Beschreibung

Substituierte 4-(Indol-3-yl)chinazoline und ihre Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung substituierter 4-(Indol-3-yl)chinazoline zur Hemmung der Proteinkinaseaktivität, insbesondere der EGF- und/oder HER2- rezeptorspezifischen Tyrosinproteinkinase, zur Behandlung von Tumorerkrankungen, Osteoporose oder proliferativen Epidermiserkrankungen, sowie neuartige substituierte 4- (Indol-3-yl)chinazoline und Verfahren zu deren Herstellung.

Des Weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung dieser substituierten 4-(Indol-3- yl)chinazoline als Pflanzenschutzmittel, insbesondere als Insektizide, Fungizide oder Herbizide.

Hintergrund der Erfindung

Die Erkenntnisse der modernen Tumorforschung haben einen Paradigmenwechsel in der Therapie eingeleitet. Während klassische Therapieformen, wie Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie ausschließlich die Eliminierung der Tumorzelle zum Ziel haben, sind die neuen Ansätze darauf gerichtet, eine Wachstumsinhibition zu erreichen. Die konventionelle Chemotherapie ist nur wenig spezifisch für Tumorzellen und verbunden mit einer Vielzahl an Nebenwirkungen auf normale Zellen. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente mit spezifischeren Wirkungsmechanismen von grosser Bedeutung. In den letzten Jahren wurden zahlreiche vielversprechende Substanzen gegen Krebs entwickelt, die extrazelluläre Zellstrukturen oder intrazelluläre Signaltransduktionswege als Angriffsziel haben.

Die Progression von Tumoren und Metastasen wird unter anderem durch Wachstumsfaktoren kontrolliert, die nach Bindung an Rezeptoren auf der Zelloberfläche komplexe Signaltransduktions-Kaskaden auslösen. Dies führt zu vermehrter Proliferation, Angiogenese, Metastasierung und Invasion sowie verminderter Apoptosefähigkeit der Tumorzellen. Daher sind Wachstumsfaktoren attraktive Angriffspunkte für die Tumorbekämpfung. Ein Großteil der soliden Tumoren exprimiert den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR, HERl, erbBl), den ersten von vier Transmembran-Rezeptoren der HER-(oder erbB-) Familie.

Das 170 kDa große, membranständige Glykoprotein besteht aus drei Bereichen: einer extrazellulären, Amino-terminalen Ligandenbindungsdomäne, einem transmembranären lipophilen Abschnitt sowie einer intrazellulären Domäne mit Tyrosinkinase-Funktion

(Salomon, D., Gullick, W.: The erbBfamily ofreceptors and their ligands: multiple targets or therapy, Signal, 2/3, 4-11, (2001)). Kinasen sind Enzyme, die den Transfer von Phosphat-Gruppen von Adenosintriphosphat (ATP) auf Zielproteine katalysieren.

Bindet ein spezifischer Ligand, zum Beispiel EGF (Epidermal Growth Factor) oder TGF- α (Transforming Growth Factor alpha), an der Zelloberfläche an den Rezeptor, dimerisiert dieser und stößt eine Reaktionskaskade im Zellinneren an. In der Folge katalysiert die Tyrosinkinase die Phosphorylierung von Proteinen, die als Signaltransduktoren wirken. Dabei wird ein Phosphatrest von Adenosintriphosphat auf eine Hydroxylgruppe eines Substratproteins übertragen. Die phosphorylierten Proteine fungieren dann als überträger des Wachstumssignals innerhalb der Zelle (Schlessinger, J.; Ullrich, A.: Growth Factor Signaling by Receptor Tyrosine Kinases, Neuron 9, 383-391 (1992)). Erreicht das Wachstumssignal den Zellkern, werden Gentranskription und DNA-Replikation angeregt. Diese Signale befähigen die Zelle zur Reifung und Proliferation, Angiognese und Metastasierung.

