USOS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se insere no campo da farmacologia, e mais especificamente na área dos peptideos com atividade farmacológica, uma vez que se refere a peptideos sintéticos ligantes de receptores do tipo tirosina-quinase da família do VEGF e seus usos.

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[002] A aplicação industrial da invenção refere-se ao fato dos peptideos sintéticos serem produzidos no ambiente industrial com diversas possibilidades de aplicações.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

[003] A formação de novos vasos sanguíneos num organismo adulto ocorre, principalmente, por um processo chamado angiogênese, no qual estes novos vasos se formam, por germinação, a partir de vasos existentes.

[004] A angiogênese é um processo importante na progressão de muitas doenças, incluindo câncer e retinopatias . Compostos capazes de inibir a angiogênese são potenciais agentes terapêuticos. Como o VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) e membros da sua família são importantes na angiogênese, terapias anti-VEGF já apresentam algum sucesso no tratamento da Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI), doença que causa cegueira, e também prolongam a sobrevida de pacientes com certos tipos de câncer. No entanto, esses agentes terapêuticos, incluindo anticorpos monoclonais anti-VEGF, podem apresentar resistência e efeitos colaterais, alguns graves, como perfuração intestinal, hipertensão e alterações cardíacas (Ellis & Hicklin, 2008; Welti e col., 2013) . Novos medicamentos que inibam seletivamente a angiogênese patológica, sem afetar a homeostase das células endoteliais normais, são, portanto, necessários para a eficácia das terapias anti-angiogênicas .

[005] O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem papel central no estímulo da angiogênese através da ativação de receptores de VEGF tirosina-quinase (VEGFR) expressos nas células endoteliais. A família de fatores de crescimento endotelial vascular é constituída de 5 membros: VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e P1GF (fator de crescimento placentário) (Figura 1) . O VEGF (também conhecido como VEGF- A) tem papel central e importante no estímulo da angiogênese através da ativação de receptores de VEGF tirosina-quinase expressos nas células endoteliais: VEGFR- 1, VEGFR-2 (Figura 1) . Por isso, a maioria dos inibidores de angiogênese utilizados em terapias é dirigida contra VEGF e seu principal receptor, o VEGFR-2 (Ellis & Hicklin, 2008) .

[006] Estudos recentes mostraram que o receptor VEGFR-3 é um alvo importante na terapia anti-angiogênica (Tammela e col., 2008) . O receptor VEGFR-3 interage com dois ligantes da família de VEGF (VEGF-C e VEGF-D) , sendo expresso em células endoteliais linfáticas e está envolvido na linfangiogênese (Ellis e Hicklin, 2008), conforme figura 1. Embora o papel essencial da sinalização de VEGFR-3 é na linfangiogênese (formação de vasos linfáticos), camundongos que não expressam VEGFR-3 morrem na fase embrionária pela má formação dos vasos sanguíneos (Dumont et al . , 1998) indicando um papel de VEGFR-3 no desenvolvimento de vasos sanguíneos no embrião. Além disso, VEGFR-3 é altamente expresso em células endoteliais de vasos sanguíneos, particularmente, durante a angiogênese, nas células de ponta ( tip cells) as quais são células da extremidade que guiam o processo migratório do novo vaso sanguíneo em formação (Tammela et al . , 2008) . Anticorpos que bloqueiam a ação de VEGFR-3, além de afetarem a formação de vasos linfáticos, também são capazes de inibir a angiogênese em tumores (Laakkonen et al . , 2007; Tammela et al . , 2008) . Juntos estes resultados sugerem que a sinalização de VEGFR- 3 é necessária tanto na fase de desenvolvimento dos vasos no embrião quanto no processo de formação de novos vasos no adulto e que VEGFR-3 é um alvo importante em terapias anti- angiogênicas . VEGFR-3 e seu ligante VEGF-C são alvos interessantes na terapia anti-angiogênica, pois, ao contrário de VEGF e seu receptor VEGFR-2 (expresso em células endoteliais quiescentes e importante para a sobrevivência destas células), o VEGFR-3 só é expresso em células endoteliais que estão migrando e, consequentemente estão envolvidas no processo de formação de novos vasos sanguíneos .

[007] Ainda dentro da família do VEGF, as moléculas VEGFR-1 e seu ligante P1GF também são importantes na formação de vasos pelo processo de angiogênese associada a doenças. Inibidores destas moléculas bloqueiam a formação de vasos na retina e reduzem o crescimento de tumores (Wu e col, 2006; Dewerchin & Carmeliet, 2012) . Portanto, moléculas que interfiram e modulem a atividade do VEGFR-1 e do P1GF podem ser importantes para o tratamento de doenças com um componente angiogênico, como o câncer e a retinopatia .

Metodologia de Phage Dlsplay

[008] A técnica de Phage Display permite identificar peptideos ligantes de virtualmente qualquer molécula biológica. Isto é feito pela expressão na superfície de partículas virais (bacteriófagos ) de uma grande diversidade de sequências de peptídeo (mais de IO ⁹ diferentes peptideos) . Os bacteriófagos , também chamados fagos, expressando diferentes peptideos formam uma biblioteca de fagos que pode ser incubada com uma molécula alvo ou com a superfície de uma célula, tanto in vitro como in vivo, e aqueles fagos que se ligam ao alvo ou superfície celular através dos peptideos podem ser recuperados por infecção bacteriana (já que esses vírus infectam bactérias) . O processo de ligação de fagos ao alvo e infecção desses fagos em bactéria pode ser repetido até que ocorra um enriquecimento da amostra de fagos expressando peptideos que se ligam aos alvos. Essa metodologia é bastante versátil, permitindo ensaios de seleção de peptideos contra diferentes alvos em diferentes situações, por exemplo, ensaios de seleção de peptideos (chamados panning) podem ser realizados in vitro contra: moléculas alvo aderidas em superfície; células que podem ou não ser estimuladas para alterar a expressão de receptores; tecidos dissecados; e também in vivo injetando os fagos na circulação do animal, retirando os órgãos de interesse e selecionando aqueles fagos que expressam peptideos que interagem com a vasculatura de diferentes órgãos do organismo. Esta abordagem permite identificar moléculas que potencialmente podem servir para o desenvolvimento de fármacos, vacinas, métodos diagnósticos e de outros insumos (Smith, 1985; Scott e Smith, 1990; Giordano et al . , 2009; Hamzeh- Mivehroud e col., 2013) .

[009] Objetlvos e Vantagens da Invenção.

[010] Agentes terapêuticos seletivos contra receptores de VEGF podem ser eficazes na inibição da angiogênese patológica .

[011] Por isso, o VEGFR-3 foi escolhido como alvo para a busca de novos compostos que possam ser utilizados em terapias angiogênicas . A presente invenção descreve peptideos com atividade antagonista e agonista dos diferentes membros da família do VEGF aos seus receptores.

[012] As sequências desses peptideos são inéditas e nunca antes descritas na literatura científica. Um dos peptideos desenvolvidos (de sequência PCAIWF) inibe a interação dos fatores angiogênicos da família do VEGF com seus respectivos receptores. Sendo assim, o PCAIWF é um inibidor competitivo de todos os receptores de VEGF (VEGFR- 1, VEGFR-2 e VEGFR-3) . Porém, o peptídeo PCAIWF não afetou a interação de outros fatores angiogênicos, o FGF (fator de crescimento de fibroblastos ) e o PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) aos seus receptores, o FGFR e o PDGFR, respectivamente.

[013] Mais interessante ainda, o peptídeo PCAIWF, administrado em injeção intraocular é capaz de inibir a neovascularização (angiogênese) da retina no modelo animal de retinopatia da prematuridade que estabelecemos no laboratório. Também identificamos que o peptídeo PCAIWF é reconhecido por receptores expressos na superfície das células endoteliais e sofre internalização e pode atuar como alvo especifico dessas células. Com base em nossos resultados experimentais, propomos que a atividade anti- angiogênica do peptideo PCAIWF tem potencial terapêutico na prevenção e/ou no tratamento de retinopatias e, talvez, de outras doenças humanas com um componente angiogênico associado, e pode também ser usado para endereçamento especifico de drogas direcionadas às células endoteliais.

[014] Outro peptideo desta invenção (sequência CPLWYYWYEC) é um agonista alostérico, aumentando a afinidade de VEGFR-3 pelo seu ligante VEGF-C. Com base neste resultado, sugerimos que o peptideo CPLWYYWYEC possa ser utilizado como um agente pro-linfangiogênico e pro- angiogênico, estimulando a formação de vasos linfáticos e sanguíneos. Isto é desejável em situações onde os vasos linfáticos não funcionam de forma apropriada (por exemplo, no linfedema) ou na isquemia cardíaca, onde a formação de novos vasos sanguíneos é desejável.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[015] A invenção se refere a peptídeos sintéticos ligantes de receptores de VEGF e seus usos. A presente invenção descreve peptídeos inibidores e ativadores dos fatores angiogênicos da família do VEGF.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A figura 1 se refere a uma representação esquemática dos fatores da família do VEGF e seus receptores .

[017] A figura 2 se refere a um fluxograma da construção da biblioteca de fagos.

[018] A figura 3A se refere à representação gráfica dos resultados de panning contra o alvo VEGFR-3 utilizando a biblioteca de fagos CX8C.

[019] A figura 3B se refere à representação gráfica dos resultados de panning contra o alvo VEGFR-3 utilizando a biblioteca de fagos X6.

[020] A figura 4A se refere à representação gráfica dos resultados do ensaio de validação da interação peptideo- receptor demonstrando os fagos selecionados no panning contra VEGFR-3 e apresentado na superfície, unicamente, o peptídeo CPLWYYWYEC (A) incubado com diferentes alvos.

[021] A figura 4B se refere à representação gráfica dos resultados do ensaio de validação da interação peptídeo- receptor demonstrando os fagos selecionados no panning contra VEGFR-3 e apresentado na superfície, unicamente, o peptídeo PCAIWF (B) incubado com diferentes alvos.

[022] A figura 5A se refere à representação gráfica dos resultados dos ensaios de competição na qual os fagos apresentando os peptídeos CPLWYYWYEC foram incubados com a porção extracelular do receptor VEGFR-3 na presença e ausência dos competidores VEGF-C e VEGF165 e sem competidor .

[023] A figura 5B se refere à representação gráfica dos resultados dos ensaios de competição na qual os fagos apresentando os peptídeos PCAIWF foram incubados com a porção extracelular do receptor VEGFR-3 na presença e ausência dos competidores VEGF-C e VEGF165 e sem competidor .

[024] A figura 6 se refere à representação gráfica dos resultados dos ensaios de competição na qual os fagos apresentando os peptídeos PCAIWF foram incubados com a porção extracelular do receptor VEGFR-3 na presença e ausência de concentrações crescentes do competidor VEGF-C e sem competidor.

[025] A figura 7A se refere à representação gráfica dos resultados dos ensaios de competição na qual o peptideo sintético PCAIWF inibe a ligação do fago-PCAIWF ao receptor VEGFR-3, enquanto o peptideo controle IFCAPW não tem efeito .

[026] A figura 7B se refere à representação gráfica dos resultados dos ensaios de competição mostrando a inibição da ligação do fago-PCAIWF ao receptor VEGFR-3 é inibida pelo peptideo sintético PCAIWF é dependente da concentração do peptideo, enquanto a dose mais alta peptideo controle IFCAPW não tem efeito.

[027] A figura 8A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF, do PSAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante- receptor in vitro em relação ao VEGF-C/VEGFR-3.

[028] A figura 8B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF, do PSAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante- receptor in vitro em relação ao VEGF-C/VEGFR-2.

[029] A figura 8C se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF, do PSAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante- receptor in vitro em relação ao P1GF/VEGFR-1.

[030] A figura 8D se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF-A/VEGFR-2.

[031] A figura 8E se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF-A/VEGFR-1.

[032] A figura 9A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao PDGF-BB/PDGFR-Beta .

[033] A figura 9B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao FGF/FGFR-beta .

[034] A figura 10A se refere ao efeito do peptideo sintético PCAIWF na vascularização da retina de camundongos no modelo da retinopatia da prematuridade.

[035] A figura 10B se refere à representação gráfica da porcentagem de área neovascularizada no teste do efeito dos peptideos sintéticos no modelo animal de retinoplastia induzida por oxigénio.

[036] A figura 11A é uma imagem representativa da retina de um animal utilizado para quantificar o número de vasos sanguíneos para cada tratamento no ensaio do peptideo PCAIWF inibindo a formação de vasos na retina em condições patológicas numa dose de 30 μg.

[037] A figura 11B se refere à representação gráfica da quantificação da área vascularizada na retina no ensaio do peptideo PCAIWF inibindo a formação de vasos na retina em condições patológicas numa dose de 30 μg.

