Analysen, die auf molekularbiologischer Ebene durchgeführt werden, gewinnen zunehmend an Bedeutung. In den meisten Fällen wird in solchen Methoden ein zu analysierendes Nucleinsäuregemisch durch Hybridisierungsreaktionen mit sogenannten Sonden hybridisiert und charakterisiert. Insbesondere bei Fragestellun- gen, bei denen gleichzeitig eine Vielzahl von Polynucleinsäuren verschiedener Art nachgewiesen werden sollen, kommt es zu methodischen Engpässen. Man versucht insbesondere durch parallele Prozeßführung eine Vielzahl von Analyseschritten in kurzer Zeit durchzuführen. Dabei stellt sich oftmals das Problem, daß Trägersysteme, auf denen die Hybridisierungsexperimente durchgeführt werden können, nur beschränkte Raumkapazität aufweisen. Man versucht daher durch Verwendung von Trägern, auf denen eine Vielzahl von Proben plaziert werden können, diese Probleme zu lösen. Insbesondere werden im Stand der Technik Träger beschrieben, die Mikro- oder Nanokompartimente aufweisen zur Aufnahme entsprechend kleiner Volumina, der meistens in Lösung befindlichen Analyten. Entsprechende Trägersysteme sind beispielsweise durch Ätzen von Oberflächen von aus Silizium aufgebauten Wafern erhältlich.

E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acids Research 20 : 1679 bis 1684 und E. M. Southern et al. (1997), Nucleic Acids Research 25 : 1155 bis 1161) beschreibt die Herstellung sogenannter Oligonucleotid-Anordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glykol derivatisiert wurde.

Ein ähnliches Verfahren betrifft die Veröffentlichung von S. P. A. Fodor (Pease, A. C. et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 5022 bis 5026). Die dort beschriebene in. situ Oligonucleotidsynthese findet mittels vollautomatischer, lichtgesteuerter kom- binatorischer Chemie statt. Die Direktsynthese von Oligonucleotiden auf einer Glasoberfläche erlaubt eine maximale Länge von ca. 30 Basen. Eine Sicherstellung des Syntheseverlaufs der individuellen Sequenz längerer Oligonucleotide ist-wenn überhaupt-mit einem nicht vertretbaren Aufwand verbunden. Diese Oligonucleotide als Leit-DNA erlauben die Hybridisierung eines nur sehr kurzen Stücks der Analyse- Nucleinsäure. Um diesen Nachteil zu umgehen, werden für jede zu analysierende Nucleinsäure mehrere Oligonucleotide als Leit-DNAs synthetisiert. Dies hat eine größere Platzbeanspruchung und damit größeres Probenvolumen an Analyse- Nucleinsäure zur Folge. Die geringe Länge der Oligonucleotide schließt ferner Kreuzhybridisierungen mit verschiedenen Analyse-Nucleinsäuren nicht aus. Dadurch wird eine eindeutige Zuordnung der aufgenommenen Signale erschwert.

P. O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278 : 680-686) offenbart zur Herstellung sogenannter DNA-Chips Polylysin beschichtete Glasoberflächen, auf die kleinste DNA-Mengen mittels Kapillartechnik aufgetropft werden. Die Immobilisierung der Leit-DNA auf einer Polylysin-Oberfläche beeinträchtigt allerdings die Hybridisierung und setzt damit die Nachweisgrenze und Verläßlichkeit bei der Detektion der Analyse-Nucleinsäuren beträchtlich herab.

L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acids Research 22 : 5456-5465) beschreibt eine Technik zur Immobilisierung von Oligonucleotiden, die darauf beruht, daß Oligonucleotide mit einer 5'terminalen Aminogruppen derivatisiert werden und diese dann auf eine Glasoberfläche gebracht werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat derivatisiert wurde. Während die Chemie zur Immobilisierung der Oligonucleotide die Nachteile der zuvor beschriebenen Systeme umgeht, gelten auch hier die zuvor erwähnten Nachteile, die durch die Verwendung von kurzen Oligonucleotiden als Leit-DNA bedingt sind.

Solche Systeme sind üblicherweise nur recht aufwendig herstellbar und erreichen oft eine nicht zufriedenstellende Kapazität von Probenkompartimenten, die für eine entsprechende Parallelisierung notwendig wären.

Außerdem ist die Verwendung von vollständigen cDNAs nicht ratsam. Zum einen werden Kreuzreaktionen bei stark homologen Genfamilien auftreten und zum anderen enthalten die cDNA's repetitive Elemente, die zu unspezifischen Hybridisierungen führen können. Es können daher Artefakte verursacht werden. Bei speziesübergreifenden Vergleichen können die genannten Artefakte zu einer starken Limitierung der Methodik führen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist mithin die Bereitstellung eines Trägers, der die genannten Nachteile des Standes der Technik vermeidet. Insbesondere soll der erfindungsgemäße Träger Nucleinsäuren, bevorzugt mit definierter Sequenz und mög- lichst gleicher Länge, in hoher Dichte binden können und eine hohe Parallelisierung von zu untersuchenden Proben erlauben.