Diese zentrale Funktion macht den EGFR als Target in der Tumortherapie hoch interessant. Es sind eine Reihe von Strategien zur EGFR-Inhibition erprobt worden; zwei Ansätze führten inzwischen zu zugelassenen Arzneistoffen. Zum einen können monoklonale Antikörper wie Cetuximab (Erbitux ^® ) die extrazelluläre Rezeptordomäne besetzen und damit die Ligandenbindung und Signalweiterleitung verhindern (Pivot, X.; Guardiola, E.; Stein, U.: Epidermal growth factor receptor as a target for anticancer therapy, CancerFutures, 1, 90-93 (2002)). Zum anderen lagern sich kleine applizierbare Moleküle wie Gefitinib (Iressa ^® ) und Erlotinib (Tarceva ^® ) reversibel in die ATP- Bindungstasche und blockieren selektiv das Enzym. Dadurch wird die Phosphorylierung unterbunden, die pathologisch verstärkte Signalweiterleitung und die EGF-stimulierte Zeilproliferation werden gezielt unterdrückt; gleichzeitig werden die Apoptose verstärkt und die Metastasierung gehemmt. Gefitinib hemmt den EGF-Rezeptor in vitro mit einer IC ₅₀ von 0,023 μmol/L, ähnlich potent ist Erlotinib mit einer IC ₅₀ von 0,02 μmol/L (Artaega, C. L.: The epidermal growth factor receptor: from mutant oncogene in nonhuman Cancers to therapeutic target in human neoplasia. J. Clin. Oncol. 19/15, 32-40 (2001); Ciardiello, F.; Caputo, R.; Bianco, R.; Vincenzo, D.; Pomatico, G.; De Placido, S.; Bianco, R. A.; Tortora, G.: Antitumor Effect and Potentation ofCytotoxic Drugs Activity in human Cancer Cells by ZD-1839 (Iressa), an Epidermal Growth Factor Receptor-selective Tyrosine Kinase Inhibitor, Clin. Cancer Res. 6, 2053-2063 (2000)).

Die Weiterentwicklung dieser Tyrosinkinase-Inhibitoren stellt deshalb ein lohnendes Ziel der modernen Tumorforschung dar.

Von einer Reihe gewisser Chinazolin-Derivate, die in Position 4 einen Anilinosubstituenten besitzen, ist bekannt, dass sie die Rezeptortyrosinkinasen hemmen (EP-Anmeldungen Nr. 0520722, 0566226 und 0635498). Es ist weiterhin bekannt, dass gewisse Chinazolin-Deriate, die in Position 4 mit einem Heteroarylaminorest substituiert sind, ebenfalls Rezeptortyrosinkinasen hemmen (EP- Anmeldung Nr. 0602851). In diesen Fällen sind die Chinazolingrundkörper in Position 4 stickstoffsubstituiert. In der WO 96/39145A1 sind weitere 4-(Indol-3-yl)chinazolinderivate beschrieben, wobei bezüglich einer der dort offenbarten Verbindungen - 4-(l-Benzylindol-3-yl)-6,7-dimethoxychinazolin - im übersichtsartikel von A. Bridges; Pfizer Global Research; Chem. Rev. 2001, 101, 2541-2571 angegeben wird, dass diese Verbindung nur eine geringe oder keine EGFR- Aktivität aufweist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Verbindungen, die die Proteinkinaserezeptoraktivität hemmen.

Beschreibung der Erfindung

Diese Aufgabe wird gelöst durch Verbindungen der Formel A

worin

R ₁ für Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 2-Dimethylaminoethoxy, 2-Diethylaminoethoxy, 3- Dimethylaminopropoxy, 3-Diethyl-aminopropoxy, 2-(Pyrrolidin-l-yl)ethoxy, 3-

(Pyrrolidin-l-yl)propoxy, 2-Piperidinoethoxy, 3-Piperidinopropoxy, 2-Morpholinoethoxy, 3-Morpholinopropoxy, 2-(4-Methylpiperazin-l-yl)ethoxy, 2-(Imidazol-l-yl)ethoxy, 3- (Imidazol-1 -yl)propoxy, 2-[Di-(2-methoxyethyl)-amino]ethoxy, 3-Morpholino-2- hydroxypropoxy, 5-[(2-Methylsulfonyl)ethylamino]methyl-2-furyl oder -O- (CH ₂ ) _m O(CH ₂ ) _p CH ₃ , steht, wobei m und p unabhängig voneinander 1, 2, 3, oder 4 sind, R ₂ für H, Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder -O-(CH ₂ ) _q O(CH ₂ ) _r CH ₃ steht, wobei q und r unabhängig voneinander 1, 2, 3, oder 4 sind,

R ₃ unabhängig voneinander für Halogen, halogeniertes Benzyloxy, insbesondere 3- Fluorbenzyloxy, oder C ₁ -C ₅ -AIlCyI steht, wobei mindestens ein Substituent R ₃ ein Halogen oder ein halogeniertes Benzyloxy darstellt, und n 1, 2 oder 3 ist, sowie Salze und/oder Solvate davon.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen, die sich insbesondere durch folgende Strukturmerkmale auszeichnen: 1) das Indol -N-H ist unsubstituiert, 2) der Benzenring des Indols ist halogensubstituiert bzw. mit einer halogensubstituierten Gruppe substituiert, eine Hemmung der Aktivität von Rezeptortyrosinkinasen wie beispielsweise der EGF -rezeptorspezifischen Tyrosinproteinkinase oder der EGF- und HER2 -rezeptorspezifischen Tyrosinproteinkinase bewirken.