[038] A figura 11C se refere à representação gráfica da quantificação do número de brotamentos e bifurcações nos vasos angiogênicos no ensaio do peptideo PCAIWF inibindo a formação de vasos na retina em condições patológicas numa dose de 30 μg.

[039] A figura 12A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença do peptideo sintético PCAIWF, _D (PCAIWF), OU dos peptideos controles IFCAPW ou _D (IFCAPW) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF- C/VEGFR-3.

[040] A figura 12B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF, _D (PCAIWF), OU dos peptideos controles IFCAPW ou _D (IFCAPW) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF- C/VEGFR-2.

[041] A figura 12C se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF, _D (PCAIWF), OU dos peptideos controles IFCAPW ou _D (IFCAPW) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF- A/VEGFR-2.

[042] A figura 12D se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGF-A/VEGFR-1.

[043] A figura 12E se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF ou do peptideo controle IFCAPW na interação ligante-receptor in vitro em relação ao P1GF/VEGFR-1.

[044] A Figura 13 se refere à capacidade de células endoteliais internalizarem o fago-PCAIWF.

DESCRIÇÃO DE TALHADA DA INVENÇÃO

[045] A invenção se insere no campo da farmacologia, e mais especificamente na área dos peptideos com atividade farmacológica, uma vez que se refere a peptideos sintéticos ligantes de receptores de VEGF e seus usos. A presente invenção descreve peptideos que interagem especificamente com os receptores de VEGF e modula sua atividade, inibindo- a (antagonistas) ou aumentando-a (agonistas) .

[046] Peptideos são pequenas moléculas que podem ser sintetizadas de acordo com os padrões necessários para uso em humanos (Good manufacturing Practice, GMP) e, assim, peptideos sintéticos são insumos com importantes aplicações biotecnológicas, como biofármacos.

Peptideos sintéticos ligantes de receptores de VEGF

[047] Os peptideos descritos pela presente invenção são: CPLWYYWYEC; CFGVFDFFWC; CELSFRPMMC; CAHHRWAVC; PCAIWF; WVCSGG; PSAIWF; CEYWYYWLPC; CWFFDFVGFC; CMMPRFSLEC; CVAWRHHAC; FWIACP; GGSCVW; FWIASP conforme demonstrados na SEQ. ID. n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, respectivamente .

[048] Dessa forma, toda vez que, ao longo do presente relatório, mencionarmos o peptideo CPLWYYWYEC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 1.

[049] Toda vez que, ao longo do presente relatório, mencionarmos o peptideo CFGVFDFFWC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 2.

[050] Toda vez que, ao longo do presente relatório, mencionarmos o peptideo CELSFRPMMC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 3.

[051] Toda vez que, ao longo do presente relatório, mencionarmos o peptideo CAHHRWAVC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 4.

[052] Toda vez que, ao longo do presente relatório, mencionarmos o peptideo PCAIWF, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 5.

[053] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo WVCSGG, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 6.

[054] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo PSAIWF, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 7.

[055] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo CEYWYYWLPC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 8.

[056] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo CWFFDFVGFC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 9.

[057] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo CMMPRFSLEC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 10.

[058] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo CVAWRHHAC, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ. ID. N° 11.

[059] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo FWIACP, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 12.

[060] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo GGSCVW, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 13.

[061] Toda vez que, ao longo do presente relatorio, mencionarmos o peptideo FWIASP, estamos nos referindo ao peptideo descrito na SEQ . ID. N° 14.

[062] Os referidos peptideos sãc > ligantes de receptores de VEGF e inibidores dos fatores angiogênicos da família do VEGF, conforme comprovado no exemplo de concretização da invenção .

[063] Os peptídeos desta invenção podem ser sintetizados por métodos químicos (em solução ou acoplados a uma fase sólida) ou por métodos biológicos. No caso de peptídeos sintetizados pelo método biológico, ácidos nucleicos (RNA, DNA ou cDNA) que codificam a sequência de aminoácidos desejada são empregados. Enquanto peptídeos sintetizados por métodos químicos são limitados a tamanhos entre 5 e aproximadamente 100 aminoácidos, pelos métodos biológicos, peptídeos entre 5 e mais de 1000 aminoácidos podem ser produzidos.

[064] Assim, esta invenção, contempla peptídeos entre 3 e 1000 aminoácidos produzidos de forma sintética ou biológica, que contenham as sequências contíguas de aminoácidos listadas (SEQ. ID. N° 1 a 14) ou parte de suas sequências. Estas sequências poderão ser encontradas na região inicial ( amino-terminal ) ou final da proteína ( carboxi-terminal ) . Mas elas podem também ser encontradas em regiões internas das proteínas. É importante observar, que esta invenção não contempla peptídeos naturais encontrados na natureza, que contenham as sequências (ou parte delas) SEQ. ID. N° 1 a 14. Esta invenção contempla apenas sequências sintéticas ou inseridas propositalmente para modificar proteínas naturais com o objetivo de que as mesmas se liguem a VEGFs ou seus receptores.

[065] Os aminoácidos que compõem as proteínas podem ser classificados de acordo com a composição de suas cadeias laterais em: (1) aminoácidos hidrofóbicos alifáticos (G, A, L, I, V, P, M) , (2) aromáticos (F, Y, W) , (3) hidrofilicos (S, T, C, P, N, Q) , (4) básicos (K, H, R) ou (5) ácidos (D, E) . Em muitos casos, os aminoácidos de um peptideo podem ser substituídos por outros com cadeia lateral semelhante, preservando suas propriedades biológicas. Assim, por exemplo, o peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) poderá ser sintetizado como PSAIWF (SEQ. ID. N° 13), onde o aminoácido cisteína (C) foi substituído por serina (S), ambos com propriedades semelhantes. De fato, conforme será demonstrado, o peptideo PSAIWF apresenta atividade biológica semelhante à do peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) .

[066] Exceto pela glicina, todos os demais aminoácidos podem ser encontrados como dois enantiômeros , denominados de L e D. Somente os aminoácidos L são encontrados em proteínas, e as enzimas proteolíticas , de forma geral, não são capazes de processar peptídeos compostos por D- aminoácidos. Assim, esta invenção compreende os peptídeos SEQ. ID. 1 a 14, sintetizados utilizando-se D-aminoácidos (representados por _D (CPLWYYWYEC) ; _D (CFGVFDFFWC) ;

D (CELSFRPMMC) ; _D ( CAHHRWAVC ) ; _D (PCAIWF); _D (PSAIWF);

_D (WVCSGG); D (CEYWYYWLPC) ; _D ( CWFFDFVGFC ) ; _D ( CMMPRFSLEC ) ; D ( CVAWRHHAC ) ; _D (FWIACP); _D (FWIASP) e _D (GGSCVW) . De fato, conforme será demonstrado, o peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) modificado com D-aminoácidos, D ( PCAIWF) , inibe a ligação dos fatores angiogênicos da família do VEGF aos seus receptores, da mesma forma que o peptideo sintetizado com L-aminoácidos .

[067] Pelo método químico, peptídeos podem ser sintetizados utilizando-se aminoácidos não naturais, modificados e não encontrados em proteínas. Estas modificações não alteram as propriedades farmacológicas dos peptideos, mas podem alterar sua meia vida dentro de um organismo e torná-los mais resistentes a degradação por enzimas (proteases e outras enzimas envolvidas no metabolismo e degradação de peptideos) . Alguns exemplos de aminoácidos que poderão ser utilizados para modificar os peptideos SEQ. ID. 1 a 14 desta invenção são a beta-alanina (bAla) , a 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4-hidroxiprolina (4Hyp), N-metil-glicina (MeGly) , N-etilglicina (EtGly) , alo- isoleucina (alie) , N-metil-isoleucina (Melle) , N-metil- valina (MeVal), norvalina (Nva) e norleucina (Nle) . Por exemplo, o peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) poderá ser sintetizado utilizando-se os aminoácidos modificados beta- alanina no lugar da alanina e N-metilisoleucina no lugar da isoleucina. Estes são apenas alguns exemplos de aminoácidos modificados, porém, para aqueles que entendem da técnica, outros aminoácidos modificados, além dos 20 aminoácidos encontrados nas proteínas, poderão ser empregados para alterar a sequência dos peptideos desta invenção, preservando suas aplicações e suas propriedades farmacológicas de modular os receptores de VEGF e seus ligantes .

[068] Outra modificação utilizada para melhorar a resistência de peptideos a degradação, e desta forma, aumentar sua meia-vida no organismo, preservando sua atividade biológica, é a chamada retro-inversão (Chorev & Goodman, 1995) . Por este processo, a sequência primária é invertida e o peptideo sintetizado utilizando-se D- aminoácidos. Por exemplo, o peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) poderá ser sintetizado com a sequência FWIACP (SEQ. ID. N° 11) utilizando-se D-aminoácidos resultando no peptideo _D (FWIACP) . Desta forma, os peptideos SEQ. ID. N° 8 a 14 poderão ser sintetizados como _D (CEYWYYWLPC) ; _D (CWFFDFVGFC) ; D (CMMPRFSLEC) ; _D ( CVAWRHHAC ) ; _D (FWIACP); _D (GGSCVW);

_D (FWIASP) e utilizados como moduladores dos receptores de VEGF.

[069] Peptideos podem ser também modificados através da adição de diferentes moléculas nas extremidades amino e carboxila terminais, tais como resíduos amida, formil, acetil, propionil, succinil, benzoil ou ácidos graxos (mirístico, palmítico, esteárico, entre outros), para citar alguns exemplos. Os peptideos podem ainda ser modificados pela adição de polietilenoglicóis (PEG) de diferentes tamanhos moleculares. Estas são modificações comumente utilizadas para aumentar a meia-vida do peptideo, melhorando suas propriedades farmacológicas.

[070] Estas modificações (PEG, miristil, palmitoil, etc) poderão ser feitas diretamente no peptideo, utilizando-se os grupos amino ou carboxila terminais ou elas poderão ser feitas nas cadeias laterais dos aminoácidos. As modificações poderão ainda ser feitas pela adição de aminoácidos adicionais à sequência do peptideo. Por exemplo, o peptideo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) poderá ser sintetizado adicionando-se uma lisina na extremidade amino ou carboxila terminal do peptideo, e a modificação adicionada ao grupo amino épsilon da cadeia lateral desta lisina. Em outro exemplo, o resíduo utilizado para adicionar a modificação, por exemplo, a lisina poderá ser precedida por um espaçador de glicina e serina. Este espaçador serve para aumentar a distância entre a modificação e o domínio ligante de VEGF do peptideo. Aqueles que conhecem bem a técnica saberão que outros espaçadores poderão ser utilizados com o mesmo objetivo, sem alterar significativamente a atividade biológica e as aplicações dos peptídeos desta invenção.

Usos dos peptídeos sintéticos llgantes de receptores de VEGF.

[071] Os peptídeos descritos nas SEQ. ID. N° 1 a 14 poderão ser utilizados separadamente ou em conjunto para a prevenção ou o tratamento de doenças onde os receptores de VEGF tem um papel importante na iniciação e progressão da patologia .

[072] Um exemplo de uso desta invenção são as doenças com um componente angiogênico.

[073] Isto é, doenças onde a formação de vasos sanguíneos é um elemento importante no desenvolvimento e na progressão da patologia (Folkman, 2007) . Exemplos de doenças onde a angiogênese tem um papel importante na patologia são as doenças oculares. Entre elas, destacamos as doenças oculares como retinopatias (diabética e da prematuridade) e degeneração macular relacionada com a idade, que são causadas e/ou agravadas pelo crescimento exacerbado de vasos sanguíneos angiogênicos na retina ou na mácula do paciente (Folkman, 2007) . Isto leva a um processo inflamatório crónico, morte das células fotorreceptoras e perda da visão. Outras doenças oculares onde a angiogênese é um componente importante são o glaucoma neovascular (Chang e col., 2012) e o transplante de córnea (Bock e col . , 2013) .

[074] A angiogênese também é um componente importante de hiperplasias. Exemplos de hiperplasia são os diferentes tipos de câncer. Para que as células cancerosas possam dar origem a tumores maiores do que 1 mm ³ , elas precisam de oxigénio e nutrientes para crescer. As células tumorais são capazes de induzir a formação de novos vasos sanguíneos pelo processo de angiogênese, e medicamentos inibidores deste processo tem se mostrados eficientes na clínica. Inibidores da angiogênese são, portanto, alvos importantes na prevenção e/ou no tratamento de pacientes com diferentes tipos de câncer. A presente invenção poderá ser utilizada para a prevenção e/ou o tratamento de pacientes com câncer, principalmente, mas não exclusivamente, de tumores que dependam de VEGF-A, VEGF-C e P1GF para seu crescimento. Isto porque, células tumorais expressam, comumente, elevados níveis dos fatores de crescimento da família de VEGF e seus receptores (Goel & Mercúrio, 2013) . Desta forma, os peptídeos desta invenção, por exemplo, peptídeo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5), poderão ser utilizados com inibidores do crescimento tumoral .