Erfindungsgemäß gelöst wird diese Aufgabe durch einen Träger mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Bevorzugte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Trägers finden sich in den Unteransprüchen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eben- falls ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Trägers sowie dessen Verwendung. Die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Trägers ermöglicht ein neues und erfinderisches Verfahren, das in vorteilhafter Weise eine Quantifizierung von Transkriptionsprofilen erlaubt.

Figur 1 betrifft ein Reaktionsschema, in dem die chemische Derivatisierung der Festphasenoberfläche und Kopplung der Leit-DNA dargestellt ist.

Figur 2 betrifft einen Vergleich der Expressionsintensitäten von 72 unterschiedlichen Genen in zwei gleichen aber unterschiedlich markierten Wildtyp-Maus-Gehirn RNA Proben, wobei Figur 2a eine mit Cy3-dCTP und Figur 2b eine mit Cy5-dCTP markierte Probe betrifft. Figur 2c zeigt Signalintensitäten wt/wt der beiden fluoreszenzmarkierten Proben in einem doppeltlogarithmischen Punktdiagramm Figur 2d betrifft den Expressionsquotienten wt/wt, wobei das Verhältnis von Cy3 zu Cy5 markierter Probe als halblogarithmisches Balkendiagramm dargestellt ist.

Figur 3 zeigt den Vergleich der Expressionsintensitäten von 72 unterschiedlichen Genen in einer Wildtyp-Maus-Gehirn RNA Probe und einer Mutanten (PLP-'-/MBP4-) Maus-Gehirn RNA Probe. Figur 3a betrifft die mit Cy3-dCTP markierten Nucleinsäuren gewonnenen Expressionsprofile und Figur 3b zeigt die mit Cy5-dCTP markierten Nucleinsäuren gewonnenen Expressionsprofile. Figur 3c zeigt die entsprechenden Signalintensitäten analog Figur 2c. Figur 3d betrifft normierte Expressionsquotienten wt analog Figur 2d.

Der erfindungsgemäße Träger mit an mindestens einer Hauptoberfläche des im we- sentlichen planaren Trägers kovalent gebundener Oligo-oder Polynucleinsäuren weist an der Hauptoberfläche des Trägers eine reaktive Gruppe auf, die mit einem bifunktionellen Spacer unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Spacers und der reaktiven Gruppe der Hauptoberfläche des Trägers reagiert hat. Unter Hauptoberfläche wird jede Oberfläche verstanden, die eine hinreichende Dimension aufweist, um eine für die Verwendung des Trägers notwendige Anzahl von Proben aufzunehmen.

Die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Spacers hat mit einer funktionellen Gruppen eines bifunktionellen Linkers reagiert und die zweite funktionelle Gruppe des bifunktionellen Linkers hat mit dem Oligo-oder Polynucleotid, das kovalent gebunden werden soll (Leit-Nucleinsäure), unter Ausbil- dung einer kovalenten Bindung am 5'-oder 3'-Terminus des Oligo-oder Polynucleotid reagiert.

Der erfindungsgemäße Rager ist dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem 5'-oder 3'-Terminus über bifunktionelle Spacer und bifunktionelle Linker kovalent gebundenen Oligo-oder Polynucleinsäuren eine Länge von 200 bis 600 bp aufweisen. Die Oligo-oder Polynucleinsäuren sind durch ein Verfahren mit folgenden Schritten erhältlich : Auswahl homologer Bereiche von mRNA einer Zielspezies und mindestens einer Modellspezies, Auswahl von Amplifikationsprimern, die die Amplifikation von 200 bis 600, vorzugsweise 200 bis 400 bp langen Nucleinsäuren, aus den homologen Berei- chen sowohl der mRNA der Zielspezies als auch der mRNA der mindestens ei- nen Modellspezies erlauben, wobei gegebenenfalls die Amplifikationsprimer maximal 1 Mismatch pro 6 Nucleinsäuren des Amplifikationsprimers aufweisen, Immobilisierung der durch Amplifikationen unter Einsatz der Amplifikations- primer entsprechende 200 bis 600 bp lange Nucleinsäuren für die Zielspezies oder die mindestens eine Modellspezies erhaltenen Nucleinsäuren an der mindestens einen Hauptoberfläche des Trägers.