Verbindungen der Formel A enthalten als Substituenten R ₃ mindestens einen Halogensubstituenten oder eine halogenierte Benzyloxygruppe am Indolring. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst Halogen Br, F, Cl und Iod. Bevorzugt steht Halogen für Brom, Chlor oder Fluor, besonders bevorzugt für Chlor oder Fluor. Die halogenierte

Benzyloxygruppe kann an 2-, 3- und/oder 4-Position mit einem Fluor-, Chlor- und/oder

Bromatom substituiert sein, bevorzugt handelt es sich um 3-Fluorbenzyloxy. Die Sub- stituenten R ₃ sind bevorzugt an 5'- und/oder 6'-Position des Indolrings. Bei zweifacher

Halogensubstitution sind Verbindungen mit 5 '-Chlor und 6 '-Fluor oder 6 '-Chlor und 5'-

Fluor besonders bevorzugt. Des Weiteren kann R ₃ für einen Q-Cs-Alkylrest stehen, insbesondere für Methyl oder Ethyl. Bevorzugt sind auch Verbindungen mit n = 2 und R ₃ gleich Halogen und halogenierte Benzyloxygruppe, insbesondere Verbindungen mit 5'- Chlor und 6'-(3-Fluorbenzyloxy).

R ₁ steht bevorzugt für Methoxy oder -O-(CH ₂ ) _m O(CH ₂ ) _p CH ₃ , steht, wobei m und p unabhängig voneinander 1, 2, 3, oder 4 sind, besonders bevorzugt für 2-Methoxyethoxy.

R ₂ steht bevorzugt für Methoxy oder -O-(CH2) _m O(CH2) _p CH ₃ , steht, wobei m und p unabhängig voneinander 1, 2, 3, oder 4 sind, besonders bevorzugt für 2-Methoxyethoxy.

Besonders bevorzugt sind R ₁ und R ₂ beide jeweils Methoxy oder 2-Methoxyethoxy.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindungen sind Verbindungen der Formel A besonders bevorzugt, worin die Substituenten R ₃ 5 '-Chlor und 6 '-Fluor oder 6 '-Chlor und 5 '-Fluor sind, und/oder R ₁ Morpholinopropoxy ist und R ₂ Methoxy ist, R ₁ und R ₂ 2-Methoxyethoxy sind, oder

R ₁ 2-Methoxyethoxy ist und R ₂ Methoxy ist.

Die Verbindungen der Formel A können in optisch aktiver oder racemischer Form vorliegen, wenn ein oder mehrere Substituenten ein asymmetrisches Kohlenstoffatom enthalten. Die Erfindung schließt optisch aktive oder racemische Formen mit antiproliferativer Aktivität mit ein. Die Synthese optisch aktiver Verbindungen kann nach den Standardtechniken der organischen Chemie durchgeführt werden, z.B. durch Herstellung optisch aktiver Ausgangstoffe.

Die Chinazoline der Formel A sind in Position 2, 5 und 8 unsubstituiert. Deshalb besteht die Möglichkeit, dass Chinazolinderivate der Formel A in solvatisierter bzw. nicht solvatisierter Form vorliegen, z.B. in hydratisierter Form. Die Erfindung schließt solvatisierte Formen mit antiproliferativer Aktivität mit ein.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ferner als freie Base oder als Salz vorliegen. Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines Chinazolinderivates dieser Erfindung mit ausreichender Basizität ist z.B. ein mono- oder di-Säureadditionssalz anorganischer oder organischer Säuren wie z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Trifluoressigsäure, Zitronensäure, Malonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Methansulfonsäure oder 4-Toluensulfonsäure.

Die Verbindungen der Formel A weisen wertvolle, pharmakologisch nützliche Eigenschaften auf. Insbesondere entfalten sie spezifische, hemmende Wirkungen, die pharmakologisch von Interesse sind. Sie sind insbesondere als Tyrosinproteinkinasehemmer wirksam. Sie hemmen die Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR). Diese rezeptorspezifischen Enzymaktivitäten spielen eine Schlüsselrolle bei der Signalübertragung in einer großen Zahl von Säugetierzellen einschließlich der menschlichen Zelle. Die Hemmung der EGF- rezeptorspezifischen Tyrosinproteinkinase (EGF-R-TPK) kann mittels bekannter Verfahren nachgewiesen werden, beispielsweise unter Verwendung der rekombinaten intrazellulären Domäne des EGF-Rezeptors; siehe Beispiel 7.

