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| WO2004005504A1 | 2004-01-15 |
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DATABASE UniProt [online] 1 October 2000 (2000-10-01), "RecName: Full=Oligo-1,6-glucosidase; EC=3.2.1.10; AltName: Full=Dextrin 6-alpha-D-glucanohydrolase; AltName: Full=Oligosaccharide alpha-1,6-glucosidase; AltName: Full=Sucrase-isomaltase; Short=Isomaltase;", XP002633288, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9K8U9 Database accession no. Q9K8U9
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| Patentansprüche 1. Sucrosemutaseenzym mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz einen oder mehrere Aminosäureaustausche, ausgewählt aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q, aufweisen: 2. Sucrosemutaseenzym nach dem vorstehenden Anspruch mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz den Aminosäureaustausch S303P aufweist. 3. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch D302Y aufweist. 4. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 darge- stellten Sequenz zumindest die Aminosäureaustausche S303P und D302Y aufweist. 5. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch K180P aufweist. 6. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch M199I aufweist. 7. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 darge- stellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch Q276A aufweist. 8. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch A198D aufweist. 9. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch Y219F aufweist. 10. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch V324T aufweist. 11. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch T369L aufweist. 12. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch A346Q aufweist. 13. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Enzym als isoliertes Polyaminosäuremolekül vorliegt. 14. Biokatalysator, enthaltend an einen Träger immobilisiert das Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche. 15. Polynucleotidmolekül, codierend das Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche. 16. Vektor, enthaltend eines oder mehrere Polynucleotidmoleküle nach Anspruch 15. 17. Zelle, enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 16. 18. Zelle nach Anspruch 17 enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 im Chromosom der Zelle. 19. Zelle nach Anspruch 17, enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 extrachromosomal (episomal). 20. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mikroorganismen der Gattungen: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pecto- bacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea Leucanea und Protami- nobacter. 21. Zelle nach Anspruch 20, ausgewählt aus Organismen der Species Protaminobacter rubrum. 22. Verfahren zur Herstellung einer in einem der Ansprüche 17 bis 21 charakterisierten Zelle, enthaltend die Schritte: - Bereitstellen einer Zelle und - Inkontaktbringen des Stamms mit dem Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 und/oder dem Vektor nach Anspruch 16. 23. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, enthaltend den Schritt: Inkontaktbringen des Saccharose- haltigen Substrats mit dem Sucrosemutaseenzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder des Biokatalysators nach Anspruch 14 unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. 24. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, enthaltend den Schritt: Kultivieren der Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 21 oder der gemäß dem Verfahren nach Anspruch 22 herstellbaren Zelle in einem Kulturmedium enthaltend das Substrat, unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. 25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Zelle bei der Umsetzung in einer Matrix immobilisiert ist. 26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, weiter enthaltend Schritt: Isolieren der Isomaltulose oder Isomaltulose-Zusammensetzung aus dem Kulturedium und/oder der Zelle. |
Die Erfindung betrifft die biotechnologische Herstellung von Isomaltulose und Isomaltulose-haltigen Zusammensetzungen aus Saccharose und stellt dazu ver- besserte Mittel, besonders eine Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifi- tät sowie mikrobielle Zellen, enthaltend die verbesserte Sucrosemutase, bereit.
Bekanntermaßen ist Isomaltulose (Palatinose) in einem biotechnologischen Pro- zess durch enzymatische Isomerisierung aus Saccharose (Rohrzucker, Rübenzucker) herstellbar. Isomaltulose ist ein physiologisch wertvoller Zucker, der als Saccharoseaustauschstoff in Lebensmitteln und verwandten Produkten zunehmend an Bedeutung gewinnt. Isomaltulose ist nicht kariogen und besitzt einen niedrigen glykämischen Index bei im Wesentlichen demselben Energiegehalt wie Saccharose. Isomaltulose ist seit 2005 zur Verwendung in Lebensmitteln zugelassen ist. Isomaltulose ist außerdem Ausgangsstoff für die Herstellung des Zu- ckeralkohols Isomalt, eines razemischen Gemisches aus 1 ,6-GPS (6-O-a-D- Glucopyranosyl-D-sorbit) und 1 ,1 -GPM (1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannit) sowie Abwandlungen davon, besonders GPS- oder GPM-angereicherter Gemische.
Die biotechnologische Herstellung von Isomaltulose aus Saccharose erfolgt be- kanntermaßen unter Verwendung von vorzugsweise immobilisierten Bakterienzellen oder Fragmenten davon, welche die Aktivität des bakteriellen Enzyms Sucrosemutase, E.C. 5.4.99.11 (synonym: Saccharosemutase, Sucroseisomera- se, Saccharoseisomerase, Isomaltulosesynthase), aufweisen. Mikroorganismen, die bekanntermaßen Sucrosemutaseaktivität besitzen und in biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden können, sind insbesondere Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Pseudomonas mesoacidophila, Pantoea dispersa und Serratia plymuthica. Deren endogenen Sucrosemutase(n) sind unter den Kurzbezeichnungen SmuA, Pal I, SmtA, MutB, SIM und weiteren bekannt. Die Sucrosemutasen werden durch ein chromosomales Gen kodiert. In den bekannten biotechnologischen Systemen wird Saccharose enzymatisch nicht vollständig zu Isomaltulose isomerisiert. Es entstehen vielmehr weitere Isomerisierungsprodukte und Nebenprodukte. Ein wesentliches weiteres Isome- risierungsprodukt ist Trehalulose. In dem Mikroorganismus Protaminobacter rubrum liegt eine Sucrosemutase SmuA vor, deren Produktspezifität derart aus- gestaltet ist, dass Saccharose auch unter optimierten Kultivierungsbedingungen nur zu etwa 85 % zu Isomaltulose isomerisiert wird. Die Produktspezifität der Sucrosemutase SmuA ist verbesserungswürdig. Die technische Isomaltulo- seproduktion mit biotechnologischen Mitteln basiert aber auf der Sucrosemutase SmuA von P. rubrum. Die vorliegende Erfindung hat sich deshalb zur Aufgabe gestellt, eine verbesserte Sucrosemutase auf Basis von SmuA sowie auch einen diese verbesserte Sucrosemutase enthaltenden Mikroorganismus bereitzustellen, die eine verbesserte Produktspezifität und Selektivität für Isomaltulose besitzt, wodurch der Anteil an Isomaltulose im Isomerisierungsprodukt erhöht wird, womit die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose auch in ansonsten bekannten biotechnologischen Prozessen effizienter durchgeführt werden kann. Die Erfindung hat sich dabei besonders zur Aufgabe gestellt, eine verbesserte Sucrosemutase auf Basis von SmuA bereitzustellen, die in im Wesentlichen unveränderten, bereits etablierten industriellen biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden kann, ohne dass Reaktionsbedingungen und Verfahrensabläufe in den etablierten Prozessen aufwändig angepasst werden müssten. Eine Verwendung von Sucrosemutasen aus anderen Organismen und die Umstellung auf neue biotechnologische Pro- zess soll vermieden werden.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird vollständig gelöst durch die Bereitstellung eines neuartigen Polyaminosäuremoleküls, das eine verbesserte Sucrosemutaseaktivität in Bezug auf die Umsetzung von Saccharose in Isomaltulose, das heißt eine höhere Produktspezifität für Isomaltulose, aufweist. Erfindungsgemäß weist die verbesserte Sucrosemutase, eine Aminosäuresequenz auf, die bevorzugt unmittelbar abgeleitet ist aus der Wildtypsequenz der Sucrosemutase SmuA aus Protaminobacter rubrum, wobei in zumindest einer der nachfolgend genannten Aminosäurepositionen, jeweils bezogen auf die Positionsnummer einer Wildtypsequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, einen oder mehrere der nachfolgend angeführten Aminosäureaustausche aufweist: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q sowie Kombinationen aus zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben acht, neun oder allen zehn. Dabei wird erfindungsgemäß die Position in Abhängigkeit zur Lage des aktiven Zentrums bestimmt.
