La presser,te invention porte sur une structure d' inclusion d'une substance active, notamment constituée par des microorganismes, par des cel lules vivantes d'origine animale ou végétale, ou par des ensembles cellulaires cons¬ ti tuant des organismes et des individus fonc ionnels, ladite structure consti tuant notaπτnent un inoculum. Dans les struc- tures d' inclusion de l ' invention, les microorganismes, cel ¬ lules ou ensembles cel lulaires sont conditionnés dans une formulation permettant leur très bonne -conserva ion en mi¬ l ieu sec et leur l ibération en mi l ieu humide. Ces inoculums trouvent leur appl ication notamment dans les domaines de l 'agriculture, corrme engrais microbiologiques et indirecte¬ ment pour l 'enrobage microbiologique des semences; de l 'horticulture et du maraîchage, par incorporation dans des substrats naturels et arti ficiels et en culture hors-sol ; de l 'élevage, pour reconstituer la flore de l 'appareil digesti f des animaux; et en al imentation animale, dans la fabrication des ensi lages.

Les inoculums proposés jusqu' ici, qui sont consti¬ tués par des mic roo rgan i smes , peuvent être conditionnés sous diverses formula ions. Cependant, dans la plupart des cas, le type de formulation choisi détermine une grande partie l 'efficacité de l ' inoculum:

Les formulations l iquides sont les plus fac i les ù réa¬ l iser, mais el les ne donnent pas toujours satisfaction. En effet, dans les mil ieux l iquides, les mi c roo ry n i s - mes se présentent nus et en ordre dispersé lors de l ' inoculation dans le sol ou dans les substrats. Dans ces conditions, le rapport de force est souvent en fa¬ veur de la flore résidente et les résul ta de l ' inocula ion peuvent être d'autant plus décevants que l 'an agonisme de la flore autochtone est puissant. On s it que du reste que dans un gramme de sol fert ile, on peut trouver plus d'un mi l l iard de bactéries.

Les formulations solides, se présentant sous la forme

. de poudres, donnent parfois de meilleurs résultats.

Dans ce cas, les microorganismes sont plus ou moins déshydratés, parfois même lyophil isés. L'adjonction

5 d'un support protecteur inerte mais hydrophile, du type argile, est nécessaire pour obtenir une bonne ef f icaci¬ té. L'un des problèmes est que les microorganismes, avant d'entrer en activité, doivent être réhydratés, ce qu provoque généralement une perte de viabil ité par xϋ choc osmotique. De plus, les particules d'argile ne semblent pas offrir un rempart protecteur suf f isant vis-à-vis de la multitude d'agresseurs telluriques ré- s i den s . Af in d'éviter ces problèmes, on a utilisé des formula-

15 tions gélif iées sous forme solide, dans lesquel les les microorganismes sont immobil isés et qui présentent L' intérêt de pouvoir être hydratées selon ce que l 'on veut obtenir. Certains gels, constitués par des polymè¬ res tels que le polyuréthanne, les po 1 y sacchar i des , com-

20 me le xanthane et les dérivés cellulosiques, ou encore les po 1 yacry 1 ami des , ont été proposés. Toutefois, les techniques d' inclusion directe des microorganismes dans les gels de polymère apparaissent corrrne étant délica¬ tes. Ainsi, dans le brevet français N° 2.501.229, on

25 propose par exemple d'apporter un milieu de cul ture en¬ semencé par le microorgαπ i sme ou une suspension de mi¬ croorganismes obtenue par centr i f uga ion ou filtration dudit milieu, dans une solution chauffée de polysaccha- ride, et de former le gel par refroidissemen . Ce trai-

30 tement thermique assurant la réticulation du gel peut être rem lacé par l 'action d'un sel métall ique ou par traitement de synergie par un autre polymère. Duns le brevet français N° 2.519.022, on préconise d'abaisser l 'activité de l 'eau dans l' inoculum en-dessous de sa

35 valeur critique ù une valeur inférieure ù 0,5. A cet ef fet, on réal ise un séchage par atornisation par f lux d'air chaud et sec ou encore on utilise une solution

N

saturée en un composé présentant l 'activité dt: l 'eau requise évoluant vers l 'équil ibre uvec l ' inoculum. Par ail leurs, on peut soul igner que les po 1 yoc r 1 ami de s ne sont pas biodégradables et jouissent d'une très mau- vaise réputation concernant la toxicité.