Die untersuchten, erfindungsgemäßen Verbindungen 1 bis 4, die im Schema 1 dargestellt sind, zeigten alle eine inhibitorische Aktivität, siehe Beispiel 7. Eine besonders signifikante Aktivität (> 50%) wurde für die Verbindungen 1, 2 und 4 beobachtet. Auffällig ist ferner, dass die Verbindungen 1-4 starke Fluoreszenzen im UV-Licht bei Wellenlängen von 254 nm und 366 nm zeigen, was sie für eine Verwendung als Diagnostika zur Charakterisierung von ATP-Bindungsstellen der EGFR-Tyrosinkinase in Zellpräparationen

geeignet macht. Teil der Erfindung ist somit auch die Verwendung solcher Verbindungen als Diagnostika.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel A sowie Salze oder Solvate resp. Hydrate davon und pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können oral oder parenteral verabreicht werden. Geeignete Träger für injizierbare Lösungen oder Dispersionen sind beispielsweise Lösungs- oder Dispersionsmittel, wie sie dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise auf der Basis von Wasser, Ethanol, Polyolen oder Mischungen davon. Geeignete Trägerstoffe für eine orale Verabreichung umfassen allgemein bekannte Hilfsstoffe zur Herstellung von Tabletten, Kapseln, Pillen, Sirupen usw. Daneben können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe usw. enthalten.

Teil der Erfindung ist ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel A sowie deren pharmazeutisch annehmbare Salze zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Aktivität von Proteinkinase, insbesondere zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Proteinkinaseaktivität, insbesondere einer erhöhten Proteinkinaseaktivität, in Zusammenhang stehen resp. davon abhängig sind. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um Tyrosinproteinkinasen, insbesondere die EGF-rezeptorspezifische Tyrosinproteinkinase sowie die EGF- und HER2 -rezeptorspezifische Tyrosinproteinkinase. Solche Krankheiten umfassen u.a. Tumorerkrankungen, Osteoporose oder proliferative Epidermiserkrankungen wie Psoriasis.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Verbindung der Formel A als Pflanzenschutzmittel. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Pflanzenschutzmittel insbesondere Insektizide, Fungizide, Herbizide, Nematizide, Rodentizide sowie Akarizide. Basierend auf der Hemmung der Proteinkinaseaktivität eignen sich die substituierten 4-(Indol-3-yl)chinazoline als wirksame Pflanzenschutzmittel. Besonders bevorzugt liegen die erfindungsgemäßen Pflanzenschutzmittel in Form von wässrigen Formulierungen vor, die übliche Hilfsstoffe wie Stabilisatoren, Tenside, Entschäumer usw. enthalten können, sowie auch weitere übliche Pestizide, Insektizide oder Herbizide in Kombination mit den erfindungsgemäßen Wirkstoffen.

Im Folgenden werden Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel A vorgestellt, die gemäß Anspruch 6 ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung sind.

Herstellung der substituierten 4-(Indol-3-yl)chinazoline

Ein Chinazolinderivat der Formel A oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann durch Umsetzungen geeigneter Chinazoline 6 - 8, in denen Z eine Abgangsgruppe ist, mit metallierten Indolen erfolgen (Schema 4).

Eine geeignete Abgangsgruppe Z ist z.B. eine Halogen-, Alkoxy-, Aryloxy- oder Sulfonyloxygruppe, z.B. eine Chlor-, Brom-, Methoxy-, Phenoxy-, Methansulfonyloxy- oder Toluen-4-sulfonyloxygruppe.

Bei den metallierten Indolen handelt es sich um N-Li-, N-K-, N-Na- sowie um magnesiumorganische Verbindungen, die unter Verwendung von Organomagnesiumverbindungen R-Mg-X (Grignardverbindungen) aus den entsprechenden Indolen hergestellt werden. R bedeutet Alkyl, Aryl, Alkenyl, Arylalkyl oder Heteroarylalkyl.

Als Lösemittel für die Deprotonierung der Indole mit den Grignardverbindungen dienen Diethylether und höhere Ether, z.B. Dibutylether und Amylether, Tetrahydrofuran, 1,4- Dioxan, Anisol, Ligroin, Benzen, Xylen.

Die Hydrolyse der N-Mg-Bindung erfolgt mit Wasser, Ammoniumchloridlösung oder verdünnten Säuren. Die Herstellung der Chinazoline erfolgt gemäss Schema 2, Weg 1 oder Weg 2.