Die Erfindung stellt demgemäß zur Lösung bereit: Ein verbessertes neuartiges Sucrosemutaseenzym, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine abgewan- delte Aminosäuresequenz aufweist, ausschließlich aufweist oder diese enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz einen oder mehrere der folgenden Aminosäureaustausche aufweisen: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Die Erfindung betrifft auch eine funktionelle Abwandlung davon, das heißt ein Polyaminosäuremolekül, das Abschnitte dieser erfindungsgemäß abgewandelten Aminosäuresequenz der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz aufweist, ausschließlich aufweist oder diese enthält, soweit dieses Polyaminosäuremolekül die erfindungsgemäße Funktion des verbesserten neuartigen Sucrosemutaseenzym aufweist. Der Fachmann kann entsprechende funktionelle Abwandlungen aus den hierin angegebenen Sequenzdaten leicht herstellen und in an sich bekannter Weise auf deren Funktion als Sucrosemutaseenzym testen.
In einer ersten Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position S303; bevorzugt wird gegen Aminosäure P ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position D302; bevorzugt ist gegen Aminosäure Y ausge- tauscht. Besonders bevorzugt ist eine Kombination der Austausche S303P mit D302Y.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position K180; bevorzugt ist gegen Aminosäure P ausgetauscht. In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position M199; bevorzugt ist gegen Aminosäure I ausgetauscht (M199I).
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position Q276; bevorzugt ist gegen Aminosäure A ausge- tauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position A198; bevorzugt ist gegen Aminosäure D ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Ami- nosäureaustausch an Position Y219; bevorzugt ist gegen Aminosäure F ausgetauscht. In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position V324; bevorzugt ist gegen Aminosäure T ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Ami- nosäureaustausch an Position T369; bevorzugt ist gegen Aminosäure L ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position A346; bevorzugt ist gegen Aminosäure Q ausgetauscht. Zusätzlich zu den nachfolgend im Detail beschriebenen bevorzugten Kombinationen mehrerer Aminosäureaustausche sind folgende zusätzliche Aminosäuren einzeln oder in Kombination möglich: M199I in Kombination mit V1 14I, Q122R, Q276A, N423E, L426I, L426F.
Bevorzugt ist eine Kombination von S303P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M 99I. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L.
Eine bevorzugte Kombination davon ist S303P + D302Y + K180P. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + M199I, S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + Q276A, S303P + D302Y + K180P + A198D, S303P + D302Y + K180P + Y219F, S303P + D302Y + K180P + V324T, S303P + D302Y + K180P + T369L und/oder S303P + D302Y + K180P + A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + M199I + S303P + D302Y + M199I + Q276A, S303P + D302Y + M199I + A198D, S303P + D302Y + M199I + Y219F, S303P + D302Y + M199I + V324T, S303P + D302Y + M199I + T369L und/oder S303P + D302Y + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + Q276A + A198D, S303P + D302Y + Q276A + Y219F, S303P + D302Y + Q276A + V324T, S303P + D302Y + Q276A + T369L, S303P + D302Y + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + A198D + Y219F, S303P + D302Y + A198D + V324T, S303P + D302Y + A198D + T369L und/oder S303P + D302Y + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + Y219F + V324T, S303P + D302Y + Y219F + T369L und/oder S303P + D302Y + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + V324T + T369L und/oder S303P + D302Y + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + M199I + S303P + K180P + M199I + Q276A, S303P + K180P + M199I + A198D, S303P + K180P + M199I + Y219F, S303P + K180P + M199I + V324T, S303P + K180P + M199I + T369L und/oder S303P + K180P + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + Q276A + A198D, S303P + K180P + Q276A + Y219F, S303P + K180P + Q276A + V324T, S303P + K180P + Q276A + T369L und/oder S303P + K180P + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + A198D + Y219F, S303P + K180P + A198D + V324T, S303P + K180P + A198D + T369L und/oder S303P + K180P + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + Y219F + V324T, S303P + K180P + Y219F + T369L und/oder S303P + K180P + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + V324T + T369L und/oder S303P + K180P + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, 199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + Q276A + S303P + M199I + Q276A + A198D, S303P + M199I + Q276A + Y219F, S303P + M199I + Q276A + V324T, und/oder S303P + M199I + Q276A + T369L, S303P + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + A198D + Y219F, S303P + M199I + A198D + V324T, S303P + M199I + A198D + T369L und/oder S303P + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + Y219F + V324T und/oder S303P + M199I + Y219F + T369L, S303P + M199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + V324T + T369L und/oder S303P + M199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + T369L + A346Q Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + A198D + Y219F, S303P + Q276A + A198D + V324T, S303P + Q276A + A198D + T369L und/oder S303P + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und, A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + Y219F + V324T, S303P + Q276A + Y219F + T369L und/oder S303P + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + V324T + T369L, und/oder S303P + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + Y219F + V324T, S303P + A198D + Y219F + T369L und/oder S303P + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + V324T + T369L, S303P + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Y219F + V324T + T369L und/oder S303P + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist S303P + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + M199I + D302Y + K180P + M199I + Q276A, D302Y + K180P + M199I + A198D, D302Y + K180P + M199I + Y219F, D302Y + K180P + M199I + V324T, D302Y + K180P + M199I + T369L und/oder D302Y + K180P + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. D302Y + K180P + Q276A + A198D, D302Y + K180P + Q276A + Y219F, D302Y + K180P + Q276A + V324T, D302Y + K180P + Q276A + T369L und/oder D302Y + K180P + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + A198D + Y219F, D302Y + K180P + A198D + V324T, D302Y + K180P + A198D + T369L und/oder D302Y + K180P + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, 199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + Y219F + V324T, D302Y + K180P + Y219F + T369L und/oder D302Y + K180P + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + V324T + T369L und/oder D302Y + K180P + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. D302Y + M199I + Q276A + A198D, D302Y + M199I + Q276A + Y219F, D302Y + M199I + Q276A + V324T, und/oder D302Y + M199I + Q276A + T369L, D302Y + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + A198D + Y219F, D302Y + M199I + A198D + V324T, D302Y + M199I + A198D + T369L und/oder D302Y + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + 199I + Y219F + V324T, D302Y + M199I + Y219F + T369L und/oder D302Y + 199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + V324T + T369L, D302Y + 199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + A198D + Y219F, D302Y + Q276A + A198D + V324T, D302Y + Q276A + A198D + T369L, und/oder D302Y + Q276A + A198D + A346Q. Wei- tere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + Y219F + V324T und/oder D302Y + Q276A + Y219F + T369L, D302Y + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + V324T + T369L, D302Y + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + A198D + V324T + T369L, und/oder D302Y + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Y219F + V324T + T369L, D302Y + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A. Eine andere bevorzugte Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. K180P + M199I + Q276A + A198D, K180P + M199I + Q276A + Y219F, K180P + M199I + Q276A + V324T, K180P + M199I + Q276A + T369L und/oder K180P + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + A198D + Y219F, K180P + M199I + A198D + V324T, K180P + M199I + A198D + T369L und/oder K180P + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + 199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + Y219F + V324T, K180P + M199I + Y219F + T369L und/oder K180P + M199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + V324T + T369L, K180P + M199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + A198D + Y219F, K180P + Q276A + A198D + V324T, K180P + Q276A + A198D + T369L und/oder K180P + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + Y219F + V324T, K180P + Q276A + Y219F + T369L, und/oder K180P + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + V324T + T369L und/oder K180P + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, 199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + Y219F + V324T, K180P + A198D + Y219F + T369L und/oder K180P + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + V324T + T369L und/oder K180P + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Y219F + V324T + T369L, K180P + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist K180P + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T. Eine andere bevorzug- te Kombination ist M199I + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von 199I mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + A198D + Y219F, M199I + Q276A + A198D + V324T, M199I + Q276A + A198D + T369L und/oder M199I + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + Y219F + V324T und/oder M199I + Q276A + Y219F + T369L, M199I + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + V324T + T369L und/oder M199I + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + Y219F + V324T und/oder M199I + A198D + Y219F + T369L, M199I + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + V324T + T369L, M199I + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Y219F + V324T + T369L und/oder M199I + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist M199I + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + Y219F + V324T und/oder Q276A + A198D + Y219F + T369L, Q276A + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + V324T + T369L und/oder Q276A + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + Y219F + V324T + T369L und/oder Q276A + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit mit mindestens einer weite- ren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, T369L und A346Q. Bevorzugt ist A198D + Y219F + V324T + T369L und/oder A198D + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T und A346Q. Bevorzugt ist A198D + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist A198D + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, 199I, Q276A, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Bevorzugt ist eine Kombination von Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und A346Q. Bevorzugt ist Y219F + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und V324T. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Eine bevor- zugte Kombination ist V324T + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist V324T + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von V324T mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von V324T mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L.
Eine bevorzugte Kombination ist V324T + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und Y219F. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist T369L + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von T369L mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, das heißt Polynukleotidmole- küle, welche jeweils die vorgenannten, durch Aminosäureaustausch abgewandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren. Es versteht sich, dass darunter eine Vielzahl von Polynukleotidmolekülen fällt, die aufgrund des degenerativen genetischen Codes in mehreren Ausgestaltungen vorkommen können, den- noch aber dieselben erfindungsgemäßen Polyaminosäuremoleküle kodieren. Der Fachmann kennt bioinformatische Verfahren, die geeignet sind, aus einer gegebenen erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz die definierte Gruppe der diese Aminosäuresequenz kodierenden Polynukleotidmoleküle zu finden.
In einer ersten Ausführung liegt das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül als isoliertes Polynukleinsäuremolekül vor.
In einer alternativen Ausgestaltung liegt das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in Form oder als Bestandteil eines Konstrukts vor, welches die Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase in einem biologischen System, insbesondere in einer biologischen Zelle, bevorzugt in einer Bakterienzelle, vermittelt. Ein solches Konstrukt ist ein einer ersten Ausgestaltung eine Expressionskassette, die das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in einer oder mehreren Kopien enthält. Vorzugsweise enthält die Expressionskassette zusätzlich mindestens ein Promotorelement zur Steuerung der Expression des Polynukleotidmoleküls und gegebenenfalls zusätzlich eine Terminatorsequenz.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektorkonstrukt, welches zumindest eine oder bevorzugt mehrere der Expressionskassetten enthält.
Als Promotor der Expressionskassette und des Vektorkonstrukts sind an sich bekannte Promotoren zur Expression des erfindungsgemäßen Polynukleotidmoleküls in einem biologischen System möglich. Bevorzugt ist der native Promotor des Sucrosemutase-Wildtypgens. Alternativ bevorzugt ist ein Promotorelement, welches die Expression der erfindungsgemäß modifizierten Sucrosemutase verbessert vermittelt, insbesondere eine mehrfach gesteigerte Aktivität, das heißt besonders Volumenaktivität der exprimierten Sucrosemutase ermöglicht.
Neben dem vorgenannten Expressionsvektor zur bevorzugt extrachromosomalen Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase betrifft die Erfindung auch ein Konstrukt, welches geeignet ist, ein im Genom einer biologischen Zelle enthaltenes, eine Sucrosemutase kodierendes Wildtypgen gegen das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül, kodierend die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, auszutauschen. Ein solches Austauschplasmid dient dazu, das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in das chromosomale Genom der Zelle zu integrieren. Das den Genaustausch vermittelnde Austauschplasmid ist besonders derart ausgestaltet, dass es in die Wirtszelle, in die es eingebracht wird, selbst nicht repliziert. Ein bevorzugtes Vektorkonstrukt ist ein pUT-Derivat, das auf einem R6K Replikationsursprung basiert. Dieser Vektor repliziert insbesondere nicht in Wirtszellen vom Stamm P. rubrum, zumindest nicht konditional.
Das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül, kann entweder in Form eines extrachromosomalen Expressionskonstrukts oder durch chromosomalen Genaustausch, in eine Wirtszelle eingebracht werden die ausgewählt ist aus Wirtszellen, die ansonsten geeignet sind, Saccharose in Isomaltulose zu konvertieren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle, Austauschpromotoren und deren Fragmente oder vollständige Sucrosemutase-Expressionskassetten, zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des vorstehend charakterisierten Vektors, gemäß des ersten Aspekts der Erfindung also ein Austauschplasmid, gemäß des zweiten Aspekts der Erfindung also ein Expressionsvektor, zur Herstellung einer solchen Zelle.