[075] As hiperplasias podem ser ainda do tipo benignas, quando não há invasão e destruição de tecidos. Por exemplo, a hiperplasia da próstata é uma doença comum em homens acima dos 50 anos de idade e a hiperplasia endometrial pode acometer mulheres entre os 40 e 60 anos de idade. Em ambos os casos, há angiogênese associada ao crescimento do órgão (da próstata ou da parede do útero) . Outro exemplo de hiperplasia benigna é o mioma (sangramento uterino) .

[076] Assim, a presente invenção poderá ser utilizada para a prevenção e/ou o tratamento de hiperplasias benignas, como a endometriose , o mioma ou a hiperplasia benigna da próstata.

[077] A presente invenção poderá, também, ser utilizada para a prevenção e/ou o tratamento de outras doenças onde formação de vasos sanguíneos é um componente importante. Estas doenças foram classificadas pelo Dr . Judah Folkman em 2007 como doenças dependentes da angiogênese (Folkman, 2007) e incluem a artrite reumatóide, a aterosclerose, a psoríase e a doença de Crohn (sangramento intestinal) .

[078] Porém, com o avanço da medicina e do conhecimento científico, é possível que sejam descobertas outras doenças onde a angiogênese e os VEGFs e seus receptores são componentes importantes na patogênese e progressão; estas doenças poderão ser prevenidas ou tratadas pela presente invenção .

[079] Um exemplo de uma desordem metabólica onde a angiogênese tem um papel importante é a obesidade. Por exemplo, estudos sugerem que o crescimento do tecido adiposo (resultando na obesidade) pode ser modulado por inibidores da angiogênese (Rupnick e col, 2002) . Assim, os peptídeos desta invenção poderão ser utilizados para a prevenção e/ou o tratamento da obesidade, principalmente, da obesidade considerada mórbida (onde o índice de massa corpórea do paciente é maior do que 40) .

[080] O VEGF e seus receptores são importantes também na formação do sistema linfático. Os vasos linfáticos também fazem parte do sistema circulatório, e são responsáveis pela remoção do líquido intersticial e seu retorno ao sistema circulatório sanguíneo. São importantes também na absorção de nutrientes no intestino delgado (ácidos graxos) e para a circulação de células do sistema imune. Falhas no sistema linfático causam várias doenças em humanos, e os peptideos desta invenção poderão ser utilizados para a prevenção e/ou o tratamento das mesmas.

[081] O VEGF-C, VEGF-D e seus receptores, VEGFR-2 e VEGFR-3 são importantes na formação do sistema de vasos linfáticos e, portanto, o VEGF-C, VEGF-D e VEGFR-3 são alvos importantes para a prevenção e/ou o tratamento de doenças do sistema linfático (Cueni & Detmar, 2008) . Os vasos linfáticos são importantes na homeostase dos fluidos biológicos, na circulação de células do sistema imune ou de células tumorais ao estabelecerem novos sítios metastáticos (Liersch & Detmar, 2007) .

[082] Por exemplo, linfedema (também conhecido por obstrução linfática) é uma disfunção causada pela obstrução dos vasos do sistema linfático, o que resulta no acúmulo de líquido no (s) órgão (s) ou tecido (s) afetado (s) . Os peptideos desta invenção (por exemplo, o peptídeo CPLWYYWYEC (SEQ. ID. N° 1) que aumenta a atividade do fator lionfangiogênico VEGF-C) poderão ser utilizado para estimular a formação de novos vasos linfáticos, aumentando o dreno de líquido no tecido afetado.

[083] É sabido que células tumorais utilizam os vasos do sistema linfático para se distribuírem pelo organismo. Carcinomas (tumores malignos proveniente de células origem epitelial) utilizam os nódulos linfáticos próximos ao tumor primário para colonizarem outros tecidos, dando origem aos tumores secundários (metástases) . Por isso, ao operarem pacientes com tumor de mama (carcinomas), os cirurgiões rotineiramente removem os linfonodos (e às vezes toda a mama) da paciente, para reduzir as chances de retorno do tumor. Assim, uma possível aplicação dos peptídeos desta invenção (por exemplo, o peptídeo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) ) é para o a prevenção e/ou tratamento de carcinomas, como um agente anti-metastático . Como exemplo de carcinomas que poderão ser prevenidos e/ou tratados com esta invenção, citamos os tumores da mama, do pênis, da pele, da boca, do pulmão, de estômago, do colo de útero e da próstata.

Usos dos peptídeos sintéticos llgantes de receptores de VEGF conjugados a outros medicamentos ou vetores virais para terapias direcionadas .

[084] Um dos objetivos da medicina moderna é o desenvolvimento de medicamentos seletivos, ou seja, medicamentos que ajam apenas no tecido ou célula alvo. Por exemplo, a quimioterapia consiste na administração de medicamentos citotóxicos, muito comumente utilizados para pacientes com câncer. Como as células tumorais crescem muito mais rápido do que as células normais, estes medicamento matam preferencialmente as células do tumor.

[085] Os peptídeos descritos nas SEQ. ID. N° 1 a 14, por exemplo: PCAIWF, poderão ser conjugados a um medicamento com alta toxicidade, como quimioterápicos para a prevenção e/ou o tratamento de cânceres, por exemplo. Dessa forma, o medicamento em questão será direcionado.

[086] Ao se distribuírem pelo organismo, os quimioterápicos agem não apenas no tumor, mas em todas as células do organismo, ou seja, seus efeitos tóxicos são sentidos pelo paciente pela ação nos outros tecidos, além do tumor, tais como problemas digestivos, queda de cabelos, dermatite, entre outros efeitos indesejados. Dessa forma, ao conjugar um medicamento a um dos peptídeos descritos na presente invenção, por exemplo, o peptideo PCAIWF, estes medicamentos poderão ser direcionados preferencialmente para células que expressam os receptores de VEGF em maior quantidade (p.ex., as células cancerígenas e as células dos vasos sanguíneos dos tumores), minimizando o efeito do quimioterápico em outros tecidos do organismo.

[087] Um dos objetivos das terapias direcionadas é fazer com o que o medicamento seja direcionado para seu tecido alvo (por exemplo, o tumor) onde sua ação será local e não mais sistémica. Assim, os peptídeos da presente invenção poderão ser utilizados conjugados a diferentes substâncias para uso terapêutico direcionado. Os peptídeos ligantes dos receptores de VEGF poderão ser conjugados quimicamente a outros medicamentos de forma a direcionar o agente terapêutico para as células que expressam os receptores de VEGF.

[088] Células tumorais expressam, comumente, elevados níveis dos receptores de VEGFs e seus receptores (Goel & Mercúrio, 2013) . Por isso, VEGF e seus receptores são alvos importantes que podem ser utilizados para direcionamento de fármacos para tumores. Exemplos de agentes terapêuticos que poderão ser conjugados a esta invenção são os quioterápicos cisplatina, gencitabina, metotrexato, mitomicina, tamoxifeno ou taxol. Estes são apenas alguns exemplos de medicamentos utilizados para o tratamento do câncer, doença na qual as células tumorais comumente produzem grandes quantidades de um ou mais receptores de VEGF (VEGFR-1, VEGFR-2 ou VEGFR-3) . Assim, esta invenção poderá ser utilizada para direcionar estes medicamentos de forma preferencial para as células tumorais, diminuindo os efeitos citotóxicos sistémicos destes quimioterápicos .

[089] Os peptideos desta invenção poderão também ser conjugados a outros tipos de medicamentos, tais como anti- angiogênicos (TNP-470, angiostatina, endostatina, talidomida, sunitinibe ou avastina) , anti-inflamatórios esteróides (hidrocortisona, cortisona, prednisona, betametasona, dextametasona ) ou não-esteróides

(cetoprofeno, nimesulida, diclofenaco, entre outros) antibióticos (penicilina, bacitracina, gentamicina, canamicina, neomicina, estreptomicina, espectromicina, cefaclor, tobramicina, cefazolina, vancomicina, eritromicina, amoxilina, entre outros) . Estes são alguns exemplos, porém, outros tipos de medicamentos poderão ser conjugados aos peptideos desta invenção para terapias direcionadas para células ou tecidos que expressam VEGF e seus receptores.

[090] Além de medicamentos, fatores de crescimento, hormônios, moléculas pró-apoptóticas , citocinas e citoquinas poderão ser conjugadas aos peptideos desta invenção para que a molécula em questão, e direcioná-los para a vasculatura ou para células que expressam receptores de VEGF. É sabido que peptideos podem ser conjugados por métodos biológicos (ou químicos) a hormônios, citocinas ou citoquinas, melhorando sua farmacologia e, consequentemente, diminuindo sua toxicidade (Corti e col., 2012) . Exemplos de fatores de crescimento, hormônios, citocinas e citoquinas que poderão ser conjugadas aos peptideos desta invenção: hormônio de crescimento, hormônios da tireóide e paratireoide, insulina, hormônios estimulador de folículos (FSH), testosterona e hormônios esteróides, cortisol, interleucinas (IL-1 a IL-18), fator de necrose tumoral (TNF) e interferon alfa e gama (INF- e INF-γ) . Os peptideos desta invenção poderão ainda ser conjugados a moléculas suicidas, que induzam a morte da células alvo (apoptose) . Exemplos de moléculas apoptóticas são as proteína Bel, Fas e caspases, ou as moléculas ceramida e o peptídeo _D (KLAKLAKKLAKLAK) , conforme SEQ. ID. 15.

[091] Outro exemplo de aplicação é a conjugação desta invenção a vetores para terapias gênicas (por exemplo, adenovírus e lentivirus) . Estes vetores virais são capazes de infectar uma grande variedade de células e, assim, transferirem seu conteúdo genético para estas células. Esta é uma aplicação importante em terapias gênicas, onde um vetor virai (p.ex., adenovírus modificado geneticamente) carrega um gene de interesse, e peptídeos descritos nas SEQ. ID. n° 1 a 14, por exemplo, PCAIWF, permite que células que produzam os receptores de VEGF sejam infectadas preferencialmente (ou exclusivamente) e recebam o gene de interesse. Um exemplo de aplicação é o uso dos peptídeos PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) ou CPLWYYWYEC (SEQ. ID. N° 1) para direcionar um adenovírus carregando um gene tóxico. Por exemplo, o gene da timidina quinase do vírus do herpes simples (HSV-TK) aliado ao tratamento com ganciclovir é uma terapia suicida experimental para o tratamento de tumores (Fillat e col., 2003) . A dificuldade é incorporar o gene HSV-TK nas células do organismo que se deseja eliminar (por exemplo, células tumorais) . Em seguida, o tratamento com a droga ganciclovir mata apenas as células que receberam e expressam o gene HSV-TK. Os peptídeos desta invenção poderão ser acoplados a vetores virais para carregar genes suicidas (como o HSV-TK) para células tumorais e positivas para os receptores de VEGF. Utilizado em conjunto com ganciclovir, os vetores lentivirais contendo os peptideos desta invenção poderão ser, assim, utilizado para o desenvolvimento de terapias gênicas ou suicidas.

Usos dos peptideos sintéticos llgantes de receptores de VEGF conjugados a fluorófos ou quelantes para imageamento diagnóstico .

[092] Outra aplicação importante é o imageamento in vivo. O imageamento in vivo, ou imageamento molecular, é uma modalidade importante para visualizar processos ou funções celulares especificas. Esta invenção poderá ser utilizada para visualizar tecidos ou órgãos que expressam receptores de VEGF. Por exemplo, DOTA (ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecane-1 , 4, 7, 10-tetraacetico ) é uma molécula quelante e é uma substância que se liga a vários radionuclideos (p.ex., Galium-68, um emissor de pósitrons com meia vida de 68 minutos) utilizado para diagnóstico em equipamentos do tipo PET Scan (Tomografia por emissão de pósitrons) . Os peptideos descritos nas SEQ. ID. n° 1 a 14, por exemplo: PCAIWF, poderão ser conjugados a uma molécula de DOTA para carrear radionuclideos para imageamento de tumores, por exemplo.

[093] Outros exemplos de moléculas que poderão ser conjugadas aos peptideos SEQ. ID. n° 1 a 14 são os fluorófos para detecção por fluorescência no ultravioleta ( indocarbocianina, rodamina, fluoresceina, carboxifluoresceina, 4 ' , 6-diamidino-2-phenylindole [dapi], entre outras), no infravermelho próximo (IRDye® 800CW™, IRDye® 700DX™, IRDye® 680RD™ - LiCor Corporate, EUA) , ou nanoparticuias fluorescentes (quantum dots), entre outras moléculas .

[094] Os peptideos desta invenção poderão ainda ser fusionados por metodologias de biologia molecular a proteínas fluorescentes, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) , amarela (YFP) ou vermelha (RFP) , TagRFPs, KFP, mCherry, UnaG, Dronpa, e IrisFP, entre outras.