Dabei ist bemerkenswert, dass das bei den Verbindungen 1 - 3 gewünschte Substitutionsmuster im Chinazolinanteil bereits vor der Umsetzung mit den Indolen festgelegt wird. Im Falle der Verbindung 4 wird der Chinazolinteil in Position 6 acetyl- oder anderweitig geschützt. Dann erfolgt die Umsetzung mit dem metallierten Indol und anschließend wird in das erhaltene 4-(Indol-3-yl)chinazolin die entsprechende Seitenkette eingeführt. Ferner wurde beobachtet, dass die 4-(Indol-3-yl)chinazoline 1 - 4 Salze und/oder Lösungsmittel einschließen. Diese Eigenschaft macht spezielle Aufarbeitungsverfahren erforderlich.

Die Herstellung der Indole erfolgt auf dem in Schema 3 dargestellten Weg oder sie sind, wie im Fall des 6-Brom-Indols, im Handel erhältlich.

Schema 1

Schema 2

Herstellung der Chinazolinc

Schema 3

Herstellung von 5-Chlor-6-fluorindol

Schema 4

Herstellung der Indolylchinazoline

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung der Chinazolinc

Das für die Herstellung der Verbindungen 1 und 2 benötigte 4-Chlor-6,7-dimethoxy- chinazolin wird nach einer Vorschrift des Patentes EP 0 556 226 synthetisiert.

Der für die Herstellung der Verbindung 3 benötigte 2-Amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)- benzoesäureethylester wird nach einer Vorschrift des Patentes WO 9843960 synthetisiert. Das aus dieser Substanz hergestellte 6,7-Di-(2-methoxyethoxy)-3,4-dihydrochinazolin-4- on und nachfolgendes 4-Chlor-6,7-di-(2-methoxyethoxy)-chinazolin sind ebenfalls in diesem Patent beschrieben, allerdings wurde das Herstellungsverfahren wie folgt abgeändert und damit optimiert: 6,3 g (21,41 mmol) 2-Amino-4,5-bis-(2-methoxyethoxy)-benzoesäureethylester und 8,5 g (81,65 mmol) Formamidinacetat werden in 100 mL 2-Methoxyethanol 24 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum erfolgt eine Aufreinigung durch Säulenchromatographie [Dichlormethan/Methanol (9+1)]. Es entstehen 4,00 g (13,59 mmol) 6,7-Di-(2-methoxyethoxy)-3,4-dihydrochinazolin-4-on als weißes Pulver. Smp: 182 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 12.07 (s, IH, NH), 7.98 (s, IH, C2), 7.46 (s, IH, C5), 7.16 (s, IH, C8), 4.25 (2xt, 4H, Cl', Cl"), 4,20 (2xt, 4H, C2', C2"), 3,71 (2xs, 6H, 2xOCH ₃ ) Elementar-Analyse: Ber. C 57.13 H 6.17 N 9.52 Gef. C 57.23 H 5.94 N 9.65

4,00 g (13,59 mmol) 6,7-Di-(2-methoxyethoxy)-3,4-dihydrochinazolin-4-on werden mit 50 mL Thionylchlorid und 0,3 mL Dimethylformamid versetzt und 150 min unter Rückfluss erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ether aufgenommen und danach über eine Glasfritte abgesaugt.

Es entstehen 2,2 g (7,03 mmol) 4-Chlor-6,7-di-(2-methoxyethoxy)-chinazolin als hellgelbes Pulver. Eine Aufreinigung kann wegen der Instabilität der Verbindung nicht erfolgen. Smp: 176 ⁰ C η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 8.87 (s, IH, C2), 7.50 (s, IH, C5) 7.46 (s, IH, C8), 4.38 (t, 2H, Cl'), 4.35 (t, 2H, Cl"), 3.77 (t, 2H, C2'), 3.75 (t, 2H, C2")

Das für die Herstellung der Verbindung 4 benötigte 6-Acetoxy-4-chlor-7- methoxychinazolin wird nach einer Vorschrift des Patentes EP 0 823 900 synthetisiert.

Beispiel 2 Herstellung von 5-Chlor-6-fluorindol

Die Herstellung von 5-Chlor-6-fluorindol erfolgt in Anlehnung an die Patente US 6,569,888 und US 5,494,928 unter Optimierung der Synthesevorschriften durch änderung von Reaktionszeiten und -temperaturen, Elutionsmitteln und Aufarbeitungsverfahren. Es entsteht 5-Chlor-6-fluorindol als weißer Feststoff sowie das Nebenprodukte 7-Chlor-6- fluorindol als hellbrauner Feststoff.

