est altérée et en ce que l'on récupère lesdites streptogramines.

Les souches mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention sont donc des souches productrices de streptogramines, mutées. La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées soit au niveau d'un des gènes impliqués dans la biosynthèse desdits précurseurs soit en dehors de la région codante, par exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle desdits gènes ou dans une région appartenant au transcript contenant lesdit gènes.

Selon un mode particulier de l'invention, les souches mutantes possèdent une ou plusieurs modifications génétiques au niveau d'au moins un de leurs gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs des streptogramines du groupe B.

Cette ou ces modifications génétiques altèrent l'expression dudit gène c'est à dire rendent ce gène, et le cas échéant un autre des gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs, partiellement ou totalement incapable de coder pour l'enzyme naturelle impliquée dans la biosynthèse d'au moins un précurseur.

L'incapacité desdits gènes à coder pour les protéines naturelles peut se manifester soit par la production d'une protéine inactive en raison de modifications structurales ou conformationnelles, soit par l'absence de production, soit par la production d'une protéine ayant une activité enzymatique altérée, ou encore par la production de la protéine naturelle à un niveau atténué ou selon un mode de régulation désiré. L'ensemble de ces manifestations possibles se traduit par une altération voire un bloquage au niveau de la synthèse d'au moins l'un des précurseurs des streptogramines du groupe B.

Les gènes, susceptibles d'être mutés dans le cadre de la présente invention, sont de préférence les gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs suivants: acide L-2-aminobutyrique, 4-diméthylamino-L-phénylalanine (DMPAPA), acide L- pipécolique, L-phénylglycine et/ou l'acide 3-hydrOxypicolinique (3-HPA).

Il s'agit plus préférentiellement des gènes papA. papM. papB (SEQ ID N°3), papC (SEQ ID N°2), hoaA. (SEQ ID N°8), sj (SEQ ID N°6) et pipA (SEQ ID N°5) décrits ci-après.

En ce qui concerne les gènes papA et papM. ils ont déjà été décrits dans la demande de brevet PCT/FR93/0923. Ils sont présents sur le cosmide pIBV2. Le gène papA semble correspondre à un gène de biosynthèse de la 4-amino-L-phénylalanine à partir du chorismate. La 4-amino-L-phénylalanine est ensuite diméthylée par le produit du gène papM. une N-méthyltransférase, pour former la 4-diméthylamino-L- phénylalanine, DMPAPA, qui est ensuite incorporée dans la pristinamycine 1 ^. Ces deux gènes interviennent donc plus particulièrement au niveau de la synthèse du précurseur dit DMPAPA.

En ce qui concerne les autres gènes papB. papC. pipA. snbF et hpaA. ils ont été identifiés et caractérisés dans le cadre de la présente invention. Ils sont regroupés avec les gènes snbA. papA. et papM sur une région chromosomique d'environ 10 kb (figure 7).

Les homologies de séquences mises en évidence pour les protéines PapB et PapC _. , montrent que ces protéines sont également impliquées dans la biosynthèse du précurseur DMPAPA, conjointement avec les protéines PapA et PapM. Les deux nouveaux gènes correspondants, papB et papC. ont été isolés et identifiés par sous- clonages effectués à partir du cosmide pIBV2, décrit dans la demande de brevet PCT/FR93/0923 et d'un plasmide ρVRC900, dérivé de pIBV2 par une délétion Hindπi, également décrit dans la demande de brevet PCT/FR93/0923.

La comparaison de la protéine codée par le gène papC. avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 27 % avec la région impliquée dans l'activité préphénate déhydrogénase des protéines bifonctionnelles TyrA d' E. coli (Hudson et Davidson, 1984) et d' Er inia herbicola (EMBL data library, 1991). Cette région de TyrA catalyse l'aromatisation du préphénate en 4-hydroxyphénylpyruvate dans la biosynthèse de la tyrosine. Une aromatisation similaire à partir du 4-déoxy 4-amino préphénate conduisant au 4- amino phénylpyruvate intervient très vraisemblablement dans la synthèse de la DMPAPA. Elle serait catalysée par la protéine PapC (SEQ ID n°2). Quant à la protéine PapB, elle possède une homologie de 24 à 30 % avec la région impliquée dans l'activité chorismate mutase des protéines bifonctionnelles TyrA et PheA d' E. coli (Hudson et Davidson, 1984) et de la protéine TyrA d' Erwinia herbicola. Cette région catalyse l'isomérisation du chorismate en préphénate dans la biosynthèse de la tyrosine et de la phénylalanine. La protéine PapB (SEQ ID n°3) intervient vraisemblablement au niveau de l'isomérisation similaire à partir du 4- déoxy 4-amino chorismate conduisant au 4-déoxy 4-aminopréphénate dans la synthèse de la DMPAPA.

En ce qui concerne les gènes pipA. snbF et hpaA. ils ont été localisés dans les régions contenues entre le gène snbA codant pour l'acide 3-hydroxypicolinique AMP ligase, décrite dans la demande de brevet PCT/FR93/0923 et les gènes papA ou snbR.

Ils ont précisément été localisés par sous-clonages effectués à partir du plasmide pVRC900 et du cosmide ρIBV2, décrits dans la demande de brevet PCT/FR93/0923.

En comparant la protéine codée par le gène hpaA et les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro, il a été mis en évidence une homologie de 30 à 40 % avec un groupe de protéines probablement impliquées (Thorson et al., 1993) dans la transamination d'intermédiaires de biosynthèse de différents antibiotiques (DnrJ, EryCl, TylB, StrS, PrgL). La synthèse du précurseur 3-HPA qui semble dériver de la lysine par une autre voie que la cyclodéamination (voir exemples 1-2 et 2-1), nécessite vraisemblablement une étape de transamination susceptible d'être catalysée par le produit de ce gène appelé hpaA (SEQ ID n°8). Les résultats de mutation réalisée dans ce gène montrent par ailleurs sans équivoque l'implication de ce gène dans la synthèse du précurseur 3-HPA.

La comparaison du produit codé par le gène dit pipA avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 30 % avec l'ornithine cyclodéaminase d'Agrobacteriυm tumefasciens (Schindler _Ê I al.,

1989). Cette enzyme intervient dans la dernière étape du catabolisme de l'octopine; elle convertit la L-ornithine en L-proline par cyclo-déamination. Des auteurs ont montré par incorporation de lysine marquée, que l'acide 4-oxopipécolique et l'acide 3-hydroxypicolinique, retrouvés aussi bien dans la PI^ que dans la virginiamycine SI, dérivaient de la lysine (Molinero ≤t al, 1989; Reed ≤I al-, 1989). Une réaction de cyclodéamination de la lysine similaire à celle décrite pour lOrnithine conduirait à la formation d' acide pipécolique. En tenant compte de cette hypothèse ce produit a été appelé PipA (SEQ ID n° 5). Les résultats de mutation dans le gène pipA. présentés dans les exemples ci-après, montrent l'implication du gène pipA dans la seule synthèse de l'acide pipécolique. On note en particulier que cette mutation n'affecte pas la biosynthèse de l'acide 3-hydroxypicolinique, qui dérive aussi de la lysine et dont l'acide pipécolique aurait pu être un précurseur.

Enfin, en comparant le produit du gène dit snbF avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro, il a été noté une homologie de 30 à 40 % avec plusieurs hydroxylases de type cytochrome P450, impliquées dans la biosynthèse de métabolites secondaires (Orner ≤l al-» 1990. Trower ≤t al-. 1992). Plusieurs hydroxylations sont envisageables dans la biosynthèse des précurseurs de la pristinamycine I, notamment au niveau de la biosynthèse du 3-HPA (hydroxylation en 3 de l'acide picolinique) et de l'acide 4-oxopipécolique (hydroxylation en 4 de l'acide pipécolique). La protéine correspondante a été appelée SnbF (SEQ ID n°6).

Les résultats de mutation dans le gène pipA. avec des effets polaires sur l'expression du gène snbF. montrent l'implication du gène snbF dans l'hydroxylation du résidu acide pipécolique des streptogramines du groupe B. C'est ainsi que l'expression du gène snbF est altérée par le biais d'une modification génétique au niveau du gène pipA.

Préférentiellement, la ou les modifications génétiques rendent ledit gène partiellement ou totalement incapable de coder pour la protéine naturelle.

Par modification génétique, on doit entendre plus particulièrement toute suppression, substitution, délétion, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore en exposant lesdits microorganismes à un traitement au moyen d'agents mutagènes. Par agents mutagènes, on peut citer par exemple les agents physiques tels que les rayonnements énergétiques (rayons X, γ, ultra violet, etc.), ou les agents chimiques capables de réagir avec différents groupements fonctionnels des bases de

l'ADN, et par exemple les agents alkylants [éthylméthane sulfonate (EMS), N- méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, N-nitroquinoléine-1-oxyde (NQO)], les agents bialkylants, les agents intercalants, etc... Par délétion, on entend toute suppression d'une partie ou de la totalité du gène considéré. Il peut s'agir notamment d'une partie de la région codant pour lesdites protéines, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription, de la traduction ou encore du transcript.

Les modifications génétiques peuvent également être obtenues par disruption génique, par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstein [Meth. Enzymol. lui (1983) 202] ou avantageusement par double recombinaison homologue. Dans ce cas, l'intégralité de la séquence codante sera préférentiellement perturbée pour permettre le cas échéant, le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence génomique sauvage par une séquence non fonctionnelle ou mutante.

Selon une autre alternative de l'invention, les modifications génétiques peuvent consister à placer le ou les gènes codant pour lesdites protéines sous contrôle d'un promoteur régulé.

Les souches de micororganismes mutantes selon la présente invention peuvent être obtenues à partir de tout microorganisme producteur de streptogramines (Cf. tableau V). Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, il s'agit d'une souche dérivant de S. pristinaespiralis et plus particulièrement de S. pristinaespiralis SP92.

A titre de souche mutante préférée dans le cadre de la présente invention, on peut plus particulièrement citer la souche SP92::pVRC508, mutée dans la biosynthèse du précurseur DMPAPA par disruption par simple crossing-over du gène papA ou encore plus préférentiellement la souche SP212, mutée dans la biosynthèse du précurseur DMPAPA par disruption du gène papA par double recombinaison homologue. Ces souches ne produisent plus de PI sauf lorsqu'elles sont complémentées par le précurseur DMPAPA. De manière inattendue, lorsqu'un précurseur original, différent de la DMPAPA et capable après, le cas échéant, métabolisation, d'être incorporé par la PI synthétase III (protéine SnbD responsable de l'incorporation des résidus L-proline et DMPAPA) est ajouté au milieu de production, ces deux souches deviennent capables de produire de nouvelles pristinamycines I ou virginiamycines ou de produire majoritairement un composant normalement minoritaire de la PI, notamment la Plg (figure 2).

Dans le cadre de la présente invention, deux autres souches mutantes ont été préparées. Il s'agit respectivement de la souche SP92pipA::Ωam^ disruptée dans le gène pipA par recombinaison homologue et la souche SP92hpaA: : Ω am^ disruptée dans le gène hpaA. La souche SP92pipA::Ωan.R d'une part, ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation et d'autre part, en présence d'acide L- pipécolique, permet la forte production d'un composant initialement minoritaire des composants B des streptogramines dans lesquels l'acide 4-oxopipécolique est remplacé par l'acide L-pipécolique. Quant à la souche S. pristinaespiralis SP92hpaA:: ΩamR. elle ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation mais est capable de produire de nouvelles streptogramines du groupe B, en présence de précurseurs originaux.

En complémentant le milieu de culture de souches mutantes selon l'invention, avec au moins un précurseur original, il s'avère possible d'orienter la biosynthèse soit vers de nouvelles streptogramines, soit vers une forme minoritaire d'entre elles, ou encore de privilégier la formation d'une d'entre elles.

Les précurseurs mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peuvent être des dérivés ou analogues d'acides aminés et plus particulièrement de la phénylalanine ainsi que d'acides organiques et notamment d'acides alpha-céto- carboxyliques et plus particulièrement des dérivés d'acide phénylpyruvique. Bien entendu, le précurseur original est tel qu'il pourvoit à l'altération voire le blocage, induit selon l'invention, au niveau de la biosynhèse d'un des précurseurs naturels des streptogramines du groupe B et conduit à la synthèse de streptogramines. Selon un mode particulier de l'invention, ce précurseur original est choisi de manière à être apparenté au précurseur dont la biosynthèse est altérée. Ainsi dans le cas particulier de mutant bloqué dans la biosynthèse du DMPAPA, le précurseur original est de préférence un dérivé de phénylalanine.

A titre de précurseurs convenant à l'invention, on peut notamment citer les suivants:

Phénylalanine, 4-diméthylaminophénylalanine, 4-méthylaminophénylalanine, 4-aminophénylalanine, 4-diéthylaminophénylalanine, 4-éthylaminophénylalanine, 4- méthylthiophénylalanine, 4-méthylphénylalanine, 4-méthoxyphénylalanine, 4- trifluorométhoxyphénylalanine, 4-méthoxycarbonylphénylalanine, 4- chlorophénylalanine, 4-bromophénylalanine, 4-k>dophényl_daιιine,

4-trifluorométhylphénylalanine, 4-tert-butylphénylalanine, 4-isopropylphénylalanine, 3-méthylaminoρhénylalanine, 3-méthoxyphénylalanine, 3-méthylthiophénylalanine,

3-fluoro 4-méthylphénylalanine, acide L-pipécolique, acide 4-tert- butylphénylpyruvique, acide 4-méthylaminophénylpyruvique, 2- naphtylphénylalanine, 4-fluorophénylalanine, 3-fluorophénylalanine, 3- éthoxyphénylalanine, 2,4-diméthylphénylalanine, 3,4- diméthylphénylalanine, 3-méthylphénylalanine, 4 _: phénylphénylalanine,

4-butylphénylalanine, 2-thiényl-3-alanine, 3-trifluorométhylphénylalanine, hydroxyphénylalanine, 3-éthylaminophénylalanine 4- aUylam ophénylalanine, 4- diallylaminophénylalanine, 4- allyl éthylaminophénylalanine, 4- éthyl propylaminophénylalanine, 4- éthyl isopropylaminophénylalanine, 4- éthyl méthylcyclopropylaminophénylalanine, 4-(l-pyrrolidinyl) phénylalanine, 4-O- all ltyrosine, 4-O-éthyltyrosine, 4-éthylthiophénylalanine, 4- éthylthiométhylphénylalanine, 4-O-(2-chloroéthyl) tyrosine, 4-acétyl phénylalanine, 4-éthyl phénylalanine, 3-diméthylaminophénylalan-ne, 3-éthoxy phénylalanine, 3- fluoro4-méthylphénylalanine et 4-aminométhylphénylalanine.

Parmi ces précurseurs, les 4-trifluorométhoxyphényl__lanine, 3- méthylaminophénylalanine, 3-méthylthiophénylalanine, 3-fluoro4- méthylphénylalanine, l'acide 4-méthylaminophénylpyruvique, 3- éthoxyphénylalanine, 4- allylaminophénylalanine, 4- diallylaminophénylalanine, 4- allyl éthylaminophénylalanine, 4- éthyl propylaminophénylalanine, 4- éthyl isopropylaminophénylalanine, 4-éthylméthyl-cyclopropylaminophénylalanine, 4-(l- pyrrolidinyl) phénylalanine, 4-éthylthiométhylphénylalanine, 4-O-(2-chloroéthyl) tyrosine, 3-diméthylaminophénylalanine et 3-éthylaminophénylalanine sont nouveaux et ont été préparés et caractérisés dans le cadre de la présente invention. Ils se révèlent particulièrement utiles pour préparer des streptogramines selon l'invention.

Le procédé revendiqué s'avère particulièrement intéressant pour préparer de nouvelles streptogramines du groupe B ou encore pour privilégier la formation de certaines d'entre elles. A ce titre il est tout particulièrement utile pour préparer la PIB.

La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique choisie parmi :

(a) tout ou partie des gènes papC (SEQ ID n° 2), papB (SEQ ID n° 3), pipA (SEQ ID n° 5), ≤nbJF (SEQ ID n° 6) et hpaA (SEQ ID n° 8),

(b) les séquences hybridant avec tout ou partie des gènes (a) et,

(c) les séquences dérivées des séquences (a), et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.

Dans le cas particulier des séquences hybrides selon (b), elles codent de préférence pour un polypeptide impliqué dans la biosynthèse des streptogramines.

Encore plus préférentiellement, l'invention a pour objet les séquences nucléotidiques représentées par les gènes papC (SEQ ID n° 2), papB (SEQ ID n° 3), pipA (SEO ID n° 5), suhE (SEQ ID n° 6) et hpaA (SEQ ID n° 8).

Un autre objet de l'invention concerne tout ADN recombinant comprenant un gène βâp£ (SEQ ID n° 2), papB ⁽ SEO ID n° 3), pipA (SEO ID n° 5), sj (SEQ ID n° 6) et hpaA (SEQ ID n° 8).

Bien entendu, les séquences nucléotidiques définies ci-dessus peuvent faire partie d'un vecteur de type vecteur d'expression qui peut être à réplication autonome ou intégratif ou vecteur suicide. La présente invention vise également ces vecteurs ainsi que toute utilisation d'une séquence selon l'invention ou d'un vecteur correspondant notamment pour la préparation de métabolites d'intérêt. Elle se rapporte en outre à tout polypeptide résultant de l'expression d'une séquence revendiquée.

La présente invention concerne également toute souche S. pristinaespiralis mutée qui possède au moins une modification génétique au niveau d'un des gènes pap£ (SEQ ID n° 2), papB (SEO ID n° 3), pipA ⁽ SEO ID n° 5), SL . (SEQ ID n° 6) et hpaA (SEQ ID n° 8) et plus préférentiellement les souches SP92pipA::ΩamR» SP92hpaA::Ωam-R ainsi que toute souche S. pristinaespiralis possédant une modification génétique consistant en une disruption du gène papA par double recombinaison homologue telle que SP212.

Les associations d'un composant des streptogramines du groupe A et d'un composé de formule générale I, selon l'invention, constituent des compositions particulièrement intéressantes sur le plan thérapeutique. Elles sont notamment employées pour les traitements d'affections dues à des bactéries Gram-positifs (du genre Staphylocoques, Streptocoques, Pneumocoques, Entérocoques) et Gram- négatifs (du genre Haemophilus, Gonocoques, Méningocoques). C'est ainsi que les composés selon l'invention synergisent l'action antibactérienne de la pristinamycine HB sur Staphylococcus aureus IP8203 in vivo chez la souris, à des doses

principalement comprises entre 30mg/kg et lOOmg/kg par voie orale, lorsqu'ils sont associés dans des proportions PI /PII de l'ordre de 30/70.

La présente invention s'étend à toute composition pharmaceutique contenant au moins un composé de formule générale I en association ou non avec une streptogramine du groupe A.

Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.

LISTE DES FIGURES.

Figure 1 : Structure de la pristinamycine IA-

Figure 2 : Structure des composants minoritaires de la pristinamycine I.

Figure 3 : Autres exemples de structures de composants B des streptogramines.

Figure 4 : Représentation de la région Pstl-Xhol de 2,9 kb. Figure 5 : Représentation de la région XhoI-PstI de 4,5 kb.

Figure 6 : Représentation de la région HindlII-BglII de 1,6 kb.

Figure 7 : Représentation de la région BglII-XhoI d'environ 10 kb.

Figure 8 : Représentation du plasmide pVRC415.

Figure 9 : Représentation du plasmide pVRC420. Figure 10 : Représentation du plasmide pVRC411.

Figure 11 : Représentation du plasmide pVRC421.

Figure 12: Représentation du plasmide pVRC414.

Figure 13: Stratégie de construction de SP212.

EXEMPLE 1: Séquençage et identification de gènes impliqués dans la biosynthèse de la pristinamycine I et de ses précurseurs-

Identification par séquençage des gènes situés en aval et en amont du gène codant pour l'enzyme PapA décrite dans le brevet PCT/FR93/0923, ainsi que d'un gène situé en aval du gène codant pour l'enzyme SnbA, également décrite dans le brevet PCT/FR93/0923.

Cet exemple décrit comment à partir du cosmide pIBV2, décrit dans le brevet

PCT/FR93/0923, et contenant les gènes de structure des enzymes PapA et PapM, intervenant dans la synthèse du précurseur 4-dimé ylamino-L-phénylalanine (DMPAPA) de la pristinamycine I et le gène de structure de l'enzyme SnbA

responsable de l'activation du précurseur aromatique de la pristinamycine I, l'acide 3- hydroxypicolinique (3-HPA), il s'est avéré possible d'identifier par séquençage autour de ces gènes et étude des mutants correspondants, d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse du précurseur DMPAPA, ou dans la biosynthèse d'autres précurseurs de la pristinamycine I.

Dans ce but, des sous-clonages ont été effectués à partir du cosmide pIBV2, et du plasmide pVRC900, dérivé de pIBV2 par une délétion HindTfl, et également décrit dans le brevet PCT/FR93/0923.

Cet exemple illustre comment les séquences nucléotidiques de fragments situés en aval et en amont des gènes papA et snbA de S. pristinaespiralis peuvent être obtenues.

Les techniques de clonage des fragments d'ADN d'intérêt dans les vecteurs M13mpl8/19 (Messing sL al- _> 1981) sont les techniques classiques de clonage dans Escherichia coli et sont décrites dans Maniatis e_t al- (1989).

1-1 Séquençage et analyse de la région en aval du gène papA.

Pour séquencer cette région, contenue entre les gènes papA et papM. les fragments Psll-Pstl de 1,5 kb, Pstl-Xhol de 0,7 kb et Xhol-Xhol de 0,7 kb ont été sous-clonés dans les vecteurs M13mpl8 et M13mpl9 à partir du plasmide pVRC900. Les sites de clonages ont été traversés par séquençage sur ADN double brin, en utilisant les plasmides ρVRC900 et ρVRC409 décrits dans le brevet PCT/FR93/0923. Les clonages ont été réalisés comme suit. Environ 2 μg du plasmide pVRC900 ont été coupés par les enzymes de restriction PstI et ou Xhol (New England Biolabs) dans les conditions préconisées par le fournisseur. Les fragments de restrictions ainsi obtenus ont été séparés sur gel d'agarose 0,8% et les fragments d'intérêt, Pstl-PstI de 1,5 kb, Pstl-Xhol de 0,7 kb et Xhol-Xhol de 0,7 kb ont été isolés et purifiés par Geneclean (BiolOl, La Jolla, Californie). Pour chaque clonage, environ 10 ng de M13mpl9 et/ou M13mpl8 coupés par P_§îl et ou Xhol. ont été ligaturés avec 100 ng du fragment à cloner, dans les conditions décrites par Maniatis ≤t al. 1989. Après transformation de la souche TG1 (K12, Mlac-pro) supE thi hsd ΔS F tr D36 pro A+B+ lacl~ lacZ ΔM15; Gibson, 1984) et sélection des plages de lyse sur milieu LB + X-gal + IPTG, selon la technique décrite par Maniatis el al- (1989), les phages portant les fragments souhaités ont été isolés. Les différents inserts ont été séquences

par la méthode de réaction de terminaison de chaîne en utilisant comme amorce de synthèse le primer universel ou des oligonucléotides synthétiques et complémentaires d'une séquence de 20 nucléotides de l'insert à séquencer. Les réactions ont été faites en utilisant des didéoxynucléotides fluorescents (PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit- Applied Biosystem) et analysées sur un séquenseur d'ADN de type Applied Biosystems Model 373A. Le recouvrement entre ces différents inserts a permis d'établir la séquence nucléotidique totale présente entre les gènes papA et papM (SEO ID N°l).

A partir de cette séquence nucléotidique, il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture et d'identifier ainsi des gènes impliqués dans la biosynthèse de la PI ou de ses précurseurs chez S- pristinaespiralis ainsi que les polypeptides codés par ces gènes.

Nous avons recherché la présence de phases ouvertes de lecture au sein du fragment Pstl-Xhol de 2,9 kb contenant la séquence nucléotidique entre les gènes papA et papM. en utilisant le fait que l'ADN des Streptomyces présente un haut pourcentage en bases G et C ainsi qu'un fort biais dans l'usage des codons qui composent les phases codantes (Bibb ≤t al. 1984). La méthode de Staden et Me Lachlan (1982) permet de calculer la probabilité des phases codantes en fonction de l'usage des codons de gènes de Streptomyces déjà séquences et rassemblés dans un fichier contenant 19673 codons obtenu à partir du serveur informatique BISANCE (Dessen elal. 1990).

Cette méthode a permis de caractériser au sein du fragment Pstl-Xhol de 2,9 kb, quatre phases ouvertes de lecture fortement probables qui sont représentées dans le tableau suivant (TABLEAU I). Elles sont nommées phases 1 à 4 d'après leur position à partir du site Pstl. Pour chacune, on a indiqué leur longueur en bases et leur position au sein du fragment (le site jPsil étant situé à la position 1); pour les phases ouvertes de lecture 2 et 3, a été également indiquée la taille en acides aminés du polypeptide codé. Les phases 1, 3 et 4 sont codées par le même brin et la phase 2 par le brin complémentaire (figure 4). Les phases 1 et 4 correspondent respectivement à la région C-terminale de la protéine PapA et N-terminale de la protéine PapM précédemment identifiées et décrites dans le brevet PCT/FR93/00923.

TABLEAU I

La comparaison du produit de la phase 2 (TABLEAU I) avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 27 % avec la région impliquée dans l'activité préphénate déhydrogénase des protéines bifonctionnelles TyrA d' E. coli (Hudson et Davidson, 1984) et d' Erwinia herbicola (EMBL data library, 1991). Cette région de TyrA catalyse l'aromatisation du préphénate en 4-hydroxyphénylpyruvate dans la biosynthèse de la tyrosine. Une aromatisation similaire à partir du 4-déoxy 4-amino préphénate conduisant au 4- amino phénylpyruvate intervient très vraisemblablement dans la synthèse de la DMPAPA. Cette réaction serait catalysée par le produit de la phase 2, appelé PapC (SEQ ID n°2).

La comparaison du produit de la phase 3 (TABLEAU I) avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 24 à 30 % avec la région impliquée dans l'activité chorismate mutase des protéines bifonctionnelles TyrA et PheA d' E. coli (Hudson et Davidson, 1984) et de la protéine TyrA d' Erwinia herbicola . Cette région catalyse l' isomérisation du chorismate en préphénate dans la biosynthèse de la tyrosine et de la phénylalanine.

Une isomérisation similaire à partir du 4-déoxy 4-amino chorismate conduisant au 4- déoxy 4-aminopréphénate intervient très vraisemblablement dans la synthèse de la DMPAPA. Cette réaction serait catalysée par le produit de la phase 3, appelé PapB (SEQ ID n°3). Dans le cas de TyrA et PheA les activités chorismate mutase et préphénate déhydratase ou préphénate déhydrogénase sont catalysées par la même protéine. Chez S. pristinaespiralis. les activités enzymatiques chorismate mutase et préphénate déhydrogénase sont catalysées par deux protéines séparées, PapB et PapC respectivement. Les homologies de séquences mises en évidence pour les protéines PapB et

PapC, montrent que ces deux protéines sont impliquées dans la biosynthèse du dérivé aromatique DMPAPA, conjointement avec les protéines PapA et PapM. De même que pour papA la disruption des gènes papB et papC doit conduire à la construction de souches de S. pristinaespiralis incapables de produire de la PI mais susceptibles de produire en présence de précurseurs originaux de nouvelles PI modifiées au niveau du résidu DMPAPA.

-2. Séquençage et analyse de la région en amont du gène papA.

Cette région est contenue entre le gène snbA codant pour l'acide 3- hydroxypicolinique-AMP ligase, décrite dans le brevet PCT/FR93/00923 et le gène papA.

