Die Erfindung betrifft neue Toxin-Bindemittel für die Hämodialyse.

Etwa 9 % der Weltbevölkerung leiden unter chronischen Nierenerkrankung (CNK) in verschiedenen schweren Ausprägungen [1], Im weiteren Verlauf haben die Betroffenen eine deutlich höhere Anfälligkeit gegenüber kardiovaskulären Erkrankungen [2], So starben im Jahr 2017 1,2 Millionen Menschen an den direkten Folgen einer CNK und nochmal 1,4 Millionen Menschen an kardiovaskulären Erkrankungen, die auf eine CNK zurückzuführen sind [1], Das hohe kardiovaskuläre Risiko konnte auf diverse urämische Toxine wie Indoxylsulfat (IS) und para-Kresyl sulfat (pCS) zurückgeführt werden [3 ]-[ 10] . Diese Toxine können selbst mit verlängerten oder häufigeren Behandlungen im Rahmen des herkömmlichen Hämodialyseverfahren nur begrenzt vom Plasma abgetrennt werden [11], Die Toxine binden aufgrund ihres teilweise hydrophoben Charakters an Plasmaproteine (z.B. Serumalbumin), was die effiziente Diffusion durch die Poren der Dialysemembranen verhindert [12, 13], Daher spricht man auch von proteingebundenen urämischen Toxinen (protein-bound uremic toxins, PBUT). Im Schnitt sind 95 % des IS und pCS proteingebunden [14], was ihre geringe Abtrennungseffizienz bei Hämodialyseverfahren erklärt.

Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Abtrennung von PBUTs ist die Zugabe von oralen oder intravenösen Ergänzungsmitteln. Intravenöse Ergänzungsmittel sollen die Toxine aus den Bindestellen der Plasmaproteine verdrängen und so ihren löslichen und durch Dialyse abtrennbaren Anteil erhöhen. Dies kann beispielsweise durch Ibuprofen ((A5)-2-(4- Isobutylphenyl)propionsäure) [15], Mesna (Natrium-2-sulfanylethansulfonat) [16] oder Acetylcystein [17] erreicht werden. Die effektive Abtrennung von pCS und IS wurde allerdings nur bei Zugabe von Ibuprofen untersucht. Orale Ergänzungsmittel wie das kohlenstoffbasierte AST- 120 (Kremezin®) adsorbieren die durch mikrobielle Prozesse im Darm entstehenden Toxine vor der Aufnahme in den Blutkreislauf [18] oder hemmen die Produktion entsprechender Toxine, wie das Synbiotikum NatuREN G [19], In einem systematischen Vergleich aller Studien zur Reduktion von protein-gebundenen urämischen Toxinen bis zum 02.01.2020 [20] zeigten die oben genannten Methoden eine Reduktionsrate für die Toxine IS and pCS von bis zu 44 % [18], Deutlich höhere Reduktionsraten zwischen 71 und 78 % wurden allerdings mit einer Kombination aus fraktionierter Plasmaseparation, Adsorption und Dialyse erreicht (FPAD) [20, 21], Dies zeigt, dass direkte Adsorption der proteingebundenen Toxine eine der effektivsten Methoden zur Toxinreduktion im Plasma der Patienten ist. Der Nachteil dieses Systems ist jedoch die aufwändige Plasmaseparation und Filtration zur Trennung des Albumins von den restlichen Bestandteilen des Blutes, die nicht in Kontakt mit den Adsorptionsmaterialien kommen dürfen [22], was einen routinemäßigen Einsatz sehr kostspielig macht.

Es mangelt nach wie vor an effektiven Adsorptionsmaterialien für PBUTs, die über eine ausreichende Bio- und Hämokompatibilität verfügen, um sie direkt mit dem Blut in Kontakt bringen und damit einfacher in die herkömmlichen Hämodialyse-Behandlungen integrieren zu können. Bisherige Mittel zur Adsorption von PBUTs verfügen nicht über eine Kombination aus a) hoher Affinität gegenüber den Toxinen und b) einer geeigneten Hämo- und Biokompatibilität. Aus dem Stand der Technik sind lediglich Untersuchungen zu gängigen Adsorptionsmaterialien wie zum Beispiel Aktivkohle [23], metallorganische Gerüstverbindungen [24] oder Zeolithe [25] bekannt, wobei die Studien sich jedoch hauptsächlich mit der Affinität dieser Materialien gegenüber den urämischen Toxinen befassen. Nur in wenigen Studien wird auch die Biokompatibilität der Materialien berücksichtigt [23],