Vorzugsweise ist das Polynucleotid eine RNA, DNA oder PNA. Der Träger besteht vorzugsweise aus einem Glas oder einem anderen hauptsächlich aus Siliziumoxid bestehenden Material. Vorzugsweise weist der bifunktionelle Spacer, der an die Hauptoberfläche des erfindungsgemäßen Trägers gebunden ist, die nachstehende Struktur auf (XO)3-Si-Y-Nu wobei X = Cl-C3 Alkvl.

Y = C2-C4 Alkylen, Nu = eine nucleophile Gruppe wie-NH2,-NHR, mit R =-CH2-CH2-NH2,-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2-CO-NH2, oder SH, ist.

Insbesondere bevorzugt ist ein Spacer der Struktur Me30Si-CH2-CH2-CH2-NHz.

Vorzugsweise ist der bifunktionelle Linker ausgewählt aus der Gruppe starrer homo- bifunktioneller Linker bestehend aus : 2,7 substituiertem Fluoren, 2,6 substituiertem Naphtalin, 2,6 substituiertem Anthracen, 2,7 substituiertem Phenanthren, 4,4'substituiertem Biphenyl, 4,4' substituierten Benzom (C6H5-CO-CH (OH)-C6H5), 4,4'substituiertem Benzil (C6H5-CO-CO-C6H5), 4,4'substituiertem Benzophenon (C6H5-CO-C6H5), 4,4' substituiertem Diphenylmethan (C6H5-CH2-C6H5), 4,4'substituiertem Stilben (C6H5-CH=CH-C6H5), 1,3 substituiertem Allen (CH2=C=CH2), 1,4- disubstituiertem Benzol.

Insbesondere bevorzugt ist ein Linker mit der folgenden Struktur S = C = N-Phenylen-N = C = S.

Die Verwendung starrer bifunktioneller Linker hat den Vorteil, daß im wesentlichen nur eine der beiden Gruppen mit der Oberfläche des Trägers reagiert.

Als funktionelle Gruppen, mit denen der homobifunktionelle Linker substituiert ist, sind bevorzugt --Aldehyde und Ketone, Isocyanate, Isothiocyanate, Carbonsäu- rederivate : a) Carbonsäureester : im Allgemeinen die leicht zugänglichen methyl und ethyl-Ester. Besser geeignet sollten aber aktivierte Ester wie z. B. Ester des p-Nitrophenols oder des N-Hydroxysuccinimids sein. b) Carbonsäurechloride (R-COCI) c) Carbonsäureazide (R-CON3) d) gemischte Anhydride mit Kohlensäuremonoester (R-CO-O-COR').

Der erfindungsgemäße Träger weist vorzugsweise ein kovalent an den bifunktionellen Linker gebundenes Oligo-oder Polynucleotid auf, wobei die kovalente Bindung mittels einer am 3'-oder 5'-Terminus über ein Alkan mit einer Länge von 4 bis 30 Methylengruppen oder über einen Polyether mit 2 bis 20 wiederholenden Struk- tureinheiten synthetisch oder über die PCR Reaktion angeftigte primäre Aminogruppe gebunden ist.

200 bis 400 bp lange DNA Fragmente bilden aus folgenden Gründen bevorzugte Leit- DNAs : Die Länge und die damit gegebene Schmelztemperatur sind ausreichend, um- bei sorgfältiger Auswahl und einer maximalen Komplexität wie sie das menschliche Genom darstellt-mit hoher Sicherheit eine nicht redundante Hybridisierung zu garantieren.

Die kürzesten bekannten cDNAs liegen im Bereich von ca. 200 bp. Somit können alle cDNAs einer zu analysierenden cDNA-Population vollständig oder als 200 bis 400 bp-Fragmente an die Festphase gebunden werden. Die ähnliche Länge aller aufgetragenen DNAs ergibt bei der Hybridisierung mit einer markierten Analyse- Nucleinsäure Hybridisierungssignale, die nicht durch die Lange oder unterschiedliche Hybridisierungskinetik der Leit-Nucleinsäure beeinträchtigt werden.

Die Sequenzen der aufzutragenden Leit-DNAs werden vorzugsweise jeweils einzeln, z. B. durch eine eigens hierfür hergestellt Software, insbesondere aus den öffentlich zur Verfiigung stehenden Gen-Datenbank herausgesucht. Es ist bevorzugt die Leit- DNAs auf Nicht-Redundanz zu prüfen. Damit ist weitestgehend ausgeschlossen, daß eine Leit-DNA mit mehreren Analyse-Nucleinsäuren hybridisiert und so zu falsch positiven Signalen führen kann. Die Leit-DNA wird, z. B. mittels RT-PCR und sequenzspezifischer Primer, ausgehend von Gesamt-RNA nach gängigen Protokollen, amplifiziert.