Die Erfindung umfasst auch biologische Zellen mit neuartigem Produktspektrum, und zwar Zellen, die in der Lage sind, aus einem Saccharose-haltigen Substrat eine Isomaltulose-Zusammensetzung zu synthetisieren, die zumindest 85 Gew.- % oder mehr (bezogen auf Trockensubstanzgewicht der Isomaltulose- Zusammensetzung), bevorzugt 86 Gew.-% oder mehr, 87 Gew.-% oder mehr, 88 Gew.-% oder mehr, 89 Gew.-% oder mehr, 90 Gew.-% oder mehr, 91 Gew.-% oder mehr, 92 Gew.-% oder mehr, 93 Gew.-% oder mehr, 94 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 95 Gew.-% oder mehr aufweist. Bevorzugt ist eine Wirtszelle, die ausgewählt ist aus Mikroorganismen den Gruppen der Gammaproteobacteria und der unklassifizierten Gammaproteobacteria. Vorzugsweise ist die Zelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mikroorganismen der Gattungen: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pectobacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea, Leucanea sowie Protaminobacter. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Klebsiella sp., besonders Stamm LX3 und Stamm NK33-98-8, Klebsiella pneumoniae, besonders Stamm 342; Enterobacter sp., besonders Stamm SZ62; Enterobacter sp., besonders Stamm FMB1 ; Rauoltella planticola; Pantoea dispersa; Erwinia rhapontici; Erwinia tasmaniensis, be- sonders Stamm Et1/99; Pectobacterium atrosepticum, besonders Stamm SCRI 1043; Pectobacterium carovotum, besonders Subspezies brasiliensis, besonders Stamm PBR 1692; Protaminobacter rubrum; Pseudomonas mesoacidophila; Serratia plymuthica sowie Azotobacter vinelandii und Leucanea leucocephalia. In einer besonders bevorzugten Variante ist die Zelle Protaminobacter rubrum (P. rubrum) oder ein davon abgeleiteter biotechnologisch einsetzbarer Stamm. Die Erfindung erstreckt sich auch auf immobilisierte und/oder auf andere Weise modifizierte Formen dieser Wirtszellen, die für biotechnologische Verfahren besonders geeignet sein können.
Besonders sind die Wirtszellen Deletionsmutanten für ein in der Zelle gegebe- nenfalls vorhandenes Sucrosemutase-Wildtypgen. Eine bevorzugte Variante ist eine Zelle, worin das in der Zelle vorhandene chromosomale Sucrosemutase Wildtypgen, gegen eine das erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutaseenzym kodierende Nucleotidsequenz im Chromosom ausgetauscht ist. In einer ersten Variante steht dieses erfindungsgemäße modifi- zierte Gen unter der Kontrolle des Promotors des Sucrosemutase Wildtypgens. In einer weiteren bevorzugten Variante dieses erfindungsgemäße modifizierte Gen unter der Kontrolle eines, bevorzugt endogenen homologen, Austauschpromotors. Ein solcher Promotor ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Promotor des Gens der 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat Synthase ribB, Promotor des Gens, welches das alter membrane Protein kodiert ompA, Promotor des Gens, welches den putativen Transkriptionsaktivator ECA2934 kodiert, Promotor des Gens der Ribonuklease E rne, Promotor des Operons des 50S-ribosomalen L21 -Proteins, Promotor des Operons des Kälteschockproteins CspE, Promotor des Operons des 50S-ribosomalen L28-Proteins und Promotor des Gens der NAD-abhängigen Epimerase-Dehydratase und funktioneller Promotorfragmente davon, die in der Lage sind, die Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase zu steuern. Es wird auf den Offenbarungsgehalt der DE 10 2009 053566 voll inhaltlich Bezug genommen, insbesondere auf die Tabellen 1A, 1 B und die Sequenzen SEQ ID No: 2 bis 21 des Sequenzprotokolls.
Die Erfindung betrifft auch Zellen, worin die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, besonders unter der Regulation mindestens eines der vorstehend charakterisierten Promotoren extrachromosomal (episomal) exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft auch Mittel zur Herstellung solcher Zellen. Ein solches Mit- tel ist das Polynucleotidmolekül, welches einen die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase kodierenden exprimierbaren Abschnitt in mindestens einer oder in mehrfacher Kopie enthält und zusätzlich zumindest ein weiteres, die Expression dieser Sucrosemutase regulierendes Element in mindestens einer oder in mehrfacher Kopie, insbesondere also ein Promotorelement. In einer alternati- ven Variante dieses Aspekts der Erfindung liegt das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, als Expressionskassette, in isolierter Form vor. Beispielsweise kann es so in eine Wirtszelle in an sich bekannter Weise transferiert werden. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen, zur Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose oder Isomal- tulose-Zusammensetzungen befähigten Zelle, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte enthält: In einem ersten Schritt wird ein Wildtypstamm oder ein bereits klassisch oder rekombinant modifizierter Stamm der Zelle be- reitgestellt; in einem zweiten Schritt wird dieser Stamm mit mindestens einem der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle, codierend die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, und/oder mindestens einem der vorstehend charakterisierten Vektoren in Kontakt oder in Verbindung gebracht, so dass das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül in exprimierbarer Form in die Zelle eingeschleust wird.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „Isomaltulose- Zusammensetzung" das Isomerisierungsprodukt durch Aktivität der Sucrosemutase aus dem Substrat Saccharose verstanden. Dieses enthält zum weitaus überwiegenden Anteil Isomaltulose. Weitere Bestandteile sind insbesondere Trehalulose, Isomelezitose und Fructose und Glucose. Besonders wird darunter vor allem folgende Zusammensetzung verstanden: 80 bis 99 % Isomaltulose, 1 bis 10 % Trehalulose, 0 bis 0,5 % Isomelezitose, 0 bis 0,2 % Trisaccharide, 0 bis 5 % Monosaccharide und 0 bis 0,2 % Restsaccharide. Besonders bevorzugt beträgt der Anteil der Isomaltulose in der Isomaltulose- Zusammensetzung zumindest 85 Gew.-% oder mehr (bezogen auf Trockensubstanzgewicht der Isomaltulose-Zusammensetzung), bevorzugt 86 Gew.-% oder mehr, 87 Gew.-% oder mehr, 88 Gew.-% oder mehr, 89 Gew.-% oder mehr, 90 Gew.-% oder mehr, 91 Gew.-% oder mehr, 92 Gew.-% oder mehr, 93 Gew.-% oder mehr, 94 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 95 Gew.-% oder mehr. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose und/oder einer Isomaltulose-haltigen Zusammensetzung, aus dem Substrat Saccharose oder einem Saccharose-haltigen Substrat.