In der DE 10 2016 108 017 Al sind geladene Proteincontainer zum Aufbau nanostrukturierter Materialien beschrieben, wobei die Proteincontainer aus Ferritin-Komplexen ausgebildet sind, in deren Inneren Nanopartikel eingeschlossen sein können. Solche Nanopartikel enthaltende Ferritin-Komplexe sollen u.a. auch in der Dialyse zur Entfernung hydrophober Toxine Verwendung finden können. Es sind jedoch keine entsprechenden Versuche hierzu beschrieben. In der WO 2004/001019 Al sind Nanopartikel beschrieben, die Proteinkäfige, beispielsweise bakterielle Ferritin-ähnliche Proteinkäfige, umfassen, die in ihrem Inneren mit mindestens einem Gastmaterial, zum Beispiel Metallen, beladen sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Adsorptionsmittel zur Abtrennung von proteingebundenen urämischen Toxinen, PBUTs, bei der Dialyse bereitzustellen, das eine möglichst hohe Affinität zu PBUTs aufweist, dabei aber über eine ausreichende Bio- und Hämokompatibilität verfügt, um direkt mit dem Blut in Kontakt gebracht werden zu können.

Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse bereit, wobei das Apoferritin-Nanopartikel Apoferritin-Untereinheiten umfasst, die zu dem Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt einen inneren Hohlraum ausbilden, und wobei das Apoferritin-Nanopartikel in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel enthält.

Es hat sich überraschend herausgestellt, dass Apoferritin-Nanopartikel gut zur Anwendung als Adsorptionsmittel für Toxine im Blut geeignet sind, zum Beispiel zur Abtrennung proteingebundener urämischer Toxine (PBUTs). Die Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung weisen einen inneren Hohlraum (im Folgenden auch als Kavität bezeichnet) auf, in dem Toxine gebunden werden können, und weisen darüber hinaus eine hohe Bio- und Hämokompatibilität auf. Damit sind sie sehr gut geeignet, im Rahmen der Dialyse, beispielsweise der Hämodialyse, Toxine, beispielsweise PBUTs oder auch andere Toxine wie Schwermetalle, aus dem Blut zu entfernen. Sie können daher beispielsweise vorteilhaft zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) eingesetzt werden. Die Proteinhülle der Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung weist Kanäle bzw. Poren auf, durch die kleine Moleküle wie beispielsweise PBUTs ins Innere des Partikels gelangen können, während größere Makromoleküle wie Protein oder Zellen zurückgehalten werden. Die Affinitiät der Ferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung zu den zu bindenden Toxinen kann gezielt eingestellt und optimiert werden, beispielsweise indem die Aminosäuresequenz von mindestens einer der Untereinheiten im Bereich des inneren Hohlraums verändert wird, so dass beispielsweise eine geeignete Anzahl hydrophober Aminosäurereste oder eine geeignete Mischung aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten vorhanden ist, oder indem ein oder mehrere Aminosäurereste mit chemischen Gruppen funktionalisiert werden. Weiterhin kann der Stofftransport in den Ferritin-Nanopartikel durch Vergrößerung oder Änderung der Oberflächenladung im Bereich der Poren verbessert werden, beispielsweise durch gezielten Austausch sterisch anspruchsvoller oder geladener Aminosäuren mit kleineren hydrophoben Aminosäuren. Die innere Oberfläche und der Bereich der Poren der Nanopartikel (Proteinkäfige) kann somit durch Sequenzmodifikation oder chemische Funktionalisierung verändert werden, um die Affinität gegenüber Toxinen zu erhöhen und/oder den Transport von Toxinen in die Nanopartikel zu erleichtern, ohne den Zusammenbau oder die Biokompatibilität zu beeinträchtigen. Die Proteinkäfige können darüber hinaus auch zu einem wohldefinierten kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert werden. Dies gewährleistet eine hohe Reinheit des Materials, erleichtert die Handhabung sowie den Einsatz als Sorptionsmaterial, und ist auch hilfreich für die Materialcharakterisierung.