Les clonages ont été réalisés comme décrit dans l'exemple 1-1, à partir du plasmide ρVRC900 et du cosmide ρIBV2 décrits dans le brevet PCT/FR93/00923. Les fragments Xhol-Xhol de 1,3 kb, X -XM de 0,2 kb, Xhol-Xhol de 3,3 kb, HindIII-PstI de 1,1 kb et Pstl-PstI de 2,2 kb ont été sous-clonés dans les vecteurs M13mpl8 et M13mρl9. Ces différents clonages ont permis de traverser tous les sites de clonage. Les différents inserts ont été séquences comme décrit en 1-1, en utilisant comme amorce de synthèse le primer universel ou des oligonucléotides synthétiques, complémentaires d'une séquence de 20 nucléotides de l'insert à séquencer.

Le recouvrement entre ces différents inserts a permis d'établir la séquence nucléotidique totale présente entre les gènes snbA et papA (SEQ ID n° 4).

A partir de cette séquence nucléotidique, il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture et d'identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse des

précurseurs de la PI de S. pristinaespiralis ansi que les polypeptides codés par ces gènes.

Nous avons recherché la présence de phases ouvertes de lecture au sein du fragment Xhol-Pstl de 4,5 kb contenant la séquence nucléotidique entre les gènes snbA et papA. comme décrit dans l'exemple 1.1. Cette méthode a permi de caractériser au sein du fragment Xhol-Pstl de 4,5 kb, quatre phases ouvertes de lecture fortement probables qui sont représentées dans le tableau suivant (TABLEAU II). Elles sont nommées phases 1 à 4 d'après leur position à partir du site Xhol. Pour chacune, on a indiqué leur longueur en bases et leur position au sein du fragment (le site Xhol étant situé à la position 1); pour les phases ouvertes de lecture 2 et 3, on a également indiqué la taille en acides aminés du polypeptide codé. Les phases 2, 3 et 4 sont codées par le même brin et la phase 1 par le brin complémentaire (figure 5). Les phases 1 et 4 correspondent respectivement aux régions N-terminales des protéines SnbA et PapA précédemment identifiées et décrites dans le brevet PCT/FR93/00923.

TABLEAU II

La comparaison du produit de la phase 2 (TABLEAU II) avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 30 %

avec l'ornithine cyclodéaminase d' Agrobacterium tumefasciens (Schindler e_£ al-, 1989). Cette enzyme intervient dans la dernière étape du catabolisme de l'octopine; elle convertit la L-ornithine en L-proline par cyclo-déamination. Des auteurs ont montré par incorporation de lysine marquée, que l'acide 4-oxopipécolique et l' acide 3-hydroxypicolinique, retrouvés aussi bien dans la PI^. que dans la virginiamycine SI, dérivaient de la lysine (Molinero ≤t ai-» 1989; Reed ≤t al., 1989). Une réaction de cyclodéamination de la lysine similaire à celle décrite pour l' ornithine conduirait à la formation d' acide pipécolique. En tenant compte de cette hypothèse le produit de la phase 2 a été appelé PipA (SEQ ID n° 5). Les résultats de mutation dans le gène pipA. présentés en 2-1, montrent l'implication du gène pipA dans la seule synthèse de 1' acide pipécolique car cette mutation n' affecte pas la biosynthèse de l'acide 3- hydroxypicolinique, qui dérive aussi de la lysine et dont l'acide pipécolique aurait pu être un précurseur.

La comparaison du produit de la phase 3 (TABLEAU ϋ) avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 30 à 40 % avec plusieurs hydroxylases de type cytochrome P450 impliquées dans la biosynthèse de métabolites secondaires (Orner ≤t al- _» 1990. Trower e_t al-, 1992). Plusieurs hydroxylations sont envisageables dans la biosynthèse des précurseurs de la pristinamycine I, notamment au niveau de la biosynthèse du 3-HPA (hydroxylation en 3 de l'acide picolinique) et de l'acide 4-oxopipécolique (hydroxylation en 4 de l'acide pipécolique). Les résultats de mutation dans le gène pipA. présentés en 2-1-3, montrent l'implication du produit de la phase 3 dans l' hydroxylation du résidu acide pipécolique de la Plg- Le gène correspondant a donc été appelé snbF et la protéine correspondante SnbF (SEQ ID n°6).

-3. Séquençage de la région en aval du gène snbA.

Cette région est comprise entre le gène snbA codant pour l'acide 3- hydroxypicolinique-adénylate-ligase et le gène snbR. codant pour une protéine membranaire probablement responsable du transport et de la résistance à la PI, toutes deux décrites dans le brevet PCT/FR93/00923. Les séquences ont été réalisées à partir d'un fragment isolé du cosmide plBV2, comme décrit dans l'exemple 1-1.

Le fragment HindIII-BglII de 1,6 kb a été sous-cloné dans les vecteurs

M13mpl8 et M13mpl9, à partir du cosmide pIBV2. L' insert a été séquence comme décrit en 1-1, en utilisant comme amorce de synthèse le primer universel ou des

oligonucléotides synthétiques, complémentaires d'une séquence de 20 nucléotides de l'insert à séquencer. A partir de la séquence nucléotidique ainsi obtenue (SEQ ID n°7), il est possible de déterminer les phases ouvertes de lecture et d'identifier des gènes impliqués dans la biosynthèse des précurseurs de la PI de S. pristinaespiralis ainsi que les polypeptides codés par ces gènes. Nous avons recherché la présence de phases ouvertes de lecture au sein du fragment HinάTfl- Bgiπ de 1,6 kb correspondant à la fin du gène snbA et à sa région aval, comme décrit dans l'exemple 1-1. Une phase ouverte complète codée par le même brin que le gène snbA (figure 6), a été mise en évidence. Par rapport à la position 1 correspondant au site Hindiπ. cette phase démarre au nucléotide 249, 30 nucléotides après la fin du gène snbA. et se termine au nucléotide 1481. Sa taille est de 1233 nucléotides correspondant à une protéine de 411 acides aminés.

La comparaison du produit de cette phase ouverte avec les séquences protéiques contenues dans la banque Genpro fait apparaître une homologie de 30 à 40 % avec un groupe de protéines probablement impliquées (Thorson ≤î al-, 1993) dans la transamination d'intermédiaires de biosynthèse de différents antibiotiques (DnrJ, EryCl, TylB, StrS, PrgL ). La synthèse du précurseur 3-HPA qui semble dériver de la lysine par une autre voie que la cyclodéamination (voir exemples 1-2 et 2-1), pourrait nécessiter une étape de transamination susceptible d'être catalysée par le produit de cette phase 3, appelé HpaA (SEQ ID n°8). Les résultats de mutation dans ce gène, présentés en 2-2, montrent sans équivoque l'implication de ce gène dans la synthèse du précurseur 3-HPA et confirment notre hypothèse.

Les gènes papB. papC. pipA. snbF et hpaA décrits dans la présente invention sont regroupés avec les gènes snbA. papA. et papM sur une région chromosomique de environ 10 kb (figure 7). Ceci confirme la présence d'un cluster de gènes impliqués dans la biosynthèse de la P I et de ses précurseurs. L'étude des régions en amont et en aval de ce cluster devrait permettre d'identifier les autres gènes de biosynthèse des précurseurs de la PI, notamment de la L-phénylglycine et de l'acide L-2-aminobutyrique. ,

EXEMPLE 2: Construction de souches recombinées par disruption des gènes identifiés.

Cet exemple illustre comment il est possible de mettre en évidence l'implication des gènes décrits dans l'exemple 1, dans la biosynthèse des précurseurs des pristinamycines, ainsi que de construire des souches de S- pristinaespiralis capables de produire de nouvelles pristinamycines. Ces souches sont obtenues en disruptant les gènes impliqués dans la biosynthèse du résidu que l'on veut substituer et les nouvelles pristinamycines sont produites en complémentant ces mutants par des précurseurs originaux.

La souche SP92::pVRC508 utilisée dans la présente invention pour produire de nouveaux dérivés de PI en remplaçant le précurseur DMPAPA par d'autres molécules, est décrite dans le brevet PCT/FR93/0923. Elle résulte de la disruption par simple crossing-over du gène papA impliqué dans la biosynthèse du précurseur de la DMPAPA et supposé intervenir dans une étape précoce concernant la transamination du chorismate. Cette disruption a un caractère polaire puisque, dans ce mutant, l'expression du gène papM (PCT/FR93/0923), situé 1,5 kb en aval du gène papA et impliqué dans la double méthylation de la 4-amino-L-phénylalanine en DMPAPA, est très réduite. En effet le dosage de l'activité de l'enzyme de méthylation SAM- dépendante de la 4-amino-L-phénylalanine (PAPA) en DMPAPA indique pour le mutant SP92::pVRC508 une activité inférieure à 5% de l' activité de la souche sauvage.

Dans la présente invention cette souche SP92::pVRC508 permet dans des conditions de fermentation et de complémentation adéquates de produire de nouvelles pristinamycines, modifiées au niveau du résidu DMPAPA, comme il sera présenté dans l' exemple 3. Des mutants de même phénotype peuvent être obtenus par disruption des gènes papB ou papC décrits dans la présente invention.

D'une manière similaire, un autre type de souche de S _» pristinaesρiralis.disruptée dans le gène papA et possédant le même phénotype que la souche SP92::ρVRC508, a été obtenue par disruption par double crossing over du gène papA. Cette construction a été réalisée à partir d'un fragment Sp l-FindTTT de 4,6kb, isolé du cosmide plBV2 et contenant la région 3' du gène pipA. les gènes snbF et papA en entier ainsi que la partie 3' du gène paoC. Ce fragment a été clone dans le vecteur suicide pDH5, capable de se répliquer seulement chez E. coli, mais portant un marqueur de résistance s'exprimant chez Streptomyces (le gène de résistance au thiostrepton ou au nohiheptide, îsr). Ce vecteur pDH5 a été développé par Wohlebben

et al. (1991 Nucleic Acid. Res. 19, 727-731). Une délétion Bcll-Bcll de 1,1 kb a ensuite été réalisée dans le gènejjaoA et un fragment Hindlϋ-HindlII de 2,2 kb portant le gène amR (résistance à la généticine et à l'apramycine) a été introduit après remplissage des extrémités cohésives. Le vecteur recombinant a été appelé pVRC414 et est présenté en figure 12. Après transformation de la souche productrice de pristinamycines par le plasmide pVRC414 des transformants résistants à la généticine et sensibles au thiostrepton ont été isolés et analysés. Ces clones résultent d'une double recombinaison homologue entre les régions d'ADN de S. pristinaespiralis du plasmide pVRC414 et la région chromosomique de S. pristinaespiralis correspondante telle que décrite en figure 13. Un de ces clones a été appelé SP212. Son phénotype est identique à celui de la souche SP92::ρVRC508 en ce qui concerne la non production de PI et sa capacité à produire de nouveaux antibiotiques en présence de précurseurs originaux. Avantageusement, ce type de souche, obtenue par double crossing over, présente une meilleure stabilité comparativement aux souches obtenues par simple crossing-over.

2-1. Construction d'un mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène î2ipΔ-

Cet exemple illustre comment il est possible par disruption du gène pipA de construire une souche de S.pristinaespiralis SP92 qui ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation et qui est capable de produire de nouvelles pristinamycines, modifiées au niveau du résidu acide 4-oxopipécolique de la PIA, lorsque des précurseurs originaux sont ajoutés à la fermentation.

Sa construction a été réalisée à l'aide d'un vecteur suicide se répliquant chez E.coli seulement, le vecteur pUC1318. Ce vecteur ne porte pas de marqueur de résistance s'exprimant chez Streptomyces. Sa présence dans le génome de Streptomyces ne peut être détectée que par hybridation sur colonies.

2-1-1. Construction du plasmide pVRC420:

Cet exemple illustre comment il est possible de construire un plasmide ne se répliquant pas chez S.pristinaespiralis SP92, qui peut être utilisé pour disrupter par double recombinaison homologue le gène pipA.

Le plasmide pVRC420 a été construit pour réaliser le mutant chromosomique SP92 disrupté dans le gène pipA à partir du cosmide pIBV2 décrit dans le brevet PCT/FR93/0923. Le cosmide pIBV2 a été coupé par l'enzyme de restriction EsH et après séparation des fragments ainsi générés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8 %, un fragment Pstl-PstI de 2,8 kb, contenant le début des gènes snbA et snbF et la totalité du gène pipA a été isolé et purifié par Geneclean (BiolOl, La Jolla, Californie). 50 ng du vecteur pUC1318 linéarisés par une digestion Es l, ont été ligués avec 200 ng du fragment de 2,8 kb, comme décrit dans l'exemple 1. Un clone portant le fragment souhaité a été isolé après transformation de la souche TGl et sélection sur milieu LB + ampicilline 150 μg/ml + X-gal + IPTG. Le plasmide recombinant a été nommé pVRC415 (figure 8). Une cassette contenant le gène am^. codant pour la résistance à l'apramycine ou à la généticine (Kuhstoss ≤£ al- _» 1991) a été alors introduite au site unique HinάTfl du plasmide pVRC415, ce site étant situé 530 pb en aval du démarrage du gène pipA. Cette construction a été réalisée comme suit. Un fragment d'ADN de 2,5 kb contenant le gène am^. le promoteur PermE (Bibb e_£ al- _» 1985) ainsi que les 158 premiers acides aminés du gène de résistance à rérythromycine, ermE a été isolé par une double digestion Sall-Bgiπ à partir d'un plasmide dérivé des plasmides pD4026 (plasmide porteur du gène ermE sous contrôle du promoteur PermE) et pHP45Ωam^. Après remplissage des extrémités cohésives 5' sortantes Sali et BglII par l'enzyme Klenow selon le protocole décrit par Maniatis et al. 1989, le fragment contenant le gène am^ a été clone au site Hjnd- jfl du plasmide pVRC415, dont les extrémités cohésives 5' sortantes avaient été également remplies par l' enzyme Klenow, comme décrit précédemment. Le plasmide recombinant ainsi obtenu a été appelé pVRC420. Sa carte de restriction est présentée figure 9.

2-1-2. Isolement du mutant SP92pip A: : Ω am^. disrupté dans le gène pipA par recombinaison homologue.

Cet exemple illustre comment le mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène pipA a été construit

Ce mutant a été isolé par transformation de la souche SP92 avec le plasmide suicide pVRC420.

La préparation des protoplastes, leur transformation ainsi que l'extraction d'ADN total des souches recombinées ont été réalisées comme décrit par Hopwood ≤t âl. (1985).

La souche SP92 a été cultivée en milieu YEME (Hopwood ≤t al-, 1985), 34% de sucrose, 5 mM MgCl2, glycine 0,25% pendant 40 heures à 30°C. Le mycélium a été protoplastisé en présence de lysozyme et 5 X 1 μg de pVRC420 ont été utilisés pour la transformation (par la méthode utilisant le PEG) des protoplastes. Après une nuit de régénération des protoplastes sur milieu R2YE (D. Hopwood e__ al- 1985), les recombinants ont été sélectionnés par étalement de 3 ml de milieu SNA (D. Hopwood ≤I al- 1985) contenant 1500 μg/ml de généticine.

Sur les 5 transformations réalisées 100 clones résistants à la généticine ont été isolés. Ces recombinants résultent de l'intégration par simple ou double recombinaison homologue entre le gène pipA porté par le chromosome de la souche SP92 et les parties du gène pipA contenues dans le fragment de 5,3 kb porté par le plasmide suicide pVRC420. Pour sélectionner les recombinants obtenus par double crossing-over (c'est à dire ne contenant pas dans leur génome la partie pUC1318 du plasmide pVRC420), des hybridations sur colonies de 90 clones ont été réalisées avec comme sonde le pUC19 marqué au [α- ³² P]dCTP, comme décrit dans Maniatis ≤î al. (1989). 10 clones résistants à la généticine mais n' hybridant pas le vecteur pUC19 ont été sélectionnés. Les spores des recombinants ont été isolées par étalement et croissance sur milieu HT7 + 10 μg/ml de généticine, et réétalées sur le même milieu pour obtenir des colonies isolées. Afin de vérifier la position de l'intégration du plasmide pVRC420, différents Southerns de l'ADN total de plusieurs clones recombinants, purifiés comme décrit par Hopwood et al. 1985, ont été réalisés et hybrides avec le fragment Pstl-Pstl de 2,8 kb utilisé comme sonde après marquage au [α- ³² P]dCTP. Les résultats confirment que ces recombinants ont été obtenus par double crossing-over entre le vecteur pVRC420 et le chromosome de la souche SP92, aboutissant au remplacement du fragment Pstl-Pstl de 2,8 kb, contenant le gène pipA par un fragment Pstl-Pstl de 5,3 kb contenant le gène pipA disrupté par l'introduction du gène am ^R . Un de ces mutants a été nommé SP92pjgA::Ωam ^R .

2-1-3. Production de pristinamycines par le mutant SP92pipA::Ωam ^R .

Cet exemple illustre comment il est déterminé que le mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène pjp_A par l'intégration du plasmide pVR420 d'une part ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation et d'autre part permet la forte production d'une forme minoritaire des composants B des streptogramines dans lesquels l'acide 4-oxopipécolique est remplacé par l'acide pipécolique.

Le mutant SP92pipA::Ωam ^R . ainsi que la souche SP92, en tant que souche témoin, ont été cultivés en milieu de production liquide. La fermentation a été réalisée comme suit : 0,5 ml d'une suspension de spores de la souche précitée sont ajoutés en conditions stériles à 40 ml de milieu inoculum dans un erlen chicané de 300 ml. Le milieu inoculum est constitué par 10 g 1 de Corn Steep, 15 g/1 de saccharose, 10 g/1 de 1 gΛ de K2HPO4, 3 gΛ de NaCl, 0,2 g/1 de MgSO ₄ - 7H2O et 1,25 g/1 de CaCθ3. Le pH est ajusté à 6.9 par de la soude avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlens sont agités pendant 44 h à 27°C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 rpm. 2,5 ml de la culture précédente âgée de 44 h sont ajoutés stérilement à 30 ml de milieu de production dans un erlen de 300 ml. Le milieu de production est constitué par 25 g/1 de farine de soja, 7,5 g/1 d'amidon, 22,5 g/1 de glucose, 3,5 g/1 de levure fourragère, 0,5 g/1 de sulfate de zinc et 6 g/1 de carbonate de calcium. Le pH .est ajusté à 6,0 par de l'acide chlorhydrique avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlens sont agités pendant 24, 28 et 32 heures à 27°C. A chaque temps, 10 g de moût sont pesés dans un erlen lisse , auxquels sont ajoutés 20 ml de phase mobile composée de 34 % d'acétonitrile et 66 % d'une solution de 0,1 M de KH2PO4 (ajusté à pH 2,9 par H3PO4 concentré) permettant l'extraction des pristinamycines. Après agitation, le tout est centrifugé et les pristinamycines contenues dans le surnageant sont dosées par CLHP en injectant 150 μl du surnageant de centrifugation sur une colonne Nucléosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm éluée par un mélange de 40 % d'acétonitrile et de 60 % de tampon phosphate 0,1 M pH 2,9. Les pristinamycines I sont détectées grâce à leur absorbance UV à 206 nm.

Les résultats ont montré que dans les conditions de fermentation réalisées, le mutant SP92pipA::Ωam ^R n' a pas produit de PI, ceci à 24, 28 et 32 hrs de fermentation, alors que le témoin SP92 a produit pour les 3 temps testés, une quantité standard de PI. Pour les deux souches, la quantité de PII produite est restée la même. Le mutant SP92ρiρA::Ωam ^R est bien bloqué dans une étape de biosynthèse de la PI.

Des tests complémentaires de fermentation ont été réalisés en ajoutant au bout de 16 heures à la culture en milieu de production, les différents précurseurs de la PI, séparément ou ensemble. Les résultats de ces complémentations ont permis de montrer que lorsqu' on ajoute au milieu de fermentation 100 mg d' acide pipécolique et 100 mg/1 de DMPAPA, simultanément, le mutant produit un dérivé normalement mineur de la PI, la Plβ (dont la quantité produite est inférieure à 5 % chez SP92), à un niveau équivalent à la production de PI A par la souche témoin. Cette production n' a pas lieu si l' acide pipécolique et le DMPAPA sont ajoutés séparément. La PIE diffère de la PIA _^ (composant majeur de la PI) par l'absence de la fonction cétone en 4 sur l' acide pipécolique. Le fait que la complémentation du mutant SP92pipA::ΩamR ne puisse être réalisée qu' en ajoutant simultanément l'acide pipécolique et la DMPAPA, indique que les gènes papA et probablement papB et papM ont été disruptés par effet polaire de la construction. En effet, tous ces gènes sont situés en aval de pipA. et sont probablement cotranscrits avec pipA. La disruption de ce dernier entraîne donc la disruption des gènes pap et par conséquence l'absence de synthèse de la DMPAPA. Le fait que la complémentation du mutant SP92pipA::Ω am ^R par l' acide pipécolique, entraîne la production de PI et non de PI A _» conduit à deux conclusions : la première est que la construction du cycle de la PI se fait par incorporation de l'acide pipécolique et non de l' acide 4-oxopipécolique, et qu' une hydroxylation générant la fonction cétone en 4 a alors lieu ultérieurement. La deuxième est que cette hydroxylation est probablement réalisée par l'enzyme SnbF, dont le gène de structure se situe directement en aval du gène pipA. En effet, la polarité évidente de la disruption du gène pipA. sur les gènes p p, implique probablement un effet polaire sur le gène snbF. situé entre pipA et les gènes pap. qui se traduit par l'inhibition de la fonction d'hydroxylation du résidu acide pipécolique de la PIE en acide 4-hydroxypipécolique retrouvé dans les PIp et PIQ (figure 2) puis oxydé en acide 4-oxopipécolique dans la PI A-

La réalisation d'un tel mutant a permis de construire une souche de pristinaespiralis incapable de produire de la PI sauf en présence des précurseurs de PI, DMPAPA et acide pipécolique, à partir desquels elle est capable de produire en quantité équivalente à la souche de départ un dérivé de PI normalement minoritaire dans le mélange de pristinamycine. De même en présence de précurseurs originaux ou d'un mélange de précurseurs originaux et des précurseurs normalement présents dans la PI, cette souche pourra produire de nouvelles pristinamycines, modifiées dans l'un ou l'autre ou dans les deux résidus DMPAPA et acide 4-oxopipécolique.

2-2. Construction d'un mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène hpaA.

Cet exemple illustre comment il est possible par disruption du gène hpaA de construire une souche de S.pristinaespiralis SP92 qui ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation et qui est capable de produire de nouvelles pristinamycines, modifiées au niveau du précurseur 3-HPA, lorsque des précurseurs originaux sont ajoutés à la fermentation.

Sa construction a été réalisée à l' aide d'un plasmide ne se répliquant pas chez S .pristinaespiralis SP92, qui peut être utilisé pour disrupter par double recombinaison homologue le gène hpaA.

2-2-1. construction du plasmide suicide pVRC421

La construction du plasmide pVRC421 a été réalisée à l'aide d'un vecteur suicide, capable de se répliquer chez E.coli seulement, mais portant un marqueur de résistance s'exprimant chez Streptomyces, le gène de résistance au thiostrepton ou au nosiheptide, îsjr. Ce vecteur, pDH5, a été développé par Hillemann ei al. (1991).

Le plasmide pVRC421 a été construit pour réaliser le mutant chromosomique SP92 disrupté dans le gène hpaA. à partir du cosmide pIBV2 décrit dans le brevet

PCT/FR93/0923. Le ρIBV2 a été digéré par l' enzyme de restriction Sphl et après séparation des fragments ainsi générés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, un fragment Sphl-SphI de 4,8 kb, contenant la totalité du gène hpaA et la quasi totalité du gène snbA a été isolé et purifié par Geneclean comme décrit plus haut. 50 ng du vecteur pDH5 linéarisés par une digestion Sphl. ont été ligués avec 200 ng du fragment de 4,8 kb, comme décrit ultérieurement Un clone portant le fragment souhaité a été isolé après transformation de la souche TGl et sélection sur milieu LB

+ ampicilline 150 μg/ml + IPTG + X-gal. Le plasmide recombinant a été nommé pVRC411 (figure 10). Une cassette contenant le gène am ^R codant pour la résistance à l'apramycine ou à la généticine a été alors introduite au site unique Pflml du plasmide

pVRC411, ce site étant situé 610 pb en aval du démarrage du gène hpaA. Cette construction a été réalisée comme suit Un fragment d'ADN de 2,2 kb contenant le gène am ^R a été isolé après digestion du plasmide pHP45Ωam ^R contenant le gène am ^R . par Hindiπ. Après remplissage des extrémités cohésives 5' sortantes HindTTI par l'enzyme Klenow selon le protocole décrit par Maniatis ≤l _. al- 1989, le fragment contenant le gène a ^R a été clone au site Pflml du plasmide pVRC411, dont les extrémités cohésives 3' sortantes avaient été rendues franches par l'enzyme T4 polymérase, comme décrit dans Maniatis ≤t al- 1989. Le plasmide recombinant ainsi obtenu a été appelé pVRC421. Sa carte de restriction est présentée figure 11.

2-2-2. Isolement du mutant SP92hpaA::Ωam . disrupté dans le gène hpaA par recombinaison homologue.

Cet exemple illustre comment le mutant de S.pristinaespiralis SP92, disrupté dans le gène hpaA a été construit.

Ce mutant a été isolé par transformation de la souche SP92 avec le plasmide suicide pVRC421.

La préparation des protoplastes et leur transformation ont été réalisées comme décrit précédemment. La souche SP92 a été cultivée en milieu YEME, 34% de sucrose, 5 mM

MgCl2, glycine 0,25% pendant 40 heures à 30°C. Le mycélium a été protoplastisé en présence de lysozyme et 5 X 1 μg de pVRC421 ont été utilisés pour la transformation (par la méthode utilisant le PEG) des protoplastes. Après une nuit de régénération des protoplastes sur milieu R2YE, les recombinants ont été sélectionnés par étalement de 3 ml de milieu SNA contenant 1500 μg/ml de généticine.

Sur les 5 transformations réalisées 600 clones résistants à la généticine ont été isolés. Ces recombinants résultent de l'intégration par simple ou double recombinaison homologue entre le gène hpaA porté par le chromosome de la souche SP92 et le fragment de 6 kb du plasmide suicide pVRC421. Pour sélectionner les recombinants obtenus par double crossing-over (c' est à dire les clones ne contenant plus dans leur génome la partie pDH5 du plasmide pVRC421), les clones ont été repiqués sur milieu HT7 contenant 400 μg/ml de thiostrepton. 6 clones résistants à la généticine mais sensibles au thiostrepton ont été sélectionnés. Les spores des recombinants ont été isolées par étalement et croissance sur milieu HT7 + 10 μg/ml de généticine, et réétalées sur le même milieu pour obtenir des colonies isolées. Afin

de vérifier la position de l'intégration du plasmide pVRC421, différents Southerns de l'ADN total des 6 clones recombinants, purifiés comme décrit par Hopwood g£ âl- 1985, ont été réalisés et hybrides avec le fragment Sphl-SphI de 4,8 kb utilisé comme sonde après marquage au [α- ³² P]dCTP. Les résultats confirment que ces recombinants ont été obtenus par double crossing-over entre le vecteur pVRC421 et le chromosome de la souche SP92, aboutissant au remplacement du fragment Sphl- Sphl de 4,8 kb, contenant le gène hpaA par un fragment Sphl-SphI de 6 kb contenant le gène hpaA disrupté par le gène arn ^R - Un de ces mutants a été nommé SP92hj2aA:: Ωam ^R .

2-2-3. Production de pristinamycines par le mutant SP92hpaA::Ωam ^R .