Bei der Auswahl der sequenzspezifischen Primer werden diese vorzugsweise so gewählt, daß sie zur Amplifizierung der gewünschten Leit-Nucleinsäure verschiedener Spezies wie z. B. human und murin geeignet sind. Auch bei diesem Vorgang hat sich eine Lange der Leit-Nucleinsäure von 200 bis 400 bp als geeignet erwiesen. Die Lange reicht aus um in ca. 70 bis 80% der Fälle 18 bis 22 bp lange Primer zu definieren, die mit maximal 3"mismatch-Basen"die Amplifizierung der Leit-Nucleinsäure beider Spezies erlaubt.

Als Träger werden vorzugsweise an sich bekannte Glas-Objektträger benutzt. Im Gegensatz zu oftmals verwendeten Nylonmembranen bieten z. B. Objektträger den Vorteil, daß sie aufgrund ihrer Starrheit und der Tatsache, daß Glas für die meisten Reagenzien inert ist, wesentlich leichter zu bearbeiten und anschließend von unspezifischen Hybridisierungssignalen freizuwaschen sind. Ein großer Vorteil liegt weiterhin darin, daß Glas zur fluoreszenzgestützten Analyse genutzt werden kann.

Insbesondere die Nutzung piezoelektrischer Nanodispenser zum Auftragen der Leit- DNA auf die Festphase erlaubt eine sehr genaue Dosierung, was für eine verläßliche Quantifizierung der Analyse-DNA bevorzugt ist, die im direkten Zusammenhang mit einer reproduzierbaren Menge an Leit-DNA steht. Die Möglichkeit, Tropfenvolumina von 0,1 nl aufzutragen, erlaubt die Anordnung von 100.000 unterschiedlichen Leit- DNAs z. B. auf der Fläche eines Objektträgers (76 x 26 mm). Damit wird es möglich, auch sehr geringe Nucleinsäuremengen zu detektieren.

Die erfindungsgemäße Immobilisierung der Leit-DNA über die Reaktion eines Isothiocyanats mit einem primären Amin zu N-substituierten Thioharnstoffen birgt Vorteile. Sowohl die Chemikalien als auch die aminomodifizierten 5'-Oligonucleotid- primer zur Synthese der DNAs sind kostengünstig im Vergleich zu anderen Syntheseverfahren, die auf der Phosphoramidit-Chemie beruhen. N-substituierte Thioharnstoffe stellen eine stabile Verbindung dar. Die nach dem hier beschriebenen Verfahren kovalent gebundene DNAs werden auch durch mehrstündiges Kochen in Wasser nicht von der Festphase abgetrennt. Damit können die DNA-Chips auch einer Mehrfachverwendung zugänglich sein. Dies scheitert bei anderen Chips unter anderem daran, daß die für die Regenerierung erforderlichen Waschbedingungen zum Entfernen von spezifischen und unspezifischen Analyse-DNAs aufgrund der Instabilität der Festphasen-Bindung nicht stringent genug gewählt werden können.

Durch die spezifische Bindung der DNA über ihr 5'oder 3'Ende ist weitestgehend sichergestellt, daß nahezu die gesamte Leit-DNA für die Hybridisierung mit der Analyse-DNA zur Verfügung steht und nicht durch unspezifische Bindung an der Oberfläche beeinträchtigt ist. Die DNA-Doppelhelix wird sich aufgrund ihrer recht starren Struktur und negativen Ladung senkrecht zur Festphase ausrichten und so eine maximale Dichte an aufzutragender Leit-DNA ermöglichen.

Die spezifische und monovalente Bindung der Leit-DNA an die Festphase erlaubt nicht zuletzt eine Kontrolle der Menge an aufgetragener DNA über die zur Verfügung stehenden derivatisierbaren Isothiocyanatgruppen.

Die erfindungsgemäße Verwendung eines erfindungsgemäßen Trägers in einem Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Polynucleotiden durch eine Markierung der zu analysierenden polynucleotide und anschließende Hybridisierung auf dem Träger ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erstellung von Transkriptionsprofilen weist die folgenden Schritte auf : homologe Bereiche von mRNA einer Zielspezies und mindestens einer Modellspe- zies werden ausgewählt, Amplifikationsprimer, die die Amplifikation von 200 bis 600, vorzugsweise 200 bis 400 bp langen Nucleinsäuren, aus den homologen Bereichen sowohl der mRNA der Zielspezies als auch der mRNA der mindestens einen Modellspezies erlauben werden ausgewählt, wobei die Amplifikationsprimer maximal 1 Mismatch pro 6 Nucleinsäu- ren des Amplifikationsprimers aufweisen, durch Amplifikationen werden unter Einsatz der Amplifikationsprimer entsprechende 200 bis 600 bp lange Nucleinsäuren für die Zielspezies oder die mindestens eine Mo- dellspezies amplifiziert und die erhaltenen Nucleinsäuren auf mindestens einem Trä- ger immobilisiert, der mindestens eine Träger wird mit einer zu analysierenden DNA-oder RNA-Probe inkubiert und die Menge an gebundener DNA oder RNA quantifiziert.