Em todos estes exemplos, os peptideos desta invenção permitirão localizar o fluorófo nas células, tecidos ou órgãos com grande expressão de VEGFs e seus receptores, permitindo desta forma sua visualização com equipamentos adequados (por exemplo, tomografia fluorescente, imageamento no infravermelho próximo [NIRI], entre outras modalidades) . Uma importante aplicação é a visualização de tumores primários e suas metástases. Células tumorais expressam, comumente, elevados níveis dos receptores de VEGFs e seus receptores (Goel & Mercúrio, 2013) . A conjugação dos peptideos desta invenção, por exemplo, do peptídeo PCAIWF (SEQ. ID. N° 5) ou CPLWYYWYEC (SEQ. ID. N° 1), a um dos fluorófos listados acima, poderá ser utilizado para visualizar in vivo tumores e suas metástases, auxiliando o médico no diagnóstico e na terapia adequada para o paciente. Se o imageamento for positivo, e com alto nível de fluorófo, isto indicará ao médico que o tumor é positivo para VEGF e seus receptores. Assim, ele poderá então indicar ao paciente um medicamento bloqueador de VEGF e seus receptores.

Exemplo de Concretização da Invenção

[095] A presente invenção utilizou a metodologia de Phage Display em pannings (ensaios de seleção de fagos apresentando peptideos na superfície) com o objetivo de selecionar peptideos com atividade angiogênica. Primeiro, construíram-se bibliotecas nas quais fagos apresentam mais de um bilhão de peptideos diferentes em sua superfície. Duas bibliotecas foram construídas, uma de peptideos lineares de 6 aminoácidos (X6) e outra com octapeptídeos cíclicos (CX8C) (X= qualquer aminoácido e C = cisteína) , todas com sequências aleatórias de aminoácidos. Essas bibliotecas de fagos foram utilizadas em varreduras contra os domínios extracelulares de VEGFR-3 recombinante . Os fagos que se ligaram ao receptor VEGFR-3 foram selecionados e sequenciados para análise dos peptideos. A seguir descreve-se a construção das bibliotecas de fagos usadas na varredura contra VEGFR-3.

Construção de bibliotecas de fagos apresentando peptideos em sua superfície .

[096] As bibliotecas de fagos foram produzidas utilizando-se o vetor fUSE55 e a metodologia desenvolvida por George Smith (Smith e Scott, 1993), com modificações para melhor eficiência e maior número de clones finais (Koivunen et al . , 1993, 1999) . O vetor fUSE55 contém dois sítios de enzima de restrição BglI, ambos localizados no início do gene pIII que codifica a proteína III do capsídeo do bacteriófago (fago) . A inserção dos sítios BglI altera a fase de leitura do gene III e não traduz uma proteína pIII funcional. Como a proteína pIII é necessária para a infecção do fago na bactéria, bactérias carregando este vetor não produzem fagos infectantes, embora como plasmídeo fUSE55 possa ser propagado devido a presença do gene de resistência a tetraciclina . Os dois sítios de BglI no gene pIII do fUSE55 estão espaçados por 14 nucleotídeos chamados de "stuffer" (conforme figura 2) . A substituição da sequência stuffer por um inserto de DNA, sintetizado ou natural, uniformemente divisível por 3 e que não tenha códons de parada em fase, restaura a fase de leitura do gene III e, portanto, restaura a capacidade infectiva do fago. Cinco cópias do peptídeo codificado pelo inserto são apresentadas na extremidade do fago em fusão com a proteína pIII do capsídeo (como mostrado na figura 2, passo 4) .

[097] A figura 2 se refere à construção das bibliotecas de Phage Display através de um esquema indicando os passos na construção da biblioteca de fagos, sendo 1) oligonucleotídeos sintéticos contendo o códon degenerado (NNK) n (N= qualquer nucleotídeo ; K= nucleotídeos T ou G com a finalidade de reduzir o número de possíveis códons de parada e n = número de aminoácidos desejado), digeridos com a enzima de restrição BglI foram inseridos na região que codifica o gene da proteína pIII no vetor fUSE55 previamente digerido com BglI. O produto da reação de ligação (2) foi transformado na bactéria eletrocompetente E.coli cepa MC1061 F- (3) e os fagos produzidos, expressando proteína recombinante pIII (4), foram recuperados por precipitação com PEG/NaCl .

[098] As bibliotecas construídas foram do tipo X6 e CX8C (X representa qualquer aminoácido e C representa cisteínas que permitem criar bibliotecas cíclicas) , ou seja, foram criadas bibliotecas nas quais fagos apresentam 6 peptídeos num arranjo linear ou 8 peptídeos num arranjo cíclico nas proteínas pIII dos fagos. O uso de bibliotecas lineares e cíclicas, e de diferentes tamanhos, aumenta a diversidade de peptídeos disponíveis para os estudos. Fagos das bibliotecas X6 e CX8C foram produzidos em bactéria E. coli cepa MC1061 transformada com o vetor fUSE55 contendo os insertos X6 e CX8C. Os fagos foram purificados do sobrenadante da cultura pelo método da precipitação com PEG/NaCl (Smith e Scott, 1993) . Alguns clones das bibliotecas na bactéria foram plaqueados, selecionados e sequenciados para análise dos peptídeos expressos nas duas bibliotecas. A tabela 1 mostra os dados das duas bibliotecas construídas.

[099] Tabela 1. Bibliotecas de fagos. Dados relativos às duas bibliotecas de fagos construídas. A biblioteca CX8C possui sequências aleatórias de 8 aminoácidos flanqueados por cisteínas as quais fazem com que os peptídeos sejam expostos de forma cíclica na superfície do fago. A biblioteca X6 possui sequências aleatórias de 6 aminoácidos expostos na superfície dos fagos de forma linear.

Biblioteca de fagos CX8C cíclica X6 linear

Número de 1,2 x 10 ¹⁰ 1,4 x IO ⁹ trans formantes

Número de peptídeos

8,0 x IO ⁹ 1,2 x IO ⁹ distintos

Título de fagos

(TU = Unidades

2,5 x 10 ⁸ TU/μΙ 7,0 x 10 ⁸ TU/ μΐ transdutoras de

bactéria )

Número de clones

23 41

sequenciados STOP STOP

Vetor Vetor

Análise dos clones Peptideos códons Peptideos códons

vazio vazio prematuros prematuros

19 3 1 36 5 0

(79%) (13%) (4%) (88%) (12%) (0%)

[100] Primeiramente, foi padronizada uma reação de transformação do vetor fUSE55 em bactéria eletrocompentente, E. coli cepa MC1061, altamente eficiente o que rendeu um grande número de transformantes para as duas bibliotecas, como mostrado na tabela 1.

[101] As duas bibliotecas possuem, cada uma, mais de um bilhão de peptideos apresentados na superfície dos fagos. A alta diversidade de peptideos garante que, virtualmente, as bibliotecas X6 e CX8C apresentam ligantes para qualquer alvo biológico. 0 título de fagos indica que cada microlitro das bibliotecas, usado para infectar bactéria, fornece mais de IO ⁸ unidades transdutoras (TU) de bactéria. O número de stop códons prematuros, que interrompem a síntese dos peptideos apresentados, nas duas bibliotecas é baixo: menos de 15%. A biblioteca CX8C possui somente 4% de fagos carregando vetores vazios, portanto sem peptideos apresentados nos fagos, enquanto que nos clones sequenciados da biblioteca de fagos X6 não se detectou nenhum com vetor vazio.

[102] O título de fagos indica que cada microlitro das bibliotecas, usado para infectar bactéria, fornece mais de IO ⁸ unidades transdutoras (TU) de bactéria. O número de stop códons prematuros, que interrompem a síntese dos peptideos apresentados, nas duas bibliotecas é baixo: menos de 15%. [103] A biblioteca CX8C possui somente 4% de fagos carregando vetores vazios, portanto sem peptideos apresentados nos fagos, enquanto que nos clones sequenciados da biblioteca de fagos X6 não se detectou nenhum com vetor vazio. Essas duas bibliotecas de fagos, de excelente qualidade, foram utilizadas em ensaios de varredura contra o alvo VEGFR-3 com o objetivo de se identificar peptideos específicos ligantes de VEGFR-3.

Identificação de peptideos direcionados ao receptor VEGFR-3 utilizando as bibliotecas de fagos em pannings (varreduras) in vitro .

[104] Para identificarmos peptideos ligantes de VEGFR-3 com potencial angiogênico, as bibliotecas de fago CX8C e X6 foram incubadas in vitro com a proteína recombinante de camundongo contendo a porção extracelular do receptor VEGFR-3 (R&D Systems) . Após lavagens com PBS, os fagos que se ligaram ao alvo foram recuperados por infecção bacteriana em E. coli K91kan, e amplificados em meio de cultura líquido LB durante 20 horas de crescimento bacteriano. Os fagos obtidos e amplificados no primeiro ciclo foram incubados com a proteína recombinante para novo ciclo de seleção. Nesta etapa os fagos não são plaqueados para contagem de unidades transdutoras (TUs) de bactéria, pois, em teoria, os fagos isolados são únicos e, ao quantificar por plaqueamento de bactéria, poderíamos perder peptideos que ainda não foram amplificados. O segundo e terceiro ciclos de seleção são semelhantes ao primeiro. Nos segundos e terceiros ciclos de seleção, cada fago expressando um determinado peptídeo já apresenta muitas cópias e parte dos fagos recuperados por infecção pode ser plaqueada para contagem do número de TUs . Foram realizados três ciclos de seleção nesse panning. Obtivemos um enriquecimento de 233 vezes no número total de fagos do segundo para terceiro ciclo no panning com a biblioteca CX8C (figura 3A) . E um enriquecimento de 7,6 vezes no número de fagos recuperados do segundo para o terceiro ciclo no panning com a biblioteca X6 (figura 3B) .

[105] As figuras 3A e 3B se referem aos resultados de Phage Display in vitro contra o receptor VEGFR-3. A biblioteca de fagos CX8C (A) , e a biblioteca de fagos X6 (B) foram usadas em ciclos de seleção contra a região extracelular do receptor VEGFR-3 recombinante, imobilizada in vitro. O número total de fagos recuperados em cada ciclo de seleção é mostrado nos gráficos de enriquecimento de fagos. Do segundo para o terceiro ciclo de seleção houve um enriquecimento de 233 (A) e 7,6 (B) vezes no número de fagos totais recuperados. No terceiro ciclo de seleção, fagos foram recuperados e sequenciados para a análise dos peptideos apresentados em sua superfície. As listas de sequências de peptideos apresentadas pelos fagos selecionados com a biblioteca CX8C e X6 são mostradas abaixo dos gráficos de enriquecimento. O primeiro ciclo de seleção (1 round) não é contabilizado.

Peptideos selecionados com a biblioteca CX8C:

1- CPLWYYWYEC

2- CPLWYYWYEC

3- CPLWYYWYEC

4- CPLWYYWYEC

5- CPLWYYWYEC

6- CPLWYYWYEC 7- CPLWYYWYEC

8- CFGVFDFFWC

9- CFGVFDFFWC

10-CELSFRPMMC

11-CAHHRWAVC

Peptídeos selecionados com a biblioteca X6:

1- PCAIWF

2- PCAIWF

3- PCAIWF

4- PCAIWF

5- PCAIWF

6- PCAIWF

7- PCAIWF

8- WVCSGG

9- WVCSGG

10-WVCSGG

11-WVCSGG

12-WVCSGG

[106] Diversos fagos individuais, que se ligaram a VEGFR-3 no terceiro ciclo de seleção obtidos no panning, foram selecionados aleatoriamente e suas sequências analisadas. A região que contém a sequência de DNA codificante para o peptideo foi sequenciada para identificação do peptideo apresentado por cada fago selecionado. Foram selecionados os dois peptideos mais abundantes provenientes das duas bibliotecas: o peptideo com a sequência de aminoácidos: CPLWYYWYEC, o qual aparece em 7 das 11 sequências proveniente da biblioteca de fagos CX8C; e o peptideo PCAIWF que aparece em 7 das 12 sequências analisadas provenientes da biblioteca X6. Fagos apresentando os peptideos CPLWYYWYEC e PCAIWF foram utilizados em ensaios de validação da interação peptideo e receptor como descrito abaixo.

Os fagos apresentando os peptideos PCAIWF e CPLWYYWYEC interagem especificamente com VEGFR-3 e afetam a interação do ligante VEGF-C com o receptor VEGFR-3.