5-Chlor-6-fluorindol: Smp: 83 ⁰ C η-NMR-Spektrum: (400 MHz/de-DMSO): δ (ppm) 11.32 (s, IH, NH), 7.70 (d, IH, C4),

7.41 (t, IH, C2), 7.38 (d, IH, C7), 6.43 (s, IH, C3) Elementar-Analyse: Ber. C 56.66 H 2.97 N 8.26 Gef. C 56.67 H 3.06 N 8.24

7-Chlor-6-fluorindol: Smp: 42 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHz/de-DMSO): δ (ppm) 11.61 (s, IH, NH), 7.53 (m, IH, C4),

7.42 (t, IH, C2), 7.04 (dd, IH, C5), 6.54 (t, IH, C3) Elementar-Analyse: Ber. C 56.66 H 2.97 N 8.26 Gef. C 56.63 H 3.09 N 8.17

Beispiel 3

Herstellung des 4-(5-Brom-lH-indol-3-yl)-6,7-dimethoxychinazolins

250 mg Magnesium - Späne und eine kleine Spatelspitze Iod werden nach und nach mit einer Mischung von 1,2 mL Methyliodid und 5 mL Diethylether im Eisbad versetzt und 15 min gerührt. Dann wird die Lösung von 0,50 g (2,60 mmol) 5-Bromindol in 15 mL

Diethylether über einen Tropftrichter langsam zum Reaktionsansatz gegeben. Nach 15 minütigem Rühren wird die Mischung mit 15 mL Diethylether versetzt und 0,70 g (3,10 mmol) 4-Chlor-6,7-dimethoxychinazolin in Anteilen dazugegeben.

Der Reaktionsansatz wird 60 min unter Rückfluss erhitzt und anschließend in eine Eis - Wasser - Mischung gegeben.

Nach Ausschütteln mit Ethylacetat wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.

Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie [Ethylacetat/Ethanol (9+1)] gereinigt.

Es werden 0,146 g (0,38 mmol) 4-(5-Brom-lH-indol-3-yl)-6,7-dimethoxychinazolin als gelbes Pulver erhalten.

Smp: 256 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 12.08 (s, IH, NH), 9.09 (s, IH, C2),

8.40 (dd, IH, C2'), 8.39 (d, IH, C4'), 7.68 (s, IH, C5), 7.51 (d, IH, C7'), 7.38 (s, IH, C8),

7.36 (d, IH, C6') Elementar-Analyse: Ber (mit 1,5 H ₂ O) C 52.57 H 4.17 N 10.22 Gef (mit 1,5 H ₂ O)

C 52.79 H 3.79 N 10.08

Beispiel 4

Herstellung des 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6,7-dimethoxychinazolins

250 mg Magnesium - Späne und eine kleine Spatelspitze Iod werden nach und nach mit einer Mischung von 1,2 mL Methyliodid und 5 mL Diethylether im Eisbad versetzt und 15 min gerührt. Dann wird die Lösung von 0,50 g (2,95 mmol) 5-Chlor-6-fluorindol in 15 mL Diethylether über einen Tropftrichter langsam zum Reaktionsansatz gegeben. Nach 15 minütigem Rühren wird die Mischung mit 15 mL Diethylether versetzt und 0,70 g (3,10 mmol) 4-Chlor-6,7-dimethoxychinazolin werden in Anteilen dazugegeben. Der Reaktionsansatz wird 60 min unter Rückfluss erhitzt und anschließend in eine Eis - Wasser - Mischung gegeben.

Nach Ausschütteln mit Ethylacetat wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.

Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie [Ethylacetat/Ethanol (9+1)] gereinigt. Es entstehen 0,24 g (0,68 mmol) 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6,7- dimethoxychinazolin als gelber Feststoff. Smp: 245 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 12.10 (s, IH, NH), 9.09 (s, IH, C2), 8.44 (d, IH, C2'), 8.37 (d, IH, C4'), 7.68 (s, IH, C5), 7.54 (d, IH, C7'), 7.39 (s, IH, C8), 4.03 (s, 3H, OCH ₃ ), 4.00 (s, 3H, OCH ₃ ) Elementar-Analyse: Ber. (mit 2 H ₂ O) C 54.9 H 4.35 N 10.67 Gef (mit 2 H ₂ O) C 55.49 H 4.59 N 10.38

Beispiel 5 H Heerrsstteelllluunngg ddeess 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6,7-di-(2-methoxyethoxy)- chinazolins

3

250 mg Magnesium - Späne und eine kleine Spatelspitze Iod werden nach und nach mit einer Mischung von 1,2 mL Methyliodid und 5 mL Diethylether im Eisbad versetzt und 15 min gerührt. Dann wird die Lösung von 0,50 g (2,95 mmol)

5-Chlor-6-fluorindol in 15 mL Diethylether wird über einen Tropftrichter langsam zum

Reaktionsansatz gegeben. Nach 15 minütigem Rühren wird die Mischung mit 15 mL

Diethylether versetzt und 0,70 g (2,40 mmol) 4-Chlor-6,7-di-(2-methoxyethoxy)- chinazolin in Anteilen dazugegeben.