Damit die Erstellung eines Transkriptionsprofils also eine qualitative und quantitati- ve Analyse der Genexpression möglich ist, wird die zu analysierende Nucleinsäure, z. B. RNA oder DNA, markiert. Der Hybridisierungsprozess führt dann dazu, daß die auf der Oberfläche immobilisierten cDNAs mit den entsprechenden markierten DNAs oder RNAs der zu analysierenden Probe zusammengeführt werden. Dies führt zur Markierung der cDNAs auf der Oberfläche des Trägers mit dem entspre- chenden Gegenstück, das in der zu analysierenden Probe vorhanden gewesen ist.

Die Markierung der zu analysierenden Probe kann auf unterschiedliche Weise erfol- gen.

Es können z. B.

1. Agentien genutzt werden, die direkt mit der RNA oder DNA reagieren, 2. auf enzymatischem Wege modifizierte Nucleotide angefügt werden, 3. über eine RT-Reaktion unter Einbau modifizierter Nucleotide die RNA in mar- kierte cDNA umgeschrieben werden.

Die Agentien bzw. modifizierten Nucleotide können Elemente enthalten, die z. B. radioaktiv sind oder zur Fluoreszenz oder Lumineszenz angeregt werden können, so daß mit einem geeigneten Detektionsgerät eine direkte Messung möglich ist. Sie können aber auch als Linker bzw. Hapten dienen, um eine anschließende Kopplung mit einem zweiten markierten Molekül zu ermöglichen.

Durch Einsatz unterschiedlicher Fluoreszenzesignale können auch unterschiedliche zu analysierende Proben gleichzeitig auf einem Träger zur Hybridisierung aufgege- ben werden, so daß ein direkter Vergleich dieser unterschiedlichen Proben auf ei- nem Träger möglich ist. So können z. B. zwei unterschiedliche Proben wie folgt behandelt werden. Man markiert die Nucleinsäuren, die in der einen Probe vorhan- den sind mit einer ersten fluoreszierenden Verbindung und die in der zweiten sepa- raten Probe vorhandenen Nucleinsäure mit einer zweiten fluoreszierenden Verbin- dung, deren emittierte Fluoreszenz von der der ersten fluoreszierenden Verbindung verschieden ist.

Die Hybridisierungslösung enthält neben den markierten Proben noch Salze, Deter- gentien und nicht markierte DNA wodurch optimale, auf den jeweiligen Träger abgestimmte Hybridisierungsbedingungen erreicht werden können. Vor der eigent- lichen Hybridisierung kann es sinnvoll sein, eine sogenannte Vorhybridisierung durchzuführen. Dabei wird der entsprechende Träger mit der Hybrdisierungslösung, allerdings ohne markierte Probe, inkubiert und Reaktionsbedingungen werden opti- mierbar.

Nach der Hybridisierungsreaktion werden nicht spezifisch gebundene Probenbe- standteile durch vorzugsweise mehrere Waschvorgänge abgetrennt. Die hierbei verwendeten Waschlösungen enthalten insbesondere Detergenzien wie Natriumdo- decylsulfat und geringe Salzmengen. Der oder die Waschvorgänge werden in der Regel in einem Temperaturbereich von 20 bis 60°C und über einen Zeitraum von 5 bis 20 Minuten durchgeführt.

Zur Erstellung eines Transkriptionsprofils werden die mittels eines geeigneten De- tektionsgeräts aufgenommenen Signale quantifiziert. Die Signalintensität entspricht hierbei z. B. direkt der Anzahl der in der Hybridisierungslösung vorhandenen mar- kierten Moleküle und damit der Expressionsstärke des entsprechenden Gens in der untersuchten Probe. Durch Normierung dieser Werte auf einen internen oder exter- nen Standard können Transkriptionsprofile unterschiedlicher Proben miteinander verglichen werden.

Die Detektion der Hybridisierung von Leit-und Analyse-Nucleinsäuren kann nach verschiedenen Methoden erfolgen. Eine geeignete Methode besteht in der Markierung der Analyse-Nucleinsäure mittels fluoreszierender Nucleotide und anschließender Detektion der Hybridisierung mittels Fluoreszensmikroskopie. Zur differentiellen bzw. relativen Quantifizierung von Analyse-Nucleinsäuren wird zu der fluoreszenzmarkierten Analyse-Nucleinsäure eine bekannte Menge an Referez- Nucleinsäure, die einen zweiten Fluoreszenzmarker trägt, zugegeben und für die Hybridisierung auf die immobilisierte Leit-DNA aufgetragen. Durch Vergleich der detektierten Signalintensitäten erfolgt eine relative Quantifizierung der Analyse- Nucleinsäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers weist folgende Schritte auf.