Cet exemple illustre comment il est déterminé que le mutant de S.pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène hpaA par l'intégration du plasmide pVR421, ne produit plus de PI dans les conditions standards de fermentation.

Le mutant SP92hpaA: : Ωam . ainsi que la souche SP92, en tant que souche témoin, ont été cultivés en milieu de production liquide. La fermentation a été réalisée comme décrit à l'exemple 2-1-3 puis les pristinamycines ont été extraites et dosées comme décrit précédemment Les résultats ont montré que dans les conditions de fermentation réalisées, le mutant SP92hpaA::Ωam ^R n' a pas produit de PI, ceci à 24, 28 et 32 hrs de fermentation, alors que le témoin a produit pour les 3 temps testés, une quantité standard de PI. Pour les deux souches, la quantité de PH produite est restée la même. Le mutant SP92hpaA::Ωam ^R est bien bloqué dans une étape de biosynthèse de la PI. Des tests complémentaires de fermentation ont été réalisés en ajoutant au bout de 16 heures à la culture en milieu de production les différents précurseurs de la PI, séparément ou ensemble. Quand on ajoute au milieu de fermentation 100 mg/1 d' acide 3-hydroxypicolinique, le mutant produit alors de la PIA _. à un niveau équivalent à la production de PI par la souche témoin. Le fait que la complémentation du mutant SP92hpaA: : Ωam ^R ne puisse être réalisée qu" en ajoutant de l' acide 3-hydroxypicolinique, montre que le gène hpaA est impliqué dans la synthèse de ce précurseur.

La construction de ce mutant a permis de réaliser une souche de £. pristinaespiralis mutée pour sa production de PI, mais qui en présence du précurseur

3-HPA est capable de produire en quantité équivalente à la souche de départ de la PL De même que dans les exemples précédents, il est envisageable à partir d'un tel mutant et en présence de précurseurs originaux de produire de nouvelles pristinamycines modifiées au niveau du résidu acide 3-hydroxypicolinique.

EXEMPLE 3: Production de composés de formule générale I par le mutant SP92::pVRC508.

Cet exemple illustre comment le mutant de S. pristinaespiralis SP92 disrupté dans le gène papA par l'intégration du plasmide pVRC508 est capable de synthétiser de nouvelles streptogramines en présence de précurseurs ajoutés dans le milieu de production. Ces précurseurs peuvent être des dérivés d'acides aminés et plus particulièrement de phénylalanine mais aussi d'acides α-cétocarboxyliques et plus particulièrement d'acide phénylpyruvique.

Le mutant SP92::pVRC508 a été cultivé en milieu de production liquide. La fermentation a été réalisée comme suit : 0,5 ml d'une suspension de spores de la souche précitée est ajouté en conditions stériles à 40 ml de milieu inoculum dans un erlen chicané de 300 ml. Le milieu inoculum est constitué par 10 g/1 de Corn Steep, 15 g 1 de saccharose, 10 g/1 de (NH4hSθ4, 1 g/1 de K2HPO4, 3 g/1 de NaCl, 0,2 gΛ de MgSθ4-7H2θ et 1,25 g/1 de CaCθ3. Le pH est ajusté à 6.9 par de la soude avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlens sont agités pendant 44 h à 27°C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 rpm. 2.5 ml de la culture précédente âgée de 44 h sont ajoutés stérilement à 30 ml de milieu de production dans un erlen de 300 ml. Le milieu de production est constitué par 25 g/1 de farine de soja, 7,5 g/1 d'amidon, 22,5 g/1 de glucose, 3,5 g/1 de levure fourragère, 0,5 g/1 de sulfate de zinc et 6 g/1 de carbonate de calcium. Le pH est ajusté à 6,0 par de l'acide chlorhydrique avant l'introduction du carbonate de calcium. Les erlens sont agités à 27°C sur un agitateur rotatif à la vitesse de 325 rpm. Au bout de 16h, 1 ml d'une solution d'un des précurseurs listés dans le tableau 3 (généralement 5 ou 10 g 1) est ajouté à la culture. Celle-ci est arrêtée 8 ou 24 h plus tard. Aussitôt le moût est volume et on lui ajoute 2 volumes de phase mobile composée de 34 % d'acétonitrile et 66 % d'une solution de 0,1 M de KH2PO4 (ajusté à pH 2,9 par H3PO4 concentré) permettant l'extraction des

pristinamycines. Après agitation, le tout est centrifugé et les pristinamycines contenues dans le surnageant sont extraites et purifiées comme décrit dans l'exemple 4. Elles sont également dosées par CLHP en injectant 150 μl du surnageant de centrifugation sur une colonne Nucléosil 5-C8 de 4,6 x 150 mm éluée par un mélange de 40 % d'acétonitrile et de 60 % de tampon phosphate 0,1 M pH 2,9. Les nouvelles pristinamycines I sont détectées grâce à leur absorbance UV à 206 nm et éventuellement grâce à leur émission de fluorescence (filtre 370 nm, excitation à 306 nm).

4-Ethyl phénylalanine Exemple 33

3-Diméthylaminophénylalanine Exemple 35-10

TABLEAU m

Le tableau suivant (TABLEAU IV) indique les temps de rétention relatifs des nouvelles P I produites en prenant pour référence la PI A- Les temps de rétention absolus ont été déterminés à 25°C dans le système CLHP décrit ci-dessus; ils varient légèrement d'une injection à l'autre d'une part et en fonction de la température d'autre part.

TABLEAU IV

La nouvelle P I de tR 4,35 pour la 4-Isopropylρhénylalanine correspond à une neo P IE décrite dans l'exemple 14.

La nouvelle P I de tR 1,63 pour la 4-Méthylthiophénylalanine correspond à une 5γ-hydroxy neo P IJJ décrite dans l'exemple 5.

Par ailleurs le mutant SP92::ρVRC508 a été fermenté en présence de 4- c_imémyl__mino phénylalanine. Dans ces conditions de complémentation le mutant SP92::pVRC508 produit une quantité de pristinamycines 1^ équivalente à celle produite par la souche SP92.

EXEMPLE 4: Préparation de la pristinamycine IJJ [4ζ-méthyIamino- dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine Ij et de la 4ζ-amino-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine 1^

4.1: Préparation de la pristinamycine Ig [4ζ-méthylamino-dés(4ζ- dimémylamino) pristinamycine IΔJ

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans l'eau de 4-mémylaminophénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 34-1. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la pristinamycine Ijj sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 6 ml d'un mélange 65% eau et 35% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 65% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 35% d'acétonitrile. Les fractions contenant la pristinamycine Ig sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 52 mg de pristinamycine Iβ-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ.en ppm, réf. TMS): 0.71 (dd, J= 16 et 6 Hz, IH, 5 ft,), 0.92 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 2 γ), de 1.10 à 1.40 (mt, 2H: 3 fe et 3 γ ₂ ), 1.34 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 ), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 37-, et CH~ 2 β), 2.03 (mt, IH, 3 β,), 2.22 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.33 (d large, J= 16 Hz, IH: 5 à.), 2.40 (d, J= 16 Hz, IH: 5 β _j ), 2.82 (mt, IH: 5 &,), 2.81 (s, 3H: 4 NCH ₃ en para du phényle), 2.90 (dd,

J= 12 et 4 Hz, IH: 4 β ₂ ), 3.29 (s, 3H: 4 NCH ₃ ), de 3.20 à 3.45 et 3.60 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 3.40 (t, J= 12 Hz, IH: 4 β,), 4.57 (dd, J= 7 et 8 Hz, IH, 3 a), 4.75 (dd large, J= 13 et 7 Hz, IH: 5 ε_), 4.83 (mt, IH: 2a), 4.89 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.24 (dd, J= 12 et 4 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d large, J= 6 Hz, IH: 5 a), 5.89 (d, J≈ 9 Hz, IH: 6 a), 5.90 (q large, J= 7.5 Hz, IH: lβ), 6.53 (d, J= 9 Hz, IH: NH 2), 6.53 (d, J= 8 Hz, 2H: 4e), 7.03 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.10 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.46 (mt, 2H: l' H ₅ et l' H ₄ ), 7.85 (dd, J = 5.5 et 2 Hz, IH: l' H _g ), 8.44 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.63 (s, IH: OH).

4.2: Préparation de la 4ζ-amino-dés(4ζ-dimé yl-imino) pristinamycine 1^

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 5 g/1 dans l'eau de 4-aminophénylalanine (S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1^ sont regroupées et évaporées. Le résidu seci est repris par 6 ml d'un mélange 65% eau et 35% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 65% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 35% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 5 mg de 4ζ- ammo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I^ -

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.72 (dd, J= 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.90 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), de 1.10 à 1.40 (mt, 2H: 3 β ₂ et 3 7 ₂ ), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 . et CTL, 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 fr), 2.19 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.33 (d large, J= 16 Hz, IH: 5 Ô^, 2.42 (d, J= 16 Hz, IH: 5 fr), 2.81 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 ε- , 2.90 (dd, J= 12 et 4 Hz, IH: 4 β-), 3.24 (s, 3H: NCH ₃ 4), de 3.20 à 3.40 et 3.54 (2 mts, IH chacun: CΑ, 3 δ), 3.30 (t, J= 12 Hz, IH: 4 fr), 3.72 (mf, 2H: ArNH ₂ ), 4.54 (dd, J= 7.5 et 7 Hz, IH, 3 a), 4.73 (dd large, J= 13 et 8 Hz, IH: 5 ε,), 4.82 (mt, IH: 2a), 4.89 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.22 (dd, J= 12 et 4 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d large, J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.89 (mt, 2H: 6 a et lβ), 6.51 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 6.61 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 6.98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.45 (dd, J= 8.5 et 1.5 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.48 (dd, J= 8.5 et 4 Hz, IH: l' H ₅ ), 7.82 (dd, J = 4 et 1.5 Hz, IH: 1' H^, 8.43 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.63 (s, IH: OH).

EXEMPLE 5 : Préparation de la 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA.. de la 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-dimêthylamino) pristinamycine IJÏ et de la 5γhydroxy 4ζ-méthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude 0,1N de 4-méthylthiophénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1 ^ sont regroupées et évaporées. On obtient 65 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 6 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 45 mg de 4ξ-méthylthio- dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA.- Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.68 (dd,

J= 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 2 7), 1.13 (mt, IH: 3 β,), de 1.25 à 1.40 (mt, IH: 37 ₂ ), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.55 à 1.85 (mt, 3H: 3 7, et CH ₂ 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 β.), 2.18 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.38 (d large, J= 16.5 Hz, IH 5 δ.), 2.46 (s, 3H: SCH ₃ ), 2.48 (d, J=16 Hz, IH, 5 β.), 2.85 (dt, J= 13.5 et 4 Hz, IH: 5 ε-), 3.00 (dd, J= 12 et 5 Hz, IH: 4 β^, 3.23 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.37 (t, J= 12 Hz, IH 4 β.), 3.37 et 3.58 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 4.55. (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 a), 4.77 (dd large, J= 13.5 et 8 Hz, IH: 5 ε.), 4.86 (mt, IH: 2α), 4.89 (dd, J= 10 et 1.5 Hz, IH: la), 5.30 (d large, J= 5.5 Hz, IH: 5 a), 5.32 (dd, J= 12 et 5 Hz, IH: 4 α), 5.90 (d, J= 9.5 Hz, IH: 6 α), 5.92 (dq, J= 7.5 et 1.5 Hz, lH:lβ), 6.55 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.13 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.19 (d, J= 8

Hz, 2H: 4ε), 7.45 (mt, 2H: l' H ₄ et l' H ₅ ), 7.76 (t, J = 5 Hz, IH: l' H^, 8.42 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IJJ» 10 mg de 4ζ-méthylthio-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IJJ sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus mais en portant la proportion d'acétonitrile de la phase éluante à 50%. Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.32 (mt, IH,

5 β _; ,), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), de 1.20 à 1.35 (mt, 2H: 3 & et 3 7-), 1.30(d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 17), de 1.35 à 2.05 (mt, 9H: 3 γ. - 3 β _: - CIL, 2 β - CIL, 5 δ - CR, 57 et 5 β^, 2.44 (dt, J= 13.5 et 1.5 Hz, IH: 5 ε-,), 2.49 (s, 3H: SCH ₃ ), 2.99 (dd, J= 12 et 5 Hz, IH: 4 β^, 3.09 (dd, J= 12.5 et 12 Hz, IH: 4 β.), 3.54 et 3.64 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 4.17 (dd, J= 7 et 6 Hz, IH: 3 α), 4.49 (d large, J≈ 13.5 Hz: IH: 5 ε.), de 4.70 à 4.80 (mt, 3H: 2α - 5 α et 4 α), 4.84 (dd, J=10 et 1.5 Hz, IH: la), 5.51 (d, J= 7 Hz, IH: 6 a), 5.73 (mt, IH: lβ), 6.65 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7.22 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), de 7.20 à 7.40 (mt, 7H: H Aromatiques 6 - l' H ₄ et l' H ₅ ), 7.87 (d, J=4 Hz, IH: l' H _j ), 8.55 (mf, IH: NH 6), 8.55 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 11.70 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1 , 3 mg de 5γ-hydroxy 4ζ-méthylthio-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine I JJ sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrite ci-dessus en gardant la proportion d'acétonitrile de la phase éluante à 45%.

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): on observe un isomère nettement majoritaire: le -OH en 57 en position axiale. 0.37 (d mt, J= 16 Hz, IH, 5 β-,), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), de 1.20 à 1.45 (mt, 2H: 3 β ₂ et 3 7-,), 1.31 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.40 à 1.85 (mt, 5H: 3 _λ - C^ 2 β et CH _j 5 δ), 1.98 (mt, IH, 3 &), 2.17 (d, J= 16 Hz, IH: 5 β,), 2.50 (s, 3H: SCH ₃ ), 2.77 (dt, J= 13.5 et 2 Hz, IH: 5 ε _∑ .), 2.99 (dd, J= 12 et 4 Hz, IH: 4 β^, 3.11 (t, J= 12 Hz, IH: 4 βi), de 3.45 à 3.70 (mt, 2H: CH ₂ 3 δ), 3.73 (mt, IH: 57 en position équatoriale), 4.13 (t, J= 7 Hz, IH, 3 α), 4.37 (d large, J= 13.5 Hz, IH: 5 ε.), de 4.75 à 4.95 (mt, 3H: 2α - 4 α et 5 a), 4.89 (dd, J= 10 et 1 Hz, IH: la), 5.70 (d, J= 8 Hz, IH: 6 a), 5.80 (dq,

J= 7.5 et 1 Hz, IH: lβ), 6.37 (d, J= 5 Hz, IH: NH 4), 6.71 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), 7.10 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7.22(d, J= 8 Hz, 2H: 4 ε), de 7.20 à 7.40 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.43 (dd, J= 8.5 et 1.5 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.47 (dd, J= 8.5 et 4 Hz, IH: l' H,,), 7.89 (dd, J = 4 et 1.5 Hz, IH: l' H,), 8.55 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 9.15 (d, J= 8 Hz, IH: NH 6), 11.70 (s, IH: OH).

EXEMPLE 6: Préparation de la 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. et de la 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ.

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 5 g/1 dans la soude 0.1N de 4-méthylphénylalanine (R,S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1^ sont regroupées et évaporées. On obtient 49 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 6 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 44 mg de 4ζ-mé yl-dés(4ζ-dimémylamino) pristinamycine IA.- Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.52 (dd,

J= 16 et 6 Hz, IH, 5 β-), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH _3. 27), 1.15 (mt, IH: 3 β,), del.20 à 1.40 (mt, IH: 37 ₂ ), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 7. et CH ₂ 2 β), 2.04 (mt, IH, 3 β,), 2.18 (mt, IH, 5 δ ₂ ), de 2.25 à 2.45 (mt, 2H: 5 δ, et 5 β _j ), 2.36 (s, 3H: ArCH ₃ ), 2.83 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 εj, 2.99 (dd, J= 13 et 4 Hz, IH: 4 _j ), 3.28 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.31 et 3.59 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 3.40 (t, J=

13 Hz, IH: 4 β.), 4.59 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.74 (dd large, J= 13 et 7 Hz, IH: 5 ε,), 4.85 (mt, IH: 2α), 4.89 (d large, J= 10 Hz, IH: la), de 5.25 à 5.35 (mt, 2H: 5 α et 4 α), de 5.85 à 5.95 (mt, 2H: 6 α et lβ), 6.52 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.14 (AB limite, J= 9 Hz, 4H: 4δ et 4ε), de 7.15 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.50 (mt, 2H: V H ₄ et l' H ₅ ), 7.81 (dd, J = 4 et 2Hz, IH: l' H^, 8.41 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.74 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.63 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IH» 21 mg de 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IH (spectrométrie de masse: M+H ⁺ = 810) sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 7: Préparation de la 4ζ-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine l .

On réalise à l'échelle de 12 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 5 g/1 dans la soude 0,1N de 4-méthoxyphénylalanine (R,S). Au terme de 40 h de culture, les 0,35 litres de moût issus de 12 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1^ sont regroupées et évaporées. On obtient 14 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi- préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 12 mg de 4ζ-méthoxy-dés(4ζ-diméth.ylamino) pristinamycine IA _. -

Spectre de R.M.N. H (400 MHz, CDCI3, d en ppm, réf. TMS): 0.63 (dd, J= 16 et 5.5 Hz, IH, 5 fâ, 0.96 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH3 27), 1.17 (mt, IH: 3 , del.30 à 1.45 (mt, IH: 3 72), 1-38 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.55 à 1.85 (mt, 3H: 3 71 et CH ₂ 2 β), 2.05 (mt, IH, 3 βi), 2.20 (mt, IH, 5 62), 2.40 (d large, J= 16 Hz, IH: 5 δi), 2.47 (d, J= 16 Hz, IH: 5 βi), 2.88 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 ε2<), 2.99 (dd, J= 12.5 et 5 Hz, IH: 4 fâ, 3.30 (s, 3H: NCH3 4), 3.32 et 3.60 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 3.40 (t, J= 12.5 Hz, IH: 4 βj), 3.80 (s, 3H: OCH3), 4.60 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.80 (dd large, J= 13 et 8.5 Hz, IH: 5 εi), 4.88 (mt, IH: 2α), 4.92 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.31 (dd, J= 12.5 et 5 Hz, IH: 4 a), 5.34 (d large, J= 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.90(d, J= 9 Hz, IH: 6 α), 5.93 (q large, J= 7.5 Hz, IH: lβ), 6.54 (d, J= 9 Hz, IH: NH 2), 6.87 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 7.16 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.40 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.50 (mt, 2H: l' H5 et l' H4), 7.80 (dd, J = 4 et 2.5 Hz, IH: l' H ₆ ), 8.43 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.78 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).

EXEMPLE 8: Préparation de la 4ζ-méthoxycarbonyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine 1^.

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 de ^j φ-méthoxycarbonylphénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 24 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichloroméhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichloroméhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine I^. sont regroupées et évaporées. On obtient 14 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi- préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de

dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 9 mg de 4ζ-mé oxyc__rbonyl-dés(4ζ-dimémylamino) pristinamycine IA _. -

Spectre de R.M.N. ^' H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.70 (dd, J= 16 et 6 Hz, IH, 5 β;,), 0.93 (t, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 1.08 (mt, IH: 3 β ₂ ), de 1.30 à 1.40 (mt, IH: 37 ₂ ), 1.33 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.55 à 1.85 (mt, 3H: 3 . et CH, 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 ft), 2.13 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.40 (d large, J= 16.5 Hz, IH: 5 Ô^, 2.48 (d, J=16 Hz, IH, 5 ft), 2.89 (dt, J= 14.5 et 4.5 Hz, IH: 5 εj, 3.10 (dd, J= 13.5 et 6 Hz, IH: 4 β ₂ ), 3.24 (s ,3H: NCH ₃ 4), 3.38 et 3.61 (2 mts, IH chacun: CR _j 3 δ), 3.47 (t, J= 13.5 Hz, IH: 4 fr), 3.96 (s, 3H: COOCH ₃ ), 4.55 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.78 (dd large, J= 14.5 et 8 Hz, IH: 5 ε,), 4.86 (mt, IH: 2α), 4.89 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.33 (d large, J= 6 Hz, IH: 5 α), 5.42 (dd, J= 13.5 et 6 Hz, IH: 4 α), 5.92 (d 0= 9.5 Hz) et mt, IH chacun: respectivement 6 α et lβ), 6.52 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), de 7.15 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.28 (d, J= 8 Hz, 2H: 4δ), 7.43 (dd, J= 9 et 1.5 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.47 (dd, J= 9 et 5 Hz, IH: l' H ₅ ), 7.66 (d, J = 5 et 1.5 Hz, IH: l' H^, 7.98 (d, J= 8 Hz, 2H: 4ε), 8.38 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.70 (s, IH: OH).

EXEMPLE 9: Préparation de la 4ζ-chloro-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine lj .

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude 0,1N de 4-chlorophénylalanine (R,S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine l ^ sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate

100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 1 mg de 4ζ-chloro-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^.- Spectre de R.M.N. ⁱ H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.93 (t, J=

7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 0.95 (dd, J= 16 et 5 Hz, IH, 5 β,), 1.09 (mt, IH: 3 _j ), de 1.20 à 1.40 (mt, IH: 37 ₂ ), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 37. et CH ₂ 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 fr), 2.17 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.43 (d large, J= 16 Hz, IH: 5 Ô- , 2.59 (d, J=16 Hz, IH, 5 β.), 2.90 (dt, J= 13.5 et 4 Hz, IH: 5 ε^, 3.04 (dd, J= 13 et 6 Hz, IH: 4 β _; ,), 3.21 (s, 3H: 4 NCH ₃ ), 3.36 (t, J= 13 Hz, IH: 4 β,), 3.39 et 3.59 (2 mts, IH chacun: Cl^ 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.76 (dd large, J= 13.5 et 8 Hz, IH: 5 εj, 4.86 (mt, IH: 2α), 4.87(d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.38 (mt, 2H: 5 a et 4 a), 5.93 (mt, 2H: 6 a et lβ), 6.52 (d, J= 10 Hz, IH: NH 2), 7.12 (d, J = 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.35 (mt, 7H: H Aromatiques 6 et 4ε), 7.38 (dd, J= 9 et 4.5 Hz, 1H.1' H ₅ ), 7.43 (d large, J= 9 Hz, 1H:1' H ₄ ), 7.68 (dd, J = 4.5 et 1 Hz, IH: 1* H^, 8.36 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.75 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).

EXEMPLE 10: Préparation de la 4ζ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^ et de la 4ζ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJI-

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude 0.1N de 4-bromophénylalanine (R,S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers.de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine 1^. sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 6 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm OMacherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon

phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 6 mg de 4ξ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine 1^. Spectre de R.M.N. ^» H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.93 (t, J= 7.5

Hz, 3H: CH ₃ 27), 0.95 (dd, J= 16 et 5 Hz, IH, 5 β;,), 1.10 (mt, IH: 3 β-), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), 1.36 (mt, IH: 3 7 ₂ ), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 . et CH ₂ 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 ft), 2.18 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.43 (d large, J= 16 Hz, IH: 5 Ô,), 2.59 (d, J=16 Hz, IH, 5 β _j ), 2.90 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 ε,), 3.02 (dd, J= 13 et 5.5 Hz, IH: 4 β,), 3.21 (s, 3H: 4 NCH ₃ ), 3.33 (dd, J= 13 - 11 Hz, IH: 4 β.), 3.39 et 3.59 (2 mts, IH chacun: CIL, 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.76 (dd large, J= 13 et 7 Hz, IH: 5 ε^, 4.86 (mt, IH: 2α), 4.89 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.37 (d large, J= 5 Hz, IH: 5 α), 5.39 (dd, J= 11 et 5.5 Hz, IH: 4 α), 5.92 (mt, 2H: 6 α et lβ), 6.56 (d, J= 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.08 (d, J = 8 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.35 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.40 (mt, 4H: l' H ₄ - l' H ₅ et 4ε), 7.70 (d large, J = 5 Hz, IH: l' H _g ), 8.40 (d, J= 10 Hz, IH: NH 1), 8.77 (d, J= 9 Hz, IH: NH 6), 11.68 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IJJ, 3 mg de 4ζ-bromo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IJJ (spectrométrie de masse: M+H ⁺ ≈ 874) sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 11: Préparation de la 4ζ-iodo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA et de la 4ζ-iodo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I}].

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude de 4-iodophénylalanine (R,S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le

dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 6 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 12 mg de 4ζ-iodo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA- Spectre de R.M.N. ^l H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.93 (t, J=

7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 0.95 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β ₂ ), 1.10 (mt, IH: 3 β ₂ ), 1.35 (d, J= 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), 1.38 (mt, IH: 3 7 ₂ ), de 1.55 à 1.85 (mt, 3H: 3 γ. et CH ₂ 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 fr), 2.17 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.43 (d large, J≈ 16.5 Hz, IH: 5 δ,), 2.60 (d, J=16 Hz, IH, 5 β,), 2.89 (dt, J= 14 et 4.5 Hz, IH: 5 ej, 3.02 (dd, J≈ 13 et 5.5 Hz, IH: 4 β-), 3.21 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.31 (dd, J= 13 et 11 Hz, IH: 4 β.), 3.39 et 3.59 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 4.53 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.75 (dd large, J= 14 et 8 Hz, IH: 5 ε.), 4.83 (mt, IH: 2α), 4.88 (d large, J≈ 10 Hz, IH: la), 5.37 (d large, J= 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.39 (dd, J≈ 11 et 5.5 Hz, IH: 4 α), 5.92 (mt, 2H: 6 α et lβ), 6.54 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 2), 6.94 (d, J = 7.5 Hz, 2H: 4δ), de 7.15 à 7.50 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.36 (dd, J = 9 et 4 Hz, IH: 1 ^* H ₅ ), 7.43 (d large, J≈ 9 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.62 (d, J≈ 7.5 Hz, 2H: 4ε), 7.68 (d, J = 4 Hz, IH: l' H^, 8.38 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J≈ 9 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IJJ» 6 mg de 4ζ-iodo-dés(4ζ-dimé ylamino) pristinamycine Ij (spectrométrie de masse: M+H ⁺ = 922) sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 12: Préparation de la 4ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine I et de la 4ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine Ijj.

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 5 g/1 dans la soude 0,1N de 4-trifluorométhylphénylalanine (S).

Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 5 mg de 4ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ-dimémyl__mino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.86 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β ₂ ), 0.91 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 1.13 (mt, IH: 3 β,), 1.31 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), 1.42 (mt, IH: 37 ₂ ), de 1.55 à 1.80 (mt, 3H: 3 7 _! et CH, 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 &), 2.15 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.40 (d large, J≈ 16.5 Hz, IH: 5 δ,), 2.55 (d, J=16 Hz, IH, 5 β.), 2.88 (dt, J= 14 et 4 Hz, IH: 5 εj, 3.18 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.20 et 3.31 (2 dd, respectivement J≈ 13 et 6 Hz et J≈ 13 et 10 Hz,, IH chacun: 4 fa et 4 β^, 3.42 et 3.60 (2 mts, IH chacun: CIL, 3 δ), 4.50 (t, J= 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.73 (dd large, J≈ 14 et 7.5 Hz, IH: 5 ε,), 4.83 (mt, IH: 2α), 4.91 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.40 (d large, J≈ 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.55 (dd, J≈ 10 et 6 Hz, IH: 4 α), 5.87 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: 6 α), 5.90 (q large, J≈ 7.5 Hz, lH:lβ), 6.68 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 2), de 7.15 à 7.40 (mt, 9 H: 4δ - H Aromatiques 6 - l' H ₅ et l' H ₄ ), 7.52 (d, J≈ 8 Hz, 2H: 4ε), 7.68 (d, J = 4 et 1.5 Hz, IH: l' H _j ), 8.43 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.76 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.70 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine Ifj, 4 mg de ζ-trifluorométhyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IJJ (spectrométrie de masse: M+H ⁺ = 864) sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 13: Préparation de la 4ζ-tert-butyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I -

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 5 g/1 dans la soude 0,1N de 4-tert-butylphénylalanine(R,S) synthétisée comme à l'exemple 35-1. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 30 mg de 4ζ- tert-butyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS, réf. TMS): 0.21 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.91 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 1.17 (mt, IH: 3 β _j ), del.20 à 1.40 (mt, IH: 3 7 ₂ ), 1.33 (s, 9H: CH ₃ du tert-butyle), 1.35 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 7. et CH ₂ 2 β), 2.04 (mt, IH, 3 fr), 2.13 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.30 (mt, 2H: 5 δ. et 5 fr), 2.80 (dt, J≈ 13 et 4 Hz, IH: 5 εj, 3.00 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 β^, 3.29 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.31 et 3.59 (2 mts, IH chacun: CI^ 3 δ), 3.40 (t, J≈ 12 Hz, IH: 4 fr), 4.57 (t, J≈ 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.74 (dd large, J≈ 13 et 7 Hz, IH: 5 ε.), 4.85 (mt, IH: 2α), 4.90 (d large, J= 10 Hz, IH: la), 5.21 (d large, J≈ 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.25 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 α),-5.87(d, J≈ 9 Hz, IH: 6 α), 5.92 (q large, J≈ 7.5 Hz, IH: 1

IH: l' H^, 8.45 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.74 (d, J≈ 9 Hz, IH: NH 6), 11.65 (s, IH: OH).

EXEMPLE 14: Préparation de la 4ζ-isopropyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA _* et de la 4ζ-isopropyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IE-

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude 0,1N de 4-isopropylphénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 36-1. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. On obtient 61 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 9 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 3 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 51 mg de 4ξ-isopropyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. * H (250 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS, réf. TMS): 0.31 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β,), 0.91 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), de 1.00 à 1.45 (mt, 2H: 3 feet 3 7 ₂ ), 1.25 (d, J≈ 7.5 Hz, 6H: CH ₃ de l' isopropyle), 1.35 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 y _r et CIL, 2 β), de 1.95 à 2.20 (mt, 2H, 3 β. et 5 δ ₂ ), 2.30 (mt, 2H: 5 à _r et 5 ), 2.80 (dt, J= 13 et 4 Hz, IH: 5 εj, 2.88 (mt, IH: CH de l' isopropyle), 2.98 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 β,), 3.30 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.32 et 3.55 (2 mts, IH chacun: CIL, 3 δ), 3.38 (t, J≈ 12 Hz, IH: 4 β.), 4.55 (t, J≈ 7.5 Hz,

IH, 3 a), 4.72 (dd large, J≈ 13 et 7 Hz, IH: 5 ε ₂ ), 4.85 (mt, IH: 2α), 4.88 (d large, J≈ 10 Hz, IH: la), 5.21 (d large, J≈ 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.25 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 α), 5.87(d, J≈ 9 Hz, IH: 6 α), 5.90 (q large, J≈ 7.5 Hz, IH: lβ), 6.50 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 2), de 7.05 à 7.35 (mt, 9H: H Aromatiques 6 - 4ε et 4δ), 7.50 (mt, 2H: l' H ₅ et l' H ₄ ), 7.86 (dd, J = 4 et 1.5 Hz, IH: l' H^, 8.40 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.72 (d, J≈ 9 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).

A partir des mêmes fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant également le nouveau dérivé de pristinamycine IE , 5 mg de ζ-isopropyl- dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IE sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.20 (mt, IH, 5 β,), 0.92 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 2 7), de 1.15 à 1.40 (mt, 2H: 3 β- et 3 7 ₂ ), 1.24(d, J≈ 7.5 Hz, 6H: CH ₃ de l'isopropyle), 1.34 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.35 à 2.05 (mt, 9H: 3 γ, - 3 fr - C 2 β - CR, 5 δ - CH ₂ 57 et 5 β..), 2.45 (dt, J≈ 13 et 1.5 Hz, IH: 5 8 ₂ ), 2.89 (mt, IH: ArCH), 3.09 (dd, J≈ 14 et 7 Hz, IH: 4 β,), 3.17 (s, 3H: NCH ₃ 4),3.25 (dd, J≈ 14 et 9 Hz, IH: 4 β.), 3.32 et 3.52 (2 mts, IH chacun: CR, 3 δ), 4.55 (mt, 2H: 3 α et 5 ε.), 4.80 (mt, IH: 2α), 4.89 (dd, J=10 et 1.5 Hz, IH: la), 4.90 (mt, IH: 5 a), 5.35 (dd, J≈ 9 et 7 Hz, IH: 4 a), 5.60 (d, J≈ 8 Hz, IH: 6 a), 5.89 (dq, J= 7.5 et 1.5 Hz, IH: lβ), 6.65 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 2), 7.08 (d, J≈ 8 Hz, 2H: 46), 7.14 (d, J≈ 8 Hz, 2H: 4ε), de 7.20 à 7.40 (mt, 7H: H Aromatiques 6 - l' H ₄ et l' H ₅ ), 7.77 (d large, J=4 Hz, IH: l' H _j ), 8.46 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.48 (d, J≈ 8 Hz, IH: NH 6),11.70 (s, IH: OH).

EXEMPLE 15 : Préparation de la 48-méthylamino-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA-

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans l'eau de 3-méthylaminophénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 35-3. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases

chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. On obtient 19 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 8 mg de 4ε-méthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.93 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), 1.00 (dd, J≈ 16 et 6 Hz, IH, 5 β-,), 1.17 (mt, IH: 3 βa), de 1.25 à 1.40 (mt, 2H: 37 ₂ ), 1.35 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 17), de 1.55 à 1.80 (mt, 3H: 3 y. et CH ₂ 2 β), 2.03 (mt, IH, 3 β,), 2.23 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.39 (d large, J≈ 16 Hz, IH: 5 δ,), 2.52 (d, J≈ 16 Hz, IH: 5 β _j ), 2.78 (s, 3H: ArNCH ₃ 4), 2.85 (dt, J≈ 13 et 4 Hz, IH: 5 ε-), 2.99 (dd, J≈ 13 et 4.5 Hz, IH: 4 β ₂ ), 3.23 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.25 (t, J≈ 13 Hz, IH: 4 β^, 3.38 et 3.58 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 4.05 (mf, IH: ArNH), 4.58 (dd, J≈ 6.5 et 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.76 (dd large, J≈ 13 et 8 Hz, IH: 5 ε , 4.85 (mt, IH: 2α), 4.87 (d large, J≈ 10 Hz, IH: la), 5.35 (dd, J≈ 13 et 4.5 Hz, IH: 4 a), 5.38 (d large, J≈ 6 Hz, IH: 5 α), 5.90 (d, J=9.5 Hz, IH: 6 α), 5.91 (mt, IH: lβ), 6.36 (s large, IH: H 2 de l' aromatique en 4), de 6.45 à 6.55 (mt, 2H: H 4 et H 6 de l' aromatique en 4), 6.53 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 2), 7.12 (t, J≈ 8 Hz, IH: H 5 de 1* aromatique en 4), de 7.15 à 7.45 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.35 (mt, 2H: l' H ₄ et l' H ₅ ), 7.75 (t, J = 3 Hz, IH: l' H^, 8.40 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.78 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).

EXEMPLE 16: Préparation de la 4ε-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A et de la 4ε-méthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I H.

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1

ml d'une solution à 5 g/1 dans la soude 0,1N de 3-méthoxyphénylalanine (S). Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. On obtient 41 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 6 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en 2 fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 28 mg de 4ε-méthoxy-dés(4ζ-diméthyl_u_r_ino) pristinamycine I A.

Spectre de R.M.N. ^" H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.52 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β _; ,), 0.90 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 27), de 1.10 à 1.34 (mt, 2H: 3 β ₂ et 3 7 ₂ ), 1.34 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 17), de 1.50 à 1.80 (mt, 3H: 3 y _r et CR, 2 β), 2.04 (mt, IH, 3 ft), 2.20 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.35 (d large, J≈ 16 Hz, IH: 5 δ..), 2.38 (d, J≈ 16 Hz, IH: 5 β.), 2.83 (dt, J≈ 13 et 4 Hz, IH: 5 εj, 2.97 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 β,), 3.28 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.28 et 3.56 (2 mts, IH chacun: CI^ 3 δ), 3.40 (t, J≈ 12 Hz, IH: 4 β _j ), 3.80 (s, 3H: OCH ₃ ), 4.58 (t, J≈ 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.76 (dd large, J≈ 13 et 8 Hz, IH: 5 ε _λ ), 4.85 (mt, IH: 2α), 4.90 (d large, J≈ 10 Hz, IH: la), 5.27 (dd, J≈ 12 et 4 Hz, IH: 4 a), 5.30 (d large, J≈ 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.89 (d, J≈ 9.5Hz, IH: 6 α), 5.91 (q large, J≈ 7.5 Hz, IH: lβ), 6.51 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 2), de 6.80 à 6.90 (mt, 3H: H 2 - H 4 et H 6 de l' aromatique en 4), de 7.15 à 7.40 (mt, 6H: H 5 de l' aromatique en 4 et H Aromatiques 6), 7.45 (d large, J≈ 9 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.50 (dd, J≈ 9 et 4 Hz, 1H:1' H ₅ ), 7.80 (d large, J = 4 Hz, IH: l' H^, 8.40 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.73 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.62 (s, IH: OH).

A partir des fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant le nouveau dérivé de pristinamycine I H, 7 mg de 4ε-méthoxy-dés(4ζ-

diméthylamino) pristinamycine I H (spectrométrie de masse: M+H ⁺ = 826)sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 17: Préparation de 4ε-fluoro 4ζ-méthyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine I A.

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 10 g/1 dans la soude 0,1N de 3-fluoro 4-méthylphénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 34-5. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. On obtient 15 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 9 mg de 4ε-fluoro 4ζ-méthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A.

Spectre de R.M.N. ¹ H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0.60 (dd, J≈ 16 et 5.5 Hz, IH, 5 β^, 0.91 (t, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 2 7), 1.12 (mt, IH: 3 β-), de 1.25 à 1.35 (mt, IH: 37 ₂ ), 1.33 (d, J≈ 7.5 Hz, 3H: CH ₃ 1 7), de 1.50 à 1.85 (mt, 3H: 3 , et CR _j 2 β), 2.02 (mt, IH, 3 β.), 2.13 (mt, IH, 5 δ ₂ ), 2.27 (s, 3H: ArCH ₃ ), 2.36 (d large, J≈ 16 Hz, IH: 5 δ.), 2.45 (d, J≈ 16 Hz, IH: 5 fr), 2.85 (dt, J≈ 13 et 4.5 Hz, IH: 5 ε-), 2.97 (dd, J≈ 12.5 et 4.5 Hz, IH: 4 β,), 3.23 (s, 3H: NCH ₃ 4), 3.30 et 3.56 (2 mts, IH chacun: CH ₂ 3 δ), 3.37 (t, J≈ 12.5 Hz, IH: 4 β,), 4.55 (t, J≈ 7.5 Hz, IH, 3 α), 4.75 (dd large, J≈ 13 et 8 Hz, IH: 5 ε.), 4.83 (mt, IH: 2α), 4.89 (d large, J≈ 10 Hz, IH: la), 5.29 (dd, J≈ 12.5 et 4.5 Hz, IH: 4 a), 5.32 (d large, J≈ 5.5 Hz, IH: 5 α), 5.89 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: 6 α), 5.92 (mt, IH: lβ), 6.49 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 2), 6.90

(mt, 2H: H 2 et H 6 de l' aromatique en4), 7.11 (t, J≈ 8 Hz, IH: H 5 de l' aromatique en 4), de 7.10 à 7.30 (mt, 5H: H Aromatiques 6), 7.43 (dd, J≈ 8.5 et 1 Hz, IH: l' H ₄ ), 7.49 (dd, J≈ 8.5 et 4.5 Hz, IH: l' H ₅ ), 7.75 (dd, J = 4.5 et 1Hz, IH: l' H _g ), 8.48 (d, J≈ 10 Hz, IH: NH 1), 8.70 (d, J≈ 9.5 Hz, IH: NH 6), 11.60 (s, IH: OH).

EXEMPLE 18 : Préparation de la 4ζ-éthylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I

On réalise à l'échelle de 50 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de dichlorhydrate de 4- éthylaminophénylalanine (R,S) synthétisé comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 1,5 litres de moût issus de 50 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-éthylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 65% eau et 35% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-éthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 10 mg de 4ζ-éthylam o-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. - H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,72 (dd, J = 16 et 6 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,15 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; de 1,20 à 1,40 (mt, IH : IH du CH ₂ en 37) ; 1,27 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; de 1,50 à 1,65 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 7) ; 1,60 et 1,74 (2 mts, IH chacun : CH ₂ en 2 β) ; 2,02 (mt,

IH : l'autre H du CR, en 3 β) ; 2,21 et 2,33 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CI^ en 5 δ) ; 2,40 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CR^ en 5 β) ; 2,82 (dt, J = 13 et 4,5 Hz, IH : IH du CH- en 5 ε) ; 2,89 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CIL _, en 4 β) ; 3,10 (mt, 2H : NCR, de l'éthyle) ; de 3,20 à 3,35 (mt, IH : IH du CH^ en 3 δ) ; 3,26 (s, 3H : NCR,) ; 3,31 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,54 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 δ) ; 3,67 (mf, IH : NH) ; 4,56 (dd, J = 6,5 et 7 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,90 (d large, J = 10 Hz, IH : 1 α) ; 5,24 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,32 (d large, J = 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,52 (d, J = 8 Hz, 3H : NH en 2 et H Aromatiques en 4 ε) ; 7,00 (d, J ≈ 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,46 (AB limite, 2H : l' H ₄ et l' H^ ; 7,84 (dd, J = 4 et 1 Hz, IH : l' H^ ; 8.45 (d. J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,77 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,65 (s, IH : OH).

EXEMPLE 19 : Préparation de la 4ζ-diéthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine I

On réalise à l'échelle de 50 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h del ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de dichlorhydrate de 4- -Uéthylaminophénylalanine (R,S) synthétisé comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 1,5 litres de moût issus de 50 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-diéthylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en deux fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 68% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 32% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ- diéthylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites

par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 50 mg de 4ζ-diéthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. ^l H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,65 (dd, J = 16 et 6 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 7) ; 1,14 (t, J = 7 Hz, 6H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,15 (mt, IH : IH du CR, en 3 β) ; 1,26 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 7) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; 1,55 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 7) ; 1,63 et 1,75 (2 mts, IH chacun : CI^ en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 β) ; 2,22 et 2,31 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CR, en 5 δ) ; 2,37 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH- en 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 et 4,5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 ε) ; 2,89 (dd, J = 12.5 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 4 β) ; de 3,20 à 3,40 (mt, 6H : NCR, de l'éthyle - IH du CR, en 3 δ et l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,27 (s, 3H : NCH _j ) ; 3,55 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 δ) ; 4,58 (dd, J = 8 et 6 Hz, IH : 3 α) ; 4,76 (dd large, J = 13 et 7,5 Hz, IH : l'autre H du CH-. en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,21 (dd, J = 12,5 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,28 (d large, J = 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,87 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,52 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 2) ; 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,46 (AB limite, 2H : l' H ₄ et l' H) ; 7,88 (dd, J = 4,5 et 2,5 Hz, IH : l' H^ ; 8,43 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,76 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 20 : Préparation de la 4ζ-diaUylamino-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA

On réalise à l'échelle de 94 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g1 dans l'eau de dichlorhydrate de 4-diaUylaminophénylalanine (R,S) synthétisé comme à l'exemple 38-1 . Au terme de 40 h de culture, les 2,8 litres de moût issus de 94 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une

colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-di__Uylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-di__Uyl__mino-dés (4ζ-diméthylamino) IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 15 mg de 4ζ-di_-Uyl-_mino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,55 (dd, J = 16 et 6 Hz, IH : IH du CH2 en 5 β) ; 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH3 en 2 7) ; 1,18 (mt, IH : IH du CH2 en 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH du CH2 en 3 7) ; 1,34 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH3 en 1 7) ; 1,59 (mt, IH : l'autre H du CH2 en 3 7) ; 1,68 et 1,78 (2 mts, IH chacun : CH2 en 2 β) ; 2,04 (mt, IH : l'autre H du CH2 en 3 β) ; 2,25 et 2,34 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH2 en 5 δ) ; 2,40 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH2 en 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 et 4,5 Hz, IH : IH du CH2 en 5 ε) ; 2,92 (dd, J ≈ 12 et 4 Hz, IH : IH du CH2 en 4 β) ; de 3,20 à 3,30 (mt, IH : IH du CH2 en 3 δ) ; 3,29 (s, 3H : NCH3) ; 3,33 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH2 en 4 β) ; 3,57 (mt, IH : l'autre H du CH2 en 3 δ) ; 3,93 (AB limite, 4H : NCH2 de l'allyle) ; 4.60 (dd, J = 8 et 6,5Hz, IH : 3 α) ; 4,78 (dd large, J = 13 et 7,5 Hz, IH : l'autre H du CH2 en 5 ε) ; 4.87 (mt, IH : 2 α) ; 4,92 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; de 5,10 à 5,25 (mt, 5H : 4 α et =Œ_2 de l'allyle) ; 5,28 (d large, J ≈ 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,85 (mt, 2H : CH≈ de l'allyle) ; 5,92 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,94 (mt, IH : 1 β) ; 6,54 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,65 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,05 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,51 (AB limite, 2H : IΗ4 et l' H5) ; 7,88 (dd, J = 4 et 2 Hz, IH : l' He) ; 8,43 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,77 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,65 (s, IH : OH).

EXEMPLE 21 : Préparation de la 4ζ-allyléthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA

On réalise à l'échelle de 26 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de dichlorhydrate de 4- __Uyléthylanunophénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 39-4. Au terme de 40 h de culture, les 0,78 litre de moût issus de 26 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-_ιUyléthyl__mino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et -48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-aUyléthyl._mmo-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 20 mg de 4ζ- allyléthylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,58 (dd, J = 16 et 6 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,16 (t, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,16 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 7) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz. 3H : CH ₃ en 1 7) ; 1,54 (mt, IH : l'autre H du CIL, en 3 7) ; 1,63 et 1,75 (2 mts, IH chacun : CH- en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 β) ; 2,23 et 2,31 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH ₂ en 5 δ) ; 2,37 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 et 4,5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 ε) ; 2,87 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; de 3,15 à 3,30 (mt, IH : IH du CR, en 3 δ) ; 3,26 (s, 3H : NCHj) ; 3,30 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,36 (mt, 2H : NCR, de l'éthyle) ; 3,54 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 δ) ; 3,90 (AB limite, 2H : NCH ₂ de l'allyle) ; 4,57 (dd, J ≈ 8 et 6 Hz, IH : 3 α) ; 4,76 (dd large, J = 13 et 7,5 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; de 5,05 à 5,20 (mt, 3H : 4 α et ≈CR, de l'allyle) ; 5,27 (d large, J = 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,83 (mt, IH : CH≈ de l'allyle) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,91 (mt, IH : 1 β) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,60 (d,

J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,02 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,47 (AB limite, 2H : 1" H ₄ et l' H^ ; 7,88 (dd, J = 4 et 2 Hz, IH : l' H^ ; 8,41 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,75 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 22 : Préparation de la 4ζ-éthyl propylamino-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de dichlorhydrate de 4- éthylpropylaminophénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 39-6. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-éthyl propylamino-dés (4ζ- diméthyl-imino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 63% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 37% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-éthyl propylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine ÏA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 16 mg de 4ζ-éthyl propylamino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA- Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,67 (dd, J =

16 et 6 Hz. IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 7) ; 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ du propyle) ; 1,14 (t, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,15 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 7) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; de 1,45 à 1,65 (mt, 3H : l'autre H du CH;, en 3 7 et CH ₂ propyle) ; 1,63 et 1,75 (2 mts, IH chacun : CR, en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR ₂ en 3 β) ;

2,23 et 2,33 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH^ en 5 δ) ; 2,37 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH-, en 5 β) ; 2,80 (dt, J = 13 et 5 Hz, IH : IH du CH _j en 5 ε) ; 2,89 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 4 β) ; de 3,10 à 3,25 (mt, 3H : IH du CR. en 3 δ et NCRj du propyle) ; 3,26 (s, 3H : NCH ₃ ) ; de 3,25 à 3,40 (mt, 2H : NCR, de l'éthyle) ; 3,34 (t, J ≈ 12 Hz, IH : l'autre H du CR, en 4 β) ; 3,54 (mt, IH : l'autre H du CR _* en 3 δ) ; 4,57 (dd, J = 7,5 et 6 Hz, IH : 3 α) ; 4,76 (dd large, J = 13 et 7,5 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et l Hz, IH : l a) ; 5,21 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 a) ; 5,28 (d large. J ≈ 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,91 (mt, IH : 1 β) ; 6,48 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,60 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,03 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,47 (AB limite, 2H : l' H ₄ et l' H^ ; 7,89 (mt, IH : V HJ ; 8,42 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,76 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 23 : Préparation de la 4ζ-trifluorométhoxy-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::ρVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g 1 dans l'eau de chlorhydrate de 4-O-trifluorométhyltyrosine (R.S) synthétisé comme à l'exemple 34-8. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-trifluorométhoxy-dés (4ζ-diméftyl-_mino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté en deux fois sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-trifluorométhoxy-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de

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63

dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 46,5 mg de 4ζ-trifluorométhoxy-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,77 (dd, J = 16 et 5,5 Hz, IH : IH du CH;, en 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 7) ; 1,08 (mt. IH : IH du CΗ, en 3 β) ; de 1,30 à 1,40 (mt, IH : IH du CR, en 37) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ en 17) ; de 1,55 à 1,70 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 7) ; 1,65 et 1,76 (2 mts, IH chacun : CH-, en 2 β) ; 2,02 (mt. IH : l'autre H du CR en 3 β) ; 2,11 et 2,40 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CR, en 5 δ) ; 2,54 (d, J ≈ 16 Hz, IH : l'autre H du CR^en S β) ; 2,88 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du C ^ en 5 ε) ; 3,08 (dd, J = 12 et 5 Hz. IH : IH du CH ₂ en 4 β) ; 3,22 (s, 3H : NO ; de 3,30 à 3,45 (mt, IH : IH du CiL, en 3 δ) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,59 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 δ) ; 4,53 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,85 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et 1,5 Hz, IH : 1 α) ; 5,35 (d large, J = 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,41 (dd, J = 12 et 5 Hz, IH : 4 α) ; 5,92 (d, J = 10 Hz, IH : 6 α) ; 5,93 (mt, IH : 1 β) ; 6,53 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 2) ; de 7,15 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,16 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,26 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; 7,37 (dd, J ≈ 8,5 et 4 Hz, IH : l' H,) ; 7,42 (dd, J = 8,5 et 1,5 Hz, IH : l' H ₄ ) ; 7,70 (dd, J = 4 et 1,5 Hz, IH : V HJ ; 8,37 (d, J ≈ 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,75 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 6) ; 11,66 (s, IH : OH).

EXEMPLE 24 : Préparation de la 4ζ-allyloxy-dés (4ζ-di_néthylamino) pristinamycine I

On réalise à l'échelle de 90 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 gΛ dans l'acide chlorhydrique 0.1N de chlorhydrate de 4-O- allyltyrosine (S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 2,7 litres de moût issus de 90 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté

sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-allyloxy-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-allyloxy-dés (4ζ- climéthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 29 mg de 4ζ-allyloxy-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. ^» H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,63 (dd, J = 16 et 6 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,13 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; 1,29 (mt, IH : IH du CH ₂ en 37) ; 1,33 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CR, en 1 7) ; 1,57 (mt, IH : l'autre H du CR, en 37) ; 1,65 et 1,74 (2 mts, IH chacun : CH^ en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 β) ; 2,14 et 2,34 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH ₂ en 5 δ) ; 2,43 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,85 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du C^ en 5 ε) ; 2,95 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 4 β) ; 3,25 (s, 3H : NCH _j ) ; 3,33 (mt, IH : IH du 0 en 3 δ) ; 3,36 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CR, en 4 β) ; 3,56 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 δ) ; 4,51 (AB limite, 2H : OCR, de l'allyle) ; 4,56 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,88 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,27 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,32 (d large, J = 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,30 et 5,40 (respectivement mt et dd, J = 17 et 1,5 Hz, IH chacun : =CH ₂ de l'allyle) ; 5,89 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,91 (mt, IH : 1 β) ; 6,02 (mt, IH : CH= de l'allyle) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,85 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,45 (dd, J = 8,5 et 1,5 Hz, IH : l' B_) ; 7,57 (dd, J = 8,5 et 4 Hz, IH : l' H^ ; 7,77 (dd, J = 4 et 1,5 Hz, IH : l' H^ ; 8,41 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,74 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,63 (s, IH : OH).

EXEMPLE 25 : Préparation de la 4ζ-éthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A

On réalise à l'échelle de 90 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans l'acide chlorhydrique 0,1N de chlorhydrate de 4-O- éthyltyrosine (S) synthétisé comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 2,7 litres de moût issus de 90 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-éthoxy-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-éthoxy-dés (4ζ- d__méthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 29 mg de 4ζ-éthoxy-dés (4ζ-dimé ylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. ⁱ H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,64 (dd, J = 16 et 5,5 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 7) ; 1,12 (mt, IH : IH du CR, en 3 β) ; 1,25 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 7) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; 1,42 (t, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,57 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 7) ; 1,63 et 1,74 (2 mts, IH chacun : CH _j . en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH^ en 3 β) ; 2,16 et 2,35 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CIÎ ₂ en 5 δ) ; 2,43 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 ε) ; 2,93 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; de 3,15 à 3,30 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 δ) ; 3,24 (s, 3H : NCH _j ) ; 3,35 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,55 (mt, IH : l'autre H du CIL, en 3 δ) ; 3,95 (AB limite, 2H : OCH ₂ de l'éthyle) ; 4,56 (dd, J = 7,5 et 6 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,87 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,26 (dd, J ≈ 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,32 (d large, J = 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,88 (d, J = 10 Hz, IH : 6 α) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,48 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,83 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H : H

Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,44 (dd, J = 8,5 et 1,5 Hz, IH : l' H,) ; 7,57 (dd, J = 8,5 et 4,5 Hz, IH : V H _j ) ; 7,77 (dd, J = 4,5 et 1,5 Hz, IH : l' H^ ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,75 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 6) ; 11,60 (s, IH : OH).