Der Reaktionsansatz wird 60 min unter Rückfluss erhitzt und anschließend in eine Eis -

Wasser - Mischung gegeben.

Nach Ausschütteln mit Ethylacetat wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.

Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie [Ethylacetat/Ethanol (9+1)] gereinigt. Es entstehen 0,10 g (0,22 mmol) 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6,7-di-(2- methoxyethoxy)-chinazolin als gelber Feststoff Smp: 197 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHz/de-DMSO): δ (ppm) 12.11 (s, IH, NH), 9.09 (s, IH, C2) 8.41 (d, IH, C2'), 8.38 (d, IH, C4'), 7.73 (s, IH, C5), 7.55 (d, IH, C7'), 7.41 (s, IH, C8), 4.36 (t, 2H, Cl"), 4.32 (t, 2H, Cl'), 3.76 (m, 4H, C2' + C2"), 3.33 (2xs, 6H, C4' + C4") Elementar-Analyse: Ber. C 59.26 H 4.75 N 9.42 Gef. C 59.21 H 4.59 N 9.38

Beispiel 6

Herstellung des 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-7-methoxy-6-(3- morpholinopropoxy)chinazolins

1. ^(S-Chlor-ό-fluor-lH-indolS-ylJ-ό-acetoxy-V-methoxychinazo lin

250 mg Magnesium - Späne und eine kleine Spatelspitze Iod werden nach und nach mit einer Mischung von 1,2 mL Methyliodid und 5 mL Diethylether im Eisbad versetzt und 15 min gerührt. Dann wird die Lösung von 0,50 g (2,90 mmol) 5-Chlor-6-fluorindol in 15 mL Diethylether wird über einen Tropftrichter langsam zum Reaktionsansatz gegeben. Nach 15 minütigem Rühren wird die Mischung mit 15 mL Diethylether versetzt und 0,70 g (2,80 mmol) 4-Chlor-6-acetoxy-7-methoxy-chinazolin werden in Anteilen dazugegeben. Der Reaktionsansatz wird 60 min unter Rückfluss erhitzt und anschließend in eine Eis - Wasser - Mischung gegeben.

Nach Ausschütteln mit Ethylacetat wird die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt.

Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie [Ethylacetat/Ethanol (9+1)] gereinigt. Es werden 319 mg (0,83 mmol) 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6-acetoxy-7- methoxychinazolin als hellgelbes Pulver erhalten. Smp: 19O ⁰ C η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 12.34 (s, IH, NH), 9.24, (s, IH, C2), 8.44 (d, IH, C4'), 8.34 (d, IH, C2'), 8.23 (s, IH, C5), 7.57 (d, IH, C7'), 7.43 (s, IH, C8), 4.02 (s, 3H, OCH ₃ ), 2.34 (s, 3H, CH ₃ CO)

Elementar-Analyse: Ber. (mit 1 H ₂ O) C 56.4 H 3.6 N 11.62 Gef. (mit 1 H ₂ O) C 56.88 H 3.89 N 11.61

2. 3-Morpholinopropylchlorid

Die Herstellung der Seitenkette 3-Morpholinopropylchlorid erfolgt nach einer Vorschrift des Patentes WO 02092579.

3. 3-(6-Acetoxy-7-methoxychinazolin-4-yl)-5-chlor-6-fluorindol- l-carbonsäure-tert- butylester

319 mg (0,83 mmol) 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-6-acetoxy-7-methoxychinazo lin und 350 mg Di-tert-butylpyrocarbonat (BOC) werden mit katalytischen Mengen 4- Dimethylaminopyridin und 70 mL Acetonitril versetzt. Nach 24 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Acetonitril unter Vakuum entfernt. Auf dieser Stufe erfolgt keine Aufreinigung durch Säulenchromatographie. Es entstehen 0,20 g 3-(6-Acetoxy-7- methoxychinazolin-4-yl)-5-chlor-6-fluorindol- 1 -carbonsäure-tert-butylester Feststoffgemisch.

4. S-Chlor-ό-fluor-S-tJ-methoxy-ό-ß-morpholinopropoxyj-china zolin^-ylJ-indol-l- carbonsäure-tert-butylester

200 mg des 3-(6-Acetoxy-7-methoxychinazolin-4-yl)-5-chlor-6-fluorindol- l-carbonsäure- tert-butylester - Feststoffgemisches werden mit zwei Spatelspitzen Kaliumcarbonat, einer Spatelspitze 18-Krone-6, 10 mL 3-Morpholinopropylchlorid und 50 mL Acetonitril versetzt. Die Mischung wird 4 h bei 6O ⁰ C gerührt, danach filtriert, das Lösungsmittel unter

Vakuum entfernt und das erhaltene Feststoffgemisch durch Säulenchromatographie [Ethylacetat/Ethanol (9+1)] aufgereinigt.

