CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um sistema para obtenção de bioprodutos em larga escala, segundo o qual um biorreator é integrado a diferentes processos em que são utilizadas membranas especiais com o objetivo, entre outros, de separar as células microbianas, garantir a esterilização do meio de cultivo, reduzir a formação de espuma, concentrar os produtos de interesse e fornecer oxigénio para as células microbianas. Dentre esses produtos de interesse que podem ser obtidos com o sistema integrado encontram-se os biossurfactantes, biocombustíveis e enzimas para a produção de biocombustíveis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Biossurfactantes são compostos com propriedades tensoativas produzidos por via bioquímica utilizando-se linhagens microbianas, e que são capazes de melhorar a eficiência de remoção de determinados tipos de poluentes, como por exemplo, hidrocarbonetos provenientes do derramamento de petróleo e seus derivados. Estes hidrocarbonetos se agregam a componentes presentes no solo, dificultando sua remoção e causando sérios problemas ambientais.

Na última década esses compostos biossurfactantes tornaram-se alvo de interesse das indústrias devido a permitirem uma variedade de aplicações e possibilidade de produção a baixo custo, dependendo da produtividade da cepa selecionada, da matéria-prima empregada e dos processos de purificação envolvidos.

A maioria dos microorganismos produtores conhecidos necessita de condições aeróbicas para a produção eficiente desses tensoativos. Entretanto, a forma de se introduzir aeração no meio de cultivo, normalmente utilizando-se borbulhamento de oxigénio ou ar, pode levar à formação de grande quantidade de espuma.

A técnica exige, portanto, o uso de controladores de espuma, em geral agentes antiespumantes, os quais contribuem no custo do produto final e na qualidade desse produto.

Outro aspecto a ser considerado diz respeito à facilidade de contaminação dos equipamentos e materiais por microorganismos exógenos, face ao volume de produto a ser tratado quando se trabalha em larga escala. Todos os equipamentos precisam ser esterilizados antes e ao final de cada campanha produtiva, assim como os meios de cultivo que alimentam ao biorreator.

Na maioria das situações a esterilização térmica não pode ser aplicada, pois poderia causar danos aos microorganismos ou provocar a degradação dos insumos. Uma das soluções que vem sendo empregada é o uso de membranas especiais, desenvolvidas para atender diferentes finalidades.

TÉCNICA RELACIONADA

De há muito utilizam-se membranas permeáveis em várias áreas de aplicação. O aperfeiçoamento de tecnologias de separação de produtos adaptadas para emprego na área microbiológica encontra-se em franco desenvolvimento no mundo.

A literatura técnica especializada descreve o uso de membranas separadoras em diversas situações: cultivo e separação de células em processos fermentativos, separação de plasma sanguíneo, separação de enzimas e de proteínas, dentre outras.

No pedido de patente brasileiro PI 0418820 (Probiogen AG) descreve-se um biorreator e um método para cultivo e crescimento de células, em que as células a serem cultivadas estão situadas em membranas de filamento oco e são alternadamente colocadas em contato com uma fase líquida de meio nutriente e com uma fase gasosa, obtendo- se alta densidade de células.

A patente norte-americana US 7129082 (CSIR) ensina um método de cultivo de células vivas usando um biorreator que suporta uma matriz formada de um material de espuma porosa em cujo interior as células vivas são ancoradas; o suporte também contém um líquido carreador de oxigénio que satura os poros da matriz porosa. O líquido é um constituinte sintético ou semi-sintético que permeando a matriz libera oxigénio para as células e absorve dióxido de carbono das células.

O uso de unidades de microfiltração envolvendo membranas de fibras ocas para realizar a esterilização de linhas de processos de obtenção de bioprodutos foi proposto por Carneiro, L. e colaboradores— "Cold sterilization and clarification of pineapple juice by tangential microfiltration" - Desalination 148 (2002) 93-98.

No pedido de patente brasileiro PI 0405952 (Petrobras) descreve-se a obtenção de um biossurfactante e seu uso para a remediação de solos impactados por óleo. O biossurfactante é constituído do meio de cultura isento de células microbianas, resultante do cultivo de uma cepa de Pseudomonas aeruginosa isolada de ambiente de petróleo, produzindo ramnolipídeos por fermentação conduzida sob aeração realizada por difusão de oxigénio por membranas.