EXEMPLE 26 : Préparation de la 4ζ-(2-chloroéthoxy) -dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans l'eau de chlorydrate de j4-O(2-chloroéthyl) tyrosine (S) synthétisé comme à l'exemple 42-1. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-(2-chloroéthoxy)-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-(2- chloroéthoxy)-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 3,2 mg de 4ζ-(2-chloroéthoxy)-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA- Spectre de R.M.N. ^» H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, ref. TMS): 0,66 (dd, J =

16 et 5,5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,13 (mt, IH : IH du CIL, en 3 β) ; 1,28 (mt, IH : IH du CIL, en 3 7) ; 1,33 (d, J ≈ 7 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; 1,57 (mt, IH : l'autre H du CHj en 3 7) ; 1,66 et 1,76 (2 mts, IH chacun : CH ₂ en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du C^ en 3 β) ; 2,16 et 2,37 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH ₂ en 5 δ) ; 2,47 (d, J = 16

Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,86 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : lH du C^ en S ε) ; 2,95 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; 3,23 (s, 3H : NCH ₃ ) ; 3,32 (mt, IH : IH du CR, en 3 δ) ; 3,37 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CR, en 4 β) ; 3,57 (mt. IH : l'autre H du CH _; , en 3 δ) ; 3.82 (t, J = 6 Hz, 2H : CR,C1) ; 4,19 (AB limite, 2H : OCR, de l'éthyle) ; 4,55 (dd, J = 7,5 et 7 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J ≈ 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,87 (d large, J = 10 Hz, IH : 1 α) ; 5,28 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,32 (d large, J = 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,88 (d, J = 10 Hz, IH : 6 α) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,50 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,86 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7,13 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,45 (AB limite, 2H : l' H ₄ et l' H _j ) ; 7,75 (dd, J = 4 et 2 Hz, IH : l' H _j ) ;-8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,74 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 27 : Préparation de la 4ζ-acétyl -dés 4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0.1N de 4-acétyl phénylalanine (S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-acétyl)- dés (4ξ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-acétyl-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est

lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 4,2 mg de 4ζ- acétyl-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, r f. TMS): 0,73 (dd, J ≈ 16 et 6 Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,12 (mt, IH : IH du CR, en 3 β) ; de 1,25 à 1,45 (mt, IH : IH du CR, en 3 7) ; 1,33 (d, J = 7 Hz, 3H : CR, en 1 7) ; 1,62 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 7) ; de 1,60 à 1,85 (mt, 2H : CH ₂ en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 β) ; 2,20 et 2,42 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CHj en 5 δ) ; 2,52 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 β) ; 2,60 (s, 3H : ArCOCH _j ) ; 2,88 (dt, J = 13 et 4,5 Hz, IH : IH du CR, en 5 ε) ; 3,13 (dd, J = 13,5 et 5,5 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; 3,21 (s, 3H : NCH _j ) ; de 3,30 à 3,50 (mt, IH : l'autre H du: C^ en 4 β) ; de 3,30 à 3,50 et 3,63 (2 mts. IH chacun : CH ₂ en 3 δ) ; 4,53 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,88 (dd. J = 10 et 1 Hz. IH : 1 a) ; 5.35 (d large, J = 6 Hz, IH : 5 α) ; 5,43 (dd, J = 10,5 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,90 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,56 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 2) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,28 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; 7,38 (dd, J = 8,5 et 2 Hz, IH : l' H^ ; 7,42 (dd, J = 8,5 et 4,5 Hz, IH : l' H _j ) ; 7,66 (dd, J = 4,5 et 2 Hz, IH : l' H^ ; 7,88 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,74 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,65 (s, IH : OH).

EXEMPLE 28 : Préparation de la 4ε-diméthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA-

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0.1N de dichlorhydrate de 3- dimémylaminophénylalaiiine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 35-10. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le

dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la -4ε-diméthylamino-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 57% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 43% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ε-diméthylamino-dés (4ζ-din éthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 1,1 mg de 4ε-diméthylaπ_ino-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. ¹ H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,63 (dd, J = 16 et 5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 β) ; 0,91 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; 1,13 (mt, IH : IH du CH- en 3 β) ; de 1,20 à 1,35 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 7) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH ₃ en 1 7) ; 1,57 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 37) ; 1,63 et 1,76 (2 mts, IH chacun : CR, en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 β) ; 2,08 et 2,31 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CH _j en 5 δ) ; 2,35 (d, J = 16 Hz, lH : rautre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,81 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : lH du CR, en 5 ε) ; 2,90 (s, 6H : N CR^) ; 2,97 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; de 3,20 à 3,30 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 δ) ; 3,28 (s, 3H : NCH _j ) ; 3,37 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CR, en 4 β) ; 3,57 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 δ) ; 4,58 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,74 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,86 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (d large, J = 10 Hz, IH : 1 α) ; 5,27 (dd, J ≈ 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,29 (d large, J = 5 Hz, IH : 5 α) ; 5,89 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,50 (d, J ≈ 10 Hz, IH : NH en 2) ; de 6,50 à 6,70 (mt, 3H : H Aromatiques en ortho et en para du diméthylamino) ; de 7,15 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,20 (t, J =

ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de chlorhydrate de 3- méthylthiophénylalanine (R,S) synthétisé comme à l'exemple 34-11. Au terme de 40 h de culture, les 1,68 litres de moût issus de 56 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 54% eau et 46% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 55% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 45% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 20 mg de -4ε-méthylthio-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,56 (dd, J = 16 et 5,5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 γ) ; 1,13 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; 1,28 (mt, IH : IH du CR _> en 3 γ) ; 1,32 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH ₃ en 1 γ) ; 1,58 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 γ) ; 1,62 et 1,74 (2 mts, IH chacun : CR, en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR _> en 3 β) ; 2,25 et 2,35 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CHg en 5 δ) ; 2,39 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 β) ; 2,43 (s, 3H : SCH ₃ ) ; 2,82 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CH _; , en 5 ε) ; 2,98 (dd, J = 12 et 4,5 Hz, IH : IH du CHg en 4 β) ; 3,26 (s, 3H : NCH ₃ ) ; 3,30 (t, J = 12 Hz IH : IH du CH ₂ en 3 δ) ; 3,38 (mt, IH : l'autre H du CHg en 4 β) ; 3,57 (mt, IH : l'autre H du CK^ en 3 δ) ; 4,56 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 a) ; 4,74 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 ε) ; 4,84 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,29 (dd, J = 12 et 4,5 Hz, IH : 4 α) ; 5,32 (d large, J = 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 o) ; 5,90 (mt, IH : 1 β) ; 6,51 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,99 (d large, J = 8 Hz, IH : H Aromatique en para du méthylthio) ; 7,10 et 7,15 (respectivement s large et d large, J = 8 Hz, IH chacun : H Aromatiques en ortho du méthylthio) ; de 7,15 à 7,35 (mt, 6H : H Aromatiques en 6 et H Aromatiques en meta du méthylthio) ; 7,43 (d large, J ≈ 8 Hz, IH : l' H^ ; 7,52

(dd, J = 8 et 4 Hz. IH : l' Hg) ; 7.79 (d large, J = 4 Hz, IH : l' HJ ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,73 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 30 : Préparation de la 4ε-éthoxy-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A _*

On réalise à l'échelle de 60 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g 1 dans la soude 0.2N de chlorhydrate de 3-O-éthyltyrosine (S) synthétisé comme à l'exemple 37-1. Au terme de 40 h de culture, les 1,8 litres de moût issus de 60 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant le nouveau dérivé de pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. On obtient 19 mg de résidu sec. Celui-ci est repris par 3 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 60% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 40% d'acétonitrile. Les fractions contenant la nouvelle pristinamycine sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 15,8 mg de 4ε-O-éthoxy-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. » H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,55 (dd, J = 16 et 5,5 Hz, IH : IH du CH _j , en 5 β) ; 0,90 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 γ) ; 1,12 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 β) ; 1,20 (mt, IH : IH du C ^ en 3 γ) ; 1,31 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CH ₃ en 1 γ) ; 1,49 (t, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,54 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 γ) ; 1,63 et 1,73 (2 mts, IH chacun : CR, en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 β) ; 2,22 et 2,33 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CR-. en 5 δ) ; 2,46 (d, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,83 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 ε) ; 2,95 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 4 β) ; 3,22 (mt, IH : IH du CH ₂ en 3 δ) ; 3,27 (s, 3H : NCHg) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CHa en 4 β) ; 3,53 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 δ) ; 3,93 et 4,03 (2 mts, IH chacun : OCH ₂ de l'éthyle) ; 4,56 (dd, J = 7 et 5,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5 ε) ; 4,82 (mt, IH : 2 α) ; 4,88 (dd, J = 10 et

1 Hz, IH : 1 α) ; 5,23 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,23 (d large, J = 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,87 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,47 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; 6,80 (mt, 3H : H Aromatiques en ortho et en para de l'éthoxy) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 6H : H Aromatiques en 6 et H Aromatiques en meta de l'éthoxy) ; 7,43 (dd, J = 8 et 1 Hz, IH : l' H^ ; 7,50 (dd, J = 8 et 4 Hz, IH : l' Hg) ; 7,77 (dd, J = 4 et 1 Hz, IH : l' He) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,70 (d, J = 9,5 Hz. IH : NH en 6) ; 11,60 (s, IH : OH).

EXEMPLE 31 : Préparation de la 4ζ-éthylthio-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A

On réalise à l'échelle de 2 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 gΛ dans la soude 0.1N de chlorhydrate de 4- éthylthiophénylalanine (S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 60 ml de moût issus de 2 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois 0,5 volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20 ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ζ-éthyltMo-dés(4ζ-diméthyl__m_no) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7 ml d'un mélange 60% eau et 40% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la 4ζ-éthylthio-dés (4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient ? mg de 4ζ-éthylthio-dés (4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. * H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm) : 0,68 (dd, J = 16 et 6

Hz, IH : IH du CR, en 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; de 1,10 à 1,40 (mt, 5H : IH du CH ₂ en 3 β et IH du CR, en 3 7 et CH ₃ de l'éthyle) ; 1,32 (d, J = 7

Hz, 3H : CH ₃ en 17) ; de 1,45 à 1,85 (mt, 3H : l'autre H du CH ₂ en 37 et CR, en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 β) ; 2,18 et 2,37 (respectivement mt et d large, J = 16,5 Hz, IH chacun : CR, en 5 δ) ; 2,45 (d large, J = 16 Hz, IH : l'autre H du CH _j , en 5 β) ; 2,85 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 ε) ; 2,90 (mt, 2H : ArSCR, éthyle) ; 2,98 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du CH _; , en 4 β) ; 3,25 (s, 3H : NCH _j ) ; 3,35 (mt, IH : IH du 0 en 3 δ) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CR, en 4 β) ; 3,57 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 δ) ; 4,55 (t, J = 7,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 7,5 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 ε) ; 4,85 (mt, IH : 2 α) ; 4,89 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; de 5,25 à 5,40 (mt, 2H : 5 α et 4 α) ; 5,88 (d, J = 9,5 Hz, IH : 6 α) ; 5,91 (mt, IH : 1 β) ; 6,55 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 2) ; 7,10 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 7H : H Aromatiques en 6 et 4 ε) ; 7,44 (AB limite, 2H : l' H ₄ et l' HZ) ; 7,74 (mt, IH : l' H _β ) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,75 (d, J = 9,5 Hz, IH : NH en 6) ; 11,62 (s, IH : OH).

EXEMPLE 32 : Préparation de la 4ζ-éthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine I A

On réalise à l'échelle de 2 erlenmeyers comme décrit dans l'exemple 3 une culture de la souche SP92::pVRC508 en milieu de production avec ajout à 16h de 1 ml d'une solution à 20 g/1 dans la soude 0,1N de 4-éthylphénylalanine (R,S) synthétisée comme à l'exemple 33. Au terme de 40 h de culture, les 60ml de moût issus des 2 erlenmeyers sont extraits par 2 volumes d'un mélange de 66% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 34% d'acétonitrile, puis centrifugés. Le surnageant est extrait par 2 fois volumes de dichlorométhane. Les phases chlorométhylèniques sont lavées à l'eau puis combinées, séchées sur sulfate de sodium et évaporées. L'extrait sec est repris par 20ml de dichlorométhane et injecté sur une colonne de silice (30g) montée dans le dichlorométhane et éluée successivement par paliers de 0 à 10 % de méthanol dans le dichlorométhane. Les fractions contenant la 4ξ-éthyl-dés(4ζ- diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et évaporées. Le résidu sec est repris par 7ml d'un mélange 52% eau et -48% acétonitrile et injecté sur une colonne semi-préparative Nucléosil 7μ C8 10x250 mm (Macherey Nagel) éluée dans un mélange de 52% de tampon phosphate 100 mM pH 2,9 et 48% d'acétonitrile. Les fractions contenant la j4ζ-éthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA sont regroupées et extraites par un volume de dichlorométhane. La phase organique est

lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée. On obtient 0,50 mg de 4ζ- éthyl-dés(4ζ-diméthylamino) pristinamycine IA-

Spectre de R.M.N. ^J H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm, réf. TMS): 0,42 (dd, J = 16 et 5,5 Hz, IH : IH du CH ₂ en 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 2 _γ ) ; de 1,10 à 1,40 (mt, 2H : IH du CHg en 3 β et IH du CHg en 3 γ) ; 1,23 (t, J = 7.5 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,35 (d, J = 7 Hz, 3H : CH ₃ en 1 γ) ; de 1,45 à 1,85 (mt, 3H : l'autre H du CH _j , en 3 γ et CH _j , en 2 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CH _j en 3 β) ; 2,15 et de 2,25 à 2,40 (2 mts, IH chacun : CHj, en 5 δ) ; de 2,25 à 2,40 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,60 (q, J = 7,5 Hz, 2H : ArCHg de l'éthyle) ; 2,83 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CIL, en 5 ε) ; 2,98 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : IH du C^ en 4 β) ; de 3,25 à 3,35 (mt, IH : IH du CHg en 3 δ) ; 3,27 (s, 3H : NCH ₃ ) ; 3,39 (t, J = 12 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 4 β) ; 3,59 (mt, IH : l'autre H du CH ₂ en 3 δ) ; 4,58 (dd, J = 7 et 6,5 Hz, IH : 3 α) ; 4,75 (dd large, J = 13 et 8 Hz, IH : l'autre H du CHg en 5 ε) ; 4,87 (mt, IH : 2 α) ; 4.89 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,24 (d large, J ≈ 5,5 Hz, IH : 5 α) ; 5,29 (dd, J = 12 et 4 Hz, IH : 4 α) ; 5,88 (d, J = 10 Hz, IH : 6 α) ; 5,92 (mt, IH : 1 β) ; 6,73 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 2) ; de 7,10 à 7,35 (mt, 9H : H Aromatiques en ό - 4 ε et 4 δ) ; 7,44 (dd, J = 8,5 et 1,5 Hz, IH : l' ΗJ ; 7,50 (dd, J ≈ 8,5 et 4,5 Hz, IH : l' Hg) ; 7,80 (dd, J = 4,5 et 1,5 Hz, IH : l' He) ; 8,38 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 8,75 (d, J = 10 Hz. IH : NH en 6) ; 11.66 (s, IH : OH).

A partir des mêmes fractions issues de la colonne de silice décrite ci-dessus, contenant également le nouveau dérivé de pristinamycine IH , 0,3mg de ζ-éthyl- dés(4ξ-diméthylamino) pristinamycine IH sont isolés en opérant la chromatographie sur colonne semi-préparative comme décrit ci-dessus.

Spectre de R.M.N. ¹ H (400 MHz, CDC1 ₃ , δ en ppm) : 0,04 (mt, IH : IH du CH ₂ en 5 β) ; 0,92 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ en 27) ; de 1,10 à 1.40 (mt, 2H : IH du CR, en 5 δ et IH du O^ en 5 7) ; 1,18 (t, J = 7,5 Hz, 3H : CH ₃ de l'éthyle) ; 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H : CR, en 1 7) ; de 1,45 à 1,85 (mt, 7H : l'autre H du CR, en 5 7 - l'autre H du CH ₂ en 5 δ - IH du CH ₂ en 3 β - CR, en 3 7 et CH ₂ en 2 β) ; 1,81 (d large, J = 13 Hz, IH : l'autre H du CH ₂ en 5 β) ; 2,02 (mt, IH : l'autre H du CR, en 3 β) ; 2,40 (dt, J = 13 et 4 Hz, IH : IH du CR, en 5 ε) ; 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H : Ar CIL, de l'éthyle) ; 2,97 et 3,09 (respectivement dd et t, J = 12 et 5 Hz et J = 12 Hz, IH chacun : CH ₂ en 4 β) ; 3,50 et 3,60 (2 mts, IH chacun : CR, en 3 δ) ; 4,13 (dd, J = 8 et 5 Hz, IH : 3 α) ; 4,49 (d large, J = 13 Hz, IH : l'autre H du CR, en 5

ε) ; 4,70 (mt, 2H : 5 α et 4 α) ; 4,77 (mt, IH : 2 α) ; 4,83 (dd, J = 10 et 1 Hz, IH : 1 α) ; 5,50 (d, J = 7 Hz, IH : 6 α) ; 5,74 (mt, IH : 1 β) ; 6,09 (d, J = 4 Hz, IH : NH en 4) ; 6,72 (mf, IH : NH en 2) ; 7,07 (d, J = 8 Hz, 2H : H Aromatiques en 4 ε) ; 7.15 (d, J = 8 Hz. 2H : H Aromatiques en 4 δ) ; de 7,15 à 7,35 (mt, 5H : H Aromatiques en 6) ; 7,40 (dd, J = 8 et 1 Hz, IH : l' H,,) ; 7,45 (dd, J = 8 et 4 Hz, IH : l' Hg) ; 7,92 (dd, J = 4 et 1 Hz, IH : l' H,) ; 8,40 (mf, IH : NH en 6) ; 8,50 (d, J = 10 Hz, IH : NH en 1) ; 11,72 (s, IH : OH).

EXEMPLE 33 : Préparation de dérivés de phénylalanine et d'acide phénylpyruvique déjà décrits.

La phénylalanine, et les dérivés 4-méthoxyphénylalanine, 4- bromophénylalanine, 4-chlorophénylalanine, 4-iodophênylalanine, 4- trifluorométhylphénylalanine, 4-aminophénylalanine, 3-méthoxyphénylalanine utilisés sont commerciaux.

Les dérivés suivants de phénylalanine peuvent être préparées selon les méthodes décrites dans la littérature.

4-Diméthylaminophénylalanine (RS)

D.F. Elliott, A.T. Fuller, CR. Harrington, J. Chem. Soc., 1948, 85-89.

4-Diéthylaminophénylalanine (RS)

Moldaver B.L., Pushkareva Z.V., Zhur. Obshchei Khim,. 31, 1560-1569 (1961);

C.A. 1961, 22226f .; J.A Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97

4-Ethylaminophénylalanine (RS)

F. Bergel, J.A. Stock, J. Chem. Soc, 1959, 90-97.

4-Phénylphénylalanine (RS) J. V. Braun, J. Nelles, Berichte, 66B, 1933, 1464-1470.

4-Méthylphénylalanine (RS)

R.R.,Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231.

4-Méthylthiophénylalanine (RS) et 4- Ethylthiophénylalanine (R,S)

R.L.Colescott, R.R.Herr, J.P. Dailey J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4232-4235.

4-Méthoxycarbonylphénylalanine (RS)

RCleland, J. Org.Chem., 1969, 34, 747.

2,4 Diméthylphénylalanine (RS)

R.R.,Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 4229-4231. 3,4 Diméthylphénylalanine (RS)

R.R.,Herr, T. Enjoki, J.P. Dailey, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79, 4229-4231.

3-Trifluorométhylphénylalanine (RS), chlorhydrate

R. Filler and H.Novar, J. Org.Chem, 1960, 25, 733-736.

4-Aminométhyl phénylalamne (S) G.E. Stokker, W.F. Hoffman and CF. Homnick, J.Org.Chem., 1993, 58, 5015-

5017.

3- Méthylphénylalanine (R,S)

J.H Burckhalter, V.C Stephens, J. A.CS. 1951, 73, 56-58.

4-Acétyl phénylalamne (R3) J.I. Degaw et coll., J. Med.Che., 1969, 11, 225-227

4-O-Allyl tyrosine (S)

A. Loffet, H. Zang, Int. J. Pept Protein Res. ,1993, 42, 346

4-O-Ethyl tyrosine (S)

Y. Sasaki et colU, Chem. Pharm, Bull., 1982, 30, 4435 4-Ethyl phénylalanine (RS)

A. Zhuze et coll., Coll., Czech. Chem. Commmm., 1965, 62, 2648

L' acide 4-tert-butylphénylpyruvique peut être préparé suivant

R. Breslow, J.W. Canary, M. Varney, S.T. Waddell and D. Yang, J. Am.Chem.Soc., 1990, 112, 5212-5219.

Les autres dérivés de phénylalanine ont été préparés suivant les exemples 34 à 42 indiqués ci-dessous. Dans ces exemples, les chromatographies flash sont effectuées sous une pression d'azote moyenne de 50 kPa, en utilisant une silice de granulométrie 40-53 μm, selon Still ej ^~ , J- Org. Chem., &, 2923, (1978).

EXEMPLE 34: Préparation de dérivés de phénylalanine et d'un dérivé d'acide phénylpyruvique par la méthode A.

34-1: 4-Méthylaminophénylalanine (RS). dichlorhydrate

A 3,70 g de N-acétyl 4-mémylaminophénylalaninate de méthyle on ajoute 37 ml d'acide chlorhydrique 12 N et le mélange est chauffé au reflux sous agitation pendant 8 h. Après une nuit à température ambiante , le milieu réactionnel est concentré à sec sous pression réduite (50 kPa), repris par un mélange de 50 ml de toluène et 50 ml d'éthanol puis à nouveau concentré. Après séchage en dessicateur sous pression réduite (2,6 kPa), on obtient 4,18 g (100%) de dichlorhydrate de 4- méthyl-iminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide beige clair hygroscopique fondant à 158°C

34-2: N-Acétyl 4-méthylaminophénylalaninate de méthyle (RS)

A 4 g de 4-méthylamino 2-acétamido cinnamate de méthyle placé sous atmosphère d'azote dans un autoclave, on ajoute 0,4 g de palladium sur charbon à 10% puis 50 ml d'éthanol absolu. Le mélange est placé sous une pression de 5,5 bars d'hydrogène et chauffé 15 h à 50°C sous agitation. Après stabilisation de la température à 26°C et remise à pression atmosphérique, le milieu réactionnel est filtré sur Clarcel®, rincé à l'éthanol puis concentré à sec sous sous pression réduite (2,6 kPa). On obtient ainsi 3,73 g de N-acétyl 4-mémylaminophénylalaninate de méthyle sous forme de cristaux blancs fondant à 118°C

34-3: 4-Méthvlamino 2-acétamido cinnamate de méthyle

Dans un tricol placé sous azote on ajoute 5,75 g de 2-acétamido acrylate de méthyle, 0,185 g d'acétate de palladium, 8,1 g de chlorure de tétrabutyl ammonium et 6,03 g d'hydrogénocarbonate de sodium puis on additionne à ce mélange 6,5 g de 4- iodo N-méthyl-uiiline en solution dans 200 ml de DMF. Le mélange est chauffé 16 h 30 mn à 82°C puis après refroidissement versé sur 1000 ml d'eau distillée. Le milieu est repris par 250 ml de CH ₂ C1 ₂ , la phase organique est décantée et la phase aqueuse lavée par 2 fois 250 ml de CH ₂ C1 ₂ . Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de sodium, filtrées et concentrées sous pression réduite (50 kPa) à 70°C pour donner une huile brune qui est purifiée par flash-chromatographie ( éluant AcOEt / cyclohexane puis AcOEt pur).

On obtient ainsi 4 g de 4-méthylamino 2-acétamido cinnamate de méthyle, sous forme d'un solide jaune (Silice Merck 5719, Rf = 0,48) qui est utilisé tel quel. La N-méthyl-p-iodoaniline peut être préparée suivant : S. Krishnamurthy,

Tetrahedron Letters, 33, 3315-3318, 1982.

34-4: Acide 4-méthylamino phénylpyruvique

On place dans un ballon 2,4 g de 4-méthylamino 2-acétamido cinnamate de méthyle et 32 ml d'acide chlorhydrique 12 N. Le mélange est chauffé au reflux 3 h puis refroidi et lavé par 2 fois 20 ml d'éther diéthylique. La phase aqueuse est refroidie à -10°C et le précipité obtenu est filtré puis rincé par un minimum d'acide chlorhydrique froid. Le solide obtenu est séché au dessicateur sous pression réduite pour donner 1,1 g d'acide 4-méthylamino phénylpyruvique sous forme d'un solide beige clair fondant à 210°C

34-5: 3-Fluoro 4-méthvlphénvlalanine (R.S). chlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 34-1 mais à partir de 1,6 g de N-Acétyl (3- fluoro-4 méthyl) phénylalaninate de méthyle, on obtient 0,6 g de chlorhydrate de 3- fluoro 4-méthyl phénylalanine (R,S) sous forme de cristaux blancs fondant à une température supérieure à 260°C

34-6: N-Acétvl (3-fluoro-4 méthvl) phénvlalaninate de méthvle. R.S)

En opérant comme à l'exemple 34-2 mais à partir de 1,9 g de (4-méthyl 3- fluoro) 2-acétamido cinnamate de méthyle, de 0,2 g de palladium sur charbon à 10% dans 230 ml d'éthanol, on obtient 1,6 g de N-acétyl (3-fluoro-4 méthyl) phénylalaninate de méthyle sous forme d'une huile incolore (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,46; éluant CH ₂ C1 ₂ / AcOEt 50/50).

34-7: (3-Fluoro 4-méthvl . 2-acétamido cinnamate de méthyle

En opérant comme à l'exemple 34-3 mais à partir de 3,6 g de 2-acétamido acrylate de méthyle, 0,12 g d'acétate de palladium, 5,2 g de chlorure de tétrabutyl ammonium, de 3,8 g d'hydrogénocarbonate de sodium et de 4 g de 2-fluoro 4-bromo toluène en solution dans 120 ml de DMF anhydre, on obtient 2,6 g de (3-fluoro 4- méthyl) 2-acétamido cinnamate de méthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 163°C

34-8: 4-Trifluorométhoxyphénylalanine (R.S). chlorhydrate ou ζ_ trifluorométhyl tyrosine. chlorhydrate (R.S)

En opérant comme à l'exemple 34-1 mais à partir de 3 g de N-acétyl (4- trifluorométhoxy) phénylalaninate de méthyle et de 30 ml d'acide chlorhydrique 12 N, on obtient 1,5 g de chlorhydrate de 4-trifluorométhoxy phénylalanine (RS) sous forme de cristaux blancs fondant à 260°C

34-9: N-Acétvl (4-trifluorométhoxv) phénvlalaninate de méthvle (R.S) En opérant comme à l'exemple 34-2 mais à partir de 3,1 g de (4- trifluorométhoxy) 2-acétamido cinnamate de méthyle, de 0,3 g de palladium sur charbon à 10% dans 50 ml d'éthanol, on obtient 3 g de N-acétyl (4-trifluorométhoxy) phénylalaninate de méthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 80°C

34-10: 4-Trifluorométhoxv 2-acétamido cinnamate de méthyle

En opérant comme à l'exemple 34-3 mais à partir de 4,3 g de 2-acétamido acrylate de méthyle, 0,14 g d'acétate de palladium, 6,1 g de chlorure de tétrabutyl

ammonium, de 4,6 g d'hydrogénocarbonate de sodium et de 5 g de 4- trifluorométhoxy bromo benzène en solution dans 150 ml de DMF anhydre.

On obtient 3,1 g de (4-trifluorométhoxy) 2-acétamido cinnamate de méthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 135°C

34-11: 3-Méthvlthiophénvlalanine (RS). chlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 34-1 mais à partir de 3,3 g de N-acétyl 3- méthylthio phénylalaninate de méthyle et de 40 ml d'acide chlorhydrique 12N, on obtient 1,38 g de chlorhydrate de 3-méthylthio phénylalanine (RS) sous forme de cristaux blancs fondant à 190°C

34-12: N-Acétvl 3-méthvlthio phénvlalaninate de méthvle (RS)

On place dans un ballon 3,72 g de 3-méthylthio 2-acétamido cinnamate de méthyle en solution dans 100 ml de méthanol et 30 ml de tétrahydrofuranne puis on ajoute 1,4 g de magnésium. Après 20 mn de réaction on refroidi le milieu par un bain de glace puis on ajoute à nouveau 1,4 g de magnésium. Le mélange est agité à température ambiante pendant 18 h, versé sur 1,4 1 d'eau distillée et 300 ml de CH ₂ C1 ₂ puis filtré sur Clarcel®. La phase aqueuse est ajustée à pH 6 par addition d'acide chlorhydrique 12 N puis décantée et lavée par 100 ml de CH ₂ C1 ₂ . Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées à sec sous pression réduite pour donner 3,42 g de N-acétyl 3-méthylthio phénylalaninate de méthyle sous forme d'une huile incolore (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,5 ; AcOEt).