Unter „Ferritin“ (abgekürzt „Ftn“) wird ein globulärer Proteinkomplex (Sphäroprotein) verstanden, der aus 24 Protein-Untereinheiten aufgebaut ist, die einen hohlen Nanokäfig bilden, und der natürlicherweise Eisen bindet. Die Begriffe „Apoferritin“ oder „Apoferritin- Nanopartikel“ beziehen sich auf den nicht an Eisen gebundenen Proteinkomplex. Der Proteinkomplex weist einen inneren Hohlraum von etwa 6-8 nm Durchmesser auf, während der äußere Durchmesser etwa 12-13 nm beträgt (s. z.B. [28], [29]). Apoferritin kann aus identischen Untereinheiten zusammengesetzt sein, zum Beispiel ausschließlich aus der so genannten schweren Kette (H-Kette), oder aus variierenden Anteilen einer leichten (L-Kette) und einer schweren Kette (H-Kette). Die H-Kette (abgekürzt hFTN-H, HFt oder FTH) von menschlichem Ferritin wird vom FTHl-Gen kodiert und ist ein natürlicherweise etwa 21 kDa großes und 183 Aminosäuren umfassendes Protein (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2; NCBI NP 002023.2). Die leichte L-Kette (abgekürzt hFTN-L, LFt oder FTL) von menschlichem Ferritin wird vom FTL-Gen kodiert und ein natürlicherweise etwa 19,5 kDa großes und 175 Aminosäuren umfassendes Protein (s. UniProtKB Nr. P02792, 2007-01-23 v2; NCBI NP_000137.2). Sowohl die leichte Kette als auch die schwere Kette weisen eine Tertiär Struktur mit einem Bündel aus vier alpha-Helices (A, B, C und D) auf, wobei die B- und C-Helix über eine aus 18 Aminosäuren bestehende nicht-helikale Schlaufe (BC-Loop) miteinander verbunden sind. Darüber hinaus ist am C-Terminus eine fünfte alpha-Helix (E) vorhanden, die in den Hohlraum ragt. Der N-Terminus sowie die A- und C-Helix liegen auf der Außenseite des Ferritins, während die B- und D-Helix zum Inneren des Ferritins gerichtet sind. Ferritin weist Kanäle bzw. Poren in seiner Proteinhülle auf, welche den inneren Hohlraum mit der äußeren Umgebung verbinden ([28]). Dabei werden an Stellen, an denen aufgrund der räumlichen Anordnung der Apoferritin-Untereinheiten jeweils drei Apoferritin-Untereinheiten aufeinanderstoßen, Dreifachkanäle (threefold channels, triple axis channels), an Stellen, an denen jeweils vier Apoferritin-Untereinheiten aufeinanderstoßen, Vierfachkanäle (fourfold channels, quadruple axis channels) gebildet (s. z.B. [28]). Ein aus 24 Untereinheiten zusammengesetztes Apoferritin-Nanopartikel umfasst in der Regel 8 Dreifachkanäle und 6 Vierfachkanäle (s. z.B. [28]).

Die Begriffe „humanes H-Kette-Ferritin“ oder „human heavy chain ferritin“, abgekürzt HuHF, beziehen sich auf ein humanes Ferritin, dessen Untereinheiten ausschließlich aus der menschlichen schweren Kette bestehen, und nicht aus einer Mischung aus einer schwereren (H- Kette) und leichteren Kette (L-Kette). Der Begriff umfasst auch Varianten mit H-Ketten, die in ihrer Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz der H-Kette (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2; NCBI NP_002023.2 für die Aminosäuresequenz der schweren Kette des humanen Ferritins) modifiziert sind.