In einem ersten Aspekt ist dies ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose- haltigem Substrat, worin in einem ersten Schritt Saccharose-haltiges Substrat mit der erfindungsgemäßen Sucrosemutase oder mit dem Biokatalysator in Kontakt gebracht wird, und zwar unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. In einem weiteren Aspekt ist dies ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, worin in einem ersten Schritt enthaltend den Schritt: die vorstehend charakterisierte Zelle in einem Kulturmedium, welches das Substrat enthält, kultiviert wird, und zwar unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. Bevorzugt wird in einem bevorzugt nachfolgenden Schritt die Isomaltulose oder die Isomaltulose-Zusammensetzung aus dem Kulturmedium isoliert. In einer besonderen Ausgestaltung der zellbasierten Herstellung sind die Zelle an oder in einer Matrix, besonders einer Alginatmatrix oder ähnliche, in an sich bekannter Weise immobilisiert. Dies ist besonders für die großtechnische Umset- zung von Saccharose in Isomaltulose oder die Isomaltulose-Zusammensetzung vorgesehen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen, vorstehend charakterisierten Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung, bevorzugt aus Saccharose oder einem Saccharose-haltigen Substrat, und bevorzugt nach dem hier beschriebenen Verfahren.
Weiter ist vorgesehen, das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, besonders in isolierter Form oder als Bestandteil eines Zellfragmentes, zur Entwicklung zellfreier Systeme und Biokatalysatoren zu verwenden. In einer bevorzugten Aus- gestaltung weist der Biokatalysator einen Träger auf, woran die erfindungsgemäß modifizierte Sucrosemutase immobilisiert vorliegt. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung wird das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, besonders in isolierter Form, nicht immobilisiert als Sucrosemutase-Biokatalysator eingesetzt, insbesondere in löslicher Form. Die Erfindung betrifft somit auch Biokatalysatoren, die im Wesentlichen zellfrei sind, und sich bevorzugt dadurch auszeichnen, dass die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase daran immobilisiert vorliegt. Eine bevorzugte erste Variante sind an ein Substrat, vorzugsweise an eine Filtermembran, immobilisierte Zellfragmente. Alternativ bevorzugt liegt ein isoliertes, bevorzugt synthetisch in an sich bekannter Weise hergestelltes, erfindungsgemäßes Polyaminosäuremo- lekül vor, das die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutaseaktivität aufweist. In einer alternativen bevorzugten Ausgestaltung ist der Biokatalysator durch das nicht immobilisierte isolierte erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül mit Sucrosemutaseaktivität gebildet. Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären:
Figur 1 zeigt beispielhaft ein Vektormap des in Zusammenhang mit der Erfindung hergestellten smuA-Deletionsplasmids pUT-GntR-P3C1-DSmuA, enthaltend die Austauschsequenz nach SEQ ID NO: 1 (dunkelgraue Box). Dieser Be- reich zeigt stromaufwärts der smuA-Deletionsbereichs 1267 bp Homologie zum P. rubrum Chromosom. Dieser Bereich trägt Homologien zu einem GntR-Typ Transkriptionsregulatorgen und den narbenfrei eingeführten 3C1 -Promotor. Stromabwärts des smuA-Deletionsbereiches sind 655 bp homologe DNA- Sequenz vorhanden. Der eigentliche Deletionsbereich des smuA-Gens innerhalb der Austauschsequenz ist als Nukleotidsequenz vergrößert hervorgehoben. Das native smu-A-Startcodon ATG und ein TAA Stoppcodon sind unterstrichen. Eingeführte Schnittstellen-Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Nsil und Pmel sind ebenfalls durch gestrichelte Linien markiert. Das pUT-Derivat basiert auf einen R6K ori („origin of transfer") und trägt zur Selektion das Kanamy- cin-Resistenzgen aphll und das xy/E-Gen, das für eine Catechol-2,3 Dioxygena- se kodiert.
Figur 2 illustriert schematisch und beispielhaft das erfindungsgemäße Vorgehen zur Herstellung der smi/>4-Deletionsmutante P. rubrum 3C1 DsmuA: Austausch des nativen smuA-Gens durch homologe Rekombination. Auf Basis eines in der Wirtszelle P. rubrum 3C1 bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT-Vektor) wird bevorzugt in E. coli ein smu>4-Austauschplasmid konstruiert. Hierzu werden zwei DNA Fragmente stromaufwärts und stromabwärts des smuA-Gens basengenau amplifiziert und fusioniert (s. Fig. 1). Nach Ligation entsteht ein Xmal/Pstl- Fragment (s. SEQ ID No:2), das stromaufwärts des deletierten smuA-Gens ein 1267 bp großes DNA-Fragment, das den putativen gntR-Regulator kodiert und den 3C1 -Promotor trägt und stromabwärts von einem 655 bp großen DNA- Fragment flankiert wird. Das erzeugte Plasmid wird in der Wirtszelle, hier: P. rubrum 3C1 , transferiert. Durch Selektion auf vorzugsweise Kanamycin werden daraus solche Kolonien selektioniert, die Austauschplasmide im Chromosom tragen, die vorzugsweise über mindestens eine der beiden homologen Regionen ins Chromosom integrierten. Die Inkubation auf Kanamycin-freiem Medium erlaubt die Selektion von Deletionsstämmen, in denen das integrierte Plasmid über ein zweites Cross-over (zweites Rekombinationsereignis) wieder aus dem Chromosom desintegrierte. Solche Kolonien sind vorzugsweise durch das Fehlen der xy/E-Aktivität nach Catecholzugabe in an sich bekannter Weise phänotypisch nachweisbar (keine Gelbfärbung). Die erfolgreiche Herstellung des Deleti- onsstammes kann anschließend durch molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) in an sich bekannter Weise überprüft werden, um die vollständige Desintegration des Austauschplasmids, die zur Rekonstruktion des Wildtyps führt, zusätzlich ausschließen zu können.
Figur 3 illustriert schematisch und beispielhaft das erfindungsgemäße Vorgehen zur Expression von smty>A-Sequenzvarianten in der smu>A-Deletionsmutante P. rubrum 3C1DsmuA: Auf Basis eines in der Wirtszelle P. rubrum 3C1 DsmuA bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT-Vektor) wird bevorzugt in E. coli ein integratives smty \*-Expressionsplasmid konstruiert. Hierzu werden smuA*-Gene, die die vorgenannten erfindungsgemäßen durch Aminosäureaustausch abge- wandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren mit einem 1267 bp großen DNA-Fragment fusioniert, das den putativen g/?ff?-Regulator kodiert und den zur Expression notwendigen 3C1 -Promotor trägt. Anschließend erfolgt die Insertion des Fusionsprodukts in den bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT- Vektor) Die erzeugten Plasmide werden in die Wirtszelle, hier: P. rubrum 3C1 DSmuA, transferiert. Durch Selektion auf vorzugsweise Kanamycin werden daraus solche Kolonien selektioniert, deren smt * -Expressionsplasmide über homologe Rekombination ins Chromosom integrierten. Die erfolgreiche Herstellung der Integrationsstämme kann anschließend durch molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) in an sich bekannter Weise überprüft werden. Die Expres- sion der integrierten s/77t7>4 * -Variantengene erfolgt durch den starken 3C1- Promotor.
Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID NO: 1 Aminosäuresequenz des Wildtyps Sucrosemutase SmuA aus P. rubrum nach Ravaud et al. 2009 (FEBS Letters 583, 1964-1968): TQQPLLNEKSIEQSKTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGI DAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDWINHTS DQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAK QQPDLNWDNPKVRQDLYA LRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEY TKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLD RDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREP SAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEF LQNVRLTSRDNSRTPFQ DGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQ LIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLWVNFKEQMMRYKLPDNLSIE KVI I DSNSKNVVKKNDSLLELKP QSGVYKLNQ SEQ ID NO:2 DNA Sequenz des 1942 bp großen Xmal/Pstl Fragmentes, das nach Klonierung in einen nichtreplikativen Vektor, z.B. in das smuA- Deletionsplasmid pUT-GntR-P3C1-DSmuA (Fig. 1) resultiert und zur Deletion des smuA-Gens durch homologe Rekombination eingesetzt werden kann. Die DNA-Sequenz resultiert aus einer Fusion von zwei DNA-Fragmenten, die in P. rubrum 3C1 stromaufwärts und -abwärts des zu deletierenden smuA-Gens lokalisiert sind. CCCGGGATCGCATTCATGTTTTCTCCTTCGGTGAAGTGGTCTACTTTTATGGCGATTTGT ATACATTAAAGTGATCAAGGAAAAAATAGCCAGAGGAATAGCCAAATAAATTTCAGGTTT TACAGTGCGGTAACCTCTTTTTGTTGCGCGGTTATCAGGATTCATTTAGGGATAAAGAGG TCTTCAAGTGATCTACAAAACGCTTGCTGAACGTCTGAGAATACGTATCAATTCTGCTGA TTTTGCTATCGGCGATGCTTTACCCAGTGAGAAACGTCTGGCTGCCGAATTTTCTGTATC GAGGATGACACTCCGCAAAGCGGTAAATTTACTGATTGAATGGGGGCTGGTACGTCGCTG TCACGGCAGCGGAACCTTCGTCGCGCAGAAAGATCTCCAACATGAAACTCGTGGGCTGAT GGGGTTTTCAGAACTGATGAAAGAACTGGGCCGCCCCACGGTGAGCGAGGTGCTGGAGTT TCGAATGATGGGAGCCCCCCCAGCCATCGCCAGCCAGCTGCGAATCAAGGCCGATGAACG CATTTACTATTCGCGTCGCGTAAGGTTTGTGGAAGGGAAGCCTGTGGTGCTGGAAGATAG TTACATGCCTGGCAGGTTATTTGGCAACCTTTCAGTCGCACATCTGGAGGGTTCAAAGTT TTCGTATATAGAAGACGAATGCCATATCAATATCGCAGGGAATTACGAAAGCTTCAGCCC GATCTTGGCAGACAGCACGATCGGCGCGCTACTGCACGTTGCCGAAGGCACGCCGCTGCT GCGCCTGACATCGCTTTCTTACAGTGATACCGGCGACTATATCAACTATTCGGTGATATT CAGAAA GC C AAT GAA AC C AC GT G GAC T AC C AT T T GAAG AGGAA AAAT AGC GGGC GAA
GGGGAGCTACATTCCTACTATATAGCAATTCTGTTGCCTAGTGTAATGCGAGTTGCC CGC CGGATAAACCAATAACCGCATTCTCCGCAGGGGGCCGAATTGTGCTTTTGCCAATTGCCC TGATTAATCATTAGCGTTATAGTCAGAATGCTTATTCTCAGGGCGGGGTGCAAGTCCCCA CCGGCGGTAAATCACCTTCTACGGTGAAAGCCCGCGAGCGCTCAGCCAGTCTCTTGTAGT TTGGTTAGAGGTCAGCAGATCCGGTGTAATTCCGGGGCCGACGGTTATAGTCCGGATGGG AGAGAGTAACGGTATCTGCCGGGCTTGCGCCCGCTTGCGTTATTTTTTTAGAAACAGGAG AGTATTGTAATGCATTTTGTTTAAACTAAATCAATAAATCTCATAGTCACGCCAAATAAT GTAAATATATTGAAACTATTAAAACCGGCATTTTATGCCGGTTTTTTTAGCGCAAAATAG GGCTGGCAAAGATAAAGCAGGAGGCTACCACCGTGAGCTATATGCTTTTTTAAAAGGCAA GATTCTCCATCGAGGCTCTGCCGTCACCCGAACGCGATAAACCGCGTTTATCCTCAGATG CCTGGCCGTTGCGCGCAAACGAAGACCGGGGTTTGAGGGCTTGTGGGGCAACGCCGGCGA GCCAGTCAGCTTCTCGTGGGTGCGAGCACATTGCTAATGAACAATCTCGCTTCAAATGTT ATCGTGAGAATGAAGTGTTGCAGTGGCGCCGCCGGGGTTTGCGCTCGATTCAGGTCTGAT TCACATAACAAGGTCACATGGAAATGAAAGTGTTATTCATCGCTTCGCTAGGCGCTTTAT CGTTAATGCAAGCATCATTCTCCTTCGCGGATAATGCCAATGGGAAAAACATCTATTCAC AGAGATGTACTATGTGCCACGGAACCGATCTCAAAGGCACGGGGCCATTGGCTGATAAAA CCAACCCGCCGACACCTGATCTGACAACCCCCGCTTTCAAAGCACGCCTCAATGATTATC CGGGCGTTATTGTATCCTGCAG
SEQ ID No: 3 Nukleotidsequenz des Vollängengens, das für die SmuA- Aminosäureaustauschvariante D302Y kodiert. Ausgetauschte Nukleotide sind hervorgehoben. ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATC TCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAG TCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCC TTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGAC TATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAAC ACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATG GAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGAT GTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAG GATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAAT AATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATAC TACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGT CAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTT GATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTG AAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATG AATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCC TTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACC TTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATTCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAA TTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGG AATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGAT CGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGA GCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCT ATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGA AAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGG ACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTC AAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCA GTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTAT GGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTT GGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTA CCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAA AAGAAT GAT T C AT T AC T C GAGC T AAAAC C AT GGC AGT C AGGGGT T A AAAC T ΑΆΑΤ C AA
TAA
SEQ ID No: 4 Nukleotidsequenz des Vollängengens, das für die SmuA- Doppelmutante D302Y/S303P kodiert. Ausgetauschte Nukleotide sind hervorgehoben. ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATC TCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAG TCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCC TTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGAC TATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAAC ACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATG GAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGAT GTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAG GATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAAT AATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATAC TACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGT CAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTT GATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTG AAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATG AATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCC TTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACC TTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATCCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAA TTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGG AATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGAT CGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGA GCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCT ATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGA AAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGG ACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTC AAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCA GTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTAT GGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTT GGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTA CCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAA AAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAA TAA
Beispiel : Austausch des smuA Wildtypgens gegen smuA-
Seguenzvariantengene in P. rubrum 3C1/Z12A
Die Charakterisierung erfindungsgemäßer modifizierter Sucrosemutaseenzymva- rianten (SmuA*) erfolgt in dem P. rubrum Stamm 3C1. In diesem Stamm ist die SmuA Expression durch den narbenfreien Austausch des nativen smuA- Promotors gegen den homologen Promotor des 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4- Phosphat-Synthasegens ribB signifikant erhöht (r/bß-Promotorsequenz in Stamm 3C1 , s, SEQ ID No:2 Nukleotidposition 1013-1270). Zur Bestimmung der Sucro- semutase-Produktspezifität erfindungsgemäßer SmuA*-Sequenzvarianten, wurde zunächst das im P. rubrum Stamm 3C1 vorhandene smuA-Wildtypgen durch homologe Rekombination deletiert. Im Anschluss werden SmuA*-Varianten kodierende Gene in die smoA-Deletionsmutante durch homologe Rekombination integriert. Diese Vorgehensweise erlaubt die Expression von sequenzmodifizierten Genen im homologen System und die detaillierte Bestimmung der Produkts pezifität erfindungsgemäßer Sequenzvarianten ohne eine Beeinflussung durch SmuA-Wildtypaktivitäten.