Jusqu' à présent, on avait proposé des techniques d' inclusion faisant appel à un enrobage direct, par exemple par un polymère, des éléments cel lulaires. 11 s'agissai t donc d'une inclusion directe. La présente invention impl ique non seulement un enrobage de l'élément mais aussi un autre revêtement, et il s'agit donc d'une technique d' inclusion indirecte, aboutis¬ sant à une structure que l 'on peut qual if ier de structure d' inclusion indirecte. La présente invention vise ù remédier à l 'ensem le de ces inconvénients. On a en ef fet recherché à assurer une bonne conservation de l ' inoculum sélectionné dans des struc¬ tures stables, faciles ù fabriquer, à corrmerc i a i i se r et ù util iser dans les domaines précités, également à assurer une mult ipl ica ion immédiate des microorganismes et une l ibéra¬ tion progressive de l ' inoculum dès les premiers contacts avec un mi l ieu hydraté, et enf in à obtenir une bonne coloni¬ sation de la cible (syst me racinaire, sol , apparei l diges¬ tif suivant l 'appl ication particul ière de l ' inoculum) et, en conséquence, les ef fets bénéfiques attendus.

La structure d' inclusion qui a été mise au puint selon l ' invention s'appl ique, de façon équivalente, aux cel¬ lules vivantes d'origine végétale ou animale et aux ensem¬ bles cel lulaires constituant des organismes et individus fonc t ionne 1 s .

La structure d' inclusion selon l ' invention, qui est, de façon générale, formée d'au moins une substance ac¬ tive incluse dans un support et qui se présente sous la for- me de granulés répond ù l 'ensemble de ces objecti fs. Cette structure d ¹ inclusion, notamment de type inoculum, est ca¬ ractérisée par le fait que les granulés comprennent: a) un noyau consistant en une matrice enrobant la substance active à inoculer, ladi e matrice étant co m os e:

FSU1LLE DS REMPLACEMENT

( 1 ) d' au moins un agent d' enrobage dans lequel la¬ dite subs tance active est enrobée; et

( 2 ) d ' au moins un agent hydrorétenteur ; et

(b ) une enveloppe protectrice poreuse entourant ledit noyau ( a ) et composée:

(l)d'au moins un agent filmogène susceptible de subir une dégradation biologique ; et

(2) d'au moins un agent hydrorétenteur.

De préférence,les granulés de la structure d'inclusion selon l'invention comportent en outre:

(x) une pellicule hydrophile protectrice entourant l'enveloppe (b) .

Dans le cas où la- substance active est choisie parmi les microorganismes , cellules vivantes ou ensembles cellulaires, la structure selon l'invention constitue géné¬ ralement un inoculum. L'agent d'enrobage (al) est alors constitué par au moins une substance nutritive , notamment par un extrait nutritif complet, la matrice étant une ma¬ trice nourricière . Les inoculums que l'on peut ainsi préparer se dis¬ tinguent des perles de dimensions de l'ordre du millimètre décrites dans la demande de brevet français n° 2.599.639, dont le rôle est d'immobiliser des bactéries , champignons etc dans une matrice de polymère (polyacrylamide) , non bio- dégradable , cette matrice étant protégée par une enveloppe d'alginate _-

La présente invention ne vise pas l'immobilisation de microorganismes , cellules ou similaires , mais au contraire, leur conservation à l'état vivant, par encapsu- Iation provisoire, puis leur libération au moment voulu hors de la matrice, après éclatement de l'enveloppe, dans le milieu dans lequel elles doivent se développer . L'agent hydrorétenteur , par définition absent dans les perles de la demande de brevet précité , joue, lors de la libération des microorganismes, cellules ou similaires, un rôle impor¬ tant d'aide au développement de ces substances dans leur milieu d'inoculation.

EMPLACEMENT

Les micrααrganlsmes, cellules ou ensembles cellulaires, sont appαrLos dans le noyau <α. do pr' ¹ _ è i f-noo sous la forme d'une suspension plus ou moins cαncerili é-e. L matrice nourricLère peut constituer un milieu de culture 5 desdLts iaicrαorganismes ou autres avant la formation des granulés, auquel cas l'inoculum résultant présente une concentration très élevée en microorganismes ou autre,, par exemple, pour les bactéries, pouvant aller jusqu'à

10 3 x 10 bactéries par ml.