34-1 : 3-Méthvlthio 2-acétamido cinnamate de méthvle

En opérant comme à l'exemple 34-3 mais à partir de 5,6 g de 2-acétamido acrylate de méthyle, 0,18 g d'acétate de palladium, 8,2 g de chlorure de tétrabutyl ammonium, de 5,86 g d'hydrogénocarbonate de sodium et de 6,5 g de 3-iodo 1- méthylthiobenzène en solution dans 160 ml de DMF anhydre, on obtient 4,8 g de (3- méthylthio) 2-acétamido cinnamate de méthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 139°C

34-14: 3-Iodométhvlthiobenzène

On place sous agitation dans un tricol 20 ml d'eau distillée et 20 ml d'acide chlorhydrique 12 N puis on ajoute par une ampoule de coulée 10 ml de 3-méthylthio aniline. Le mélange est tiédi pour assurer la dissolution puis refroidi à 5°C On ajoute ensuite lentement par une ampoule de coulée 5,86 g de nitrite de sodium en solution dans 15 ml d'eau en maintenant la température entre 5 et 8°C 20mn après la fin de l'addition, 13,57 g de iodure de potassium en solution dans 15 ml d'eau sont ajoutés en lOmn puis le mélange est agité 15 h à température ambiante. L'huile formée est séparée de la phase aqueuse par décantation, puis additionnée d'une solution aqueuse de thiosulfate de sodium. La phase aqueuse est décantée, et le produit extrait par 100 ml de dichlorométhane. La phase organique est lavée avec 100 ml d'eau, la phase aqueuse ajustée à pH 9 avec de la soude concentrée puis décantée. La phase organique est lavée par 2 fois 100 ml d'eau, décantée, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée à sec sous pression réduite (50 kPa) à 40°C Le produit résultant est purifié par chromatographie flash (éluant cyclohexane) pour donner 13 g de 3-iodo 1-méthylthiobenzène sous forme d'un liquide jaune (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,8 / cyclohexane).

EXEMPLE 35 : Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode

B.

35-1: 4-tert-Butvlphénvlalanine (RS)

Dans un tricol surmonté d'un réfrigérant sont additionnés 25 g de 4-(tert butyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle et 250 ml d'acide chlorhydrique à 37%. Le mélange est agité et chauffé au reflux jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de dégagement gazeux. Après refroidissement du milieu réactionnel le précipité obtenu est filtré puis recristallisé dans l'acétonitrile pour donner 25, 6 g de chlorhydrate de 4-tert- butylphénylalanine (R,S) sous forme d'un solide blanc fondant à 234°C (Voir également Journal of the Takeda Research Laboratories Vol. 43; N°3/4, Décl984 p53-76).

35-2: 4-(tert butyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle

Dans un tricol surmonté d'un réfrigérant sont additionnés sous atmosphère d'azote, 25 g de bromure de 4-tert-butyl benzyle, 50 ml de toluène anhydre et 3,1 g d'hydrure de sodium en suspension dans l'huile à 80% puis 21,8 g d' acétamido malonate de diéthyle. Le mélange est chauffé à 110°C pendant 17 h. Après refroidissement on ajoute lentement à l'aide d'une ampoule de coulée, 15 ml d'éthanol absolu puis 15 ml d'éthanol à 50% puis 50 ml d'eau. La phase organique est décantée et la phase aqueuse lavée par 3 fois 50 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont réunies, lavées à l'eau puis séchées sur sulfate de sodium. Après filtration et concentration sous pression réduite, le produit est cristallisé dans l'éther de pétrole pour donner 25 g de 4-(tert-butyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 80°C

35-3: 3-Méfhvlaminoρhénylalanine (R.S). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 1,17 g 3-méthylamino benzyl acétamidomalonate de diéthyle et 20 ml d'acide chlorhydrique 12 N, on obtient 1, 03 g d'un solide jaune beige. Celui-ci est dissous dans 20 ml d'éthanol absolu et additionné de 0,4 g de noir animal. La solution est filtrée sur Clarcel®, puis filtrée et concentrée sous pression réduite (50 kPa) La même opération est recommencée avec 1 g de noir animal et le solide obtenu trituré dans 20 ml d'éther. Après filtration et séchage sous pression réduite (2,7 kPa) à 50°C, on obtient 0,65 g

de dichlorhydrate de 3-mémylaminophénylalanine (R,S) sous forme d'une poudre blanche fondant vers 135°C (décomposition).

35-4: 3-Méthvlamino benzvl acétamidomalonate de Hiéthvlft

On place dans un tricol maintenu sous atmosphère d'azote 3,11 ml d'anhydride acétique. On ajoute ensuite en 3 mn à 0°C, 1,51 ml d'acide formique puis on chauffe à 50°C pendant 2 heures. On laisse le mélange revenir à température ambiante en agitant pendant 3h 20 et on ajoute 4 ml de THF anhydre sous azote et on refroidi à - 20°C On ajoute en 10 mn, une solution de 4 g de 3-aminobenzyl acétamidomalonate de diéthyle dans un mélange de 15 ml de THF anhydre et de 15 ml de dichlorométhane anhydre. L'agitation est poursuivie lh lOmn à -20°C puis à 20°C pendant 16 h. Le mélange réactionnel est concentré à sec sous pression réduite (50 kPa) à 30°C, puis coévaporé avec 30 ml de toluène anhydre pour donner un solide blanc qui est dissous dans un mélange de 10 ml de THF anhydre et de 20 ml de dichloro 1,2 éthane anhydre puis placé dans un tricol sous azote.

Le milieu est refroidi à -5°C puis 1,55 ml de complexe borane-diméthylsulfure (solution 2M dans le THF) est ajouté en 10 mn. On laisse le milieu revenir à température ambiante et la solution et chauffée 3 h au reflux puis agitée 15 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est refroidi à 0°C puis on ajoute en 25 mn, 10 ml de MeOH. On agite 45 mn à 0°C puis 30 mn à température ambiante. On refroidit à 0°C puis on fait barboter HC1 gaz jusqu'à pH 2. On chauffe 1 h à reflux puis le mélange est concentré à sec sous pression réduite à 30°C pour donner 5 g d'un produit qui est repris par 30 ml d'une solution aqueuse de NaHCO ₃ et de 30 ml de CH ₂ C1 ₂ . La phase organique est décantée et la phase aqueuse lavée par 20 ml d'eau. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées à sec sous pression réduite (2,6 kPa) pour donner 3,43 g d'une huile jaune qui est purifiée par chromatographie flash (éluant AcOEt-cyclohexane 50/50). On obtient ainsi après séchage sous pression réduite (2,7 kPa) à 20°C, 1,18 g de 3- méthylamino benzyl acétamidomalonate de diéthyle sous forme d'un solide beige clair fondant à 122°C

35-5: 3-Aminobenzvl acétamidomalonate de diéthvle

Le 3--imino benzyl acétamidomalonate de diéthyle peut être préparé comme décrit dans : T.S. Osdene, D.N.Ward, W.H. Chapman and H. Rakoff, J. Am. Chem. Soc.,

≤l, 1959, 3100-3102.

35-6: 3-Ethvlaminophénvlalanine (R.S). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 34-1 mais à partir de 2 g de N-acétyl 3- éthylamino phénylalaninate d'éthyle(R,S) et de 30 ml d'acide chlorhydrique 12N, on obtient 1,7 g de dichlorhydrate de 3-éthylamino phénylalanine (R,S) sous forme d'un solide beige clair hygroscopique contenant 10% molaire de dichlorhydrate de 3- diéthylamino phénylalanine (R,S).

35-7: N-Acétyl 3-éthvlamino phénvlalaninate d'éthvle(R.S)

On place dans un ballon sous atmosphère d'azote, 3 g de N-acétyl 3-amino phénylalaninate d'éthyle (R,S), 40 ml d'éthanol et 14 g de nickel de Raney préalablement lavé à l'eau distillée et à l'éthanol. Le mélange est chauffé au reflux 19 h, refroidi, filtré sur Clarcel® puis concentré à sec sous pression réduite (50 kPa) pour donner 3,07 g d'une huile incolore qui est purifiée par chromatographie flash (éluant AcOEt) pour donner 2,1 g de N-acétyl 3-éthylamino phénylalaninate d'éthyle (R,S) sous forme d'une huile incolore (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,6 : AcOEt) contenant 10% de N-acétyl 3-diéthylamino phénylalaninate d'éthyle (R,S).

35-8: N-acétvl 3-amino phénylalaninate d'éthvle(R.S)

25 g d'un mélange de N-acétyl 3-nitro phénylalaninate d'éthyle (R,S) (75% molJmol.) et de 3-nitro benzyl acétamidomalonate de diéthyle (25% molJmol.) sont placés sous azote dans un autoclave. On ajoute 2,5 g de palladium sur charbon à 10% puis 200ml de dichlorométhane. Le mélange est placé sous une pression de 9 bars d'hydrogène puis agité à 18°C pendant 4 h. Après remise à la pression atmosphérique, le milieu réactionnel est filtré sur Clarcel®, rincé par du dichlorométhane puis concentré à sec sous pression réduite (50 kPa) pour donner un solide qui est

recristallisé dans 450 ml d'eau distillée au reflux en présence de 4 g de noir animal 3S. Après filtration à chaud sur Clarcel® la cristallisation est abandonnée à 4°C, les cristaux sont filtrés puis séchés pour donner 9,9 g de N-acétyl 3-amino phénylalaninate d'éthyle (R,S) sous forme d'un solide beige clair fondant à 106°C et contenant 5% de 3-amino benzyl acétamido malonate de diéthyle.

35-9: N-acétvl 3-nitro phénvlalaninate d'éthvle(R.S) et 3-nitro benzyl acétamidomalonate de diéthvle.

Dans un tricol surmonté d'un réfrigérant sont placés sous atmosphère d'azote,

600 ml d'éthanol absolu puis 7,9 g de sodium. Après dissolution totale, on ajoute 74,5 g d' acétamido malonate de diéthyle puis 60 g de chlorure de 4-nitro benzyle dans 200 ml d'éthanol anhydre. Le mélange est chauffé au reflux pendant 16h 30mn. Après refroidissement le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite (50 kPa) puis repris par un mélange de 500 ml de CH2CI2 et de 500 ml d'eau. Le pH est ajusté à 7 par addition d'acide sulfurique 0,5N puis la phase organique est décantée et la phase aqueuse lavée par 2 fois 200 ml de CH2CI2. Les phases organiques sont réunies, lavées avec 200 ml d'eau saturée en bicarbonate de sodium, décantée puis séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration sous pression réduite (50 kPa), le produit est recristallisé dans 600 ml d'éthanol au reflux pour donner après cristallisation à température ambiante, filtration et séchage, 70,4 g de 3-nitro benzyl acétamidomalonate de diéthyle.sous forme de cristaux blancs fondant à 156°C Les eaux-mères sont concentrées puis purifiées par chromatographie flash (éluant AcOEt) pour donner 25,6 g d' un mélange de N-acétyl 3-nitro phénylalaninate d'éthyle (75% mol/mol) et de 3-nitro benzyl acétamidomalonate de diéthyle (25% mol/mol) sous forme d'un solide beige clair utilisé tel que dans l'étape suivante.

35-10 : 3-Diméthvlamino phénylalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 0,72 g de N-acétyl 3- diméthylamino phénylalaninate d'éthyle (RS) et de 8,6 ml d'acide chlorhydrique à ION, on obtient après évaporation un solide qui est trituré dans 50ml d'acétone, filtré puis séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 0,68 g (93%) de dichlorhydrate de 3-diméthylamino phénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc fondant vers 120°C (décomposition).

35-11: N-acétvl 3-diméthvlamino phénvlalaninate d'éthyle (RS)

On place dans un tricol sous atmosphère d'azote, 4g de N-acétyl 3-amino phénylalaninate d'éthyle (RS), préparé comme décrit à l'exemple 35-8 dans 15ml de DMF et on ajoute 5,5 ml de triéthylamine puis 2,5 ml de iodure de méthyle et 4 ml de dichlorométhane en maintenant la température vers 30°C à l'aide d'un bain de glace. Le mélange est ensuite chauffé 18h à 35°C On ajoute alors lentement 1ml de iodure de méthyle en solution dans 1ml de DMF en maintenant la température vers 30°C, puis 2,2ml de triéthylamine puis le mélange est chauffé 5h supplémentaires à 35°C Le mélange est ramené à température ambiante puis extrait par 100ml d'acétate d'éthyle et 150ml d'eau distillée. La phase aqueuse est décantée puis relavée par 2 fois 70ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées par 2 fois 80 ml d'eau distillée puis par 50ml d'eau distillée saturée en NaCl. La phase organique est décantée, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, puis concentrée à sec sous pression réduite pour donner 2,4g d'un produit qui est purifié par chromatographie flash (dichlorométhane, MeOH 90/10). On obtient ainsi 0,72g (16%) de 3-N-acétyl 3- diméthylamino phénylalaninate d'éthyle (RS) sous forme de cristaux jaunes.

EXEMPLE 36: Préparation de dérivés de phénylalamne par la méthode C.

36-1: 4-Isopropvlphénvlalanine (R.S)

On place dans un tricol 7 g de phosphore rouge et 8 g de 4-(isopropyl benzylidène) 2-méthyl 5-oxazolone dans 45 ml d'anhydride acétique puis on ajoute lentement sous agitation à l'aide d'une ampoule de coulée 35 ml d'acide iodhydrique à 57%. En fin d'addition le mélange est chauffé 3h 30mn au reflux puis laissé 3 jours à température ambiante. Le milieu réactionnel est filtré, le solide obtenu rincé par 2 fois 10 ml d'acide acétique puis le filtrat concentré à sec sous pression réduite. Le

résidu obtenu est repris par 100 ml d'eau distillée, concentré à sec sous pression réduite pour donné un solide qui est repris dans 50 ml d'eau distillée puis extrait par 3 fois 50 ml d'éther diéthylique après addition de 0,5g de sulfite de sodium. L'éther est décanté et la phase aqueuse placée sous pression réduite pour éliminer les traces d'éther diéthylique. On ajoute à la phase aqueuse 2 g de noir animal, on chauffe à 40- 50°C, on filtre sur Clarcel® puis on rince avec un πiinimum d'eau. Le pH est ajusté à 5 par addition, à 4°C, d'ammoniaque à 32%. Le précipité obtenu est filtré à froid, rincé par 2 fois 10 ml d'eau, 10 ml 'éthanol puis par 2 fois 10 ml d'éther pour donner après séchage sous pression réduite à 20°C, 3,97 g de 4-isopropylphénylalanine (R,S) sous forme d'un solide blanc fondant à une température supérieure à 260°C (Voir également Journal of the Takeda Research Laboratories Vol. 43; N°3/4, Décl984 p53-76).

36-2: 4-(isopropvl benzvlidène) 2-méthvl 5-oxazolone

On place dans un ballon muni d'un réfrigérant, 18,52 g de N-acétylglycine, 10,6 g d'acétate de sodium, 20 ml de 4-isopropylbenzaldéhyde et 57 ml d'anhydride acétique. On agite 30 mn puis le mélange est agité 1 h à 110°C puis 15 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est versé sur 600 ml d'eau et 400 ml d'éther de pétrole préalablement chauffé à 50°C La phase organique est décantée et la phase aqueuse lavée par 2 fois 150 ml d'éther de pétrole.

Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite jusqu'à 100 ml et obtention d'un précipité. Celui-ci est filtré, lavé par 2 fois 50 ml de pentane pour donner 8,2 g de 4-(isopropyl benzylidène) 2-méthyl 5-oxazolone sous forme d'un solide jaune fondant à 77°C

36-3: 4-butvlphénvlalanine (R.S)

En opérant comme à l'exemple 36-1 mais à partir de 1,49 g de phosphore rouge, de 1,8 g de 4-(butyl benzylidène) 2-méthyl 5-oxazolone dans 9,23 ml d'anhydride acétique et de 7,39 ml d'acide iodhydrique à 57%, on obtient 0,35 g de 4- butylphénylalanine (R,S) sous forme d'un solide beige clair fondant à une température supérieure à 260°C

36-4: 4-(hutvl benzylidène) 2-méthvl 5-oxazolone

En opérant comme à l'exemple 36-2 mais à partir de 8,43 g de N-acétylglycine, 4,92 g d'acétate de sodium, 9,8 g de 4-butylbenzaldéhyde et 26 ml d'anhydride acétique, on obtientl,89 g de.4-(butyl benzylidène) 2-méthyl 5-oxazolone, sous forme d'un solide jaune fondant à 74°C

EXEMPLE 37 : Préparation d'un dérivé de phénylalanine par la méthode D.

37-1: 3-Ethoxv phénvlalanine(R.S). chlorhydrate (ou 3-O-Ethyltyrosine (R.S). chlorhydrate)

On place dans un ballon 1 g de N-tert butoxy carbonyl 3-éthoxy phénylalanine (R,S) en solution dans 3,6 ml de dioxanne chlorhydrique puis le mélange est agité 5 h à température ambiante. Le précipité formé est filtré, rincé par du dioxanne puis à l'éther puis séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C pour donner 0,65 g de 3- éthoxy phénylalanine (R,S), chlorhydrate sous forme d'un solide blanc fondant à 200°C

37-2: N-tert Butoxv carbonvl 3-éthoxv phénylalanine (R.S)

On place dans un ballon 1,33 g de N-tert butoxy carbonyl 3-éthoxy phénylalaninate d'éthyle (R,S) en solution dans 8 ml de méthanol puis on ajoute 8 ml de soude IN. Après 18 h d'agitation à température ambiante, le mélange est évaporé sous pression réduite, puis acidifié par 8,56 ml d'acide chlorhydrique IN. Le produit est extrait par 2 fois 10 ml d'acétate d'éthyle, les phases organiques sont réunies, lavées par 2 fois 10 ml d'eau, séchées filtrées puis concentrées à sec sous pression réduite pour donner 1 g de N-tert butoxy carbonyl 3-éthoxy phénylalanine (R,S) sous forme d'une huile jaune (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,7, éluant : toluène 80 / MeOH 10 / diéthylamine 10).

37-3: N-tert Butoxv carbonvl 3-éthoxv phénvlalaninate d'éthvle (R.S)

On place dans un tricol sous atmosphère d'azote, 1,5 g de N-tert butoxy carbonyl 3-tyrosine (R,S) en solution dans 7,5 ml de DMF sec puis on ajoute, 0,508 g d'hydrure de sodium à 50% dans l'huile. Après 2 h d'agitation à température ambiante on ajoute 0,86 ml de iodoéthane puis le mélange est agité 4 h à température ambiante. Le milieu est filtré, le solide résultant lavé par 3 fois 10 ml d'eau puis 2 fois 10 ml d'éther de pétrole pour donner après séchage sous pression réduite (2,7 kPa) à 30°C, 1,33 g de N-tert butoxy carbonyl 3-éthoxy phénylalaninate d'éthyle (R,S) sous forme d'un solide blanc.

37-4: N-tert Butoxv carbonvl 3-tvrosine (R.S)

On place sous agitation dans un tricol, 18 g de 3-tyrosine (R.S) en solution dans 180 ml de dioxanne puis on ajoute 99 ml de soude IN puis 26 g de di-tert butyl dicarbonate en solution dans 160 ml de dioxanne. Après 36 h d'agitation le milieu est concentré sous pression réduite à 30°C, repris avec 100 ml d'eau distillée, acidifié avec de l'acide chlorhydrique IN jusqu'à pH 5 puis extrait par 2 fois 200 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée puis concentrée à sec sous pression -réduite à 30°C, pour donner 30 g de N-tert butoxy carbonyl 3-tyrosine (R,S) sous forme d'un solide blanc (Silice Merck 5719, Rf≈ 0,25, éluant : toluène 80, MeOH 10, diéthylamine 10).

EXEMPLE 38: Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode E.

38- 1: 4-Diallvlaminophénvlalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 5,8 g de 4- diallylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 48 ml d'acide chlorhydrique

ION, on obtient après évaporation un solide qui est trituré dans 50ml d'acétone, filtré puis trituré dans 10ml de dichlorométhane, filtré, puis rincé par 3 fois 10 ml d'éther éthylique. Apres séchage sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C, on obtient 4,41 g de

dichlorhydrate de -4-diaUylaminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc cassé fondant vers 135°C (décomposition).

38- 2: 4-Allvlaminophénvlalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 3,27 g de 4- allylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 30 ml d'acide chlorhydrique ION, on obtient après évaporation un solide qui est trituré dans 50ml d'acétone, filtré puis séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 2,3 g de dichlorhydrate de 4-aUylaminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc fondant vers 134°C (décomposition).

38-3: 4-Diallylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle et 4- Allylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle

On place dans un tricol surmonté d'une ampoule de coulée et maintenu sous atmosphère d'azote 10g de 4-aminobenzylacétamidomalonate de diéthyle en solution dans 150ml de DMF. On ajoute lentement à température ambiante, 6,57 ml de bromure d'allyle puis 10,76ml de triéthylamine sous agitation. Après 19 h d'agitation on ajoute à nouveau, 1,31ml de bromure d'allyle et 2,15ml de triéthylamine et le mélange est agité 26h. Le milieu réactionnel est versé sur 1,51 d'eau distillée et extrait par 11 d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est décantée, lavée par 2 fois 500ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées par 500ml d'eau distillée puis par 500ml d'eau saturée en chlorure de sodium, décantées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées à sec pour donner une huile marron qui est purifiée par chromatographie flash (éluant CH2CI2 90/ AcOEt 10) pour donner 6,66 g de 4-diallylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide beige fondant à 94-96°C (Rf =0,6 AcOEt 50/ cyclohexane 50) et 3,49g de 4- allylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide beige fondant à 104-106°C (Rf =0,45 AcOEt 50/ cyclohexane 50)

Le 4-aminobenzyl acétamido malonate de diéthyle peut être préparé comme décrit dans J.B. Burckhalter, VC Stephens, J. Am. Chem. Soc., 5_£, 1951, 73.

EXEMPLE 39: Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode F

39-1: 4-Ethvl isopropvl phénylalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 2,9 g de 4-éthyl isopropylbenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 24,6 ml d'acide chlorhydrique ION, on obtient après évaporation un solide qui est trituré dans 20 ml d'acétone, filtré puis séché sous pression réduite (2,7 kPa) à J40°C On obtient 2 g de dichlorhydrate de 4-éthyl isopropyl-tminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc fondant vers 147°C (décomposition).

39-2: 4-Ethyl isopropvl aminobenzvl acétamido malonate de diéthyle

On place dans un tricol maintenu sous atmosphère d'azote, 15g de 4-éthyl .iminobenzylacétamido malonate de diéthyle dans 70ml de THF, on ajoute 6,4ml de 2-iodopropane puis 8,4ml de l,5-diazabicyclo[4-3-0]non-5-ène puis le mélange est chauffé 24h à 60°C On ajoute alors 2,13ml de 2-iodopropane, puis 8,4ml de 1,5-

diazabicyclo[4-3-0]non-5-ène puis le mélange est chauffé 24h supplémentaires à 60°C

Le mélange est ramené à température ambiante puis extrait par 50ml de dichlorométhane et 50ml d'eau distillée. La phase aqueuse est décantée puis relavée par 2 fois 30ml de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies, lavées par 60 ml d'eau distillée puis par 50ml d'eau distillée saturée en NaCl. la phase organique est décantée, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, puis concentrée à sec sous pression réduite pour donner 16,2g d'un produit qui est purifié par chromatographie flash (dichlorométhane, MeOH 90/10). On obtient ainsi 4,59g d'un produit qui est recristallisé dans 45ml de cyclohexane pour donner 3,44g de 4-éthyl isopropyl aminobenzyl acétamido malonate de liéthyle sous forme de cristaux blancs fondants à 80°C

39-3: 4-Ethvlaminobenzvlacétamido malonate de diéτhvle

Le 4-éthyl arninobenzylacétamido malonate de diéthyle peut être préparé en opérant comme à l'exemple 35-7 mais à partir de 22 g de 4-aminobenzyl acétamidomalonate de diéthyle, 500 ml d'éthanol et 70 g de nickel de raney. On obtient ainsi, 23,8 g de 4-éthylamino benzylacétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc cassé fondant à 136°C

39-4: 4- Allyl éthylaminophénylalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 4,54 g de 4-allyl éthylbenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 37,9 ml d'acide chlorhydrique à

ION, on obtient après évaporation un solide qui est séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 3,67g de dichlorhydrate de -4-allyl éthylaminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide brun fondant vers 130°C (décomposition).

.39-5: 4-Allyl éthylaminobenzvl acétamido malonate de diéthvle

En opérant comme à l'exemple 39-2 mais à partir de 8 g de 4- éthyl__minobenzylacétamido malonate de diéthyle, 4 ml de bromure d'allyle, 5,82 ml de l,5-diazabicyclo[4-3-0]non-5-ène, dans 50ml de THF, on obtient après

purification par chromatographie flash (éluant CH2C12 / AcOEt 90-10 en volume) 5, 6g d'un solide qui est recristallisé dans 35ml de cyclohexane. On obtient ainsi 5,43g de 4-allyl éthylaminobeiizyl acétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 86°C

39-6: 4-Ethvl propylaminophénylalanine (RS). dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 2,5 g de 4-éthyl propylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 21 ml d'acide chlorhydrique à ION, on obtient après évaporation un solide qui est séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 2 g (97%) de dichlorhydrate de 4-éthyl propylaminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc fondant vers 147°C (décomposition).

39-7: 4-Ethvl propylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle

En opérant comme à l'exemple 39-2 mais à partir de 10 g de 4- éthyl-iminobenzylacétamido malonate de diéthyle, 5,6 ml de 1-iodo propane, 7,2 ml de l,5-diazabicyclo[-4-3-0]non-5-ène, dans 70ml de THF, on obtient après 36heures de réaction puis purification par chromatographie flash (éluant CH2C12 / MeOH 97-3 en volume), 2,8g d'un solide qui est recristallisé dans 26 ml de cyclohexane. On obtient ainsi 2,9g de 4-éthyl propylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 84-86°C

39-8: 4-Ethyl méthvlcvclopropylaminophénvlalanine (RS) dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 3 g de 4-éthyl méthylcyclopropylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle et de 25 ml d'acide chlorhydrique ION, on obtient après 3 jours de réaction, puis évaporation un solide qui est trituré dans 40 ml d'acétone, filtré puis séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 2,24 g de dichlorhydrate de 4-éthyl méthylcyclopropylaminophénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc fondant vers 140°C (décomposition).

39-9: 4-Ethvl méthylcvclopropvlaminobenzvl acétamido malonate de diéthvle

En opérant comme à l'exemple 39-2 mais à partir de 8 g de 4- éthylaminobenzylacétamido malonate de diéthyle, 2,6 ml de bromométhylcyclopropane, 2,97 ml de l,5-diazabicyclo[4-3-0]non-5-ène, dans 50ml de THF, on obtient après 3 jours de réaction puis purification par chromatographie flash (éluant CH2C12 / AcOEt 90-10 en volume), 3,3 g de 4-éthyl méthylcyclopropylaminobenzyl acétamido malonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 112-114°C -

EXEMPLE 40: Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode G

40-1: 4-(1-pvrrolidinyl) phénylalanine (RS) dichlorhydrate

En opérant comme à l'exemple 35-1 mais à partir de 1,5 g de 4-(l-pyrrolidinyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle et de 40 ml d'acide chlorhydrique 5N, on obtient après évaporation un solide qui est trituré dans 15 ml d'acétone, filtré puis

séché sous pression réduite (2,7 kPa) à 40°C On obtient 0,6 g de dichlorhydrate de 4- (1-pyrrolidinyl) phénylalanine (RS) sous forme d'un solide blanc cassé.