Der bifunktionelle Spacer wird in einem polaren aprotischen Lösungsmittel auf die Hauptoberfläche des Trägers aufgebracht, woraufhin gegebenenfalls überschüssiger nicht abreagierter Spacer entfernt wird. Der bifunktionelle Spacer wird beispielsweise in 95%-igem Aceton/Wasser-Gemisch (Vol-%) auf die Hauptoberfläche des Trägers aufgebracht. Vorzugsweise wird der Träger nach den eventuell durchgeführten Waschschritten, insbesondere durch Erhitzen, getrocknet.

Der bifunktionelle Linker wir in einem im wesentlichen wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel gelöst und zur Reaktion mit dem auf der Hauptoberfläche gebundenen Spacer gebracht. Der Linker sollte vorzugsweise in geringer Konzentra- tion, beispielsweise im Bereich von 0,5 Gew.-% in dem polaren aprotischen Lösungsmittel vorliegen. In diesem Falle kommt z. B. ein Lösungsmittelsystem mit 10% Pyridin/Dimethylformamid (Vol-%) in Betracht. Die Reaktionszeit hängt von der Reaktionsfreudigkeit des bifunktionellen Spacers oder bifunktionellen Linkers ab und kann durchaus mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur betragen. Der Träger kann in diesem Zustand gekühlt und trocken mehrere Monate aufbewahrt werden.

In einem weiteren Ansatz wird das am 5'-oder 3'-Terminus über eine Alkylengruppe mit einer Aminogruppe modifizierte Oligo-oder Polynucleotid in einem Puffer aufgenommen. Hierzu bietet sich insbesondere ein basischer Puffer, beispielsweise ein Carbonatpuffer an. Die Mischung wird auf dem vorher vorbereiteten Träger inkubiert zur Bindung des Oligo-oder Polynucleotids an eine freie Gruppe des bifunktionellen Linkers. Dies kann insbesondere für einen Zeitraum von mehreren Stunden in einer dampfgesättigten Atmosphäre erfolgen. Danach werden eventuell nicht abreagierte Gruppen des bifunktionellen Linkers entfernt. Hierzu dienen insbesondere Amine wie Ethanolamin oder Hydroxylamin. Es handelt sich dabei um dem Fachmann an sich bekannte typische Blockierungsreaktionen reaktiver Gruppen.

Danach wir das auf dem Träger gebundene Oligo-oder Polynucleotid denaturiert. Zur Denaturierung wird beispielsweise der Träger mit dem dann daran kovalent gebundenen Polynucleotid in bidestilliertem Wassern gekocht. Zur Aufrechterhaltung des denaturierten Zustandes kann der Träger mit reinem Alkohol gespült und anschließend kühl und trocken aufbewahrt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden weiteren Erläuterungen näher beschrieben.

Figur 1 : Chemische Derivatisierung der Festphasenoberfläche und kovalente Kopplung der Leit-DNA.

Reinigung der Glas-Obiektträger : 76 x 26 mm, reinweißes Glas, ohne Beschichtung, Mattrand oder Beschriftungsfeld ; z. B. Fisher Scientific unter der Bezeichnung "Objektträger Reinweiß mit geschnittenen Kanten" : zwei Stunden Schütteln der Objektträger in einer Lösung aus 2 N NaOH in 70% EtOH, dreimaliges Waschen mit vollentsalztem (und bidestilliertem) Wasser und einmaliges Waschen mit Aceton.

Beschichtung : Die Objektträger werden zwei Minuten in einer Lösung aus 1% 3- Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS) in 95% Aceton/Wasser eingetaucht, dann zehnmal jeweils fünf Minuten in Aceton gewaschen und anschließend 45 Minuten bei 110°C getrocknet.

Derivatisierung der beschichteten Objektträger mit einem Linker : Die Objektträger werden zwei Stunden in einer Lösung aus 0,2 Gew.-% 1,4 PhenyldiIsothiocyanat (PDC)/10 Vol.-% Pyridin/Dimethylformamid eingetaucht und anschließend mit Methanol und Aceton gewaschen.

Auftragen der Leit-DNA zur kovalenten Kopplung : 0,1 nl PCR-Fragmente werden mittels eines Nano-Dispensers auf definierte Positionen der Objektträger aufgetragen, die Objektträger mindestens eine Stunde bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert, dann einmal mit 1 % NH40H und dreimal mit Wasser gespült und gekühlt und trocken gelagert.

Zur Abtrennung des DNA-Gegenstranges vom Matrizen-Strang werden die Objektträger zehn Minuten bei 96°C in vollentsalztem Wasser inkubiert, mit 96% Ethanol gespült und anschließend bei Raumtemperatur getrocknet. Die Objektträger sind nun für die Hybridisierung mit der Analyse-Nucleinsäure bereit.