10 L'extrait nutritif complet (al) peut être d'origine végétale ou d'origine animale. Dans le premier cas, ce peut être un extrai à. base d'algues, lesquellε-s sont choisies notanimerit parmi les espèces Fucus, Laml na π a et Ascaphyl l um, ledit extrait étant amené èx pH 7, par

1":. exemple par de l'oxyde de magnésium.

Les agents hydrorétenteurs <a2> ou (b2> sont constitués avantageusement par des argiles, comme la bentonite, le kaolin, le talc, la vermiculite et la montmarillonite.

'.o Quant aux agents filmogènes <1>1), ils peuvent notamment être constitutés par de≈ alginates, des polypectates, du chitosan, des carraghènαnes, ou d'autres biopαlymères.

Conformément â. une autre caractéristique intéreΞ-

.-J ^* : ^" . santé de l'invention, l'enveloppe .b) peut renfermer en outre au inoins une substance phytostimulαnte choisIf* notamment parmi les nitrates, les substances de crolsijnce, les sels minéraux divers, etc, et/ou une substance phyto- sαnitαire, choisie notamment parmi les fongicides, le__ i insecticides et les herbicides compatibles avec les micro- organismes, cellules vivantes ou ensembles cellulaire: enrobés. Comme substances phytosti ulantes, on peut mentionner ]' acide i dol acétique et la Cytokinine. Λ propos des substances phytα5αnltaire_., on utilisera les

,'. fongicides et les insecticides dans le cas au les πiLcro- arganlsmes enrobés sont des bactéries, et des bactéricide:

FEUILLE DE REMPLACEMENT

et insecticides lorsque les micrαorganismes enrobés sont des cham 1gnons.

En ce qui concerne la pellicule Ce) , elle est constituée avantageusement par une argile très hydrophile, "3 comme la bentαnite.

Concernant les proportions des différents compo¬ sants des granulés qui constituent l ^' inoculum selon l'inven¬ tion C près déshydratation), on peut indiquer que la matrice nourricière Ca) peut comprendre de 5 à. 10 g de 1* extrait

10 (al) et de 1 à 5 g du Cou des) agent s) hydrorétenteur(s) <a2), pour 10 à 15 ml d'eau, et que l'enveloppe Cb) peut comprendre de 1 à 5 g du Cou des) agent s) filmogèneCs) Cbl) et de 5 a 20 g du Cou des) agent s) hydrorétenteurCs) CbΞ) , pour 10 à 15 ml d'eau. Ceci correspond à. une formulation r_. initiale suivante dans le cas des micrααrganismes :

- pour la matrice nourricière (a), 5 à 10 g de l'extrait Cal) et de 1 à 5 g du Cou des) agentCs) hydro- rêtenteurCs) Ca2) pour 100 ml d ^l eau, le Cou les) micro- organismeCs) étant présentes) dans ladite matrice par

7 -;o exemple à une concentration de l'ordre de 10 à

10 10 bactéries par ml d'eau pour les bactéries, et de l'ordre de 10 propagules par ml d'eau pour les champignons ;

- pour l'enveloppe Cb) , 1 à 5 g- du Cou des) age t Cs) _I -- ^* : _. filmogèneCs) Cbl) et 5 à 20 g du Cou des) agent Cs) hydrorétenteurCs) Cb2) pour 100 ml d'eau.

Ea particulier, les granulés de l'invention peuvent se présenter sous la forme d'éléments parasphériques dont le noyau a) présente un diamètre moyen compris entre 2 .'.t.. et 5 mm et dont l'épaisseur de l'enveloppe Cb) est comprise entre 0,5 et 3 mm, la pellicule externe, lorsqu'elle est présente, pouvant avoir une épaisseur comprise entre 1 et 3 mm.

11 n' y a pas de limitation particulière quant aux :*<_. micraarganis es que l'an peut intraduire dans le noyau. On peut citer les bactéries comme les Rhizobaclé ies, et les

FEUILLE D RE PLACE E T

champignons comme les Mycarhises. Des exemples par iculiers de ces bactéries seront donnés ci-après en référence aux applications de l'inoculum selon l'invention.