40-2: 4-(l-pvrrolidinyl) benzvl acétamidomalonate de diéthyle

On place dans un autoclave 4g de 4-(l-pyrrolyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle en solution dans 100ml de MeOH et lg de palladium sur charbon à 10%. Après avoir purgé 3 fois à l'azote, le produit est hydrogéné sous une pression de 14 bars d'hydrogène à 19°C Après 25 heures d'agitation, l'hydrogénation est arrêtée, le produit filtré sur Clarcel®, rincé au dichlorométhane puis la solution concentrée sous pression réduite pour donner 3,85 g d'un solide qui est trituré dans un mélange de 50ml d'heptane et de 10 ml d'éther éthylique. Le solide obtenu est filtré, séché puis purifié par chromatographie flash (éluant CH2CI2 / acétone 90/10 en volume) pour donner 1,6g de 4-(l-pyrrolidinyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle sous forme d'un solide blanc fondant à 132°C

40-3: 4-(l-pyrrolyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle

On place dans un tricol maintenu sous azote, 4,6 g de 4-aminobenzyl acétamidomalonate de diéthyle dans 104 ml d'acide acétique.On ajoute 7,02 g d'acétate de sodium puis 1,87 ml de 2,5-diméthoxytétrahydrofur-_nne. Le mélange est chauffé à 65°C pendant lh 15mn, refroidi, puis extrait par 100ml de dichlorométhane et 100ml d'eau distillée. La phase aqueuse est décantée puis lavée par 3 fois 100 ml de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies, lavées par 100 ml d'eau puis par 100 ml d'une solution saturée en NaCl, décantées puis séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis évaporées à sec sous pression réduite(50k Pa) pour donner 6,2g d'un solide qui est purifié par chromatographie flash (éluant CH2C12 / acétone 75/25 en volume). On obtient ainsi 3,57 g de 4-(l-pyrrolyl) benzyl acétamidomalonate de diéthyle sous forme d'un solide beige fondant à 110°C

EXEMPLE 41: Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode H

41-1: 4-Ethylthiométhyl phénylalanine ⁽ RS ⁾

On place dans un tricol maintenu sous azote, 300ml de méthanol anhydre puis on ajoute sous agitation 1, 72g de méthylate de sodium puis 5,55ml d'éthyl mercaptan. Le solvant est concentré sous pression réduite à 40°C pour donner 8,5 g du sel de sodium de réthylmercaptan qui est mis en solution dans 100ml de THF anhydre. On ajoute à température ambiante 3,6g de 4-chlorométhyl phénylalanine (RS) puis le mélange est chauffé au reflux pendant 18h. Le solvant est évaporé sous pression réduite à 40°C et le résidu repris par 100ml d'eau distillée. La solution trouble obtenue est acidifiée par 5 ml d'acide acétique. Le précipité obtenu est filtré, rincé à l'eau distillée puis séché à 60)C sous pression réduite pour donner 3,6g d'un solide qui est purifié par chromatographie flash (éluant AcOEt 60, AcOH 12, eau 10). On obtient ainsi 256 mg de 4-éthylthiométhyl phénylalanine (RS), sous forme d'un solide blanc fondant à 251°C La 4-chlorométhyl phénylalanine (RS) peut être obtenue par analogie avec la 4- chlorométhyl phénylalanine (S) décrite dans : R.Gonzalez-Muniz, F. Cornille, F. Bergeron, D. Ficheux, J. Pothier, C. Durieux and B. Roques, Int. J. Pept. Protein. Res., 1991,37 (41), 331-340.

EXEMPLE 42: Préparation de dérivés de phénylalanine par la méthode I

42-1 :4-O-(2-Chloroéthv1) tvrosine (S), chlorhydrate

On place dans un ballon, 5g de N-tert-butoxy carbonyl-4-O-(2-chloroéthyl) tyrosine (S) en solution dans 50ml de dioxane chlorhydrique. Après 28h d'agitation, le mélange est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris par 50ml d'éther, agité puis filtré. Le solide obtenu est lavé par 2 fois 25 ml d'éther, séché sous pression réduite pour donner 1,58g de chlorhydrate de 4-O-(2-chloroéthyl) tyrosine (S) sous forme d'un solide blanc fondant à 260°C

42-2: N-tert-butoxv carhonvl-4-O-(2-chloroéthvl) tvrosine (S)

On place dans un tricol sous atmosphère d'azote, 14g de N-tert-butoxycarbonyl tyrosine (S), en solution dans 140ml de DMF. On ajoute 4,8g d'hydrure de sodium à 50% dans l'huile lentement à la spatule. Après 2h d'agitation à température ambiante,

on ajoute 16,87g de 1-tosyl 2-chloroéthanol . Après 2 jours d'agitation on ajoute 2,4g d'hydrure de sodium à 50% dans l'huile et 8,4ml supplémentaires de 1-tosyl 2- chloroéthanol . La même opération est effectuée après 24h et l'agitation est poursuivie 24h supplémentaires. La réaction est arrétée par addition de 100ml d'eau distillée et le mélange réactionnel est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris par 100ml d'eau distillée puis extrait par 3 fois 100ml d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est décantée, acidifiée par 50ml d'HCl IN jusqu'à pH3 et le produit est extrait par 3 fois 100ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées par 2 fois 50ml d'eau, décantées , séchées sur sulfate de magnésium, filtrées puis concentrées à sec sous pression réduite pour donner 13,51g de N-tert- butoxy carbonyl-4-O-(2-chloroéthyl) tyrosine (S) sous forme d'une huile marron (Rf 0,5, toluène 70% / méthanol 20% / diéthylamine 10%) utilisée telle quelle dans l'étape suivante.

TABLEAU V

Bibliographie:

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LISTE PB SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON

(C) VILLE: ANTONY

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 92165

(ii) TITRE DE L* INVENTION : NOUVELLES STREPTOGRAMINES ET PROCEDE DE PREPARATION DE STREPTOGRAMINES PAR MUTASYNTHESE.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8

(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version 1.1.25 (OEB)

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 2888 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

10 20 30 40 50 60 CTGCAGTTCC CCGGGGCCAC CGTGCTCAGC TCCTCACCCG AACGGTTCCT GCGCATCGGC

70 80 90 100 110 120 GCGGACGGCT GGGCGGAGTC CAAACCCATC AAGGGCACCC GCCCCCGCGG CGCCGGCCCC

130 140 150 160 170 180 GCCCAGGACG CCGCCGTCAA GGCCTCCCTC GCCGCGGCCG AGAAGGACCG CAGCGAGAAC

190 200 210 220 230 240 CTGATGATCG TCGACCTGGT CCGCAACGAC CTCGGCCAGG TCTGCGACAT CGGCTCCGTC

250 260 270 280 290 300 CACGTACCGG GCCTGTTCGA GGTGGAGACC TACGCCACCG TCCACCAGCT CGTCAGCACG

310 320 330 340 350 360 GTCCGCGGCC GCCTGGCGGC CGACGTCTCC CGCCCCCGCG CGGTACGGGC CGCCTTCCCC

370 380 390 400 410 420 GGCGGGTCGA TGACCGGCGC GCCCAAGGTC CGCACCATGC AGTTCATCGA CCGGCTCGAG

430 440 450 460 470 480 AAGGGCCCGC GCGGCGTGTA CTCGGGCGCG CTGGGCTACT TCGCCCTCAG CGGCGCGGCC

490 500 510 520 530 540 GACCTCAGCA TCGTCATCCG CACCATCGTC GCCACCGAGG AGGCCGCCAC CATCGGCGTG

550 560 570 580 590 600 GGCGGCGCCG TCGTCGCCCT GTCCGACCCC GACGACGAGG TCCGCGAAAT GCTCCTCAAG

610 620 630 640 650 660 GCGCAGACCA CCCTCGCCGC CCTGCGCCAG GCACACGCGG GCGCCACCGC CTCGGACCGT

670 680 690 700 710 720 GAACTCCTGG CCGGCAGCCT GCGGTGACCC ACCCACCGCC CCACCCCGGC CACCGCAACC

730 740 750 760 770 780 CCGGCTCACC CCCGGGGCGG CCGCGCGCGG TGCCGCCCGG CGGCCGACCC GGCGACGGGT

790 800 810 820 830 840 CCGCTCGCGG ACCGGGTGAC GGACCCGGCG GCGGGGCCGG CGGCGGGCCG GGACGTGGGC

850 860 870 880 890 900 CGGGACGTGG GCCCGGCGTC CCCGGCGACC GGCACGGCGG CGGGCCCGGA CGTGGGCCCG

910 920 930 940 950 960

GCGTGCCCGG CGACCGGCAC GGTGGCGGGG CGGGGCGGGG GACGGTCAGT GCAGGGCGGT

970 980 990 1000 1010 1020

GAACATCCGC GCGCACAGCC GTTCCAGCTC CGCGCCGTGC TCGCCCAGCA CACCGCGCAG

1030 1040 1050 1060 1070 1080 TTCGGCGAAC AGGGCGGCGA ACGTCTCCTC GTCGCCCCTC TCGACGGCCT GCCCCAGCCG

1090 1100 1110 1120 1130 1140

CACCAGGCCG CGGCCCAGCG CCTGCCGCGC GGCCGGCGCG CCGGGGTTGG CGGCCTGGAT

1150 1160 1170 1180 1190 1200

GTCGAAATAC ACCTCCGGCG TCCCGCCGGC GATCCGGGCC AGCAGCGCCA GCATCGCCAG

1210 1220 1230 1240 1250 1260 ATGCGGCGGC GGGGCACTGT CCCGCAGCGC CCCCACGTCC ACCGACAGCT CACCCAGGCC

1270 1280 1290 1300 1310 1320 CAGCCCGAAG GCCAGCACCG CGGCATGCGT GGCGGCCTGC TGCGCGGCGG TCAGCTCGTC

1330 1340 1350 1360 1370 1380 GTGCCGCCGC GCCGGCATCT CCACCACCCG GGCCCCCCAC CCGGCCACCA GCTCCACCAG

1390 1400 1410 1420 1430 1440 GGCCCGCACA CCGGGCCCGT CGGTGACCAC CACCGCCGCC ACCGGCCGCC CCTGAAGACC

1450 1460 1470 1480 1490 1500 CAGCGAGGGG GCGAACATCG GGTTCAGCCC CACCGCCTGC AGCCCCGGCG CCGCCTCACG

1510 1520 1530 1540 1550 1560 CAGCCGCCCG GCGATCCGGC TCTTGACCGA CAAGGTGTCC GCGAGCACCG CACCGGGCCG

1570 1580 1590 1600 1610 1620 CATCACCCCC GCCAGCACCT CCACCGCCTC CCACGCCACC GGCTCCGGCA CCGCCAGCAC

1630 1640 1650 1660 1670 1680 CACCACGTCC GCCGCCGCCA GCGCCGCGAC CGCCTCCGGC CCCGGCCGCC GCACATCACC

1690 1700 1710 1720 1730 1740

GGCCACCACC CGCACCCCGT CCGCCGCACC GGCCCCGGCC ACGTCCAGCC AGGTCACCGC

1750 1760 1770 1780 1790 1800 CACCCCCGAA CGCACCAGCC AGTGGCTGAA CATGCGGCCC ACCGCACCGG CCCCGCCCAC

1810 1820 1830 1840 1850 1860 CACCACACAA CGCCCGAACA CCGAACCACC CCTCATCCGC GTTCCCGATC CCCCCGGTAC

1870 1880 1890 1900 1910 1920 GGAGGAAGAA CCATGACCCC GCCCGCCATC CCCGCCGCCC CGCCCGCCAC CGGGCCCGCC

1930 1940 1950 1960 1970 1980

CCCGCCACCG ACCCCCTCGA CGCGCTGCGC GCCCGCCTGG ACGCCGCGGA CGCCGCCCTG

1990 2000 2010 2020 2030 2040

CTGGACGCCG TCCGCACACG CCTGGACATC TGCCTGCGCA TCGGCGAGTA CAAGCGCCTC

2050 2060 2070 2080 2090 2100 CACCAGGTGC CGATGATGCA GCCCCACCGG ATCGCCCAGG TCCACGCCAA CGCCGCCCGC

2110 2120 2130 2140 2150 2160 TACGCCGCCG ACCACGGCAT CGACCCCGCC TTCCTGCGCA CCCTGTACGA CACGATCATC

2170 2180 2190 2200 2210 2220 ACCGAGACCT GCCGCCTCGA GGACGAGTGG ATCGCCTCCG GCGGCGCCCC CGTCCCCACG

2230 2240 2250 2260 2270 2280 CCCGTGCACG CGTCCGCGTC CGCGCGGGGG GCCGTGTCGT GACCGCCGCC GCACCCACCC

2290 2300 2310 2320 2330 2340 TCGCCCAGGC GCTGGACGAG GCCACCGGGC AGCTGACCGG CGCCGGGATC ACCGCCGACG

2350 2360 2370 2380 2390 2400

CCGCCCGGGC CGACACCCGG CTGCTGGCCG CCCACGCCTG CCAGGTCGCC CCGGGGGACC

2410 2420 2430 2440 2450 2460

TCGACACCTG CCTGGCCGGC CCGGTGCCGC CCCGGTTCTG GCACTACGTC CGGCGCCGTC

2470 2480 2490 2500 2510 2520 TGACCCGCGA ACCCGCCGAA CGCATCGTCG GCCACGCCTA CTTCATGGGC CACCGCTTCG

2530 2540 2550 2560 2570 2580 ACCTGGCCCC CGGCGTCTTC GTCCCCAAAC CCGAGACCGA GGAGATCACC CGGGACGCCA

2590 2600 2610 2620 2630 2640 TCGCCCGCCT GGAGGCCCTC GTCCGCCGCG GCACCACCGC ACCCCTGGTC GTCGACCTGT

2650 2660 2670 2680 2690 2700 GCGCCGGACC GGGCACCATG GCCGTCACCC TGGCCCGCCA CGTACCGGCC GCCCGCGTCC

2710 2720 2730 2740 2750 2760 TGGGCATCGA ACTCTCCCAG GCCGCCGCCC GCGCCGCCCG GCGCAACGCC CGCGGCACCG

2770 2780 2790 2800 2810 2820 GCGCCCGCAT CGTGCAGGGC GACGCCCGCG ACGCCTTCCC CGAACTGAGC GGCACCGTCG

2830 2840 2850 2860 2870 2880 ACCTCGTCGT CACCAACCCG CCCTACATCC CCATCGGACT GCGCACCTCC GCACCCGAAG

TGCTCGAG

(3) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 888 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2

ATG AGG GGT GGT TCG GTG TTC GGG CGT TGT GTG GTG GTG GGC GGG GCC GGT GCG 54 Met Arg Gly Gly Ser Val Phe Gly Arg Cys Val Val Val Gly Gly Ala Gly Ala 18

GTG GGC CGC ATG TTC AGC CAC TGG CTG GTG CGT TCG GGG GTG GCG GTG ACC TGG 108 Val Gly Arg Met Phe Ser His Trp Leu Val Arg Ser Gly Val Ala Val Thr Trp 36

CTG GAC GTG GCC GGG GCC GGT GCG GCG GAC GGG GTG CGG GTG GTG GCC GGT GAT 162

Leu Asp Val Ala Gly Ala Gly Ala Ala Asp Gly Val Arg Val Val Ala Gly Asp 54

GTG CGG CGG CCG GGG CCG GAG GCG GTC GCG GCG CTG GCG GCG GCG GAC GTG GTG 216 Val Arg Arg Pro Gly Pro Glu Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Val Val 72

GTG CTG GCG GTG CCG GAG CCG GTG GCG TGG GAG GCG GTG GAG GTG CTG GCG GGG 270

Val Leu Ala Val Pro Glu Pro Val Ala Trp Glu Ala Val Glu Val Leu Ala Gly 90

GTG ATG CGG CCC GGT GCG GTG CTC GCG GAC ACC TTG TCG GTC AAG AGC CGG ATC 324

Val Met Arg Pro Gly Ala Val Leu Ala Asp Thr Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile 108

GCC GGG CGG CTG CGT GAG GCG GCG CCG GGG CTG CAG GCG GTG GGG CTG AAC CCG 378

Ala Gly Arg Leu Arg Glu Ala Ala Pro Gly Leu Gin Ala Val Gly Leu Asn Pro 126

ATG TTC GCC CCC TCG CTG GGT CTT CAG GGG CGG CCG GTG GCG GCG GTG GTG GTC 432

Met Phe Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gin Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Val 144

ACC GAC GGG CCC GGT GTG CGG GCC CTG GTG GAG CTG GTG GCC GGG TGG GGG GCC 486 Thr Asp Gly Pro Gly Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Val Ala Gly Trp Gly Ala 162

CGG GTG GTG GAG ATG CCG GCG CGG CGG CAC GAC GAG CTG ACC GCC GCG CAG CAG 540

Arg Val Val Glu Met Pro Ala Arg Arg His Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gin Gin 180

GCC GCC ACG CAT GCC GCG GTG CTG GCC TTC GGG CTG GGC CTG GGT GAG CTG TCG 594

Ala Ala Thr His Ala Ala Val Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Glu Leu Ser 198

GTG GAC GTG GGG GCG CTG CGG GAC AGT GCC CCG CCG CCG CAT CTG GCG ATG CTG 6 8

Val Asp Val Gly Ala Leu Arg Asp Ser Ala Pro Pro Pro His Leu Ala Met Leu 216

GCG CTG CTG GCC CGG ATC GCC GGC GGG ACG CCG GAG GTG TAT TTC GAC ATC CAG 702

Ala Leu Leu Ala Arg Ile Ala Gly Gly Thr Pro Glu Val Tyr Phe Asp Ile Gin 234

GCC GCC AAC CCC GGC GCG CCG GCC GCG CGG CAG GCG CTG GGC CGC GGC CTG GTG 756

Ala Ala Asn Pro Gly Ala Pro Ala Ala Arg Gin Ala Leu Gly Arg Gly Leu Val 252

CGG CTG GGG CAG GCC GTC GAG AGG GGC GAC GAG GAG ACG TTC GCC GCC CTG TTC 810 Arg Leu Gly Gin Ala Val Glu Arg Gly Asp Glu Glu Thr Phe Ala Ala Leu Phe 270

GCC GAA CTG CGC GGT GTG CTG GGC GAG CAC GGC GCG GAG CTG GAA CGG CTG TGC 864 Ala Glu Leu Arg Gly Val Leu Gly Glu His Gly Ala Glu Leu Glu Arg Leu Cys 288

GCG CGG ATG TTC ACC GCC CTG CAC 888 Ala Arg Met Phe Thr Ala Leu His 296

(4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 387 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3

ATG ACC CCG CCC GCC ATC CCC GCC GCC CCG CCC GCC ACC GGG CCC GCC CCC GCC 54

Met Thr Pro Pro Ala Ile Pro Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gly Pro Ala Ala Ala 18

ACC GAC CCC CTC GAC GCG CTG CGC GCC CGC CTG GAC GCC GCG GAC GCC GCC CTG 108 Thr Asp Pro Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Ala Asp Ala Ala Leu 36

CTG GAC GCC GTC CGC ACA CGC CTG GAC ATC TGC CTG CGC ATC GGC GAG TAC AAG 162

Leu Asp Ala Val Arg Thr Arg Leu Asp Ile Cys Leu Arg le Gly Glu Tyr Lys 54

CGC CTC CAC CAG GTG CCG ATG ATG CAG CCC CAC CGG ATC GCC CAG GTC CAC GCC 216

Arg Leu His Gin Val Pro Met Met Gin Pro His Arg Ile Ala Gin Val His Ala 72

AAC GCC GCC CGC TAC GCC GCC GAC CAC GGC ATC GAC CCC GCC TTC CTG CGC ACC 270

Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Ala Asp His Gly Ile Asp Pro Ala Phe Leu Arg Thr 90

CTG TAC GAC ACG ATC ATC ACC GAG ACC TGC CGC CTC GAG GAC GAG TGG ATC GCC 324

Leu Tyr Asp Thr Ile Ile Thr Glu Thr Cys Arg Leu Glu Asp Glu Trp Ile Ala 108

TCC GGC GGC GCC CCC GTC CCC ACG CCC GTG CAC GCG TCC GCG TCC GCG CGG GGG 378 Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Thr Pro Val His Ala Ser Ala Ser Ala Arg Gly 126

GCC GTG TCG 387 Ala Val Ser 129

(5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 4496 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4

10 20 30 40 50 60

CTCGAGCAGG TGCCCCACCT CGGCGGCACG GTGCGCGGGC AGCGCGAACA CCGGCAGCGC

70 80 90 100 110 120

GCCCAGACGG AACAGCGCGA AGCACACCGC GACGAACTCG GGCGTGTTCG GCAGCTGCAC

130 140 150 160 170 180

CAGCACCCGC TCGCCGGCGC CGATCCCGCG CGCCGCGAAC CCCGCCGCCA GCCGGTCGCA

190 200 210 220 230 240 CCAGCGGTCC AGGGCACGGT AGGTGACACG GGAGCACCCG TCCGCGCCGA CCAGCGCCTC

250 260 270 280 290 300

CCGCTCGCCG TACTGCTCCG CCCAGCGGCC CAGCAGCATG CCCAGCGGCT CGCCCCGCCA 310 320 330 340 350 360 GTAGCCGGCC GCCCGGTACT TCGCGGCCAC ATCCTCGGGC CAGGGAACGC ATCCGTCCAG

370 380 390 400 410 420

CATCGTTGGT CCTTTCCGGC TTCGTCCTCG CGTCGCGCCC AGTGTCGGCA GCGCCGTTGA

430 440 450 460 470 ' 480

CACGCCGCTG ATGCGCCGCG CCCGCGCGCC GCCGCTCCGT CAGGAGCCGA TCAGGGCGGC

490 500 510 520 530 540

GTCAGCCGGG CCGGACAGGA TGCCGCCCAC GGGGCCCGGC ACACCGGGCC GCGGCGACAG

550 560 570 580 590 600 CGGGCCGGCG ACCGGCAGGC CGACACCACG CACGGACGAG AAGAAACAAC ACAAGGGGAG

610 620 630 640 650 660 CACCCGATGG AGACCTGGGT CCTGGGCCGG CGCGACGTCG CCGAGGTGGT GGCCGCCGTC

670 680 690 700 710 720 GGCCGCGACG AACTCATGCG CCGCATCATC GACCGCCTCA CCGGCGGACT GGCCGAGATC

730 740 750 760 770 780 GGCCGCGGCG AGCGGCACCT GTCCCCGCTG CGCGGCGGAC TGGAACGCAG CGAACCCGTG

790 800 810 820 830 840 CCCGGCATCT GGGAATGGAT GCCGCACCGC GAACCCGGCG ACCACATCAC CCTCAAGACC

850 860 870 880 890 900 GTCGGCTACA GCCCCGCCAA CCCCGGCCGC TTCGGCCTGC CGACCATCCT GGGCACCGTC

910 920 930 940 950 960 GCCCGCTACG ACGACACCAC CGGCGCCCTG ACCGCCCTGA TGGACGGCGT GCTGCTCACC

970 980 990 1000 1010 1020 GCCCTGCGCA CCGGCGCCGC CTCCGCCGTC GCCTCCCGCC TGCTGGCCCG CCCCGACAGC

1030 1040 1050 1060 1070 1080 CACACCCTGG GACTGATCGG CACCGGCGCC CAGGCCGTCA CCCAACTGCA CGCCCTGTCC

1090 1100 1110 1120 1130 1140 CTGGTACTGC CCCTGCAACG GGCCCTGGTG TGGGACACCG ACCCCGCCCA CCGGGAAAGC

1150 1160 1170 1180 1190 1200 TTCGCCCGGC GCGCCGCGTT CACCGGCGTC AGCGTCGAGA TCGCCGAGCC CGCCCGGATC

1210 1220 1230 1240 1250 1260 GCCGCCGAGG CCGACGTCAT CTCCACCGCC ACCTCGGTAG CCGTCGGCCA GGGCCCGGTC

1270 1280 1290 1300 1310 1320 CTGCCCGACA CCGGCGTCCG CGAGCACCTG CACATCAACG CCGTCGGCGC GGACCTCGTC

1330 1340 1350 1360 1370 1380

GGCAAGACGG AACTGCCGCT CGGCCTGCTC GAGCGGGCGT TCGTCACCGC CGACCACCCC

1390 1400 1410 1420 1430 1440

GAGCAGGCGC TGCGCGAGGG CGAGTGCCAG CAACTCTCCG CCGACCGGCT CGGCCCGCAG

1450 1460 1470 1480 1490 1500 CTGGCCCACC TGTGCGCCGA CCCGGCGGCC GCCGCCGGCC GGCAGGACAC CCTGAGCGTC

1510 1520 1530 1540 1550 1560

TTCGACTCCA CCGGCTTCGC CTTCGAGGAC GCCCTGGCGA TGGAAGTGTT CCTCGAGGCC

1570 1580 1590 1600 1610 1620

GCCGCCGAAC GGGACCTGGG CATCCGGGTG GGCATCGAAC ACCACCCCGG CGACGCCCTG

1630 1640 1650 1660 1670 1680 GACCCCTACG CCCTCCAGCC CCTGCCCCTG CCCCTGGCCG CCCCCGCCCA CTGACCCCCC

1690 1700 1710 1720 1730 1740 CCTTTTTTCG GGACCCCCGC TCTTTTTCGA GACCCCCGCC CGGCCGGCCC GGCCCTCCTC

1750 1760 1770 1780 1790 1800 CCGCCGGCCC CCATGCCCGG CCGGGCCGGG GCACCCACGA CGCCCTCGCG AGGAGAGAGA

1810 1820 1830 1840 1850 1860 TGCCCCCCAC CCCCCGGCCC ACCACCGACG ACGGCGGCCG TGAACTGCTC GCCTGGCTGC

1870 1880 1890 1900 1910 1920

GCGAGATGCG CCACCACCAC CCCGTCCACG AGGACGAATA CGGTGCCTTC CACGTCTTCC

1930 1940 1950 1960 1970 1980

GGCACGCCGA CGTCCTCACC GTCGCCTCCG ACCCCGGCGT CTACTCCTCC CAGCTCAGCC v 1990 2000 2010 2020 2030 2040 GGCTACGGCC CGGCTCCCAG GCGTTGAGCG AACAGATCCT GTCGGTCATC GACCCGCCGA