Erfindungsgemäß kann auch wie folgt verfahren werden.

Es kann auch eine Glasoberfläche genutzt werden, die nicht zur Nutzung als Objektträger angefertigt wurde.

Die Dichte der derivatisierbaren Aminogruppen auf der Glasoberfläche kann durch die Konzentration der APTMS-Lösung zwischen 0,1 und 10% variiert werden, wodurch eine unterschiedliche Dichte an gekoppelter Leit-DNA eingestellt werden kann.

Die Dichte der derivatisierbaren Aminogruppen kann ferner gesteuert werden durch ein Gemisch aus APTMS/Propyltrimethoxysilan (PTMS) oder APTMS/Tetrametho- xysilan (TeMS) im Verhältnis 1 : 10 bis 10 : 1.

Vor der Derivatisierung der Aminogruppen mit PDC können die gebundenen APTMS-Moleküle vernetzt werden : 30 Minuten bei 90°C mit 5% APTMS oder PTMS oder TeMS in Wasser ; pH 5,5 bis 5,8.

Die Konzentration der PDC kann, wie oben für das APTMS beschrieben, zwischen 0,04% und 1% variiert werden, um so die Dichte der Linker für die Aufnahme der Leit-DNA je nach Bedarf einzustellen.

Anstelle von PDC können auch andere mit Diisothiocyanate substituierte Moleküle verwendet werden. PDC und andere starre homobifunktionelle Linker haben den Vorteil, daß eine Vernetzung von benachbarten Aminogruppen sterisch gehindert wird. Um einen größeren Abstand zwischen Trägeroberfläche und DNA zu erhalten, kann es von Vorteil sein, längere Verbindungsmoleküle zwischen derivatisierter Oberfläche und DNA oder mehrere Einheiten kurzer Verbindungsmoleküle hintereinander zu setzen.

Die Generierung der PCR-Fragmente erfolgt vorzugsweise, indem die Information einer mRNA mit Hilfe der reversen Transkriptasen in DNA umgeschrieben wird.

Diese DNA wird mit der Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Für beide enzymatische Vorgänge werden unter anderem Oligonucleotidprimer benötigt, die mit einer Matrize hybridisieren und als Synthesestart für die jeweilige Polymerase dienen.

Es wird eine Liste von Genen erstellt, deren parallele Identifizierung und Quantifizierung von Interesse ist. Diese Liste wird als Input für ein hierfür erstelltes Programm genutzt. Mit Hilfe des Programms werden die Sequenzen der zu analysierenden Gene z. B. einer öffentlich zugänglichen Gen-Datenbank entnommen und Oligonucleotidpaare entworfen, die eine spezifische Amplifizierung von jeweils 200 bis 400 bp Fragmenten eines jeden Gens ergeben. Die Oligonucleotide werden synthetisiert und die RT-PCR nach einem dem Fachmann an sich bekannten Protokoll durchgeführt. Die PCR-Fragmente werden zur Abtrennung nicht eingebauter Nucleotide und Oligonucleotide mit Ethanol gefällt und mit 100 mM Natriumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Lösung, pH 9, eine Konzentration von 10 bis 1.000 ng/lll, vorzugsweise 50 bis 500 ng/pl eingestellt.

In den folgenden zwei Beispielen zur Erstellung eines Transkriptionsprofils wurden Träger nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt. Es wurden 72 unter- schiedliche murine cDNAs unter Verwendung der entsprechenden spezifischen Primer (Oligonukleotide) mittels RT-PCR aus muriner Gehirn Gesamt-RNA gene- riert, auf die derivatisierte Glasoberfläche aufgetragen und kovalent gebunden. Jede cDNA wurde in vier Quadranten jeweils zweimal aufgetragen, also insgesamt acht- mal. Es wurden jeweils 2 nl der entsprechenden cDNA mit einer Konzentration von 100 ng/pl mittels eines Dispensier-Automaten aufgetragen. Der Durchmesser der eingetrockneten Proben beträgt jeweils 350 pm, der Abstand von einem Zentrum zum nächsten zweier benachbarter Proben beträgt 750Rm.

In den Beispielen wird ein Expressionsprofil von Wildtyp und Mutanten Maus Ge- hirn-Proben erstellt. Hierzu wurde das Gehirn von 18 Tage alten Wildtyp und mu- tierten Mäusen (MBP-/-/PLP-/-) präpariert und die Gesamt-RNA extrahiert. Zur Mar- kierung der jeweiligen Proben wurde aus jeweils 100 llg gesamt-RNA die mRNA isoliert und mittels einer Reversen Transkriptase in die entsprechende cDNA umge- schrieben. Hierbei wurden fluoreszenzmarkierte Nukleotide (Cy3-dCTP oder Cy5- dCTP) eingebaut. Die markierten Proben wurden aufgereinigt, auf die für die Hy- bridisierung optimalen Bedingungen eingestellt und auf ein Volumen von 20µl konzentriert.