[107] Fagos apresentando o peptideo PCAIWF e CPLWYYWYEC foram usados em ensaios de ligação contra diferentes receptores: VEGFR-1 VEGFR-2 e VEGFR-3, de camundongo e humanos, VEGFR-3 humano e neuropilina-2 de rato (co- receptor de VEGFR-3) . O objetivo deste ensaio de ligação é confirmar que a interação entre peptideo apresentado pelo fago e o receptor alvo do panning é especifica. No gráfico mostrado na figura 3A observa-se que o fago expressando o peptideo CPLWYYWYEC interage com maior afinidade com o receptor VEGFR-3 de camundongo e em menor afinidade com o receptor VEGFR-3 humano, mas não interage com VEGFR-1 e VEGFR-2 de camundongo, muito menos com o co-receptor neuropilina-2 de rato. O gráfico da figura 3B mostra que o peptideo PCAIWF apresenta afinidade especifica por VEGFR-3 de camundongo e humano e não com os outros receptores testados, VEGFR-1, VEGFR-2 de camundongo e humano, e neuropilina-1 humana e neuropilina-2 de rato. Em todos os ensaios com os peptideos, observamos que o fago controle (Fd), que não expressa peptideo algum na superfície, não é capaz de se ligar a nenhum receptor, indicando que a presença dos peptideos é importante para a interação do fago com o receptor VEGFR-3 (dado não apresentado no gráfico) . Igualmente, os fagos expressando os peptideos não são recuperados de poços contendo somente albumina (BSA) imobilizada, confirmando a especificidade da interação peptideo-receptor (figura 4) .

[108] As figuras 4A e 4B se referem ao ensaio de validação da interação peptideo-receptor. Fagos selecionados no panning contra VEGFR-3 e apresentando na superfície, unicamente, o peptídeo CPLWYYWYEC (figura 4A) ou o peptídeo PCAIWF (figura 4B) foram incubados com diferentes alvos: VEGFR-3 humano (hVEGFR-3) e de camundongo (VEGFR-3 mouse) , VEGFR-2 de camundongo (VEGFR-2 mouse) , VEGFR-1 de camundongo (VEGFR-1 mouse) , neuropilina 2 de rato (NRP-2) e albumina (BSA) . Os fagos selecionados foram recuperados por infecção bacteriana. As unidades transdutoras de bactérias foram contadas e os valores no gráfico são a média de cada triplicata plaqueada mais o erro padrão. Os fagos apresentando o peptídeo na superfície apresentam alta afinidade específica por VEGFR-3 tanto humano quanto de camundongo .

[109] Uma vez confirmada a especificidade de ligação dos peptídeos a VEGFR-3, realizamos ensaios de competição. Nesses ensaios, fagos apresentando os peptídeos CPLWYYWYEC e PCAIWF foram incubados com o receptor VEGFR-3 na presença do seu ligante: VEGF-C, e na presença de um não ligante de VEGFR-3: o VEGF-A isoforma VEGF165. VEGF165 é uma isoforma de VEGF, ligante de VEGFR-2 e VEGFR-1 (revisado por Koch et al . , 2011) . Um resultado esperado é que a presença de ligante específico iniba a interação do peptídeo com o receptor. No gráfico da figura 5A, observamos que a presença de VEGF-C, ao contrário, aumenta a interação do fago que apresenta o peptídeo CPLWYYWYEC com o receptor VEGFR-3. Uma explicação é que o peptídeo CPLWYYWYEC pode interagir fora do sitio de ligação de VEGF-C em VEGFR-3 e a ligação de VEGF-C favoreça alguma mudança estrutural no receptor que aumenta sua afinidade pelo fago-CPLWYYWYEC . Assim, concluímos que o peptídeo CPLWYYWYEC é um modulador alostérico do VEGFR-3, aumentando sua afinidade por VEGF-C e que o peptídeo CPLWYYWYEC possa ter atividade pró- angiogênica e pró-linfangiogênica, estimulando a formação de vasos sanguíneos e linfáticos.

[110] Em relação ao peptídeo PCAIWF, o gráfico da figura 5B mostra que a presença de VEGF-C inibe a ligação do fago apresentando o peptídeo a VEGFR-3 indicando que o ligante, VEGF-C, e o peptídeo PCAIWF competem pela ligação em VEGFR-3. O número total de fagos que se ligam em VEGFR-3 na presença do ligante inespecí fico, VEGF, é muito próximo ao número de fagos que se ligam em VEGFR-3 sem ligante. O gráfico da figura 6 mostra que a competição entre o peptídeo PCAIWF pela ligação ao VEGFR-3 é dependente da concentração de VEGF-C. Isto é um indicativo da especificidade da interação. Este resultado sugere ainda que o peptídeo PCAIWF seja um inibidor do receptor de VEGFR-3, com atividade anti-angiogênica e anti- linfangiogênica, inibindo a formação de vasos sanguíneos e linfáticos .

[111] As figuras 5A, 5B e 6 se referem aos resultados dos ensaios de competição. Fagos apresentando os peptídeos CPLWYYWYEC (figura 5A) e PCAIWF (figura 5B e figura 6) foram incubados com a porção extracelular do receptor VEGFR-3 na presença e ausência dos competidores VEGF-C e VEGF165 e sem competidor. Os fagos selecionados foram recuperados por infecção bacteriana. As unidades transdutoras de bactéria foram contadas e os valores nos gráficos são a média de cada quadruplicata plaqueada mais o erro padrão. Teste estatístico: t de student.

[112] Confirmada a especificidade de ligação dos peptídeos a VEGFR-3, realizamos ensaios de competição com o peptídeo sintético. Nesses ensaios, fagos apresentando o peptídeo PCAIWF foram incubados com o receptor VEGFR-3 na presença do peptídeo sintético PCAIWF solúvel. Um resultado esperado é que a presença de peptídeo sintético compita pela interação do fago PCAIWF com o receptor. Isto indica que o peptídeo sintético tem propriedades semelhantes às do peptídeo fusionado à proteína do fago.

[113] O gráfico da figura 7A mostra que a presença do peptídeo sintético PCAIWF solúvel inibe a ligação do fago apresentando o mesmo peptídeo a VEGFR-3 indicando que o ligante é mediador da interação entre o fago e VEGFR-3 e o peptídeo PCAIWF e que o peptídeo sintético tem as mesmas propriedades do fago PCAIWF. O número total de fagos que se ligam em VEGFR-3 na presença do ligante inespecí fico, o peptídeo sintético IFCAPW solúvel, é muito próximo ao número de fagos que se ligam em VEGFR-3 sem ligante. Na figura 7B, está mostrado que esta competição é dependente da concentração do peptídeo sintético PCAIWF, mais uma vez, confirmando a especificidade da interação.

[114] O peptídeo IFCAPW, conforme SEQ. ID. N° 21, foi escolhido por conter os mesmos aminoácidos do peptídeo PCAIWF, porém, arranjados em outra ordem. Ou seja, o peptídeo controle IFCAPW tem as propriedades químicas semelhantes ao peptídeo PCAIWF (carga, solubilidade, ponto isoelétrico, etc) , incluindo a presença de uma cisteína contendo um grupo SH livre.

[115] As figuras 7A e 7B se referem aos resultados dos ensaios de competição com o peptideo sintético. O fago apresentando o peptideo PCAIWF foi incubado com a porção extracelular do receptor VEGFR-3 na presença e ausência dos competidores PCAIWF e IFCAPW e sem competidor. Os fagos selecionados foram recuperados por infecção bacteriana. As unidades transdutoras de bactéria foram contadas e os valores nos gráficos são a média de cada quadruplicata plaqueada mais o erro padrão. Teste estatístico: t de student .

O peptideo PCAIWF pan-inibidor de VEGFs em ensaios in vitro .

[116] Para avaliar o efeito do peptideo PCAIWF sintético na interação ligante-receptor, sem a presença do fago, realizamos ensaios de FLISA ( Fluorophore-Linked Immunosorbent Assay) .

[117] Nesses ensaios as porções extracelulares de VEGFR-3, VEGFR-2 ou VEGFR-1 foram imobilizadas em microplacas de poliestireno e incubadas com o ligante de VEGFR-2 e VEGFR-3: VEGF-C ou com o ligante de VEGFR-2 e VEGFR-1: VEGF-A ou ainda com o ligante de VEGFR-1, P1GF, com e sem a presença de competidor peptideo sintético PCAIWF, ou a forma mutada PSAIWF, ou peptideo controle (sequência IFCAPW) . A quantidade relativa de ligante VEGF- C, VEGF-A ou P1GF) que permaneceu ligada ao receptor foi determinada pela ligação de anticorpo primário anti-ligante seguido de anticorpo secundário (IRDye 680LT, da empresa Li-COR Bioscience) . O sinal do anticorpo secundário, o qual possui conjugado um marcador fluorescente (IRDye 680LT) que absorve e emite em comprimentos de onda próximos ao infravermelho, é detectado no equipamento Odyssey Infrared Imaging Systems (LI-COR Bioscience) .

[118] A figura 8 (A, B, C, D e E) se refere ao efeito da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro. VEGF-C e VEGF-A foram incubados com as porções extracelulares de VEGFR-3, VEGFR-2 e VEGFR-1 humanos recombinantes imobilizados em placas de poliestireno sem e com a presença dos peptideos sintéticos: PCAIWF, PSAIWF e IFCAPW (Controle) . A quantidade relativa de VEGF-C, P1GF ou VEGF-A foi detectada por anticorpo primário anti-VEGF-C, anti-PIGF ou anti-VEGF-A e anticorpo secundário conjugado a fluoróforo IRDye 680LT, da empresa Li-COR Bioscience, no comprimento de onda de 700nm. Os resultados são a média mais o desvio padrão de duplicatas de cada ponto experimental. A foto acima dos gráficos mostra o sinal emitido pelo fluoróforo conjugado ao anticorpo secundário e capturado no leitor de infravermelho, no comprimento de onda de 700nm (Odyssey LI ^¬ COR Bioscience) .

[119] A figura 8A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 3/VEGF-C.

[120] A figura 8B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 2/VEGF-C.

[121] A figura 8C se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 1/P1GF.

[122] A figura 8D se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 2/VEGF-A.

[123] A figura 8E se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 1/VEGF-A.

[124] Estes resultados mostram que, como esperado, o peptideo sintético PCAIWF é um competidor do ligante do receptor VEGFR-3, o VEGF-C. Porém, estes resultados mostram também, que o PCAIWF inibe a interação dos outros ligante da família do VEGF, ou seja, do VEGF-A aos receptores VEGFR-2 e VEGFR-1 e do fator P1GF e sua ligação ao receptor VEGFR-1. Este resultado, não foi antecipado inicialmente, uma vez que não observamos uma interação do fago apresentando o peptideo PCAIWF ao receptor VEGFR-1 e VEGFR- 2 no contexto do fago.

[125] A explicação para este resultado é que o peptideo sintético PCAIWF apresenta maior grau de liberdade quando em solução e não mais associado ao fago. Isto permite que o peptideo se acomode nos sítios de ligação do VEGFR-2 e VEGFR-1. De fato, estudos na literatura científica sugerem que bibliotecas de moléculas mosaico apresentam VEGFs recombinantes contendo diferentes domínios de VEGF-A e VEGF-C podem se ligar aos três receptores de VEGF (nenhum membro natural da família do VEGF liga-se aos três receptores VEGFR-1, -2 e -3; ver figura 1) (Jeltsch et al . , 2006) . Estes resultados sugerem que o peptideo PCAIWF seja um mimético de um domínio estrutural conservado entre os diferentes membros da família do VEGF.

[126] Esta propriedade do peptideo PCAIWF, de ser um pan-inibidor de VEGF, é importante nesta invenção, pois o caracteriza como um peptideo com múltipla ação anti- angiogênica, uma vez que a inibição dos principais fatores angiogênicos (VEGF-A, P1GF e VEGF-C) , isoladamente, tem sido relatada na literatura como possíveis alvo para o tratamento de doenças com um componente angiogênico (Dewerchin & Carmeliet, 2012; Tammela e col., 2008) . Assim, esta invenção trata de um pan-inibidor de VEGF, num único peptideo .

[127] O resultado com o peptideo mutado PSAIWF também é importante para esta invenção. Ele demonstra que a substituição de um aminoácido em peptídeos desta invenção (a substituição da Cisteína [C] no peptideo PCAIWF por uma Serina [S], resultando no peptideo mutado PSAIWF) não altera as propriedades biológicas do peptideo original. Serina e cisteína têm cadeias laterais semelhantes, com o mesmo número de carbonos. A única diferença é que a serina contém um grupo hidroxila (-OH) ao invés de um grupo sulfidrila (-SH) , preserva a atividade biológica do peptideo as propriedades. Este resultado, confirma que o peptideo PCAIWF não inibe o receptor VEGFR-3 apenas por conter um grupo -SH livre reativo.

O peptideo PCAIWF não inibe a interação dos ligante FGF e PDGF aos seus receptores em ensaios in vitro.