1.1. Deletion des s/7?u>A-Wildtypgens in P. rubrum 3C1 /Z12A Alle Klonierungen und DNA-Modifikationen werden wie unter Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Labo- ratory, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt. PCR-Ansätze, Kits zur Nukleinsäureisolie-rung, Detektions- und Selektionsverfahren und die Kultivierung wurden in an sich bekannter Weise, soweit nicht anderes angegeben, nach Angaben der jeweiligen Hersteller durchgeführt.
Die Deletion des smu l-Wildtypgens in P. rubrum 3C1/Z12A erfolgt durch homologe Rekombination. Hierzu werden zwei DNA Fragmente stromaufwärts und stromabwärts des smuA-Gens basengenau amplifiziert und durch z.B. ligasefreie Klonierung (Geu-Flores, F. et al. 2007, Nucleic Acids Research 35 (7): e55) zu- sammengefügt (s. Fig. 1 ). Alternativ besteht die Möglichkeit, das gewünschte DNA-Fragment durch DNA-Synthese herzustellen. Nach Ligation oder Synthese entsteht ein Xmal/Pstl-Fragment (s. SEQ ID No:2), das stromaufwärts des dele- tierten smuA-Gens einen Bereich von 1267 bp homologer Sequenz zum P. rubrum 3C1 Chromosom aufweist. Dieser Bereich kodiert zum einen für einen „Offenen Leserahmen" (ORF), der hohe Homologien zu GntR-Typ Transkriptionsregulatoren aufweist und trägt zum anderen den P. rubrum homologen Promotor 3C1 des 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat Synthasegens ribB. Stromabwärts des deletierten smtv>A-Gens beträgt der zum P. rubrum Chromosom homologe Bereich 655 bp. Zur Durchführung der eigentlichen smuA-Deletion wird das 1942 bp große Xmal/Pstl-Fragment in einen geeigneten Genaustauschvektor Moniert, der in P. rubrum nicht repliziert. In P. rubrum zum Genaustausch geeignete Basisvektoren stellen sogenannte pUT-Derivate dar, die auf einen R6K Replikationsursprung basieren (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67). Diese Vektoren repli- zieren nur dann, wenn das für die Replikation essentielle π-Protein kodierende pir-Gen anwesend ist. Ein solcher Stamm ist E. coli S17-1 pir (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67), er wird zur Konstruktion der jeweiligen Promo- toraustauschplasmide eingesetzt. Ein exemplarisches finales Deletionskonstrukt (pUT-GntR-P3C1-DSmuA), das nach homologer Rekombination die basengenaue Deletion von smuA vermittelt, ist in Figur 1 dargestellt. Der Transfer des hergestellten smu^-Deletionsplasmids nach P. rubrum 3C1 wird bevorzugt durch eine intergenerische Konjugation zwischen E. coli S17- 1 λρΐΓ und P. rubrum realisiert. Die eingesetzten pUT-Plasmide tragen einen„Ori- gin of Transfer" (oriT) des RP4 Plasmids und können durch das in E. coli S17- λρ/ ' r chromosomal integrierte RP4 Plasmid nach P. rubrum mobilisiert werden (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67).
Die Bedingungen der intergenerischen Konjugation wurden wie folgt optimiert: Die Selektion potentieller P. rubrum 3C1 Transkonjuganten erfordert einen in P. rubrum selektionierbaren Plasmidmarker (z.B. aphll, Kanamycin-Resistenz), und eine Möglichkeit, den E. coli Donor selektiv zu inhibieren. Durch Ausplattieren auf Rifamycin-haltigem Medium (100 pg/ml) werden spontan Rifamycin-resistente P. rubrum 3C1 Kolonien generiert (P. rubrum 3C1 Rif), die sich ansonsten nicht vom Wildtyp unterscheiden. Die Konjugation wird wie folgt ausgeführt:
E. coli SM- λρ/ ' r Donorstämme, die das smivA-Austauschplasmid tragen, werden über Nacht in 5 ml dYT Medium (pro 1 Liter: 16 g Bacto Trypton, 10 g Bacto Yeast Extract und 5 g NaCI) unter Zusatz von Kanamycin (50 pg/ml) bei 37°C angezogen. Der Rezipient P. rubrum 3C1 wurde ebenfalls über Nacht in 5 ml dYT unter Zusatz von Rifamycin (100 pg/ml) bei 30°C angezogen. Jeweils 1 ml der Übernachtkultur werden in Erlenmeyerkolben mit 100 ml dYT-Medium (Zusätze siehe oben) überimpft und bei 30°C (P. rubrum 3C1 ) bzw. 37°C (E. coli) und 250 Upm bis zu einer OD (600 nm) von 0,4 bis 0,8 inkubiert. Donor und Rezipient werden im Verhältnis 1 :4 gemischt, abzentrifugiert, mit 1 ml dYT gewaschen und final in 100 μΙ dYT-Medium aufgenommen. Die Suspension wird auf einen Nitrocellulose-Filter (0,45 pm Porengröße) pipettiert, der sich auf einer dYT-Platte befindet und über Nacht bei 30° inkubiert. Die Zellen werden an- schließend mit 1 ml dYT vom Filter abgeschwemmt, verdünnt, auf Selektionsplatten ausplattiert (dYT + Kanamycin 50 pg/ml und Rifamycin 100 pg/ml) und über Nacht bei 30°C inkubiert. Durch die Kanamycin Selektion werden solche P. rubrum 3C1 Transkonjuganten erhalten, in denen die Plasmide vorzugsweise über eine der beiden homologen Regionen ins Chromosom integrierten (Figur 1 ). Die Inkubation auf Kanamycin- freiem Medium erlaubt die Selektion von smuA Deletionsstämmen, in denen das integrierte Plasmid über ein zweites cross-over aus dem Chromosom desintegriert ist.