La présente invention concerne également un procédé de préparation de la structure d'inclusion qui vient, d'être définie, dans laquelle on utilise un agent filmogène capable de passer de l'état sαluble a l'état insoluble, caractérisé par le fait que : A) on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composant du noyau a) des granulés de façon à obtenir un premier système de consistance pâteuse ;

CB) on associe entre eux, dans un milieu aqueux, les composants de l'enveloppe Cb) , de façon a obtenir un second système de consistance pâteuse, dans lequel l'agent filmogène est à l'état sαluble ;

CC) on fait passer les premier et second système précités dans deux ajutages cαaxiaux, le premier système, dans l'ajutage central, et le second système, dans l'espace annulaire délimité par les deux ajutages précités, de façon qu'à la sortie de ce double ajutage, an obtienne des gouttes de la matière de noyau entourée de la matière- d' nveloppe ; (D) on fait tomber ces gouttes dans un second milieu aqueux dans lequel l'agent filmogène passe à l'état insoluble, de façon à obtenir, par suite du durcissement dudit agent filmogène, des granulés dispersés dans ledit milieu ; CE) on recueille lesdits granulés et, le cas échéant, on les sèche ; et F) si on le souhaite, on enrobe ces granulés dans de la matière de pellicule.

En particulier, a l'étape (E) , on utilise comme agent filmogène, un alginate sous forme d'αlginate de sodium dans de l'eau pure, et qu'à l'étape CD), on utilise, comme milieu aqueux de formation des granulés, un bain de sel de calcium, comme le succinate ou le gluconate, de façon à

t -i-t réaliser le déplacement des ions ir j>ar les ions C.a

La présente invention porte également sur un appareillage pour la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être défini, cet appareillage étant caractérisé par le fait qu' il comporte trois éléments superposés, à. savoir : un premier élément traversé par un canal d' amenée de la matière de noyau, et par un canal d'amenée de la matière d'enveloppe ;

- un second élément comportant une pluralité de cônes d'injection de la matière de noyau, suivant des canaux perpendiculaires au plan moyen dudit élément, ces zones d'injection étant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière de noyau, ledit élément étant traversé par le canal d'amenée de la matière d' nveloppe ; et

- un troisième élément cαmjortant des zones d'injection en nombre identique à celui des zones d'injection du second élément et disposées en vis-à-vis de ces dernières, ces zones d'injection étant traversées par les canaux précités acheminant la matière de noy u , et comportant des zones annulaires de passage de la matière d'enveloppe entourant le canal associé, et se trouvant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière d'enveloppe.

De préférence, les trois éléments précités sont en forme de disques.

La paroi du troisième élément, par laquelle sortent les gouttes de la matière de noyau entourée par la matière d' enveloppe, peut être une paroi plane ou une parai hémisphèrique.

Egalement, dans un mode de réalisation particulier, les zones d'injection sont réparties sur u:_ cercle ou sur plusieurs cercles concentriques.

Ces zones d'injection peuvent être consti uées par exemple par des injecteurs amovibles, capables d'être reçus de manière étanche dans des ouvertures correspondantes du

FEUILLE DE REMPLACEMENT

deuxième et du troisième éléments, les injecteurs associés au deuxième élément recevant des tubulures axiales en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière de noyau et se prolongeant au-delà de l'extrémité tournée vers le troisième élément en position de montage, et les injecteurs associés au troisième élément comportant un alésage central traversé par l'extrémité précitée de la tubulure associée aux injecteurs destinés à être reçus dans le second élément, l'espace cylindrique annulaire entourant ladite tubulure étant en communication de fluide avec le canal d'amenée de la matière d'enveloppe.

Conformément Λ d'autres caractéristiques de ce appareillage : les injecteurs associés au troisième élément font sailli ^' e hors de la paroi de sortie dudit élément ; la communication entre l'extrémité de sortie des canaux d'amenée des matières respectivement de noyau et d'enveloppe et l'entrée des zones d'injection respectives s'effectue par l'intermédiaire d'espaces de distribution formés par des cavités pratiquées dans au moins l'un des trois éléments ; le canal d'amenée de la matière d'enveloppe est disposé selon l'axe des trois éléments et le canal d'amenée de la matière de noyau est disposé de façon excentrée ; l'appareillage comporte des moyens pour pouvoir être maintenu a température constante grâce à. une circulation d'eau ou de liquide thermosta ique, effectuée par exemple à la périphérie de chacun des trois éléments précités ; et il comporte également des moyens pour faire parvenir sous pression les matières de noyau et d'enveloppe dans les canaux d'amenée correspondants. Les applications envisagées pour les inoculums selon l'invention sont les suivantes : - Introduction dans les substrats et dans les sols de populations bénéfiques pour les plantes telles que des bactéries ( hi_z_θ-__._ _-_iji__- -___≤î. R i ∑abi um, Agrabac terl um "Kû4", etc. ⁾ au des champignons