[128] Uma vez confirmado que o peptideo PCAIWF inibe a interação dos ligantes da família do VEGF, avaliamos o efeito do peptideo na interação ligante-receptor de outros dois fatores envolvido na formação de vasos sanguíneos. O fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGF-BB) e o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) ligam-se seletivamente aos receptores do tipo tirosina quinase (da mesma superfamília dos receptores de VEGF) . O PDGF liga-se ao receptor PDGFR-beta e o FGF liga-se ao receptor FGFR- beta .

[129] A figura 9 se refere ao efeito da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro. PDGF-BB e FGF foram incubados com as porções extracelulares de PDGFR-beta e FGFR-beta humanos recombinantes imobilizados em placas de poliestireno sem e com a presença dos peptídeos sintéticos: PCAIWF e IFCAPW. A quantidade relativa de PDGF-beta e FGF-beta foi detectada por anticorpo primário anti-PDGF-beta ou anti-FGF e anticorpo secundário conjugado a fluoróforo IRDye 680LT, da empresa Li-COR Bioscience, no comprimento de onda de 700nm. Os resultados são a média mais o desvio padrão de duplicatas de cada ponto experimental. A foto acima dos gráficos mostra o sinal emitido pelo fluoróforo conjugado ao anticorpo secundário e capturado no leitor de infravermelho, no comprimento de onda de 700nm (Odyssey LI ^¬ COR Bioscience) .

[130] A figura 9A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao PDGF- BB/PDGFR-beta.

[131] A figura 9B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético PCAIWF na interação ligante-receptor in vitro em relação ao FGF/FGFR- beta .

[132] Estes resultados mostram que o efeito do peptideo PCAIWF é especifico para ligantes-receptores membros da família do VEGF.

O peptideo sintético PCAIWF apresenta efeito antl- anglogênlco no Modelo Animal de Retlnopatla Induzida por Oxigénio .

[133] 0 efeito biológico do peptideo sintético PCAIWF foi avaliado no modelo animal de retinopatia induzida por oxigénio. 0 modelo animal para ROP é amplamente utilizado na análise do papel de VEGF e outros fatores moleculares envolvidos na neovascularização da retina, assim como para avaliar possíveis terapias para a doença.

[134] Camundongos da linhagem C57BL/6J foram, em idade P7 até P12, colocados numa atmosfera com 75% de oxigénio dentro de uma câmara de oxigénio instalada no Biotério de Produção e Experimentação Animal do Instituto de Química e Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP. Nessa câmara de oxigénio os filhotes de camundongo, em idade P7, junto a suas mães são expostos por cinco dias à mistura de gases composta de 75% de oxigénio e 25% nitrogénio. A retina desses animais nas primeiras semanas de vida encontra-se em desenvolvimento semelhante à retina de bebés humanos prematuros e os vasos estão em formação (Fruttiger, 2007) . A exposição a altas concentrações de oxigénio provoca vasoconstrição e queda na expressão de VEGF. Os animais, na idade de P12, são retirados da câmara de oxigénio (hiperóxia) , voltando a respirar uma atmosfera de 21% de oxigénio (normóxia) o que induz um quadro de hipoxia relativa, resultando na expressão elevada e persistente de VEGF. No período que os animais saem da câmara de oxigénio ocorre hipoxia relativa e vasos protuberantes surgem sobre a superfície da retina. Este processo inicia-se entre 6 e 12 horas após retorno a normóxia e leva à produção exacerbada de vasos sanguíneos (Smith et al . , 1994; Alon et al., 1995; Pierce et al . , 1995; Okamoto et al . , 1997; Connor et al . , 2009) .

[135] Na idade de P15, os animais submetidos à hiperóxia entre P7 até P12, receberam injeções intraoculares de Ιμΐ de soluções de peptídeos na concentração de 100mg/ml ou 30mg/ml (ou seja, a quantidade total de peptídeo injetada intraocularmente foi de 100μg e 30 μg) ou somente veículo (DMSO) . Para cada tratamento feito, foram utilizados 6 animais e, portanto, 12 retinas foram analisadas, com exceção dos animais mantidos em normóxia (para visualização do desenvolvimento normal dos vasos sanguíneos) que eram somente 2, ou seja, 4 retinas analisadas .

[136] Os animais tiveram suas retinas dissecadas na idade de P17, no qual ocorre o pico máximo de angiogênese, como havíamos determinado em experimentos anteriores. Utilizando uma micro tesoura cirúrgica, quatro cortes simétricos, da borda para o centro, foram feitos na retina de forma que o tecido, côncavo antes dos cortes, torna-se plano em formato de flor. Os vasos sanguíneos das retinas foram então corados com isolectina B4 conjugada com o fluoróforo Alexa594 como mostrado na figura 10A. Realizamos a quantificação da neovascularização das retinas através da obtenção de imagens das retinas em microscópio de fluorescência (Nikon) utilizando o programa NIS-Elements . As imagens foram importadas para o programa Adobe Photoshop CS3 e os vasos sanguíneos quantificados conforme descrito em Connor et al, 2009. A contagem do número de pixels da área total da retina comparado com o número de pixels das áreas fortemente marcadas com isolectina B4 conjugada com o fluoróforo Alexa594 (áreas nas quais ocorreu neovascularização intensa) fornece uma porcentagem de área neovascularizada nas retinas como mostrado na figura 10B. Nossos resultados mostram que animais submetidos à hiperóxia e que não receberam injeções intraoculares (sem tratamento), assim como aqueles que receberam injeções de veículo, injeções de peptídeo controle (CARAC) , conforme SEQ. ID. N° 22, desenvolvem na retina uma densa rede de vasos sanguíneos calibrosos enquanto que os animais mantidos em normóxia no mesmo período não apresentam a mesma neovascularização (figura 10B) .

[137] Comparando com os animais em nórmóxia, os animais em hiperóxia não tratados ou tratados somente com injeções intraoculares de veículo apresentam um aumento de 98% na neovascularização observada nas retinas. Já os animais tratados com injeção intraocular de peptídeo PCAIWF (100mg/ml) apresentam uma redução significativa de mais de 50% na neovascularização quando comparados com os animais tratados com veículo (figura 10B) .

[138] Também foi testado o efeito biológico do peptídeo carregando uma mutação e escolhemos o peptídeo PSAIWF sintético (alteração de cisteína por serina na posição 2) para avaliar o efeito na angiogênese dos vasos da retina no modelo animal. Injeções intraoculares de Ιμΐ de peptídeo PSAIWF (lOOmg/ml) foram administradas aos animais em idade P15, como nos outros tratamentos. Na idade P17 as retinas foram dissecadas e os vasos corados. Observamos que o tratamento de animais com o peptideo PSAIWF provocou uma discreta redução da neovascularização (23%) quando comparada com a neovascularização observada nos animais tratados com veiculo (figura 10B) . Isto mostra que mudanças de aminoácidos conservados ou com características químicas parecidas, não afetam a atividade anti-angiogênica do peptideo PCAIWF. Indica também, que o efeito anti- angiogênico do peptideo não se deve a reatividade isolada da cisteína com proteínas da retina.

[139] As figuras 10A e 10B se referem ao efeito dos Peptídeos Sintéticos no Modelo Animal de Retinopatia Induzida por Oxigénio. Camundongos da linhagem C57B1/6 foram expostos à atmosfera de 75% de oxigénio (hiperóxia) por cinco dias, na idade de P7 até P12.

[140] Na figura 10A, os animais em idade P15 foram tratados com injeções intraoculares (volume de Ιμΐ) contendo 100mg/ml de peptídeos sintéticos solubilizados em DMSO. Na idade P17 (pico de angiogênese na retina) os animais foram sacrificados, suas retinas foram dissecadas e coradas com isolectina B4 conjugada ao fluoroforo Alexa 594 (coloração vermelha) para visualização dos vasos sanguíneos .

[141] Na figura 10B houve a quantificação dos vasos através da contagem do número de pixels da área total da retina comparado com o número de pixels das áreas fortemente marcadas em vermelho (áreas nas quais ocorreu neovacularização intensa) nos animais submetidos à hiperóxia (n= 4 a 6 animais; 8 a 12 retinas totais,) e animais mantidos em nórmóxia (n=2 animais, 4 retinas totais) . Os pixels das imagens foram quantificados utilizando o programa Adobe Photoshop conforme Connor et al . , 2009. O tratamento com injeções intraoculares de DMSO, de peptideo controle não provocou grandes alterações na densa e calibrosa rede de vasos que se forma nos animais expostos à hiperóxia, semelhante ao que se observa nos animais não tratados.

[142] Camundongos tratados com injeções intraoculares de peptideo PCAIWF apresentam uma redução de mais de 50% na quantidade de vasos sanguíneos presentes em suas retinas quando comparado com os animais sem tratamento (teste estatístico t student) . Camundongos tratados com injeções intraoculares de peptideo mutado PSAIWF apresentam leve redução de 23% na quantidade de vasos sanguíneos presentes em suas retinas quando comparado com os animais sem tratamento (teste estatístico t student) .

[143] Também foi testado o efeito biológico do peptideo PCAIWF numa concentração menor, de 30 μg, e utilizando outro peptideo controle, o IFCAPW que contém os mesmos aminoácidos do peptideo PCAIWF, porém, em outra ordem. Injeções intraoculares de Ιμΐ de peptideo PCAIWF (30mg/ml) ou do peptideo IFCAPW (30 mg/ml) foram administradas aos animais em idade P15, como nos outros tratamentos. Na idade P17 as retinas foram dissecadas e os vasos analisados.

[144] Na figura 11A está apresentada uma imagem representativa da retina de animais que receberam os diferentes tratamentos. Pode-se notar que a retina dos animais tratados com o peptideo PCAIWF apresentam uma redução visível na sua rede vascular, comparada com as retinas dos animais que não receberam peptídeo, ou que foram tratados com o peptídeo controle IFCAPW. Na figura 11B houve a quantificação dos vasos através da contagem do número de pixels da área total da retina comparado com o número de pixels das áreas fortemente marcadas em vermelho (áreas nas quais ocorreu neovacularização intensa) nos animais submetidos à hiperóxia (n= 4 animais; 8 retinas totais, ) e animais mantidos em nórmóxia (n=4 animais, 8 retinas totais) . Os pixels das imagens foram quantificados utilizando o programa Adobe Photoshop conforme Connor et al . , 2009. O tratamento com injeções intraoculares de DMSO, de peptídeo controle IFCAPW não provocaram alterações significativas na densa e calibrosa rede de vasos que se forma nos animais expostos à hiperóxia, semelhante ao que se observa nos animais não tratados. Observamos que o tratamento de animais com o peptídeo PCAIWF reduziu a neovascularização em aproximadamente 44% quando comparada com a neovascularização observada nos animais tratados com veículo (DMSO) . O peptídeo controle IFCAPW não apresentou redução na vascularização da retina. Indica também, que o efeito anti-angiogênico do peptídeo não se deve a reatividade isolada da cisteína com proteínas da retina.

[145] Na figura 11C foi realizada a quantificação do brotamento e das bifurcações de vasos através da contagem. Isto porque a angiogênese se refere a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos já existentes. Assim, espera-se que um medicamento anti-angiogênico reduza o número de novos vasos que brotem ou se bifurquem a partir dos vasos já existentes na retina. De fato, quando contamos o número de bifurcações e brotamentos, notamos que há uma redução de aproximadamente 50%, quando comparado animais tratados com o veiculo (DMSO) e com o peptideo controle I FCAPW .

Sobre modi icações nos peptideos da invenção.

[146] Peptideos podem ser alterados durante a síntese pelo uso de aminoácidos modificados. Uma possível alteração é a utilização de enantiômeros D. Peptideos sintetizados com D-aminoácidos são mais resistentes a degradação biológica (p.ex., não são clivados pela ação de proteases) . Assim, os peptideos desta invenção poderão ser sintetizados utilizando-se aminoácidos modificados, por exemplo, D- aminoácidos, com o intuito de melhorar suas propriedades farmacêuticas, sem alterar suas atividade moduladora de VEGF ou de seus receptores.

[147] A figura 12 se refere ao efeito da presença de peptideo sintético PCAIWF SEQ. ID. N° 5, modificados e sintetizado com D-aminoácidos e aqui denominado de D ( PCAIWF) , na interação ligante-receptor in vitro. VEGF-C e VEGF-A foram incubados com as porções extracelulares de VEGFR-3, VEGFR-2 e VEGFR-1 humanos recombinantes imobilizados em placas de poliestireno sem e com a presença dos peptideos sintéticos: PCAIWF, _D (PCAIWF), IFCAPW [Controle] ou _D (IFCAPW) [Controle D-aminoácidos]. A quantidade relativa de VEGF-C, P1GF ou VEGF-A foi detectada por anticorpo primário anti-VEGF-C, anti-PIGF ou anti-VEGF- A e anticorpo secundário conjugado a fluoróforo IRDye 680LT, da empresa Li-COR Bioscience, no comprimento de onda de 700nm. Os resultados são a média mais o desvio padrão de duplicatas de cada ponto experimental. A foto acima dos gráficos mostra o sinal emitido pelo fluróforo conjugado ao anticorpo secundário e capturado no leitor de infravermelho, no comprimento de onda de 700nm (Odyssey LI ^¬ COR Bioscience) .