Es werden 150 mg (0,26 mmol) 5-Chlor-6-fluor-3-[7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)- chinazolin-4-yl]-indol-l-carbonsäure-tert-butylester als hellgelbes Pulver erhalten. Smp: 156 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 9.17 (s, IH, C2), 8.46 (s, IH, C2'), 8.26 (d, IH, C4'), 8.10 (d, IH, CT), 7.61 (s, IH, C5), 7.45 (s, IH, C8) 4.16 (t, 2H, Cl"), 4.03 (s, 3H, OCH ₃ ), 3.53 (m, 4H, C3'" + C5'"), 2.41 (t, 2H, C3"), 2.33 (m, 4H, C2'" + C6'"), 1.95 (m, 2H, C2"), 1.67 (s, 9H, 3xCH ₃ ) Elementar-Analyse: Ber. (mit 1,5 H ₂ O) C 58.24 H 5.9 N 9.36 Gef. (mit 1,5 H ₂ O) C 58.22 H 6.37 N 9.49

5. 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-7-methoxy-6-(3-morpholinop ropoxy)-chinazolin

150 mg (0,26 mmol) 5-Chlor-6-fluor-3-[7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)-chinazo lin- 4-yl]-indol-l-carbonsäure-tert-butylester in 30 mL Ameisensäure werden 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wird tropfenweise zu einer Triton B - Eis - Wasser-Mischung gegeben, wobei der pH-Wert immer im alkalischen Bereich liegen muss. Anschließend wird mit Ether und Ethylacetat ausgeschüttelt und die organische Phase zwei Tage über Molekularsieb (0,3 nm) getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und das erhaltene Feststoffgemisch durch Säulenchromatographie [Ether/Ethylacetat/Methanol (3+1+1)] aufgereinigt. Zum Abschluss wird eine Umkristallisation in Ethylacetat/n-Hexan durchgeführt. Es entstehen 0,02 g (0,04 mmol) 4-(5-Chlor-6-fluor-lH-indol-3-yl)-7-methoxy-6-(3- morpholinopropoxy)-chinazolin als gelbe Kristalle. Smp: 186 ⁰ C

η-NMR-Spektrum: (400 MHZAI ₆ -DMSO): δ (ppm) 12.10 (s, IH, NH), 9.09 (s, IH, C2), 8.437 (s, IH, C2'), 8.33 (d, IH, C4'), 7.65 (s, IH, C5), 7.55 (d, IH, CT), 7.39 (s, IH, C8) 4.19 (t, 2H, Cl"), 4.01 (s, 3H, OCH ₃ ), 3.54 (m, 4H, C3'" + C5'"), 2.43 (t, 2H, C3"), 2.34 (m, 4H, C2'" + C6'"), 1.95 (m, 2H, C2") Elementar-Analyse: Ber. C 61.21 H 5.14 N 11.9 Gef. C 61.31 H 5.28 N 12.10

Im folgenden Beispiel wird die inhibitorische Aktivität von erfindungsgemäßen Verbindungen auf eine Tyrosinkinase untersucht.

Beispiel 7

CAT.# 170010 Protein Tyrosin Kinase, EGF Rezeptor

Quelle: humane A431 Zellen

Substrat: 10 μg/mL PoIy (Glu:Tyr)

Vehikel: 1% DMSO

Präinkubationszeit/-temperatur: 15 Minuten, 25°C

Inkubationszeit/-temperatur: 60 Minuten, 25°C

Inkubationspuffer: 50 mM Hepes, 20 mM MgCl ₂ , 0,2 mM Na ₃ VO ₄ , pH 7,4

Quantifizierungsmethode : ELISA-Quantifizierung von PoIy (Glu:Tyr-P)

EGFR-Tyrosinkinase-Hemmung in % bei Konzentrationen von 0,1 μM bzw. 0,02 μM

Weitere Angaben zu den inhibitorischen Studien sind den folgenden Literaturstellen zu entnehmen:

Cheng, K.; Koland, J. G.: Nucleotide binding by the epidermal growth factor receptor protein-tyrosin kinase, J. Biol. Chem., 271, 311-318, (1996);

Farey, K.; Mett, H.; McGlynn, E.; Murray, B.;Lydon, N.B.: Development of solid phase enzyme-linked immunosorbent assays for the determination of epidermal growth factor receptor and ppόOc-src tyrosine protein kinase activity, Anal Biochem., 203, 151-157,

(1992).