Tri chader a , etc. ) , entre autres pour régénérer des

FEUILLE DB REM PLACEMENT

sols "fatigués" et, corrélati ement, constituer des sols ou substrats résistant aux agents pathogènes.

- Inoculation de sols et de substrats à l'aide de bactéries pathogènes iFsBuda anaε solana.cea.rum, Agrσbaoterium tutnefaolens, Erw nia cαrαtαv .. ) au de champignons pathogènes (Fusari um, Fhytophthor , Verti cl l l ium, Pythi uzm) utiles dans les études de résistance variétale par exemple.

- Inoculation de bactéries ermentatives dans les ensilages afin d'accélérer les processus de ermentation.

- Introduction de bactéries et/ou de levures dans différents types de milieux agro-alimentaires ; reconstitution de microflores des appareils digestifs par incorporation dans les aliments (très bonne compatibilité et facile biodégradabilité) ou par ingestion directe, les inoculums de l'Invention ayant, par un choix judicieux de ses composants, une très bonne compatibilité avec les aliments et étant facilement biodégradables ;

- Conservation des cellules vivantes d'origine végétale, telles que des embryons pouvant conduire à l'obtention de semences artificielles, ou des cals pouvant conduire a l'obtention de tissus végétaux ou de plantules ; et - Conservation des ensembles cellulaires constituant des organismes et des individus fonc ionnels, tels que des protozoaires et des nématαdes, & activité mycαphage. Conformément à. une autre application de l'invention, l'extrait nutritif, dans lequel les micro- organismes sont enrobés, peut également servir d' enrobage Δ des semenees.

Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on décrira ci-après, de façon plus détaillée, Im _¬ préparation d'un inoculum selon l'invention, en référence au dessin annexé.

our ce dessin : la figure 1 représente une vue de dessous d'un appareillage pour la fabrication de structures d'inclusion conforme a la présente invention, selon un •.-i mode de réalisation particulier ;

- la figure 2 est une vue en coupe selon II-II de la figure 1 ;

- la figure 3 est une représentation schématique illustrant la libération des microorganismes encapsulé..

1.0 dans le milieu inoculé ; et les figures 4 et 5 sont des courbes illustrant la conservation de l'inoculum selon l'invention fabriqué conformément à l'exemple sϋsindiqué.

I .S I - Préparation de la matrice nourricière chargée de. πiicro- αrganlsmes.

Λ l'aide d'eau distillée stérile, on prépare une pâte à base de crème stérilisée d'algues. Selon les algues utilisées, on obtient des crèmes possédant des propri tés

;-. ^*• différentes. On peut également utiliser des poudres d'algues existant déjà dans le commerce. On ajuste le pli à 7 par de l'oxyde de magnésium.

Parallèlement, an prépare une suspension concentrée de raicraarganlsmes, ù laquelle ou ajoute un peu de bentonite stérile.

On mélange ces deux préparations durant plusieurs heures dans les proportions suivantes :

- crème d' algues à pH 7 90 g

- bentonite 10 g

- suspension concentrée de micrαorganis es 1000 ml

Λ l'état hydraté, ce milieu assure une excellente multiplication des microorganismes. A l'état désh3/draté (10 à 207 _* d'humidité résiduelle), il permet une très bonne survie des microorganismes. De plus, il se réhydrate facilement et, lors de la réhydratation, les micra-

FEUILLE DE REMPLACEMENT

organismes y trouvent tous les ingrédients nécessaires a leur multiplication. Si l'on veut obtenir une matrice très concentrée en microorganismes, il est passible de cultiver ceux-ci dans ce milieu en agitation, et à une température ; _. optimale C25 à. 28"C par exemple pour les bactéries du sol ⁾ .