[148] A figura 12A se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético _D (PCAIWF) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 3/VEGF-C.

[149] A figura 12B se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético _D (PCAIWF) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 2/VEGF-C.

[150] A figura 12C se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético _D (PCAIWF) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 2/VEGF-A.

[151] A figura 12D se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético _D (PCAIWF) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 1/VEGF-A.

[152] A figura 12E se refere à representação gráfica dos efeitos da presença de peptideo sintético _D (PCAIWF) na interação ligante-receptor in vitro em relação ao VEGFR- 1/P1GF.

[153] Estes resultados mostram que, como esperado, o peptideo sintético PCAIWF SEQ. ID. N° 5 modificado com D- aminoácidos - _D (PCAIWF) - apresentou o mesmo efeito competidor dos ligantes dos receptores de VEGF.

Efeito do peptideo PCAIWF em células endotellals .

[154] Para determinar se fagos apresentando o peptideo PCAIWF auxiliam a internalização do fago em células endoteliais, realizamos ensaios de internalização de fagos. Utilizamos células endoteliais de pulmão provenientes de um camundongo transgênico produzido pelo Instituto Ludwig, Immortomouse® .

[155] A seguir, fagos apresentando peptideo PCAIWF, peptideo contendo a sequência RGD (o qual se liga fortemente à integrinas na superfície celular) e fagos selvagens Fd sem peptídeos na superfície foram incubados, overnight, com as células endoteliais.

[156] A detecção dos fagos é feita por imunocitoquímica com anticorpo anti-fago conjugado ao fluoróforo Dylight 488. Fagos apresentando o peptideo PCAIWF são internalizados pelas células endoteliais, como mostra a figura 13 (exemplo indicado pelas setas brancas) . Já o fago Fd não apresenta peptideo na superfície (controle negativo) e não é internalizado indicando que a presença de peptideo na extremidade do capsídeo dos fagos é importante para a internalização. Fagos apresentando peptideo RGD são eficientemente internalizados (indicado pelas setas brancas) pelas células. O peptideo contendo a sequência RGD é utilizado como controle positivo já que RGD liga-se a integrinas na superfície de células. Esses resultados mostram que fagos apresentando o peptideo PCAIWF, quando incubados com células endoteliais, sofrem internalização enquanto que fagos que não apresentam peptideo (fago Fd) não são internalizados pelas células endoteliais. Esse resultado indica que o peptideo PCAIWF é reconhecido por receptores expressos na superfície das células endoteliais e pode atuar como alvo específico dessas células. Se o peptideo PCAIWF medeia a internalização do fago em células através do receptor VEGFR-3 existe a possibilidade de aplicação terapêutica como drug delivery de medicamentos no tratamento de alguns tipos de tumores nos quais o alvo é a vasculatura .

[157] A figura 13 se refere ao ensaio de internalização de fagos. Fagos apresentando o peptideo PCAIWF, fagos apresentando o peptideo RGD (usado como controle positivo por apresentar a sequência de aminoácidos RGD que se liga fortemente a integrinas na superfície das células) e fagos Fd os quais não apresentam peptídeos na superfície (usado como controle negativo) foram incubados overnight com células endoteliais de coração de camundongo. Os fagos internalizados foram detectados por imunocitoquímica com anticorpos anti-fago conjugados ao fluoróforo Dylight488 (verde) . O núcleo das células foi corado com DAPI (azul) .

Materials e Métodos referentes ao Exemplo de Concretização da Invenção

Construção das Bibliotecas de Fagos

[158] As bibliotecas foram construídas utilizando-se o vetor fUSE55 e a metodologia desenvolvida por George Smith (Smith & Scott, 1993) com modificações que permitiram uma maior eficiência e maior número de clones finais (Koivunen et al, 1993, 1999) .

[159] A biblioteca chamada de X6 contém fagos que expressam na superfície do capsídeo sequências aleatórias com 6 peptídeos. Já a biblioteca chamada de CX8C é composta de fagos que expressam na superfície do capsídeo sequências aleatórias com 8 peptídeos flanqueados por cisteínas.

Preparação em larga escala do vetor fUSE55 e digestão com enzima de restrição BglI.

[160] O vetor fUSE55 (gentilmente cedido pelo laboratório do Dr . George Smith

(http : //www. biosei .missouri . edu/SmithGP/PhageDisplayWebsite /PhageDisplayWebsitelndex . html ) foi amplificado na bactéria E. coli, cepa MC1061 F-, estreptomicina resistente. Um total de 12 litros de cultura de MC1061 contendo o vetor fUSE55 foram utilizados para amplificar o vetor.

[161] A cultura saturada de bactérias foi separada do meio liquido por centrifugação 8000Xg, 15 min a 4°C, lavada com tampão STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 e 0,1 mM EDTA) para eliminar a forma simples-fita do fUSE55, presente devido a produção de partículas virais que se mantém ligadas à superfície da bactéria.

[162] A purificação da forma dupla-fita do fUSE55 foi feita utilizando-se sistema de maxi preparação de plasmídeos com lise alcalina e cromatografia de troca iônica PlasmidMaxi kit tip500 (Qiagen) , conforme as instruções do fabricante com a seguinte modificação: para cada 2 litros de cultura utilizamos 100ml das soluções PI, P2 e P3 (composição indicada no manual do fabricante) .

[163] Para obter um vetor com alta pureza, livre de contaminantes, foi necessário realizar duas maxi- preparações seguidas de centrifugação de equilíbrio, 80krpm por 18 horas em ultracentrí fuga Beckman, com cloreto de césio e brometo de etídeo. A qualidade do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (0,5μg/ml) e quantificado por espectrofotometria (leituras nos comprimentos de onda de 260nm e 280nm) no equipamento Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) . [164] O DNA purificado foi digerido com Bgll (Ιθυ/μΐ, Fermentas) na proporção de 5U de enzima para cada liq de vetor. O DNA digerido foi purificado com o sistema de maxipreparação PlasmidMaxi kit tip500 (Qiagen) , conforme instruções do fabricante. A qualidade do DNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etideo e quantificado por espectrofotometria (260nm, 280nm) no equipamento Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) .

Preparação dos insertos X6 e CX8C usados na construção das bibliotecas de fagos e digestão com enzima de restrição Bgll.

[165] Oligonucleotideos sintéticos foram sintetizados ( Invitrogen) , contendo sequências aleatórias (NNK) n, na qual N representa qualquer um dos quatro nucleotideos (G,T,A, C) e K representa somente G ou T. As sequências desses oligos degenerados estão flanqueadas por sítios de restrição reconhecidos pela enzima Bgll. Um oligonucleotídeo complementar à região 3' dos oligos degenereados também foi sintetizado. As sequências destes oligonucleotideos são:

fUSE5-X6 Forward (referente à SEQ. ID. N° 16)

5 ' CACTCGGCCGACGGGGCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGGGCCGCTGGGGCCGA

A3' ,

em que "n" é a, g, c ou t e "k" é g ou t

fUSE5-X8 Forward (referente à SEQ. ID. N° 17)

5'

CACTCGGCCGACGGGGCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGGGCCGCTGGGGCCGA

A 3' ,

em que "n" é a, g, c ou t e "k" é g ou t

fUSE5 Reverse (Library Antisense) (referente à SEQ. ID. N° 18)

5' TTCGGCCCCAGCGGC 3'

[166] Na reação para síntese do inserto da biblioteca X6 foi usada a combinação de oligos fUSE5-X6 Forward e fUSE5 Reverse. Na reação para síntese do inserto da biblioteca CX8C foi usada a combinação de oligos fUSE5-X8 Forward + fUSE5 Reverse. O par de oligos foi tratado com Klenow (lOU/μΙ, Fermentas) para formação do inserto dupla- fita. Os insertos dupla-fita foram purificados com o sistema PlasmidMidi kit tiplOO (Qiagen) . Os insertos X6 e CX8C (lC^g no total) foram digeridos com a enzima de restrição BglI(10U^l, Fermentas) na proporção de 17U de enzima para cada ^g de DNA. O DNA digerido foi purificado com o sistema PlasmidMidi kit tiplOO (Qiagen) com modificações sugeridas para purificação de DNAs pequenos (http : //www. biosei .missouri . edu/SmithGP/PhageDisplayWebsite /PhageDisplayWebsitelndex . html ) . A qualidade do DNA foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida 15% corado com brometo de etídeo e quantificado por espectrofotometria no equipamento Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) .

Reação de ligação do vetor fUSE55 com o inserto X6 e o inserto CX8X.

[167] As sequências dos insertos X6 e CX8C, digeridas com BglI, foram clonadas no vetor fUSE55 previamente digerido com BglI em duas reações de ligação. A relação inserto : vetor foi mantida em 1:1 (melhor condição checada em ensaios piloto) . Na construção das bibliotecas X6 e CX8C utilizamos 150 μg de fUSE55 previamente digerido com BglI, 900ng de inserto também digerido com BglI, lOOul de T4 DNA ligase (5υ/μ1) e IX tampão de ligação (NEB) em um volume total de 10ml. A reação foi mantida na geladeira por 16 horas e purificada com o sistema de midipreparação PlasmidMidi kit tiplOO (Qiagen) .

Transformação das bibliotecas fUSE55-X6 e fUSE55-CX8C em bactérias eletrocompetentes e produção de fagos.

[168] Utilizamos bactérias eletrocompetentes , E. coli cepa MC1061, recém-preparadas e não congeladas. Um total de 150ug da ligação foi eletroporado (2,5kV) com 4ml de bactéria. Foram realizadas 20 eletroporações , cada uma contendo 200μ1 de bactéria mais 7,5 μg de DNA da ligação (5 μΐ de DNA na concentração de 1,5 μg/ul) . Todas as eletroporações foram transferidas para erlenmeyer de 2L contendo 500ml de meio liquido SOC seguido de incubação a 37°C, 300rpm, por 1 hora. Após, aliquotas da cultura foram plaqueadas nas diluições de 102, 10, 10-1 e 10 -2 em placas LB-ágar estreptomicina (25 μg/ml), tetraciclina (40 μg/ml) . O restante da cultura foi transferido para 10 litros de LB com tetraciclina (20 μg/ml) e mantido a 37°C, 300rpm, por 20 horas para produção de fagos. Como controle positivo da transformação, foi utilizado o vetor pUC19 (Fermentas) : 40pg eletroporado com 40ul de MC1061 e mantido em 2 ml de SOC por 1 hora, 300rpm, 37°C. O controle foi plaqueado nas mesmas diluições da biblioteca em placas LB-ágar carbenicilina (50 μg/ml) .

Purificação e titulação dos fagos das bibliotecas

[169] Os fagos das bibliotecas X6 e CX8C foram purificados do sobrenadante das culturas de bactéria E. coli, cepa MC1061 por precipitação pelo método de PEG/NaCl (Giordano et al . , 2001) . A biblioteca fUSE55-X6 foi ressuspendida em um volume final de 10 ml de PBS e a biblioteca fUSE55-X8 em 3,5 ml de PBS. Aliquotas foram estocadas na geladeira. Os fagos foram titulados por diluição seriada em meio LB, infectados em E.coli K91kan, e semeados em LB-ágar contendo tetraciclina (20 g/mL) e kanamicina (100 g/mL) . O número de unidades transdutoras de bactéria (TU) foi calculado contando-se as colónias obtidas .

Varredura utilizando as bibliotecas de fagos contra alvo in vitro (Panning in vitro)

[170] As bibliotecas de fagos X6 e CX8C foram utilizadas numa varredura in vitro contra a porção transmembrana do receptor VEGFR-3 (Recombinant Mouse VEGF R3/Flt4Fc Chimera, R&D Systems) . Resumidamente, lug de proteína VEGR-3 dissolvida em 50μ1 de PBS foi imobilizada em poços de placa de 96 poços durante a noite a 4°C. No dia seguinte a proteína foi removida e o poço foi lavado com PBS, 2 vezes; bloqueado com PBS contendo 3% BSA por 1 hora a temperatura ambiente e incubado com a biblioteca de fagos

(IO ⁹ TU em 50μ1 de PBS contendo 3% BSA) . Após 2 horas a temperatura ambiente, o poço foi lavado com PBS, 10 vezes. Os fagos ligantes foram recuperados por infecção com E.coli K91kan (Giordano et al . , 2008); cultivados e amplificados em meio LB contendo tetraciclina (20 g/mL) e kanamicina

(100 g/mL) para os sucessivos ciclos de seleção. Ao final, colónias individuais foram selecionadas para sequenciamento e identificação dos peptídeos apresentados pelos fagos.