No pedido de patente brasileiro PI 0600449 (Polymar) descreve-se um biorreator equipado com extração contínua utilizando membranas semipermeáveis confeccionadas de quitosana, permitindo contornar aspectos técnicos relevantes no que concerne à separação e concentração de produtos resultantes em biotransformações. O processo envolve três etapas: transformação microbiológica, separação por difusão osmótica e extração contínua através de extrator líquido-líquido acoplado ao sistema.

Em um contactor de membrana, a membrana de separação está completamente integrada com a operação de extração ou absorção, de modo a explorar inteiramente os benefícios de ambas as tecnologias. As aplicações que têm sido desenvolvidas podem ser tanto no tratamento de água como de gás. Alguns desenvolvimentos recentes introduzidos na indústria ensinam seu uso desde a remoção seletiva de metais pesados em banhos de processos galvânicos, passando pela recuperação de componentes orgânicos de água em processos da indústria química e também recuperação de amónia de correntes gasosas, evidenciando o amplo escopo de aplicação desses materiais - Klaassen, R. e colaboradores - "Membrane contactor applications" - Desalination 224 (2008) 81- 87.

Um dos problemas que precisa ser contornado em um bioprocesso é a formação de espuma. Quando se utiliza a técnica convencional por borbulhamento de ar ou oxigénio é necessário um controle rigoroso das condições de processo para que não se formem espumas estáveis. Para evitar o uso de agentes antiespumantes, que poderiam descaracterizar o produto e comprometer sua qualidade, o controle mais adequado pode ser feito por meio de um sistema de oxigenação dispersiva com o uso de contactores de membrana (Kronemberger e colaboradores - "Oxygen- controlled biosurfactant production in a bench scale bioreactor" - Applied Biochemistry and Biotechnology 147 (2008) 33-45.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um sistema integrado para obtenção de bioprodutos em larga escala, particularmente biossurfactantes, biocombustíveis e enzimas para a produção de biocombustíveis. O referido sistema utiliza um biorreator integrado a diferentes processos que empregam membranas especiais, as quais atendem, dentre outros objetivos, à separação de células microbianas, à garantia de esterilização do meio de cultivo e dos equipamentos envolvidos no processo, à redução da formação de espuma, ao fornecimento de oxigénio para as células e à concentração dos produtos de interesse.

O sistema para obtenção em larga escala de bioprodutos compreende os seguintes componentes:

- um biorreator (BR) integrado aos demais componentes; - um tanque de preparo (TQ1 ) do meio de cultivo, dotado de agitador mecânico, contendo os nutrientes necessários à manutenção dos microorganismos;

- um primeiro módulo de microfiltração por membranas (MF1 ), para garantir a alimentação do meio de cultivo esterilizado ao biorreator;

- um segundo módulo de microfiltração por membranas (MF2), para separação de células de microorganismo após a fermentação;

- um módulo de oxigenação (OX), do tipo contactor de membranas na forma de fibra-oca;

- um módulo de osmose inversa (Ol) para concentração de produto; dependendo do produto de interesse, pode ser utilizado, conjuntamente ou alternativamente a esse módulo, um módulo de ultrafiltração (UF);

- um tanque de armazenamento de produto (TQ2);

- linhas de fluxo interligando os componentes, todas providas com os meios de controle conectados a uma malha de controle (C) do processo.

Os módulos de microfiltração por membranas (MF1 e MF2) garantem a esterilização do sistema. A malha de controle (C) monitora a formação de espuma assim como as principais condições operacionais no biorreator, tais como pressão, temperatura e pH.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta de forma esquemática o fiuxograma do sistema objeto da presente invenção.

A Figura 2 apresenta esquematicamente o funcionamento do módulo de oxigenação do sistema objeto da invenção.

A Figura 3 apresenta sob a forma de gráfico a produção de biossurfactantes ramnolipídeos, sob regime de batelada simples, de acordo com o sistema da presente invenção. A Figura 4 apresenta sob a forma de gráfico a produção de biossurfactantes ramnolipídeos, sob regime de batelada alimentada, de acordo com o sistema da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para que o sistema integrado para obtenção de bioprodutos possa ser mais bem compreendido e avaliado, sua descrição detalhada será feita com fundamento nas Figuras que acompanham este relatório e dele é parte integrante.

O sistema da presente invenção pode ser operado em regimes distintos, simples ou combinados: batelada simples, batelada alimentada, e contínuo, introduzindo-se pequenas adaptações na condução do processo quando necessário. Em linhas gerais, o sistema compreende um arranjo inédito de seus componentes, conforme mostrados na Figura 1 e descritos a seguir, em seus aspectos principais.

Inicialmente, um meio de cultivo (1 ), contendo os nutrientes necessários à fermentação é preparado com água purificada por meio de microfiltração por membranas ou por osmose inversa antes de ser introduzida em um tanque de preparo (TQ1 ) dotado com agitador mecânico; só então o agitador mecânico é acionado. A seguir, este meio de cultivo é transferido para um biorreator (BR), por meio de uma bomba de transferência (não mostrada na figura), passando por um primeiro módulo de microfiltração por membranas (MF1 ) para ser esterilizado.

O biorreator (BR) também é dotado com agitador mecânico e possui uma camisa externa do tipo parede dupla, para a passagem de fluido térmico. Esse fluido térmico permite que a temperatura seja mantida constante durante o processo fermentativo, e também pode ser usado para esterilizar termicamente o biorreator, sem necessidade de injeção direta de vapor.

Uma quantidade de inoculo (2) é alimentada ao biorreator (BR), o qual opera sob pressão de até 2 kgf/cm ² e cujo controle é realizado por meio de malha de controle (C), atuando sobre duas válvulas de controle (não mostradas), em regime de "split-range" de adição e retirada de ar. A malha de controle (C) atua igualmente em instrumentos específicos, como por exemplo, analisadores de pH e de oxigénio dissolvido, transmissores de temperatura, de pressão, de nível de meio de cultivo e de nível de espuma, instalados nas linhas de fluxo que fazem parte do sistema; tais instrumentos servem para monitorar e controlar as condições reacionais. A corrente de saída (3) do biorreator é conduzida para um segundo módulo de microfiltração (MF2), ou para um módulo de oxigenação (OX). Depois de ser filtrada, a corrente de concentrado (5), rica em células de microorganismos, é realimentada ao biorreator (BR). Uma parte da corrente de permeado (4) isenta de células, deixa o segundo módulo de microfiltração (MF2), é conduzida ao módulo de oxigenação (OX) e posteriormente retorna ao biorreator (BR) como meio reacional (6). Outra parte (7) dessa corrente de permeado (4) segue para um tanque de armazenamento de produto (TQ2).

A microfiltração do meio reacional por membranas é de fundamental importância para o sistema, assim como a concentração das células de microorganismos por microfiltração e a concentração do produto por ultrafiltração ou osmose inversa, uma vez que constitui a garantia da esterilidade do produto, além de possibilitar diferentes configurações operacionais, como o processamento contínuo sem o descarregamento do biorreator ou ainda a operação com células em diferentes estágios metabólicos. Para garantir o bom desempenho dos módulos de microfiltração (MF1 e MF2), é previsto um sistema de retrolavagem, o qual é acionado periodicamente com o objetivo de evitar o entupimento das membranas.

O módulo de oxigenação (OX), do tipo contactor de membranas na forma de fibra-oca, promove a oxigenação da corrente do meio reacional (6). As duas correntes [líquida (L) e gasosa (G)] não entram em contato diretamente. Esta técnica constitui um processo não dispersivo de oxigenação, uma vez que a corrente líquida (L) é forçada a circular pelo casco do módulo de oxigenação, estando em contato apenas com a parte externa da fibra-oca, enquanto a corrente gasosa (G), selecionada entre ar comprimido, ar comprimido enriquecido com oxigénio e oxigénio puro, escoa pelo interior da fibra. A Figura 2 ilustra de forma simplificada este esquema de oxigenação.

Em função do tipo de cultivo em uso e da demanda por oxigénio exigida pelo microorganismo, diferentes tipos de membrana podem ser utilizados. Também pode ser necessário o uso combinado desse módulo de oxigenação (OX) com técnicas convencionais de oxigenação, como por exemplo, borbulhamento de ar comprimido ou oxigénio, como é o caso quando se utilizam linhagens de leveduras do género Pichia, que possuem elevada demanda por oxigénio.

Membranas microporosas hidrofóbicas também podem ser utilizadas como contactores, desde que o meio de cultivo apresente valores de tensão superficial próximos aos da água pura em todo o processo. Pode- se igualmente utilizar membranas compostas, de suporte microporoso recoberto com uma fina camada de material denso, como silicone ou teflon. Contudo, na maioria dos casos é aconselhável o uso de membrana de fibra do tipo densa constituída de silicone. Toda a área de contato entre as fases líquida (L) e gasosa (G) é fixa e definida pela área de membrana disponível. A oxigenação fornecida ao sistema é controlada por meio da pressão do ar fornecido e da vazão de purga.

É comum o produto de interesse encontrar-se a uma concentração inferior àquela desejada ao final da reação. Neste caso, uma parte (8) da corrente de produto (9) deixa o tanque de armazenamento de produto (TQ2), sendo conduzida a um módulo de osmose inversa (Ol) ou de ultrafiltração (UF), para concentração, onde partículas de pequenas dimensões, da ordem de poucas dezenas de Angstroms (no caso da Ol), podendo chegar a algumas centenas de Angstroms (no caso da UF), são retidas. Uma válvula reguladora de pressão, instalada a jusante do módulo (não mostrada na Figura 1), garante um diferencial de pressão entre a corrente concentrada de produto (10) e a corrente de permeado (11 ), que deve estar compreendido numa faixa entre 15 kgf/cm ² e 25 kgf/cm ² , preferencialmente em 20 kgf/cm ² .

A temperatura do concentrado é mantida por meio de um trocador de calor, de forma a não afetar a estabilidade do produto. A corrente concentrada de produto (10) é conduzida ao tanque de armazenamento de produto (TQ2). A corrente de permeado (11) é constituída basicamente de água, a qual poderá ser reutilizada no tanque de preparo (TQ1) para a composição do meio de cultivo, juntamente com a corrente de alimentação de matéria prima (12), formando a corrente (13) que será alimentada ao primeiro módulo de microfiltração (MF1 ) para esterilização, a qual é fornecida ao biorreator como meio de cultivo (1 ).

Como mencionado anteriormente, o sistema da invenção pode operar de forma contínua, em batelada simples, e em batelada alimentada. Por consequência, as válvulas de transferência de produto são controladas e acionadas adequadamente em função do "modus operandi" do processo.

Alternativamente, dependendo do produto de interesse, o módulo de osmose inversa poderá ser substituído por um equipamento mais adequado à situação, como módulos de ultrafiltração ou nanofiltração, mais compatível com as dimensões das moléculas a serem tratadas, garantindo a estabilidade e a qualidade do produto final, possibilitando também o reciclo do substrato não consumido ao início do processo.

As vantagens obtidas com a integração de processos biotecnológicos tornam-se claras para os especialistas na matéria, especialmente quando se objetiva ampliar a produção de um determinado bioproduto. Entre tais vantagens, merecem destaque a garantia de qualidade e a padronização do produto, a possibilidade de utilizar diversos tipos de matéria-prima, a possibilidade de empregar diversos modos de condução do processo, a obtenção de produtos mais puros e concentrados, o maior controle na geração de espuma, o menor gasto energético para a esterilização dos insumos, facilitando sua conservação e armazenamento, e a concentração integrada do produto, permitindo reuso de nutrientes não consumidos, bem como de água no processo.

O sistema acima descrito mostra-se particularmente interessante para a obtenção de biossurfactantes em larga escala. Esses produtos são empregados para diversas aplicações, podendo ser citadas entre outras a limpeza de solos impactados com petróleo e seus derivados, a recuperação avançada de petróleo, devido à redução dos impactos ambientais e substituição dos surfactantes sintetizados quimicamente, os quais são largamente utilizados na atualidade.

Por proporcionar elevada taxa de oxigenação para as células, o sistema também se mostra interessante para o cultivo e a produção de bioprodutos por leveduras do género Pichia, particularmente Pichia pastoris, em especial linhagens modificadas geneticamente, devido ao fato de tais células comumente demandarem altos níveis de oxigenação para alcançar alta densidade celular e produzir bioprodutos em maiores taxas.

Os bioprodutos são obtidos por processo bioquímico, que utiliza microorganismos condicionados para esse fim, dentre os quais bactérias do género Pseudomonas, as quais consomem um substrato e produzem biossurfactantes do tipo ramnolipídeo. O processo é estritamente aeróbico, de modo que o uso de oxigenação convencional por borbulhamento leva à formação de espumas muito estáveis. O emprego de oxigenação por dispersão do ar (ou oxigénio) na fase líquida, possibilita a obtenção do bioproduto em larga escala, visto que permite alcançar de forma mais económica o total controle da formação de espuma.

EXEMPLOS

O sistema integrado objeto da presente invenção será ilustrado a seguir, utilizando-se glicerol como fonte de carbono fornecida aos microorganismos para obtenção de biossurfactantes ramnolipídeos em larga escala.

Os experimentos foram conduzidos em um biorreator dotado com agitador mecânico trabalhando a uma pressão de 2 kgf/cm ² a 30°C. No entanto, o sistema poderá ser ampliado em escala sem perder suas características, podendo operar em faixas de temperatura entre 15°C e 60°C, sob regime contínuo, de batelada simples e de batelada alimentada. De acordo com um procedimento padrão adotado, os experimentos foram conduzidos sob regime de batelada em um biorreator dotado com agitador mecânico, com capacidade para 3,0 litros de meio de cultivo, empregando- se oxigenação não dispersiva e contactores de membranas densas de silicone na forma de fibras ocas. A área de contato entre as fases líquida e gasosa é definida pela área de membrana disponível, neste caso igual a 32 m ² . Foram utilizados na etapa de microfiltração quatro módulos de microfiltração para separação de células com membranas de fibra oca operando em paralelo, totalizando 100 m ² de área. Esses módulos são alimentados por bomba de circulação com vazão nominal de 7 m ³ /h provida com variador de frequência operando junto com a malha de controle de pressão na descarga. A perda de carga nesses módulos é de cerca de 0,6 kgf/cm ² . O diferencial de pressão entre o módulo e o permeado está compreendida na faixa entre 0,8 kgf/cm ² e 1 ,2 kgf/cm ² , preferencialmente em 1 kgf/cm ² , com uma perda de carga da ordem de 0,1 kgf/cm ² , o controle sendo feito por meio da malha de controle que atua sobre a válvula de descarga de concentrado. A recuperação de permeado foi de 80%. O sistema de retrolavagem foi acionado periodicamente para evitar o entupimento das membranas.

Exemplo 1

O biorreator contendo meio de cultivo para Pseudomonas aeruginosa PA1 foi mantido sob agitação de 150 rpm e temperatura de 30°C, em regime de batelada simples, acompanhando-se em gráfico o consumo de matéria-prima (glicerol) e a produção de ramnolipídeos ao longo do tempo. O gráfico resultante é apresentado na Figura 3.

Foram produzidos 36,6 mg/L.h de ramnolipídeos após 7 dias de produção com uma taxa de consumo de 119 mg/L.h de glicerol, resultando em concentração de produto próxima a 7,0 g/L na saída do biorreator, antes da concentração por osmose inversa.

Exemplo 2

O experimento foi conduzido sob regime de batelada alimentada em um biorreator dotado com agitador mecânico, com capacidade para 3,0 litros de meio de cultivo, empregando-se oxigenação não dispersiva e contactores de membranas densas de silicone na forma de fibras ocas. O biorreator contendo meio de cultivo por Pseudomonas aeruginosa PA1 foi mantido sob agitação de 150 rpm e temperatura de 30°C, sob condição de fermentação de longa duração com adição extra de glicerol e nitrato de sódio, acompanhando-se em gráfico o consumo de matéria-prima (glicerol) e a produção de ramnolipídeos ao longo do tempo. O gráfico resultante é apresentado na Figura 4.

Os experimentos apontaram um consumo máximo de 150 mg/L.h de glicerol e 200 mg/L.h de oxigénio, gerando 44,3 mg/L.h de ramnolipídeos, resultando em concentração de produto igual a 16,9 g/L na saída do biorreator, antes da concentração por osmose inversa, após 16 dias de produção.

Como se pode depreender, o sistema integrado aqui proposto permite contornar problemas comumente encontrados em processos biotecnológicos, tal como a formação excessiva de espuma. Por integrar diferentes tipos de processamento, as células microbianas podem ser concomitantemente microfiltradas e retornar ao biorreator, o que permite a obtenção de elevadas concentrações de produto, assim como a subsequente concentração da corrente de produto em módulos de osmose inversa ou de ultrafiltração, dependendo do produto de interesse. Por outro lado, nutrientes não consumidos podem ser reciclados ao biorreator, contribuindo para a viabilidade económica dos processos.

Visando ilustrar o conceito inventivo, o sistema foi descrito preferencialmente com relação à produção de biosurfactantes. Todavia, ele pode ser configurado para outras aplicações, tais como para a produção e concentração de correntes contendo enzimas, as quais podem ser obtidas utilizando-se diferentes microorganismos, como, por exemplo, lipases de Pichia sp. e de outras linhagens (Cândida sp., Rhizopus sp., Geotrichum sp., Penicillium sp., Aspergillus sp.) além de outras hidrolases, como celulases, xilanases, amilases, de Penicillium sp., Aspergillus sp. e Trichoderma sp., com o objetivo de uso na produção de biocombustíveis, como por exemplo, biodiesel, bioetanol e outros produtos químicos de interesse.