Il - Préparation de l'enveloppe protectrice

On prépare par ailleurs un mélange stérile j _. d' alginate de sodium et de kaolin dans les proportions suivantes :

- alginate de sodium 15 g

- kaolin 100 g

- eau distillée 1000 ml l. ^' ;>

III - Obtention des granulés frais

On utilise l'appareillage représenté sur les figures 1 et 2.

2ϋ Cet appareillage, désigné dans son ensemble par le chiffre de référence 1, se compose de trais éléments superposés respectivement 2, 3 et 4, réalisés par exemple en acier inoxydable et assemblés de manière étanch.e.

Le premier élément 2 est constitué par un disque traversé par un passage cylindrique axial 5 et comportant sur sa face destinée à venir en contact avec le second élément 3, un évidement annulaire 6, centré sur l'axe du disque 2 et délimité par une parai interne cylindrique 7, par une paroi de fond 8,.et par une paroiexterne cylindrique 9.

:Ά> La paroi 8 comporte une partie annulaire interne 8a_ et une partie annulaire externe 8b.. perpendiculaires a la paroi interne 7 et séparées par un décrochement d' équerre 8c_. b'e trouvent ainsi constituées une rainure distributrice intérieure 10, plus profonde, et une rainure distributrice

PSUïL ε i3H REM tA _{CΞ! 3ΞNT}

extérieure 11, moins profonde, en communica ion avec la première. Un alésage cylindrique 12, portant un filetage, est pratiqué, parallèlement au passage 5, de façon a débaucher dans la partie 0α_. du fond 3, le diamètre dudit alésage 12 étant égal a la largeur de ladite partie annulaire Sa. mesurée dans le sens radial. Dans ledit alésage 12, est adaptée par vissage l'extrémité d'une tubulure 13 d'amenée du système de consistance pâteuse, destiné à constituer le noyau. Le disque 3 porte, sur sa in face destinée à. venir en contact avec le disque 2, une saillie cylindrique 14 de même diamètre et de même hauteur que le passage 5. Le disque 3 comporte un passage cylindrique axial 15, traversant la saillie 14, et débouchant dans la face dudit disque 3 opposée a ladite !,.-; saillie 14, suivant une paroi trαnconique 16. Le passage 15 comporte, dans sa région d'extrémité côté saillie 14, un décrochement annulaire vers l'extérieur 17, à partir duquel il porte un filetage destiné a coopérer avec un filetage complémentaire porté par l'extrémité d'une tubulure 18 0 d'amenée du système de consistance pâteuse destiné à constituer l' enveloppe.

Le second élément 3 se présente également sous la forme d'un disque de même diamètre que l'élément 2. Par ailleurs, le disque 3 comporte trente 5 ouvertures cylindriques 19 d'axe parallèle à celui du passage 15 et régulièrement réparties sur deux cercles concentriques, à raison de douze sur le cercle intérieur et dix-huit sur le cercle extérieur. En position d'assemblage des disques 2 et 3, les ouvertures 19 disposées sur le 0 cercle intérieur aboutissent dans la rainure 10, et celles disposées sur le cercle extérieur aboutissent dans la rainure 11.

En outre, chaque ouverture 19 débouche, du côté de la saillie 14, suivant une partie évasée bordée par un 5 décrochement annulaire 20, et du côté opposé., l'ensemble des

1.4 αuvertures lu débauche dans une même rainure annulaire 21 peu profonde, centrée sur l'axe du disque 3. Cette rainui f 21 est sensiblement de même largeur que l'ôvidement 8 pratiqué dans le disque 2. Chaque ouverture 19 sert de logement à un injecteur 22 qui consiste en une pièce cylindrique traversée par un canal axial 23 et portant extérieurement, a une extrémité un rebord 24 d'accrochage de l' Injecteur 22 sur la portéed' appui que constitue le décrochement précité 20. La bordure externe opposée 25 de l' Injecteur 22 est chanfreinée. En position d'assemblage des injecteurs 22 - qui est celle représentée sur la figure 2 -, chaque injecteur 22 dépasse du fond de la rainure 21 par cette bordure chanfreinée. Le canal axial 23 de chaque injecteur 22 est par exemple fileté, de façon à coopérer avec une fine tubulure 26 qui, en position d'assemblage, dépasse très largement de 1' injecteur 22 du côté du disque 3 opposé au disque 2. Le disque 4 comporte, du côté destiné a venir s'appliquer contre le disque 3, une rainure annulaire 27 à peu près analogue a la rainure 21 et destinée à venir en vis-à-vis d'avec elle en position d'assemblage, trente αuvertures 28, traversant le disque 4, débouchant dans ladite rainure 21, en correspondance avec les αuvertures 19 du disque 3, et, de la même façon que ces dernières, suivant un décrochement annulaire 29. Ce dernier constitue une portée d'appui pour le rebord périphérique 30 d'un injecteur 31, de forme générale identique à celle des Injecteurs 22. Cependant, a la différence des injecteurs 22, les injecteurs 3l comportent un passage axial 32 de plus grand diamètre, et ne portant pas de filetage. Ce passage est cylindrique dans le corps de l' injecteur 31, et il se rétrécit légèrement progressivement en direction e la partie terminale troncαnique 33 de l' Injecteur 31, qui fait saillie hors de la face libre du disque 4 en position d'assemblage. Dans cette position, la tubulure 20 de chaque

FEUILLE DE REMPLACEMENT

injecteur 22 pénètre axialement dans l'ouverture 32 de l' injecteur 31 associé.

Chacun des disques 2, 3 et 4 comporte une gorge périphérique annulaire 35 ^" dans laquelle est logée une !_; canalisation d'eau ou de liquide thermαstαtique 34 dont l'entrée et l sortie sont symbolisées par des flèches sur la figure 1.

L'appareillage qui vient d'être décrit fonctionne de la façon suivante : 10 Grâce à une double pompe à motoréducteur et régulateur électronique, le système pâteux destiné Λ constituer le noyau parvient, sous pression, par le canal de distribution 13 du disque 2, pour se répartir dans l'évidement 8 et, de la, dans les tubulures 26 des lui inj cteurs 22.

La double pompe envoie également sous pression le système pâteux destiné à constituer l'enveloppe, par le canal de distribution 10, ce système étant transmis, par l'intermédiaire de l'espacement entre la paroi tronconique 0 16 du disque 3 et la paroi opposée du disque 4, à l'espace entre les rainures apposées respectivement 21 et 27 des disques 3 et 4. De là., la matière destinée a constituer l'enveloppe s'écoule dans les espacements annulaires des injecteurs 31, autour des tubulures 26. 5 Pendant son fonctionnement, l'appareillage est maintenu à. température constante grâce à une circulation d'eau ou de liquide thermostatique se faisant dans les canalisations 34.

Tous les injecteurs sont démontables et 0 interchangeables. Le diamètre des canaux centraux et coαxiαux des injecteurs, ainsi que leur position respectifs sont fonction du type de granulés que l'an veut obtenir. Qn peut en effet faire varier les dimensions du noyau et de 1' enveloppe. 5

FEUILLE DE REMPLACEMENT

10

Par ailleurs, dans chaque canal de distribution, la pression peut être finement régulée de façon séparée en fonction de la viscosité des matières utilisées, de façon à obtenir la synchronisation indispensable durant la formation des gouttes jusqu'à la sortie des injecteurs.

L'ensemble de l'appareillage peut être désinfecté à. l'aide des produits courants, au bien il peut être stérilisé ù. la chaleur.

De plu&, on peut prévoir d'assembler plusieurs

10 appareillages de ce type pour augmenter la capacité de production des granulés. Egalement, on peut prévoir que le disque 4 soit remplacé par une pièce hémisphérique, ce qui permet d'augmenter le nombre des injecteurs.

Ainsi, en fonctionnement, la matière de noyau et -~ la matière d'enveloppe parviennent aux injecteurs de sortie

31, de façon que la première soit entourée par la seconde. L'ensemble sort έ la base du dispositif d'injection sous la forme de gouttes, lesquelles tombent dans un bain de succinate ou de glucαnate de calcium (concentration 0,1K> - contenu dans un récipient . L' alginate de sodium entrant dans la formulation de la matière d'enveloppe, qui est une substance sαluble dans l'eau, est alors transformé en alginate de calcium, insoluble dans l'eau, constituant, avec le kaolin qui compose également l'enveloppe, une cαuclie ^~ ° résistante.

Plus le temps de séjour des billes obtenues dans le sel de calcium est long, plus l'enveloppe est chargée en ions Ca et sera solide.