Zum Nachweis einer erfolgreichen Desintegration kann ein auf den Austauschplasmiden vorhandenes Farbmarkergen xylE eingesetzt werden. Das xy/E-Gen kodiert für eine Catechol-2,3 Dioxygenase, die Catechol zur 2- Hydroxymuconsäure-Semialdehyd umsetzt, was phänotypisch durch markante Gelbfärbung erkennbar ist. Die Desintegration der zuvor integrierten Austauschplasmide ist ein seltenes Ereignis (1 unter 1000 Kolonien) und kann mit Hilfe dieses Markers durch die in den gewünschten Klonen ausbleibende Gelbfärbung nach Catecholzugabe (Sprühreagenz: 0,2 ml einer 0,5 mol/l wässri- gen Lösung) detektiert werden. Da die Desintegration des Austauschplasmids auch die Rekonstitution des Wildtyps zur Folge haben könnte, können alle generierten smuA-Deletionsstämme durch PCR-Experimente, Southern-Blot Analysen und genomische Sequenzierungen überprüft und verifiziert werden. Der smuA- Deletionsstamm wird mit P. rubrum 3C1 DSmuA bezeichnet (Fig. 2). 1.2. Herstellung von Sequenzvarianten und deren Integration in P. rubrum 3C1 DSmuA
Polynukleotidmoleküle, die die vorgenannten erfindungsgemäßen durch Aminosäureaustausch abgewandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren, können durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Methoden, wie z.B. Gen- Synthese, Ligase-freie Klonierung, oder Overlap-Extension-PCR generiert werden. Exemplarisch wird die Herstellung und Testung von zwei Sequenzvarianten, D302Y und der Doppelmutante D302Y/S303P beschrieben (Referenzsequenz ist SEQ-ID No: 1). SEQ-ID-No. 3 beschreibt die Nukleotidsequenz des Vollängen- gens, das für die SmuA-Aminosäureaustauschvariante D302Y kodiert und SEQ- ID-No. 4 beschreibt die Nukleotidsequenz des Volllängengens, das für die SmuA-Doppelmutante D302Y/S303P kodiert.
Modifizierte smuA Gensequenzvarianten (smuA*), die für erfindungsgemäße Aminosäureaustausche von SmuA (SmuA*) kodieren, können zur Expression in den unter Beispiel 1.1. beschriebenen SmuA-Deletionsstamm transferiert wer- den. Dazu wird das entsprechende smUiA*-Variantengen durch Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden, wie z.B. ligasefreie Klonierung (s.o.), ba- Sengenau in ein nichtreplikatives pUT-Derivat kloniert. Wie in Fig. 3 dargestellt trägt ein solches Plasmid, wie pUT-GntR-P3C1-SmuA*, neben dem smuA- Variantengen smuA*, stromaufwärts von smuA* einen 1267 bp großen Bereich, der Homologien zum Chromosom des smty>A-Deletionsstammes P. rubrum 3C1 DSmuA aufweist. Über diesen Bereich kann das Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom von P. rubrum 3C1 DSmuA integrieren (Fig. 3). Der Transfer kann durch intergenerische Konjugation (s. Beispiel 1.1.) erfolgen. Durch Kanamycin Selektion werden solche Transkonjuganten erhalten, in denen die Plasmide über die homologe Region stromaufwärts von smuA* ins Chromosom integrierten.
Der Nachweis der korrekten Integration erfolgt über PCR-Experimente. Verifizierte Transkonjuganten tragen smtv/l *-Variantengene, die durch den starken 3C1 Promotor konstitutiv exprimiert werden. Die in diesen Stämmen produzierten erfindungsgemäßen, durch Aminosäureaustausch abgewandelten SmuA- Sequenzvarianten werden anschließend hinsichtlich ihrer Produktspektren in Ganzzellbiotransformationen analysiert.
Beispiel 2: Produktspektrum erfindungsgemäßer SmuA-Variantenstämme in P. rubrum 3C1/Z12A
2.1 Analyse der Kohlenhydratzusammensetzung mittels HPLC
Die Bestimmung der aufgetrennten Kohlenhydrate erfolgt über HPLC mit folgenden Komponenten: HPLC Pumpe; Probengeber; Rl (Brechungsindex)-Detektor; Vorsäule: 10 mm x 4,6 mm, Aminophase (z.B. Zorbax-NH2); Trennsäule: 250 mm x 4,6 mm, Aminophase (z.B. Zorbax-NH2); Interface, Computer und Software zur Messdatenerfassung und -auswertung.
Die Messung wurde unter folgenden chromatographischen Bedingungen durchgeführt: Injektionsvolumen: 10 μΙ; Flussrate: 1 ,0 bis 1 ,8 ml/min. Die einzustellende Flussrate für eine optimale Trennung hängt von Art und Zustand der Trennsäule sowie der Laufmittelzusammensetzung ab. Weitere Analyseparameter siehe Tabelle 1. Tabelle 1 :
Gerät: HP1 100 HPLC-System
Säule(n): Zorbax-NH2 250 x 4,6 mm, bei Raumtemp.
5 pm mit Vorsäule 10 x 4,6 mm
Detektor: Brechungsindex-Detektor auf 30 °C temperiert
Lauf mittel: Acetonitril 73 % (v/v) Fluß: 1 ,400 ml/min
Injektionsvolumen: 10 μί
Analysenzeit: 30 min
Proben10 %ige Probelösung
konzentration
2.2 Ganzzellbiotransformation im Schüttelkolben
Die Anzucht der erfindungsgemäßen Stämme und von Wildtyp-Kontrollstämmen erfolgte in 30 ml LB-Medium (Start-OD 60 o von 0,05). Die Kulturen wurden jeweils bei 30 °C, 200 Upm im Horizontalschüttler inkubiert. Nach zunächst 24 Stunden Fermentation werden 5 x OD Zellen entnommen, abzentrifugiert und mit 1 ml CaAcetat-Puffer (0,01 mol/l, pH 5,5) gewaschen. Die Zellpellets (entsprechend 5 x OD Zellen) wurden jeweils in 1 ,25 ml CaAcetat-Puffer (0,01 mol/l, pH 5,5) mit einer Saccharoselösung von 0,584 mol/l (200 g/l) resuspendiert. Die Ansätze wurden zu Biotransformation in Deep-Well Platten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 90 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzebehandlung (5 min 98 °C) gestoppt.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse der Überstände nach Fermentation unter Saccharoseanzucht.
Tabelle 2: