CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención pertenece al campo de las formulaciones farmacéuticas como alternativas para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde a una composición farmacéutica tópica que comprende al menos dos agentes farmacéuticos seleccionados del grupo que consiste de: isetionato de pentamidina, ketoconazol y miltefosina; un agente potenciador de permeabilidad cutánea y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición es útil para tratamiento de lesiones de la piel ocasionadas por leishmaniasis.

ESTADO DEL ARTE

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria que constituye un grave problema de salud pública en muchos países tropicales y subtropicales, y afecta a millones de personas que viven principalmente en las zonas rurales pobres. Es causada por diferentes especies y subespecies del género Leishmania, y se transmite a los humanos por medio de un vector flebótomo perteneciente al género Phlebotumus . Clínicamente la enfermedad se puede presentar en tres formas: cutánea, mucocutánea o visceral. Se estima que la prevalencia global es de 12 millones de casos y la incidencia de todas las formas clínicas se aproxima a 2 millones de casos nuevos anualmente (1,5 millones para leishmaniasis cutánea y 500 mil para leishmaniasis visceral) (Mitropoulos, P., Konidas, P., y Durkin- Konidas, M. (2010). New World cutaneous leishmaniasis: updated review of current and future diagnosis and treatment. Journal of the American Academy of Dermatology, 63(2), 309-322). La leishmaniasis cutánea (LC) por lo general es causada principalmente por L. major y L. trópica, L. aethiopica en el Viejo Mundo y L. (Viannia) braziliensis , L. (V) panamensis, L. (V. ) peruviana, L. (L.) amazonensis, L. (V. ) guyaneses y L. (L.) mexicana en el Nuevo Mundo. Los pacientes infectados desarrollan típicamente lesiones ulcerosas leves a graves, limitados a una sola o a varias partes de la piel, que resulta en desfiguración severa, discapacidad y estigma psicológico y social. La leishmaniasis mucocutánea (también conocida como espundia, uta) se caracteriza por presentar destrucción parcial o completa de las membranas mucosas de la nariz, garganta, boca y garganta. La mayoría de casos se presentan en Brasil, Bolivia y el Perú.

Durante muchos años y en la actualidad, el tratamiento de la leishmaniasis se ha basado en el uso de fármacos antimoniales pentavalentes (Sb ^v ) tales como Glucantime® y Pentostan®, y sus formas genéricas. También se ha introducido como terapia de segunda línea la anfotericina B (AmB), isetionato de. pentamidina (PMD), miltefosina (MIL) y sulfato de paromomicina (PM). Desafortunadamente, los tratamientos actuales contra esta enfermedad parasitaria tienen una serie de limitaciones graves, tales como la vía de administración parenteral, su eficacia variable, efectos secundarios tóxicos, largo curso de tratamiento, costo elevado y la pérdida de eficacia debido a la resistencia que han adquirido los parásitos frente algunos de los medicamentos.

Las especies de Leishmania pueden influir en el resultado del tratamiento en pacientes con leishmaniasis. Esto ha sido demostrado con diferentes fármacos [especialmente con Sb ^v , MIL y ketoconazol (KTZ)] en diferentes regiones endémicas. Por ejemplo, con respecto a la MIL, pacientes infectados con L. (V.) panamensis en Colombia (90%) respondieron mejor al tratamiento que pacientes infectados con L. (V.) braziliensis (33%) o L. (L.) mexicana de Guatemala.

La LC es la forma más común de leishmaniasis causante de lesiones nodulares y/o ulcerativas y de cicatrices en piel. El tratamiento actual en LC incluye los Sb ^v utilizado parenteralmente (intravenoso o intramuscular), y en caso de contraindicaciones o fallas terapéuticas se utiliza la AmB, MIL, PM y PMD. Estas opciones terapéuticas están asociadas con significante toxicidad y efectos adversos.

Es por eso que la combinación de dos fármacos que actúen sinérgica o aditivamente en una formulación tópica podría ser una estrategia alternativa para el tratamiento de la LC. Por ejemplo, US5230897A divulga composiciones farmacéuticas para liberación transdérmica (parches) que comprenden PMD o sus sales (entre el 5% y 30% p/p), un terpeno como agente potenciador de la penetración y un vehículo aceptable.

También en [Karin Seifert, Jane Munday, Tahmina Syeda, Simón L. Croft; In vitro interactions between sitamaquine and amphotericin B, sodium stibogluconate, miltefosine, paromomycin and pentamidine against Leishmania donovani. J Antimicrob Chemother 201 1 ; 66 (4): 850-854] se encontró efecto sinérgico en la combinación de sitamaquine/PMD, obteniendo un resultado promedio de∑FIC de 0,5 a 0,6 al nivel de la concentración inhibitoria (IC)so en amastigotes intracelulares de L. donovani in vitro.

Sin embargo, no se encuentra en el estado del arte resultados de combinación sinérgica o aditiva para dos agentes farmacéuticos seleccionados del grupo que consiste de: PMD, KTZ y MIL para el tratamiento de lesiones de la piel ocasionadas por una enfermedad cutánea como la leishmaniasis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención divulga una formulación farmacéutica tópica que comprende una cantidad efectiva de al menos dos agentes activos seleccionados de: PMD, KTZ y MIL, junto con un potenciador de permeación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Donde el término "cantidad efectiva" significa cualquier cantidad que, en comparación con un sujeto correspondiente que no ha recibido tal cantidad, produce una mejora en el tratamiento, curación, prevención, disminución de la gravedad o mejora de lesiones causadas por la leishmaniasis. La formulación de la presente invención es estable y tiene actividad wíi-Leishmanía.

Los agentes activos de la presente invención son PMD, KTZ y MIL. En una modalidad los agentes activos de la presente invención son dos y se seleccionan del grupo que consiste de PMD, KTZ y MIL. En una modalidad los agentes activos de la presente invención son PMD y KTZ. En una modalidad los agentes activos de la presente invención son KTZ y MIL. En una modalidad los agentes activos de la presente invención son PMD y MIL.

La cantidad efectiva es el ingrediente activo requerido para un efecto terapéutico en la administración tópica, naturalmente variará con el compuesto elegido, la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar y el mamífero que recibe tratamiento. Para administración tópica, el PMD está entre 0,01 y 10,0 %p/p, en una modalidad el PMD no excede el 5 %p/p. En otra modalidad el PMD está entre 0,5 y 4,0 %p/p. En otra modalidad el PMD está entre 0,5 y 0,75 %p/p. En otra modalidad el PMD está entre 1,25 y 2,0 %p/p. En otra modalidad el PMD está entre 3,0 y 4,0 %p/p. En otra modalidad el PMD está entre 0,5 y 1,5 %p/p de la formulación. En la formulación farmacéutica tópica de la presente invención, la concentración de KTZ está entre 0,01 y 15,0 % p/p en la formulación farmacéutica, en una modalidad el KTZ no excede el 10,0 %p/p. En una modalidad el KTZ está entre 2,0 y 3,0 %p/p de la formulación farmacéutica. En una modalidad el KTZ está entre 4,0 y 6,0 %p/p de la formulación farmacéutica. En una modalidad el KTZ está entre 2,0 y 10,0 %p/p de la formulación farmacéutica. En una modalidad el KTZ está entre 5,0 y 10,0 %p/p de la formulación de la formulación farmacéutica.

En la formulación farmacéutica tópica de la presente invención, la concentración de MIL está entre 0,01 y 5,0 %p/p de la formulación farmacéutica, en una modalidad la MIL no excede el 3,0 %p/p. En una modalidad la MIL está entre 0,2 y 0,5 %p/p de la formulación farmacéutica. En una modalidad la MIL está entre 0,01 y 0,25 %p/p de la formulación farmacéutica. En una modalidad la MIL está entre 0,25 y 0,5 %p/p de la formulación farmacéutica.

En la formulación farmacéutica tópica de la presente invención el potenciador de permeación se encuentra entre 0, 1 y 30,0 %p/p, en una modalidad el potenciador de permeación no excede el 25,0 %p/p. En una modalidad el potenciador de permeación se encuentra entre 1,0 y 20,0 %p/p. En otra modalidad el potenciador de permeación se encuentra entre 1,0 y 3,0 %p/p. En otra modalidad el potenciador de permeación se encuentra entre 13,0 y 17,0 %p/p.

El potenciador de permeación mejora las características fisicoquímicas de la formulación como el color, extensibilidad y estabilidad. El potenciador de permeación referido en la formulación farmacéutica tópica de la presente invención se selecciona del grupo que incluye: trans- -cariofileno, dimetil sulfoxido (DMSO)/propilenglicol, Tween 80/Kollifor, Tween 20, alcohol, Spam 80 (y otros surfactantes no iónicos), sulfóxido de dimetilo, monooleato de glicerilo, glicofurol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, lanolina, aceite mineral ligero, ácido linoleico, mentol, ácido mirístico, alcohol miristílico, ácido oleico, alcohol oleílico, ácido palmítico, polioxietilen alquil éteres, polioxilglicéridos, pirrolidona, laurilsulfato de sodio, timol, tricaprilina, trioleina, citrato de acetiltributilo, dimetilsulfóxido, etileno vinil acetato, gliceril monooleato, isopropil miristato, polimetacrilatos, alcohol polivinílico, aceite de sésamo, carboximetil guar de sodio, alcohol estearílico, dimetilacetamida, acetato de etilo, hidroxipropil betadex, hipromelosa, alcohol isopropílico, ácido láurico, policarbófilo, polioxietileno alquilóteres, alcohol estearílico, tricaprilina, trioleina, terpenos e isoprenoides, sesquiterpenos y mezclas y combinaciones de los mismos. O algún potenciador de permeación conocido por una persona medianamente versada.

La formulación farmacéutica tópica incluye preparaciones líquidas, semi-líquidas o semi- sólidas. La presente invención se presenta en una forma de administración que puede ser soluciones acuosas, soluciones acuosas o viscosas de otro tipo, soluciones no acuosas, emulsiones, microemulsiones, nanoemulsiones (NE), suspensiones o sólidos dispersos en líquidos.

Las formas farmacéuticas de la presente invención se seleccionan del grupo que comprende: gel, loción, magma y leche, mezcla, suspensión, linimentos y suspensiones de liberación sostenida. En una modalidad la forma farmacéutica es un sistema bifásico o de una sola fase. En otra modalidad la forma farmacéutica de la presente invención se selecciona de humectante, pomada, suspensión, emulsión, nanoemulsión, champú, loción, solución, tintura, aerosol, polvo, crema, nanoemulsión en crema, gel, organogel, nanoemulgel, ungüento, aposito fijo, pasta, pulverización, aceite, vendaje oclusivo, aposito semi oclusivo, alginato, hidrocoloide o espuma. Las formas farmacéuticas se preparan siguiendo las técnicas convencionales de un técnico farmacéutico o métodos conocidos por una persona medianamente versada en la materia.

Para efectos de la presente invención se entiende por gel a sistemas semisólidos de suspensiones preparadas con pequeñas partículas inorgánicas o con grandes moléculas orgánicas interpenetradas por un líquido. Cuando la masa gelificada consiste en una red de pequeñas partículas individuales el gel se clasifica como un sistema bifásico. En el sistema bifásico, si el tamaño de las partículas de la fase dispersa es relativamente grande, a veces a la masa gelificada se la denomina magma. Los geles y los magmas pueden ser tixotrópicos porque forman semisólidos en reposo y se tornan líquidos al agitar. Los geles de una sola fase consisten en macromoléculas orgánicas distribuidas con uniformidad por todo el líquido de modo que no hay límites aparentes entre las macromoléculas dispersadas y el líquido. Los geles monofásicos pueden consistir en macromoléculas sintéticas o en gomas naturales. Estos últimos preparados también se denominan mucílagos. Aunque estos geles suelen ser acuosos, pueden usarse alcohol y aceites como fase continua. Se encuentra además los organogeles que para efectos de la presente invención es una clase de gel que está compuesta por una fase líquida orgánica (o disolvente orgánico) en una red tridimensional de cadenas flexibles por otro lado los hidrogeles son una red de cadenas de polímero hidrófilo, en forma coloidal, en la que el agua es el medio de dispersión. Los geles, organogeles e hidrogeles se pueden dar en dos fases. Se entiende por nanogel a geles con diámetros medios de gota entre 50 y lOOOnm, usualmente entre 100 y 500nm. Para efectos de la presente invención se entiende por emulsión a un sistema bifásico en que un líquido está disperso como pequeñas gotas en otro líquido. El líquido dispersado se conoce como fase interna o discontinua, en tanque que el medio dispersante se conoce como fase externa o continua. Cuando el aceite es la fase dispersa y la solución acuosa es la fase continua, el sistema es una emulsión de aceite en agua (Ac/Ag) y se puede diluir con facilidad y uniformidad agregando agua. Por el contrario, si la fase dispersa es agua o una solución acuosa y el aceite o un material oleaginoso es la fase continua, el sistema es una emulsión de agua en aceite (Ag/Ac). Se entiende por microemulsión a un sistema monofásico y por tanto estable desde el punto de vista termodinámico, cuyo tamaño de gota menor de 100 nm, están formadas por aceite y agua estabilizadas por un compuesto anfifílico. Se entiende por NE a emulsiones con diámetros medios de gotícula entre 50 y 500nm.

Se entiende por suspensión a preparados de fármacos no disueltos finamente divididas, dispersas en vehículos líquidos. Los polvos para suspensión son preparados de fármacos finamente pulverizadas destinados a suspender en vehículos líquidos. Se entiende por crema a un preparado semisólido de aceite y agua que pueden ser aceite en agua (O/W) compuestas de pequeñas gotas de aceite dispersas en una fase continua, y agua en aceite (W/O) compuestas de pequeñas gotas de agua dispersas en una fase continua oleosa.

Se entiende por NE a sistemas coloidales, transparentes, constituidos por dos fases líquidas no miscibles [agua (W), aceite (O)]) y moléculas anfifílicas, termodinámicamente inestables, utilizando métodos de alta y baja energía en su preparación. Tienen una elevada estabilidad cinética (o una cinética de desestabilización lenta, en meses) con gotículas dispersas con tamaños menores que 300 nm. Se entiende por NE en crema, a las NE dispersas una crema base que contienen o no los fármacos estudiados.

Se entiende por vehículo farmacéuticamente aceptable a agentes emulsificantes, agentes suspensores, saporíferos, colorantes, agentes tensioactivos, diluyentes, conservadores, reguladores de pH, espesante, preservantes, lubricantes, agentes para acelerar el secado, agentes para enfriar la piel, humectantes, desinfectantes, agentes antiespumantes y solventes. Donde los lubricantes se seleccionan de Carbopol 940, benzoato de sodio, agua, propilenglicol, trietanolamina, pluronic F-127, aceite de castor, fosfolipon P90, fosfatidilcolina, aceite de cañóla, hidroxietilcelulosa, ácido láurico, leucina, aceite mineral, octildodecanol, poloxámeros, alcohol polivinílico, hialuronato sódico, talco, tricaprilina. Donde los preservantes se seleccionan de alcohol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, ácido bórico, bronopol, hidroxianisol butilado, butilenglicol, butilparabeno, acetato de calcio, cloruro de calcio, lactato de calcio, dióxido de carbono, catiónico y bentonita, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, monohidrato de ácido cítrico, cresol, éter dimetílico, etilparabeno, glicerina, hexetidina, Imidurea, inactivación por trisilicato de magnesio, alcohol isopropílico, ácido láctico, metilparabeno, monotioglicerol, parabenos, longitud de la cadena alquílica, ácido pentético, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, acetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, benzoato de potasio, metabisulfito de potasio, sorbato de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, propilenglicol, propilparabeno sódico, acetato sódico, benzoato de sodio, borato sódico, lactato sódico, metabisulfito sódico, propionato sódico, sulfito sódico, ácido sórbico, sulfobutiloéter-ciclodextrina, dióxido de azufre, ácido edetico, timerosal, xilitol. Donde los humectantes se seleccionan de alginato de amonio, butilenglicol, ciclometicona, glicerina, polidextrosa, propilenglicol, hialuronato sódico, lactato sódico, sorbitol, tagatosa, trehalosa, triacetina, trietanolamina, xilitol. Donde los desinfectantes se seleccionan de alcohol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol isopropílico, fenol, fenoxietanol, ácido fosfórico, metabisulfito de potasio, povidona-yodo, propilenglicol, borato de sodio, hidróxido sódico, timol. Donde los agentes antiespumantes se seleccionan de dimeticona, alcohol oleílico, polipropilenglicol, simeticona. Donde los disolventes se seleccionan de albúmina, alcohol, aceite de almendra, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, butilenglicol, dióxido de carbono, aceite de ricino, aceite de maíz (maíz), aceite de semilla de algodón, ftalato de dibutilo, ftalato de dietilo, dimetiléter, dimetilftalato, dimetil sulfóxido, dimetilacetamida, acetato de etilo , lactato de etilo, oleato de etilo, glicerina, glicofurol, alcohol isopropílico, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral ligero, triglicéridos de cadena media, lactato de metilo, aceite mineral, monoetanolamina, octildodecanol, aceite de oliva, aceite de cacahuete, polietilenglicol, polioxil, aceite de ricino, carbonato de propileno, propilenglicol, pirrolidona, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol, triacetina, tricaprilina, trietanolamina, citrato de trietilo, trioleina, agua, o mezclas de loa mismos. El vehículo farmacéuticamente aceptable se encuentra por encima del 20,0%p/p de la formulación. En una modalidad el vehículo farmacéuticamente aceptable se encuentra entre el 60,0% p/p y el 80,0%p/p. En otra modalidad el vehículo farmacéuticamente aceptable se encuentra entre el 35,0% p/p y el 50,0% p/p. En otra modalidad el vehículo farmacéuticamente aceptable se encuentra entre el 60,0% p/p y el 75,0% p/p. Las cremas, pomadas o pastas de la presente invención se pueden preparar mezclando los agentes activos finamente divididos o pulverizados, solos o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con ayuda de una maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como, parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas, cera, jabón metálico; mucílago; aceite de origen natural tal como aceite de almendras, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de ricino o aceite de oliva; lanolina o sus derivados, o ácido graso tal como ácido esteárico o ácido oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol. La formulación puede incorporar algún agente tensioactivo adecuado tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tales como ésteres o derivados de polioxietileno de los mismos. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílicas salicáceos, y otros ingredientes tales como lanolina.

Adicional a los fármacos, las formulaciones pueden cargar sustancias coadyuvadoras y/e inmunoactivadoras derivadas de plantas tales como terpenos, compuestos oxigenados como fenoles, alcoholes, aldehidos, cetonas, lactonas, cumarinas, flavonoides y otros. Los extractos de plantas son de gran interés en la industria farmacéutica, sanitaria, cosmética, alimenticia y agrícola por sus propiedades como bactericida, virucida, fungicida, antiparasitaria, insecticida, analgésica, sedante, antiinflamatorio, antiespasmódico y anestésico local por lo que pueden estar incluidos. Entre las características fisicoquímicas de la formulación farmacéutica de la presente invención se encuentran características organolépticas como el color que incluye blanco, traslúcido, blanco hueso, rosado, salmón y rosa pálido, pH entre 5,0 y 7,0, y estabilidad por 30 días a diferentes temperaturas de almacenamiento. La formulación presenta cualidades estables lo que significa que no produce cambios en la fase, cambios de color y el pH se mantiene en el tiempo.

Las NE utilizadas en la presente invención (NE sin la crema) fueron preparadas utilizando métodos de baja energía preferiblemente presentando un tamaño inferior a 500nm. En una modalidad la NE tiene un tamaño entre 40nm y 300nm. En otra modalidad, la NE tiene un tamaño entre 50nm y 270nm. Particularmente el índice de polidispersión (PDI) es inferior a 0,3. En otra modalidad, la NE tiene un PDI entre 0.05 y 0.3. En otra modalidad, la NE tiene un PDI entre 0,11 y 0,27. Particularmente, la formulación farmacéutica tópica de la presente invención puede ser usada para el tratamiento de enfermedades causadas por especies del protozoo flagelado Leishmania, que puede ser presentada como LC, leishmaniasis mucosa, leishmaniasis mucocutánea, leishmaniasis diseminada, leishmaniasis recidivans y leishmaniasis dérmica postkala-azar u otras en donde se encuentre involucrada la piel. Entre las especies de Leishmania donde puede ser usada la formulación farmacéutica tópica de la presente invención se encuentra asociada a especies de los subgéneros Leishmania y Viannia como Leishmania major, Leishmania trópica, Leishmania aethiopica, L. (L.) mexicana, L. (V.) braziliensis, L. (V. ) panamensis, L. (V. ) guyanensis, L. (V.) peruviana, L. (L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. infantum. En general estas formulaciones podrían utilizarse en otras enfermedades infecciosas, inmunológicas, tumorales (o con metástasis a piel) que afecten la piel u otra forma clínica de la enfermedad que afecten la piel o mucosas tales como leishmaniasis mucosa, leishmaniasis mucocutánea, leishmaniasis diseminada, leishmaniasis recidivans y leishmaniasis dérmica postkala-azar. La presente invención también comprende un método de tratamiento para tratar una enfermedad de la piel que comprende aplicar una cantidad efectiva de la formulación farmacéutica tópica que comprende al menos dos agentes activos seleccionados de: PMD, KTZ y MIL, junto con un potenciador de permeación y un vehículo farmacéuticamente aceptable sobre la superficie afectada. Los siguientes Ejemplos se deben considerar meramente ilustrativos y no como una limitación del alcance de la presente invención. EJEMPLOS

Ejemplo 1. Para las formulaciones tipo gel se utilizaron los siguientes componentes y proporciones:

Tabla 1 Gel 1 KTZ:PMD

Ejemplo 2. Para las formulaciones tipo organogel se utilizaron los siguientes componentes y proporciones: Tabla 3 Organogel 2 KTZ:PMD

Componente p/p (%)

Componentes Fase 1 Pluronic F-127 18-20%

Agua c.s.p

DMSO/Propilenglicol 10,0-20,0

trans- -Cariofileno 1,0-3,0

Pentamidina 1,4-2,0

Componentes Fase 2

Aceite de castor 5,0-10,0

Fosfolipon P90 1,0-3,0

Ketoconazol 4,0-6,0

Tabla 4 Organogel 2 KTZ:MIL

Componente p/p (%)

Componentes Fase 1

Pluronic F-127 18-20%

Agua c.s.p

DMSO/Propilenglicol 10,0-20,0

trans- -Cariofileno 1,0-3,0

Miltefosina 0,25-0,5

Componentes Fase 2

Aceite de castor 5,0-10,0

Fosfolipon P90 1,0-3,0

Ketoconazol 4,0-6,0

Ejemplo 3. Para las formulaciones tipo crema se utilizaron los siguientes componentes y proporciones:

Tabla 5 Crema 1 KTZ:PMD

Componente p/p(%)

Acido esteárico 4,0-5,0

Cutina 1,0-1,5

Trietanol amina (TEA) 0,5-1,0

Glicerina 15,0-18,0 Benzoato de sodio 0,20

trans- -Cariofileno 1,0-3,0

Acido oleico 1,5-2,0

Acido láctico 0,3-0,5

Agua c.s.p

Ketoconazol 5,0-10,0

Pentamidina 3,0-4,0

Tabla 6 Crema 1 KTZ:MIL

Componente p/p(%)

Acido esteárico 4,0-5,0

Cutina 1,0-1,5

Trietanol amina (TEA) 0,5-1,0

Glicerina 15,0-18,0

Benzoato de sodio 0,20

trans- -Cariofileno 1,0-3,0

Acido oleico 1,5-2,0

Acido láctico 0,3-0,5

Agua c.s.p

Ketoconazol 4,0-6,0

Miltefosina 0,25-0,5

Ejemplo 4. Para las formulaciones tipo nanoemulsiones en crema se utilizaronientes componentes y proporciones:

Tabla 7 Nanoemulsión 1 KTZ:PMD

Componente p/p(%)

Tween 80/Kollifor 14,0-16,0

Propilen glicol 14,0-16,0

Acido oleico 14,0-16,0

Agua c.s.p

Ketoconazol 2,0-3,0 Pentamidina 0,5-1,5

Después de preparada las NE se agregan a una crema base preparada anteriormente (Tabla 4)

Tabla 8 Nanoemulsión 2 KTZ: MIL

Después de preparada las NE se agregan a una crema base preparada anteriormente (Tabla 5)

Ejemplo 5. Combinación KTZ con PMD y KTZ con MIL en L. (V) braziliensis

En promastigotes de L. (V.) braziliensis, combinaciones de KTZ con PMD fueron sinérgicas con∑FICs 0,43±0,18 y 0,54±0, 15 teniendo en cuenta el IC50 y el IC90 respectivamente. Combinaciones KTZ y MIL fueron aditivas con valores de 1,07±0, 15 y 1,08±0,02 teniendo en cuenta el IC50 y el IC90 respectivamente.

• Toxicidad en células THP-1 y susceptibilidad anti-Leishmania

Se evaluó la toxicidad en células THP-1 y la actividad anti-Leishmania en promastigotes y amastigotes intracelulares de L. (V.) brasilienses. Los resultados fueron expresados en concentración citotóxica o inhibitoria 50 y 90 (CC50, CC90, IC50, IC90).

Los agentes activos con mayor actividad anti-Leishmania fueron KTZ, PMD y MIL con valores de IC50 de 4,36±1, 1, 0,3±0,05 y 7,4±1,7 respectivamente. Además, estos agentes activos mostraron valores de índice de Selectividad (IS) superiores a 3 lo cual indica que poseen actividad selectividad para los parásitos de L. (V.) braziliensis.

Tabla 9. Actividad anti-Leishmania de los agentes activos contra células THP-1, promastigotes y amastigotes intracelulares de L. (V.) braziliensis Agente Células THP-1 Promastigotes Amastigotes activo CC50 CC90 CIso CI90 IS Exp. %Inf CIso CI90

32,5±0,6 >100 4,3±1, 1 15,4±1,9 7,4 1 80,5 6, 1±0,05 15,4±0,05

KTZ

ND ND ND ND ND 2 84 7, 1±0,2 20,2±0,4

MIL 24, 1±0,7 45,7±0,4 7,4±1,7 11,0±3,2 3,2 1 86 1,3±0, 1 6,73±0,6

19,2±1,5 272,6±5,8 0,3±0,05 0,5±0,09 64 2 80,6 11, 1±1, 1 >15

PMD

ND ND ND ND 1 86 11,8±1,0 74,8±1,9

SD: Desviación estándar; %Inf: Porcentaje de macrófagos infectados en el control celular no tratado; IS: índice de selectividad (CC50/CI50); CC50, CC90: Concentración citotóxica 50 y 90; CI50, CI90: Concentración inhibitoria 50 y 90; KTZ: Ketoconazol;

MIL: Miltefosina; PMD: Pentamidina isetionato · Interacción de los agentes activos en L. (V) braziliensis

Se determinó la dinámica de la interacción de los agentes activos. Para esto se utilizó el método del radio fijo con construcción de isobologramas según protocolo de Seifert y Croft. La concentración inhibitoria fraccionada (FICs), la sumatoria de los FICs (∑FICs) y el promedio general de los FICs (∑FIC) fueron calculados para cada combinación a nivel del IC50 e IC90. La interacción fue clasificada como sinérgica∑FIC <0.5, indiferente ∑FIC entre 0,5 y 4,0 y antagónica∑FIC >4.0.

Tabla 1 Interacciones entre los agentes activos mti-Leishmania contra promastigotes. Los resultados de la interacción fueron expresados como la media del promedio de∑FIC FICs

Ejemplo 6. Caracterización de las formulaciones

Para los ejemplos anteriores se determinaron algunas características organolépticas, el pH, la estabilidad por 30 días a diferentes temperaturas de almacenamiento (4, 25 y 37°C), y en las NE se determinó el tamaño de la gotícula y el índice de polidispersión (PDI) por el método de dispersión de la luz dinámica y el de movilidad electroforética. Los resultados se expresan en nanómetros (nm) para tamaño.

Tabla 11. Caracterización de las formulaciones

PDI: índice de polidispersión, ND: No determinado, NE: nanoemulsión: *: los resultados de tamaño de gotícula (nm) y PDI corresponden a los de la NE sin crema Criterios de clasificación:

Estabilidad: +: poco estable a esta temperatura, hay formación de fases, produce cambio de color en la formulación y el pH no se mantiene en el tiempo; ++: medianamente estable a esta temperatura, produce cambios pequeños en la fase, no produce cambios en el color de la formulación y el pH no varía en el tiempo; +++: estable, no produce cambios en la fase, no produce cambios de color en la formulación y el pH se mantiene en el tiempo.

Color: Blanco, blanco hueso, rosa pálido, rosado, salmón

Ejemplo 7. Resultados in-vitro para los Ejemplos 1 a 4

Células de mamífero (HOS) y promastigotes fueron tratados con diferentes concentraciones de las formulaciones, los vehículos y los fármacos libres durante 72 horas. Células y parásitos control fueron mantenidos en medio de cultivo (sin la formulación). La citotoxicidad en células fue determinada por la técnica colorimétrica del MTT y la del parásito con la técnica de resazurina.

Tabla 12 Citotoxicidad y actividad contra promastigotes de L. (V.) braziliensis .

KTZ:PMD 170,87±4,90 329,34±8,1 7,21±1,17 23,83±1,54

Nanoemulsió

KTZ 379,40±6,94 814,94±0,77 251,48±7,21 >300 n

PMD 472,41±4,93 760, 15±4,32 20, 19±0,28 27,83±0,05 crema

vehículo 407,52±5,65 806,72±17,7 >300 >300

PMD PMD <3 <3 0,05±0,02 0,25±0,01

KTZ KTZ 6,76±1,28 90,86±2,32 5,47±0,17 15,26±0,26

SD: desviación estándar; CC50/CC90, Concentración citotóxica 50 y 90; CI50/CI90, Concentración inhibitoria 50 y 90. KTZ: Ketoconazoí; PMD: Pentamidina isetionato.

Ejemplo 8. Interacción en amastigoies iníracehilares de L. braziliensis

Tabla 2 Interacción del KTZ con PMD en amastigotes intracelulares de L. (V.) braziliensis . Los resultados de la interacción fueron expresados como la media promedio de∑FICs y el índice FIC.

D: Desv ac ón están ar; In : Porcenta e e macró agos n ecta os en e contro ce u ar no tratado; FIC: Concentración inhibitoria fraccionada;∑FIC: Media promedio de la sumatoria de la concentración inhibitoria fraccionada; CI50, CI90: Concentración inhibitoria 50 y 90; ND: No determinado; KTZ: Ketoconazol; PMD: Pentamidina isetionato