³ 0 IV - Pelliculage des granulés

A la sortie du bain, on laisse ressuyer quelques heures les granulés a la température ambiante. Puis, on les rαule dans une argile très hydrophile comme la bentonite. de ^• - ^* - ^* manière à former une pellicule autour de chaque granulé.

Cette opération permet de conserver une humidité résiduelle et amortit 1' écroseπiGnt _'_. J. ' intérieur do la matrice, lequel pourrait être provoqué par une brutale déshydratation.

Comme indiqué ci-dessus, la figure 3 illustre la libération des microorganismes dans le milieu inoculé.

On introduit les granulés secs (figure 3Λ) dans un milieu humide (sol, substrat, appareil digestif, etc. ). Au contact de ce milieu, la pellicule P des gx-anulés absorbe

1 l'eau disponible, laquelle passe ensuite a travers l'enveloppe poreuse E. La réhydratâtion de la matrice, puis des micrα-organismes du noy u N- (figure 3B) se fait alors lentement et progressivement. Ensuite, l'enveloppe E se déchire sαus la pression de la matrice et le contenu du

^ ^~ granulé est libéré dans le milieu (figure 3C> . Dans un premier temps, les micra-organismes réhydratés absorbent. les éléments nutritifs de la matrice qui sont a proximité, puis ils acquièrent leur autonomie et se dispersent dans le mi1ieu .

- ^Q Pour illustrer la bonne conservation de l'inoculum selon l'invention, on a fabriqué, par le procédé qui vient d'être décrit ci-dessus, des granulés bactériens a base de Pseudomαnαs fl uorescens.

^• '--' Durant la fabrication, la viabilité des cellules de Pseudamanas fl uorescens descend jusqu'à environ 50 000 ώ. 100 000 cellules viables par granulé sec lorsque l'on utilise une concentration de départ de 10 bactéries par millilitre. C'est ce qui est illustré par la figure 4 qu

³⁰ est la courbe de viabilité a 25 ^* C±2'C de ces cellules

(souche L 2.3-1), les granulés ayant été dissous Λ +4"C dans du tampon phosphate 0.02W ; pli 6,4.

5

Légende de la figure 4 :

Λ. : avant mélange ;

B : après mélange ;

C : après formation des billes

(noyau + enveloppe) ; et D : après pelliculage et séchage.

Par leα suite, la conservation de l'inoculum apparaît être satisfaisante puisqu'au 60ème jour, la température du laboratoire 25 ^** C_t2°C, le nombre de bactéries par granulé étant encore de 5000 à. 10 000, suivant ce qui est illustré par la figure 5, les granulés étant dans les mêmes conditions que dans le cas de la figure 4.

Certaines souches de Khizαbactéries (groupe Pseudosnanas fluorescens - F. pu tld~~) ont un effet stimulateur de la croissance et de la protection des plantes. Lorsque l'on bactérlse le système racinalre de la laitue par exemple, on peut obtenir un gain important de croissance et de rendement. L'ensemble des résultats obtenus pour diverses plantes expérimentées est indiqué dan. le tableau :

FEUILLE DΞ REM PLACERENT

TABLEAU

ClEJ^^Xl ^Q J J ⁾ J2f__JS.U_ ^β aTfiAIS.

Amélioration des rendements en fonction de l'Δge de la plante

PLANTE SUBSTRAT 7, GAIN AGE MAX. /TEMOIN (Jours)

PELARGO IUM ^•

Poids frais de la plante 16,0 100

Nombre de boutures id 31,4 100

Nombre de boutures T207. t E607. t ILF207. 47,4 100

LAITUE

Poids frais de la feuille T100% 21,0 Poids frais de la feuille Te 50% + Tr 50% 19,0 Précocité de la pommaison id 113.0 . ' <i

CHRYSANTHEME

Hauteur de la plante E457, t t 35% t T2û% 30,4 Nombre de feuilles étalées id 26,9 36

POMMIER (Malus Evereste' )

Hauteur de la plante T 75% t __ 25% 44,0 45 Hauteur de la plante id 73.0 102 Hauteur de la plante id 12,0 430

Nombre de ramifications 20,4 480

POMIER 'Golden Sraothee'

Poids de fruits ;ol naturel 11.5 1460

« LEGENDE T Tourbe brune E Ecαrce de pin S Sable de Loire t Tourbe blonde Te Terreau maraîcher lli ^" Fibre de bais ⁽ "llortlf ibre" Tr Terre franche.

^'