Vor der eigentlichen Hybridsierungsreaktion wurde eine Vorhybridisierung des Trägers vorgenommen. Hierzu wurden 20 pl einer Salz/Detergentien/unmarkierte DNA-Lösung auf den Träger aufgegeben und mit einem Deckgläschen versehen.

Nach zweistündiger Inkubation bei 62°C in einer feuchten, nach außen dichten Kammer wurde die Reaktionslösung auf 20°C abgekühlt, das Deckgläschen abge- nommen und 20 tl der eigentlichen Hybridisierungslösung aufgetropft. Wiederum wurde die Lösung mit einem Deckgläschen versehen und 12 Stunden bei 62°C in der genannten Kammer inkubiert. Anschließend wurden unspezifisch gebundene Proben mit zwei unterschiedlichen Waschlösungen vom Träger abgewaschen. Die Detektion der Signale erfolgte mit dem Laser Scanning Gerät"ScanArray 3000"der Firma General Scanning, Watertown, MA, USA. Zur Auswertung der Signale wur- de eine kommerziell erhätliche Software ("ImaGene"der Firma BioDiscovery, Inc.

Los Angeles, CA, USA) verwendet.

Beispiel 1 mRNA wurde zweimal aus der gleichen Gesamt-RNA isoliert und mit Cy3-dCTP bzw. Cy5-dCTP markiert. Beide Proben wurden wie beschrieben auf einem Träger zur Hybridisierung aufgegeben. Figur 2 zeigt die aufgenommenen Bilder einmal für die Cy3 markierte Probe (a) und einmal für die Cy5 markierte Probe (b).

Die über die ImaGene Software erhaltenen Signalintensitätswerte der beiden fluo- reszenzmarkierten Proben sind in Figur 2c in einem doppelt logarithmischen Punkt- diagramm dargestellt. Jeder Punkt im Diagramm repräsentiert eine auf dem Träger aufgetragene cDNA. Da jede der 72 cDNAs achtmal aufgetragen wurde erhält man für jede cDNA acht Punkte. Auf der x-und y-Achse läßt sich die Signalintensität der Cy3 bzw. Cy5 markierten Probe für die jeweilige cDNA ablesen. Die durchge- zogene Linie umrahmt alle Punkte dessen Cy3 und Cy5 Signalintensität um nicht mehr als Faktor 2 differiert. Die gestrichelte Linie bildet die Grenze für eine drei- fach differentielle Signalintensität. Da die beiden markierten Proben aus der selben Gesamt-RNA stammen, liegen alle Punkte innerhalb der durchgezogenen Linie. Die absolute Intensität der einzelnen Punkte und damit letztlich die Expressionsstärke der entsprechenden Gene erstreckt sich über drei Zehnerpotenzen. In Figur 2d ist das Verhältnis von Cy3 zu Cy5 markierter Probe als halb logarithmisches Balken- diagramm dargestellt. Hierbei wurden jeweils die Mittelwerte aus den achtfach aufgetragenen cDNAs zugrunde gelegt.

Beispiel 2 Vergleich des Expressionsmusters einer Wildtyp Probe mit der einer Mutanten Probe.

Hierbei wurde die Wildtyp Probe mit Cy3 und die Mutanten Probe mit Cy5 mar- kiert. Figur 3 a und b zeigen wiederum die aufgenommenen Bilder. In Figur 3c ist zu erkennen, daß eine Vielzahl von Punkten außerhalb des von den gestrichelten Linien umrandeten Bereiches liegen. Die entsprechenden Gene werden somit um mehr als das dreifache unterschiedlich stark exprimiert. In Figur 3d sind für jede cDNA der Signalquotient der Mittelwerte aufgetragen. Die Gene 1,6,33 und 39 zeigen die stärksten Expressionsunterschiede. So ist z. B. Gen Nr. 6 in der Wildtyp Probe ca. 100fach stärker exprimiert während z. B. Gen Nr. 33 in der Mutanten Probe ca. 100fach stärker exprimiert wird. Die Summe der bei dieser Analyse de- tektierbaren cDNAs und die dazugehörigen Expressionsintensitäteten können als Transkriptionsprofil für die jeweiligen Probe definiert werden. Die bei dieser Ana- lyse nachgewiesene differentielle Expression einiger Gene kann als erster Hinweis für einen ursächlichen Wechselwirkung dieser Gene mit den in der Mutanten Probe mutierten Gene aufgefasst werden.