Seleção de clones, PCR e sequenciamento para a determinação do peptídeo apresentado pelo fago.

[171] Ao final do segundo e terceiro ciclo de seleção dos panning, os fagos obtidos foram semeados em placas de LB-ágar com tetraciclina (40 g/ml) e kanamicina (100 g/ml) e colónias individuais selecionadas e ressuspendidas em 50 μΐ de PBS . A região do DNA que expressa o inserto de peptideo foi amplificada a partir de 2 i desta suspensão em reação de PCR, utilizando-se a combinação de oligonucleotideos :

[172] Phage-PCR foward: 5' GCAAGCTGATAAACCGATACAATT3 ' (referente à SEQ. ID. N° 19) e Phage-PCR reverse: 5' CCCTCATAGTTAGCGTAACGATCT3 ' (referente à SEQ. ID. N° 20), em termociclador por 35 ciclos com o seguinte programa de ciclagem: 94°C por 15 segundos; 60°C por 30 segundos; 72°C por 1 minuto; 72 °C 7 minutos. Os produtos de PCR foram sequenciados para identificação do peptideo apresentado por cada fago selecionado.

Produção, purificação e titulação de fagos.

[173] Os fagos foram isolados e purificados do sobrenadante de cultura de bactéria (E.coli MC1061 ou K91kan) , precipitados pelo método de PEG/NaCl (Giordano et al . , 2001), e ressuspendidos em PBS. Os fagos foram titulados por diluição seriada em meio LB, infectados em E.coli K91kan, e semeados em LB-agar contendo tetraciclina

(20 g/mL) e kanamicina (100 g/mL) . O número de unidades transdutoras de bactéria (TU) foi calculado contando-se as colónias obtidas.

Ensaios de ligação

[174] Para validar a interação entre peptideos específicos apresentados pelo fago e a proteína alvo

(VEGFR-3, porção transmembrana ) , realizamos ensaios de ligação (Giordano et al . , 2001) . Fagos apresentando peptideos específicos selecionados nos pannings e fagos controle (Fd-tet, sem inserto de peptídeo) foram incubados com VEGFR-3, VEGFR-2, VEGFR-1 (disponíveis comercialmente R&D Systems) ou o poço sem receptor. Inicialmente, 200ng de proteína dissolvida em 50μ1 de PBS foi imobilizada em poços de placa de 96 poços durante a noite a 4°C. A proteína foi removida e o poço foi lavado com PBS, 2 vezes; bloqueado com PBS contendo 3% BSA por 1 hora em temperatura ambiente e incubado com partículas de fagos apresentando peptídeos específicos (IO ⁸ TU em 50μ1 de PBS contendo 3% BSA) . Após 2 horas a temperatura ambiente, o poço foi lavado com PBS, 10 vezes. Os fagos ligantes foram recuperados por infecção com E.coli K91kan (Giordano et al . , 2008); e plaqueados em diluições apropriadas em meio LB-ágar contendo tetraciclina (40 g/mL) e kanamicina (100 g/mL) para a contagem das colónias individuais.

Ensaios de ligação com competição

[175] O ensaio é semelhante ao de ligação com as seguintes modificações: 100 ng dos receptores foram imobilizados na placa de 96 poços. Partículas de fagos apresentando os peptídeos CPLWYYWYEC e PCAIWF (IO ⁸ TU el 50 μΐ de PBS) foram incubadas com o receptor imobilizado, juntamente com 10ng/ml de ligante (VEGF-C ou VEGF - R&D Systems) .

Ensaios de ligação com competidores

[176] Para validar a interação entre peptídeos específicos e a proteína alvo (VEGFR-3, porção extracelular ) , realizamos ensaios de ligação (Giordano et al . , 2001) . Fagos apresentando peptídeos específicos (PCAIWF e CPLWYYWYEC) selecionados nos pannings e fagos controle (Fd-tet, sem inserto de peptideo) foram incubados com 200ng VEGFR-3 recombinante (disponível comercialmente R&D Systems) ou o poço sem receptor contendo albumina

(BSA) . Inicialmente, 200ng de proteína dissolvida em 50μ1 de PBS foi imobilizada em poços de placa de 96 poços durante a noite a 4°C. A proteína foi removida e o poço foi lavado com PBS, 2 vezes; bloqueado com PBS contendo 3% BSA por 1 hora a temperatura ambiente e incubado com partículas de fagos apresentando peptídeos específicos (IO ⁸ TU em 50μ1 de PBS contendo 3% BSA), juntamente com os competidores: hVEGF-C (R&D Systems) na concentração de 20ng/ml; peptideo PCAIWF e peptideo controle CARAC (SEQ. ID. N° 22) (Bachem Company) em concentrações: 30C^g/ml ou 10C^g/ml. Após 2 horas a temperatura ambiente, o poço foi lavado com PBS, 10 vezes. Os fagos ligantes foram recuperados por infecção com E.coli K91kan (Giordano et al . , 2008); e plaqueados em diluições apropriadas em meio LB-ágar contendo tetraciclina

(40 g/mL) e kanamicina (100 g/mL) para a contagem das colónias individuais.

Ensaios de competição dos peptídeos sintéticos contra a Interação VEGF-C e VEGFR-3 por FLISA

[177] Para os ensaios de FLISA, foram utilizados lOOng de VEGFR-3, VEGFR-2 e VEGFR-1 recombinante (R&D Systems) imobilizados em placas de 96 poços (High Binding Plates, Costar Corning) em 50μ1 de solução PBS a 8°C durante 16 horas. A solução de receptor foi removida e lavagens com 1XPBS 0,05% Tween foram feitas. Um total de 20ng de VEGF-C ou VEGF-A em PBS foram incubados em cada poço por 1 hora e 30 minutos a 37°C. Após lavagens com PBS Tween 0,05%, foi feito bloqueio com solução de bloqueio Odyssey (Licor) a 37°C por l,5h. As lavagens foram repetidas. Anticorpo primário anti-VEGF-C ou anti-VEGF-A (R&D Systems), na diluição de 1:100, em PBS 1% solução de bloqueio odyssey foi incubado por l,5h a 37°C; as mesmas lavagens descritas acima foram repetidas. A seguir anticorpo secundário (IRDye 680LT, da empresa Li-COR Bioscience) 1:400 foi incubado em PBS 1% solução de bloqueio odyssey por lh a 37°C. Após 3 lavagens, a placa foi centrifugada a 1000xg invertida por 5 minutos à temperatura ambiente. Leituras de absorbância foram realizadas no leitor de infravermelho, no comprimento de onda de 700nm (Odyssey LI-COR Bioscience) .

Modelo animal de Retlnopatla Induzida por Oxigénio

Animais

[178] Todos os experimentos com animais foram realizados utilizando-se camundongos da linhagem C57BL/6, fornecidos pelo Biotério de Produção e Experimentação de Animais do Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Os estudos foram aprovados pela Comissão de Ética em Estudos de Animais do Instituto de Química da USP.

Modelo Animal de Retinopatia Induzida por Oxigénio

[179] O modelo animal de Retinopatia Induzida por Oxigénio é um dos mais bem aceitos para estudar a neovascularização patológica na retina (Connor et al . , 2009) . Esse modelo animal foi implantado no laboratório para estudos de angiogênese e da eficácia de peptídeos como compostos com atividade angiogênica.

Animais submetidos à hiperóxia em câmara de oxigénio

[180] Filhotes de camundongos (linhagem C57BL/6) recém- nascidos e suas mães, foram colocados e mantidos em suas gaiolas entre os dias 7 pós-nascimento (P7) e P12 dentro de câmara de oxigénio com níveis de 02 em 75%. Após este período, os camundongos retornaram para sala com ar ambiente (20,8% 02), onde permaneceram até receberem o tratamento de injeções intraoculares de Ιμΐ contendo diferentes peptídeos sintéticos.

Injeções intraoculares em animais P15 que foram para câmara de oxigénio entre P7 e P12

[181] As injeções intraoculares foram feitas com seringa Hamilton (modelo 80300 701N lOul SYR [26s/2"/2] REV L) . Nos animais que receberam tratamento, foi injetado um volume total de Ιμΐ contendo solução de peptídeo (PCAIWF, PSAIWF, IFCAPW ou CARAC) na concentração de 100mg/ml ou 30mg/ml ou veículo (DMSO) .

[182] Em idade P17 os animais são pesados e aqueles com peso abaixo de 6, Og são descartados por serem considerados subdesenvolvidos e apresentarem fenótipos anormais conforme descrito em Connor et al . 2009. Um animal, tratado com peptídeo PSAIWF foi descartado por baixo peso (resultado já computado na tabela) .

[183] As retinas foram coletadas, coradas e analisadas como explicado abaixo.

Preparação de retina inteira com marcação de vasos sanguíneos utilizando isolectina B4

[184] Camundongos são anestesiados com avertina (0,015 ml/ grama de peso) e imediatamente sacrificados por deslocamento cervical. Os olhos são retirados, fixados em 4% PFA por 2 horas a 4°C, lavados com IX PBS, três vezes e mantidos em PBS/azida a 4°C por até 15 dias. Com o auxílio de uma lupa, os olhos mergulhados em PBS, são cirurgicamente abertos e as retinas são cuidadosamente dissecadas. O tecido é incubado em 1% Triton em PBS por 30 minutos e 1% Triton PBS contendo 2C^g/ml de Isolectina B4 conjugado a Alexa594 (Invitrogen) protegido da luz na geladeira até o dia seguinte. As retinas são lavadas em 1% Triton PBS, por 15 minutos, 4 vezes; com PBS, por 15 minutos, 2 vezes e água destilada, 15 minutos, 2 vezes. Utilizando uma microtesoura cirúrgica, quatro cortes simétricos, da borda para o centro, são realizados na retina de forma que o tecido, côncavo antes dos cortes, fique plano e em formato de flor com 4 pétalas. As retinas são tranferidas para lâminas de vidro (Star Frost slides) e montadas com Vectashield sem dapi (Vector Labs) .

Quantificação dos vasos sanguíneos

[185] Imagens das retinas coradas com Isolectina B4- Alexa594 foram obtidas em microscópio de fluorescência (Nikon), objetiva de 4X, utilizando o programa NIS-Elements (tempo de exposição 200ms) . As imagens foram importadas para o programa Adobe Photoshop CS3 e os vasos sanguíneos quantificados conforme descrito em Connor et al, 2009.

Ensaios de internallzação de fagos em células

[186] Células endoteliais (2.105 células por poço) foram plaqueadas em lâminas de 8 poços (Lab-Tek® Chamber Slide) em meio DEM 10% soro fetal bovino (SFB) . O meio das células foi removido e 200ul de solução de bloqueio (DMEM 30% SFB) foi adicionado e incubado a 37 °C, na estufa de células. O meio de bloqueio foi removido após 1 hora e 200ul de solução DMEM 2%SFB com 108 fagos foram incubadas overnight a 37°C.

Bloqueio e incubação dos anticorpos

[187] As células foram lavadas com 10%BSA em PBS, por 5 vezes, à temperatura ambiente, tomando cuidado para não deixar secar. Para soltar os fagos presos à superfície celular, 4 lavagens, de 5 minutos cada com agitação, com tampão de glicina em pH 2,8 foram realizadas. As células foram lavadas 3 vezes com PBS, fixadas em 4% Paraformaldeído (pH 7,0 a 8,0) por 15 minutos, na temperatura ambiente. Após 3 lavagens com PBS, as células foram permeabilizadas com 0,2% Triton X-100, por 5 minutos. As células não permeabilizadas não são tratadas com Triton, e permanecem em PBS. As células foram lavadas com PBS, 5 vezes, cada lavagem de 1 minuto sob agitação. Realizamos o bloqueio com 1% BSA em PBS por 2 horas na temperatura ambiente. Adicionamos anticorpo primário (Anti- bacteriophage [sigma]) 1:500 diluído em 1% BSA em PBS, incubado por 2 horas em temperatura ambiente.

[188] Após cinco lavagens com PBS, cada lavagem de 2 minutos, sob agitação, adicionamos e o anticorpo secundário (Dylight 488 conjugated AffinitiPure F(ab')2 Fragment Donkey anti-rabbit IgG [Jackson ImmunoResearch] ) 1:300 diluído em 1%BSA em PBS. O anticorpo secundário foi incubado por 1 hora na temperatura ambiente, protegido da luz. Após cinco lavagens com PBS, cada lavagem de 1 minuto sob agitação, as células fora fixadas com 4% Paraformaldeído em PBS por 3 minutos, lavadas com PBS, duas vezes, uma vez com água destilada. As lâminas foram montadas utilizando meio de montagem (vectashield) com DAPI para corar núcleo. As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência (Nikon) .

[189] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.