2050 2060 2070 2080 2090 2100 TGCACCGCAC CCTGCGCCGC CTGGTCAGCC AGGCCTTCAC CCCCCGCACC GTCGCCGACC

2110 2120 2130 2140 2150 2160 TCGAACCACG CGTCACCGAA CTGGCCGGGC AACTGCTCGA CGCCGTCGAC GGCGACACGT

2170 2180 2190 2200 2210 2220 TCGACCTCGT CGCCGACTTC GCCTACCCGC TGCCCGTGAT CGTGATCGCC GAACTCCTCG

2230 2240 2250 2260 2270 2280 GCGTGCCGCC CGCCGACCGC ACCCTGTTCC GCTCCTGGTC CGACCGGATG CTGCAGATGC

2290 2300 2310 2320 2330 2340 AGGTCGCCGA CCCGGCGGAC ATGCAGTTCG GCGACGACGC CGACGAGGAC TACCAACGCC

2350 2360 2370 2380 2390 2400 TCGTCAAAGA ACCCATGCGC GCCATGCACG CCTACCTCCA CGACCACGTC ACCGACCGCC

2410 2420 2430 2440 2450 2460 GCGCCCGCCC CGCGAACGAC CTGATCTCCG CACTCGTCGC CGCCCGCGTG GAGGGCGAAC

2470 2480 2490 2500 2510 2520 GACTCACCGA CGAGCAGATC GTCGAATTCG GGGCGCTGCT GCTGATGGCC GGCCACGTCT

2530 2540 2550 2560 2570 2580 CCACCTCCAT GCTGCTCGGC AACACCGTGC TGTGCCTGAA GGACCACCCC CGGGCCGAGG

2590 2600 2610 2620 2630 2640 CCGCCGCCCG CGCCGACCGG TCCCTGATCC CCGCCCTGAT CGAAGAAGTA CTGCGGCTGC

2650 2660 2670 2680 2690 2700 GGCCGCCGAT CACCGTCATG GCCCGCGTCA CCACCAAGGA CACCGTCCTC GCCGGCACCA

2710 2720 2730 2740 2750 2760 CCATCCCCGC CGGACGCATG GTCGTGCCCT CCCTGCTGTC CGCCAACCAC GACGAACAGG

2770 2780 2790 2800 2810 2820 TCTTCACCGA CCCCGACCAC CTCGACCTCG CCCGCGAAGG CCGCCAGATC GCCTTCGGCC

2830 2840 2850 2860 2870 2880 ACGGCATCCA CTACTGCCTG GGCGCCCCGC TCGCCCGCCT GGAGGGCCGC ATCGCCCTGG

2890 2900 2910 2920 2930 2940 AAGCCCTCTT CGACCGATTC CCCGACTTCT CGCCCACCGA CGGCGCAAAA CTGCGCTACC

2950 2960 2970 2980 2990 3000 ACCGCGACGG ACTGTTCGGC GTCAAGAACC TGCCGCTGAC CGTACGGCGC GGCTGACACA

3010 3020 3030 3040 3050 3060 GACAAGGGGG CCACCTGGTG CGCACCGTGC GAACCCTGCT GATCGACAAC TACGACTCGT

3070 3080 3090 3100 3110 3120 TCACCTACAA CCTCTTCCAG ATGCTGGCCG AGGTGAACGG CGCCGCTCCG CTCGTCGTCC

3130 3140 3150 3160 3170 3180 GCAACGACGA CACCCGCACC TGGCAGGCCC TGGCGCCGGG CGACTTCGAC AACGTCGTCG

3190 3200 3210 3220 3230 3240 TCTCACCCGG CCCCGGCCAC CCCGCCACCG ACACCGACCT GGGCCTCAGC CGCCGGGTGA

3250 3260 3270 3280 3290 ^' 3300 TCACCGAATG GGACCTGCCG CTGCTCGGGG TGTGCCTGGG CCACCAGGCC CTGTGCCTGC

3310 3320 3330 3340 3350 3360 TCGCCGGCGC CGCCGTCGTC CACGCACCCG AACCCTTTCA CGGCCGCACC AGCGACATCC

3370 3380 3390 3400 3410 3420 GCCACGACGG GCAGGGCCTG TTCGCGAACA TCCCCTCCCC GCTGACCGTG GTCCGCTACC

3430 3440 3450 3460 3470 3480 ACTCGCTGAC CGTCCGGCAA CTGCCCGCCG ACCTGCGCGC CACCGCCCAC ACCGCCGACG

3490 3500 3510 3520 3530 3540 GGCAGCTGAT GGCCGTCGCC CACCGCCACC TGCCCCGCTT CGGCGTGCAG TTCCACCCCG

3550 3560 3570 3580 3590 3600 AATCGATCAG CAGCGAACAC GGCCACCGGA TGCTCGCCAA CTTCCGCGAC CTGTCCCTGC

3610 3620 3630 3640 3650 3660 GCGCGGCCGG CCACCGCCCC CCGCACACCG AACGCATACC CGCACCCGCA CCCGCCCCCG

3670 3680 3690 3700 3710 3720 CCCCCGCCCC CGCACCGGCA CCGCCCGCGT CCGCGCCGGT GGGGGAGTAC CGGCTGCATG

3730 3740 3750 3760 3770 3780 TGCGCGAGGT CGCCTGCGTG CCCGACGCGG ACGCCGCGTT CACCGCCCTG TTCGCCGACG

3790 3800 3810 3820 3830 3840 CCCCGGCCCG GTTCTGGCTC GACAGCAGCC GCGTCGAGCC GGGCCTCGCC CGCTTCACCT

3850 3860 3870 3880 3890 3900 TCCTCGGCGC CCCCGCCGGC CCGCTCGGCG AACAGATCAC CTACGACGTC GCCGACCGGG

3910 3920 3930 3940 3950 3960 CCGTGCGCGT CAAGGACGGT TCAGGCGGCG AGACCCGCCG GCCCGGCACC CTCTTCGACC

3970 3980 3990 4000 4010 4020 ACCTGGAACA CGAACTGGCC GCCCGCGCCC TGCCCGCCAC CGGCCTGCCC TTCGAGTTCA

4030 4040 4050 4060 4070 4080 ACCTCGGCTA CGTCGGCTAC CTCGGCTACG AGACCAAGGC CGACAGCGGC GGCGAGGACG

4090 4100 4110 4120 4130 4140 CCCACCGCGG CGAACTGCCC GACGGCGCCT TCATGTTCGC CGACCGGATG CTCGCCCTCG

4150 4160 4170 4180 4190 4200 ACCACGAACA GGGGCGGGCC TGGCTCCTGG CACTGAGCAG CACCCGACGG CCCGCCACCG

4210 4220 4230 4240 4250 4260 CACCCGCCGC CGAACGCTGG CTCACCGACG CCGCCCGGAC CCTCGCCACC ACCGCCCCCC

4270 4280 4290 4300 4310 4320 GCCCGCCCTT CACCCTGCTG CCCGACGACC AACTGCCCGC CCTGGACGTC CACTACCGCC

4330 4340 4350 4360 4370 4380 ACAGCCTGCC CCGCTACCGG GAACTGGTCG AGGAATGCCG CCGCCTGATC ACCGACGGCG

4390 4400 4410 4420 4430 4440

AGACCTACGA GGTGTGCCTG ACGAACATGC TCCGGGTGCC CGGCCGGATC GACCCGCTCA

4450 4460 4470 4480 4490 CCGCCTACCG CGCCCTGCGC ACCGTCAGCC CCGCCCCCTA CGCCGCCTAC CTGCAG

(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1065 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5

ATG GAG ACC TGG GTC CTG GGC CGG CGC GAC GTC GCC GAG GTG GTG GCC GCC GTC 54 Met Glu Thr Trp Val Leu Gly Arg Arg Asp Val Ala Glu Val Val Ala Ala Val 18

GGC CGC GAC GAA CTC ATG CGC CGC ATC ATC GAC CGC CTC ACC GGC GGA CTG GCC 108

Gly Arg Asp Glu Leu Met Arg Arg Ile Ile Asp Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 36

GAG ATC GGC CGC GGC GAG CGG CAC CTG TCC CCG CTG CGC GGC GGA CTG GAA CGC 162

Glu Ile Gly Arg Gly Glu Arg His Leu Ser Pro Leu Arg Gly Gly Leu Glu Arg 54

AGC GAA CCC GTG CCC GGC ATC TGG GAA TGG ATG CCG CAC CGC GAA CCC GGC GAC 216

Ser Glu Pro Val Pro Gly Ile Trp Glu Trp Met Pro His Arg Glu Pro Gly Asp 72

CAC ATC ACC CTC AAG ACC GTC GGC TAC AGC CCC GCC AAC CCC GGC CGC TTC GGC 270

His Ile Thr Leu Lys Thr Val Gly Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Gly Arg Phe Gly 90

CTG CCG ACC ATC CTG GGC ACC GTC GCC CGC TAC GAC GAC ACC ACC GGC GCC CTG 324 Leu Pro Thr Ile Leu Gly Thr Val Ala Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Gly Ala Leu 108

ACC GCC CTG ATG GAC GGC GTG CTG CTC ACC GCC CTG CGC ACC GGC GCC GCC TCC 378

Thr Ala Leu Met Asp Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Arg Thr Gly Ala Ala Ser 126

GCC GTC GCC TCC CGC CTG CTG GCC CGC CCC GAC AGC CAC ACC CTG GGA CTG ATC 432

Ala Val Ala Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro Asp Ser His Thr Leu Gly Leu Ile 144

GGC ACC GGC GCC CAG GCC GTC ACC CAA CTG CAC GCC CTG TCC CTG GTA CTG CCC 486

Gly Thr Gly Ala Gin Ala Val Thr Gin Leu His Ala Leu Ser Leu Val Leu Pro 162

CTG CAA CGG GCC CTG GTG TGG GAC ACC GAC CCC GCC CAC CGG GAA AGC TTC GCC 540

Leu Gin Arg Ala Leu Val Trp Asp Thr Asp Pro Ala His Arg Glu Ser Phe Ala 180

CGG CGC GCC GCG TTC ACC GGC GTC AGC GTC GAG ATC GCC GAG CCC GCC CGG ATC 594

Arg Arg Ala Ala Phe Thr Gly Val Ser Val Glu Ile Ala Glu Pro Ala Arg Ile 198

GCC GCC GAG GCC GAC GTC ATC TCC ACC GCC ACC TCG GTA GCC GTC GGC CAG GGC 648

Ala Ala Glu Ala Asp Val Ile Ser Thr Ala Thr Ser Val Ala Val Gly Gin Gly 216

CCG GTC CTG CCC GAC ACC GGC GTC CGC GAG CAC CTG CAC ATC AAC GCC GTC GGC 702 Pro Val Leu Pro Asp Thr Gly Val Arg Glu His Leu His Ile Asn Ala Val Gly 234

GCG GAC CTC GTC GGC AAG ACG GAA CTG CCG CTC GGC CTG CTC GAG CGG GCG TTC 756

Ala Asp Leu Val Gly Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Arg Ala Phe 252

GTC ACC GCC GAC CAC CCC GAG CAG GCG CTG CGC GAG GGC GAG TGC CAG CAA CTC 810

Val Thr Ala Asp His Pro Glu Gin Ala Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gin Gin Leu 270

TCC GCC GAC CGG CTC GGC CCG CAG CTG GCC CAC CTG TGC GCC GAC CCG GCG GCC 864

Ser Ala Asp Arg Leu Gly Pro Gin Leu Ala His Leu Cys Ala Asp Pro Ala Ala 288

GCC GCC GGC CGG CAG GAC ACC CTG AGC GTC TTC GAC TCC ACC GGC TTC GCC TTC 918

Ala Ala Gly Arg Gin Asp Thr Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Phe Ala Phe 306

GAG GAC GCC CTG GCG ATG GAA GTG TTC CTC GAG GCC GCC GCC GAA CGG GAC CTG 972 Glu Asp Ala Leu Ala Met Glu Val Phe Leu Glu Ala Ala Ala Glu Arg Asp Leu 324

GGC ATC CGG GTG GGC ATC GAA CAC CAC CCC GGC GAC GCC CTG GAC CCC TAC GCC 1026

Gly Ile Arg Val Gly Ile Glu His His Pro Gly Asp Ala Leu Asp Pro Tyr Ala 342

CTC CAG CCC CTG CCC CTG CCC CTG GCC GCC CCC GCC CAC 1065

Leu Gin Pro Leu Pro Leu Pro Leu Ala Ala Pro Ala His 355

(7) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1194 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6

ATG CCC CCC ACC CCC CGG CCC ACC ACC GAC GAC GGC GGC CGT GAA CTG CTC GCC 54 Met Pro Pro Thr Pro Arg Pro Thr Thr Asp Asp Gly Gly Arg Glu Leu Leu Ala 18

TGG CTG CGC GAG ATG CGC CAC CAC CAC CCC GTC CAC GAG GAC GAA TAC GGT GCC 108 Trp Leu Arg Glu Met Arg His His His Pro Val His Glu Asp Glu Tyr Gly Ala 36

TTC CAC GTC TTC CGG CAC GCC GAC GTC CTC ACC GTC GCC TCC GAC CCC GGC GTC 162 Phe His Val Phe Arg His Ala Asp Val Leu Thr Val Ala Ser Asp Pro Gly Val 54

TAC TCC TCC CAG CTC AGC CGG CTA CGG CCC GGC TCC CAG GCG TTG AGC GAA CAG 216 Tyr Ser Ser Gin Leu Ser Arg Leu Arg Pro Gly Ser Gin Ala Leu Ser Glu Gin 72

ATC CTG TCG GTC ATC GAC CCG CCG ATG CAC CGC ACC CTG CGC CGC CTG GTC AGC 270

Ile Leu Ser Val Ile Asp Pro Pro Met His Arg Thr Leu Arg Arg Leu Val Ser 90

CAG GCC TTC ACC CCC CGC ACC GTC GCC GAC CTC GAA CCA CGC GTC ACC GAA CTG 324 Gin Ala Phe Thr Pro Arg Thr Val Ala Asp Leu Glu Pro Arg Val Thr Glu Leu 108

GCC GGG CAA CTG CTC GAC GCC GTC GAC GGC GAC ACG TTC GAC CTC GTC GCC GAC 378

Ala Gly Gin Leu Leu Asp Ala Val Asp Gly Asp Thr Phe Asp Leu Val Ala Asp 126

TTC GCC TAC CCG CTG CCC GTG ATC GTG ATC GCC GAA CTC CTC GGC GTG CCG CCC 432

Phe Ala Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile Ala Glu Leu Leu Gly Val Pro Pro 144

GCC GAC CGC ACC CTG TTC CGC TCC TGG TCC GAC CGG ATG CTG CAG ATG CAG GTC 486

Ala Asp Arg Thr Leu Phe Arg Ser Trp Ser Asp Arg Met Leu Gin Met Gin Val 162

GCC GAC CCG GCG GAC ATG CAG TTC GGC GAC GAC GCC GAC GAG GAC TAC CAA CGC 540 Ala Asp Pro Ala Asp Met Gin Phe Gly Asp Asp Ala Asp Glu Asp Tyr Gin Arg 180

CTC GTC AAA GAA CCC ATG CGC GCC ATG CAC GCC TAC CTC CAC GAC CAC GTC ACC 594 Leu Val Lys Glu Pro Met Arg Ala Met His Ala Tyr Leu His Asp His Val Thr 198

GAC CGC CGC GCC CGC CCC GCG AAC GAC CTG ATC TCC GCA CTC GTC GCC GCC CGC 648

Asp Arg Arg Ala Arg Pro Ala Asn Asp Leu Ile Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg 216

GTG GAG GGC GAA CGA CTC ACC GAC GAG CAG ATC GTC GAA TTC GGG GCG CTG CTG 702

Val Glu Gly Glu Arg Leu Thr Asp Glu Gin Ile Val Glu Phe Gly Ala Leu Leu 234

CTG ATG GCC GGC CAC GTC TCC ACC TCC ATG CTG CTC GGC AAC ACC GTG CTG TGC 756

Leu Met Ala Gly His Val Ser Thr Ser Met Leu Leu Gly Asn Thr Val Leu Cys 252

CTG AAG GAC CAC CCC CGG GCC GAG GCC GCC GCC CGC GCC GAC CGG TCC CTG ATC 810

Leu Lys Asp His Pro Arg Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Asp Arg Ser Leu Ile 270

CCC GCC CTG ATC GAA GAA GTA CTG CGG CTG CGG CCG CCG ATC ACC GTC ATG GCC 864 Pro Ala Leu Ile Glu Glu Val Leu Arg Leu Arg Pro Pro Ile Thr Val Met Ala 288

CGC GTC ACC ACC AAG GAC ACC GTC CTC GCC GGC ACC ACC ATC CCC GCC GGA CGC 918

Arg Val Thr Thr Lys Asp Thr Val Leu Ala Gly Thr Thr Ile Pro Ala Gly Arg 306

ATG GTC GTG CCC TCC CTG CTG TCC GCC AAC CAC GAC GAA CAG GTC TTC ACC GAC 972

Met Val Val Pro Ser Leu Leu Ser Ala Asn His Asp Glu Gin Val Phe Thr Asp 324

CCC GAC CAC CTC GAC CTC GCC CGC GAA GGC CGC CAG ATC GGC TTC GGC CAC GGC 1026 Pro Asp His Leu Asp Leu Ala Arg Glu Gly Arg Gin Ile Ala Phe Gly His Gly 342

ATC CAC TAC TGC CTG GGC GCC CCG CTC GCC CGC CTG GAG GGC CGC ATC GCC CTG 1080

Ile His Tyr Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Gly Arg Ile Ala Leu 360

GAA GCC CTC TTC GAC CGA TTC CCC GAC TTC TCG CCC ACC GAC GGC GCA AAA CTG 1134

Glu Ala Leu Phe Asp Arg Phe Pro Asp Phe Ser Pro Thr Asp Gly Ala Lys Leu 378

CGC TAC CAC CGC GAC GGA CTG TTC GGC GTC AAG AAC CTG CCG CTG ACC GTA CGG 1188

Arg Tyr His Arg Asp Gly Leu Phe Gly Val Lys Asn Leu Pro Leu Thr Val Arg 396

CGC GGC 1194

Arg Gly 398

(8) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1561 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7

10 20 30 40 50 60

AAGCTTCCCG ACCGGGTGGA GGTCGTCGAC GCGTTCCCGC TGACCGGCCT CAACAAGGTC

70 80 90 100 110 120 GACAAGAAGG CCCTGGCGGC CGACATCGCC GCCAAGACCG CCCCCACCCG CCCCACCACC

130 140 150 160 170 180 GCCGGCCACG GCCCGACCAC GGACGGCGAT ACGGCCGGTG GGGGTGGGTC CGCGGGCGGG

190 200 210 220 230 240 GTGACGGCCG CCGGTGGCGG GCGGGAGGAG GCGGCGTGAG CGGGCCCGGG CCCGAGGGCG

250 260 270 280 290 300 GCTACCGGGT GCCGTTCGCG CGACGCGGTT CGGTGGTGGG CGAGGCGGAC CTGGCGGCGC

310 320 330 340 350 360 TGGGCGAACT GGTCCGCTCG GGCCGGTCGC TGACGTCGGG GGTGTGGCGG GAGCGGTTCG

370 380 390 400 410 420 AGGAACAGTT CGCCCGCCTG ACCGGCGCCC GGCACGCGCT CAGTGTCACC AGCGGCACCG

430 440 450 460 470 480 TCGCGCTGGA ACTGGCGGTG CGGATGCTGG ACCTGGCGCC GGGCGACGAG GTGATCGCCA

490 500 510 , 520 530 540 CCCCGCAGAC GTTCCAGGCG ACGGTGCAGC CGCTGCTCGA CCACGACGTG CGGCTGCGGT

550 560 570 580 590 600 TCTGCGACAT CGACCCGGAC ACCCTCAACC TCGACCCGGC GGTGCTGGAG ACGCTGATCA

610 620 630 640 650 660 CCGACCGCAC CCGGGCGATC CTGCTCGTCC ACTACGGCGG CAACCCGGCC GACATGGACC

670 680 690 700 710 720 GCATCATGGC CCTGGCCCGC AAGCGCGGCA TCATCGTCGT CGAGGACAGC GCGCACGCGC

730 740 750 760 770 780 TGGGCGCCGT GTACCGGGGG CGGCGGCCGG GGGCACTGGC GGACATCGGC TGCTTCACTT

790 800 810 820 830 840 TCCACTCCAC GAAGAACATC ACCACCCTCG GCGAGGGCGG CATGATCACC CTGTCGCGTG

850 860 870 880 890 900 ACGAGTGGGC CCAGCGGGTG GGACGTATCC GCGACAACGA GGCCGACGGC GTGTACGCGG

910 920 930 940 950 960 CGCTGCCGGA CTCCGCGCGG GCGGGTGCTC CGGCGCTGCT GCCGTGGATG AAGTTCGCGG

970 980 990 1000 1010 1020 AGGGTGTGTA CGGTCACCGG GCGGTCGGGG TCCGCGGGGC GGGCACGAAC GCGACGATGT

1030 1040 1050 1060 1070 1080 CGGAGGCGGC GGCGGCGGTG GGCGTGGTGC AACTGGCGTC GCTGGAGCGG TTCGTGGCCC

1090 1100 1110 1120 1130 1140 GGCGCCGGAG CATCGCGCAG CGGCTGGACG AGGCCGTGGC CTCGGTGGCC GGCACCCGGC

1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGCACCGGGC GGCGGCGGAC AGTCTGCACG CCTACCACCT GTACACGTTC TTCCTCACCG

1210 1220 1230 1240 1250 1260 GCGGCCGGCA GGTGCGGGAG CGGTTCGTGC GCGCCCTGGA CCGGCTGGGT GTGGAGGTCC

1270 1280 1290 1300 1310 1320 AGTTGCGGTA CTTCCCGCTC CATCTGTCGC CCGAGTGGCG GCTGCGCGGC CACGGGCCGG

1330 1340 1350 1360 1370 1380 GCGAGTGTCC GACGGCCGAA CGGGTCTGGT TCGAGGAGCA CATGAACCTG CCGTGCCATC

1390 1400 1410 1420 1430 1440 CCGGTCTGAG TGACGGCCAG GTCGACTACA TGGTCGAGGC GGTCACCCGC GCCCTGCACG

1450 1460 1470 1480 1490 1500 AGGCCCACGG CACGGGGACG CGGGTGGCGG CCGGGCACCT GTGACACCGT CCGCATCCGG

1510 1520 1530 1540 1550 1560 CCGGTGGTTT TCCAAGACCG AGGGAGAGGC AGGCGTATGC CGTTCATCGA AGTGAAGATC

(9) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 1233 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Streptomyces pristinaespiralis

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8

GTG CCG TTC GCG CGA CGC GGT TCG GTG GTG GGC GAG GCG GAC CTG GCG GCG CTG 54 Val Pro Phe Ala Arg Arg Gly Ser Val Val Gly Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu 18

GGC GAA CTG GTC CGC TCG GGC CGG TCG CTG ACG TCG GGG GTG TGG CGG GAG CGG 108

Gly Glu Leu Val Arg Ser Gly Arg Ser Leu Thr Ser Gly Val Trp Arg Glu Arg 36

TTC GAG GAA CAG TTC GCC CGC CTG ACC GGC GCC CGG CAC GCG CTC AGT GTC ACC 162

Phe Glu Glu Gin Phe Ala Arg Leu Thr Gly Ala Arg His Ala Leu Ser Val Thr 54

AGC GGC ACC GTC GCG CTG GAA CTG GCG GTG CGG ATG CTG GAC CTG GCG CCG GGC 216

Ser Gly Thr Val Ala Leu Glu Leu Ala Val Arg Met Leu Asp Leu Ala Pro Gly 72

GAC GAG GTG ATC GCC ACC CCG CAG ACG TTC CAG GCG ACG GTG CAG CCG CTG CTC 270

Asp Glu Val Ile Ala Thr Pro Gin Thr Phe Gin Ala Thr Val Gin Pro Leu Leu 90

GAC CAC GAC GTG CGG CTG CGG TTC TGC GAC ATC GAC CCG GAC ACC CTC AAC CTC 324 Asp His Asp Val Arg Leu Arg Phe Cys Asp Ile Asp Pro _, Asp Thr Leu Asn Leu 108

GAC CCG GCG GTG CTG GAG ACG CTG ATC ACC GAC CGC ACC CGG GCG ATC CTG CTC 378

Asp Pro Ala Val Leu Glu Thr Leu Ile Thr Asp Arg Thr Arg Ala Ile Leu Leu 126

GTC CAC TAC GGC GGC AAC CCG GCC GAC ATG GAC CGC ATC ATG GCC CTG GCC CGC 432

Val His Tyr Gly Gly Asn Pro Ala Asp Met Asp Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg 144

AAG CGC GGC ATC ATC GTC GTC GAG GAC AGC GCG CAC GCG CTG GGC GCC GTG TAC 486

Lys Arg Gly Ile Ile Val Val Glu Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ala Val Tyr 162

CGG GGG CGG CGG CCG GGG GCA CTG GCG GAC ATC GGC TGC TTC ACT TTC CAC TCC 540 Arg Gly Arg Arg Pro Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Cys Phe Thr Phe His Ser 180

ACG AAG AAC ATC ACC ACC CTC GGC GAG GGC GGC ATG ATC ACC CTG TCG CGT GAC 594

Thr Lys Asn Ile Thr Thr Leu Gly Glu Gly Gly Met Ile Thr Leu Ser Arg Asp 198

GAG TGG GCC CAG CGG GTG GGA CGT ATC CGC GAC AAC GAG GCC GAC GGC GTG TAC 648

Glu Trp Ala Gin Arg Val Gly Arg Ile Arg Asp Asn Glu Ala Asp Gly Val Tyr 216

GCG GCG CTG CCG GAC TCC GCG CGG GCG GGT GCT CCG GCG CTG CTG CCG TGG ATG 702 Ala Ala Leu Pro Asp Ser Ala Arg Ala Gly Ala Pro Ala Leu Leu Pro Trp Met 234

AAG TTC GCG GAG GGT GTG TAC GGT CAC CGG GCG GTC GGG GTC CGC GGG GCG GGC 756

Lys Phe Ala Glu Gly Val Tyr Gly His Arg Ala Val Gly Val Arg Gly Ala Gly 252

ACG AAC GCG ACG ATG TCG GAG GCG GCG GCG GCG GTG GGC GTG GTG CAA CTG GCG 810

Thr Asn Ala Thr Met Ser Glu Ala Ala Ala Ala Val Gly val Val Gin Leu Ala 270

TCG CTG GAG CGG TTC GTG GCC CGG CGC CGG AGC ATC GCG CAG CGG CTG GAC GAG 864

Ser Leu Glu Arg Phe Val Ala Arg Arg Arg Ser Ile Ala Gin Arg Leu Asp Glu 288

GCC GTG GCC TCG GTG GCC GGC ACC CGG CTG CAC CGG GCG GCG GCG GAC AGT CTG 918

Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Thr Arg Leu His Arg Ala Ala Ala Asp Ser Leu 306

CAC GCC TAC CAC CTG TAC ACG TTC TTC CTC ACC GGC GGC CGG CAG GTG CGG GAG 972 His Ala Tyr His Leu Tyr Thr Phe Phe Leu Thr Gly Gly Arg Gin Val Arg Glu 324

CGG TTC GTG CGC GCC CTG GAC CGG CTG GGT GTG GAG GTC CAG TTG CGG TAC TTC 1026

Arg Phe Val Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gly Val Glu Val Gin Leu Arg Tyr Phe 342

CCG CTC CAT CTG TCG CCC GAG TGG CGG CTG CGC GGC CAC GGG CCG GGC GAG TGT 1080

Pro Leu His Leu Ser Pro Glu Trp Arg Leu Arg Gly His Gly Pro Gly Glu Cys 360

CCG ACG GCC GAA CGG GTC TGG TTC GAG GAG CAC ATG AAC CTG CCG TGC CAT CCC 1134

Pro Thr Ala Glu Arg Val Trp Phe Glu Glu His Met Asn Leu Pro Cys His Pro 378

GGT CTG AGT GAC GGC CAG GTC GAC TAC ATG GTC GAG GCG GTC ACC CGC GCC CTG 1188

Gly Leu Ser Asp Gly Gin Val Asp Tyr Met Val Glu Ala Val Thr Arg Ala Leu 396

CAC GAG GCC CAC GGC ACG GGG ACG CGG GTG GCG GCC GGG CAC CTG 1233 His Glu Ala His Gly Thr Gly Thr Arg Val Ala Ala Gly His Leu 411