Der Begriff „Toxin-Bindemittel“ in Bezug auf die Apoferritin-Nanopartikel bedeutet, dass die Apoferritin-Nanopartikel ein Toxin in ihrem Hohlraum, d.h. der inneren Kavität, binden, so dass es an das Apoferritin-Nanopartikel gebunden aus beispielsweise einer Körperflüssigkeit, z.B. Blut, entfernt werden kann. Die Bindung zwischen dem Toxin und dem Apoferritin- Nanopartikel ist dabei bevorzugt nichtkovalent, und kann beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen zustande kommen. Als Toxin kommen beispielsweise proteingebundene urämische Toxine wie Indoxylsulfat (IS) und para-Kresylsulfat (pCS), organische Schwermetallverbindungen, Schwermetallionen und andere chemische Stoffe und Verbindungen in Frage, die Eigenschaften aufweisen, die eine Bindung vorzugsweise über nichtkovalente Bindung erlauben. Auch eine kovalente Bindung ist jedoch nicht ausgeschlossen. Die Begriffe „proteingebundene urämische Toxine“ oder „proteingebundene Urämietoxine“, PBUTs, bezieht sich auf in der Regel schlecht wasserlösliche (hydrophobe) chemische Verbindungen, die im Serum an Protein gebunden vorliegen. Beispiele für PBUTs sind Indoxylsulfat (IS), para-Kresylsulfat (p-Kresylsulfat, auch p-Cresylsulfat, pCS), Phenylacetat (PheAc, PhAc), p-Hydroxyhippursäure, Kynurenin, Kynureninsäure, Indol-3-essigsäure, 3- Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionsäure (CMPF) und p-Kresylglucuronid (s. z.B. [37]; „Uremic Solutes Database“, „List of uremic solutes“, https://database. uremic- toxins. org/soluteList.php?sortkey=class&direction=asc, abgerufen am 25.07.2022, die 33 PBUTs auflistet).

Unter „Hämodialyse“ wird eine extrakorporale Behandlung des Blutes verstanden, bei der Stoffwechselabfallprodukte (z.B. Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, überschüssiges Phosphat etc.) und/oder überschüssige Flüssigkeit aus dem Blut entfernt werden. Hämodialyse wird regelmäßig eingesetzt, wenn die Nieren einer Person nicht mehr ausreichend funktional sind, zum Beispiel im Fall einer chronischen Nierenerkrankung (CNK). Der Ausdruck „zur Anwendung bei der Hämodialyse“ schließt die Anwendung im Rahmen einer Hämapharese, insbesondere eine Vollblutapharese, mit ein. Unter „Hämapharese“ wird ein Verfahren zur extrakorporalen Entfernung von bestimmten Blutbestandteilen oder von pathogenen Substanzen, Mikroorganismen oder dergleichen aus Blut verstanden (s. z.B. „Standard der Therapeutischen Apherese 2019, 29.03.2019, Deutsche Gesellschaft für Nephrologie).

Der Begriff „chronische Nierenerkrankung (CNK)“, englisch „chronic kidney disease“ (CKD) bezieht sich auf eine chronische Erkrankung der Niere, die eine allmähliche und länger (>3 Monate) andauernde Beeinträchtigung der Nierenfunktion bis hin zu einer dauerhaften Niereninsuffizienz oder vollständigem Nierenversagen beinhaltet (ICD-10-Code N18). Der Begriff bezieht sich hier insbesondere auf eine chronische Nierenerkrankung im Stadium 5 (ICD-10-Code N18.5), bei dem mit einer glomeruläre Filtrationsrate (GFR) von <15 mL/min ein Nierenersatzverfahren zur Blutreinigung benötig wird. Der Begriff „chronische Niereninsuffizienz“ wird hier gegebenenfalls synonym zu dem Begriff „chronische Nierenerkrankung“ verwendet.

Der Ausdruck, wonach das Apoferritin-Nanopartikel „in seinem inneren Hohlraum keine Nanopartikel“ enthält, bedeutet, dass der innere Hohlraum der Apoferritin-Nanopartikel leer ist, d.h. keine separaten Nanopartikel einschließt, die beispielsweise zur Bindung von Toxinen ausgestaltet sind.

Der Begriff „im Bereich des inneren Hohlraums“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, der zum inneren Hohlraum des Apoferritin-Nanopartikels gerichtet ist. Es handelt sich vor allem um die B-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 50-77), die D-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 128-159), die E-Helix (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin die Aminosäuren 165-174) und die auf die E-Helix in Richtung C-Terminus folgende C-terminale Region (175-183).

Der Begriff „im Bereich eines Dreifachkanals“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, die sich in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel an einem Dreifachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden, oder Aminosäurereste, die einen unmittelbaren Einfluss auf den Transport eines Toxins in das Innere des Apoferritin- Nanopartikels haben, d.h. deren Austausch zu einer Erleichterung des Toxintransports in das Innere des Apoferritin-Nanopartikels führt. Es kann sich beispielsweise um die Aminosäuren am Ende der C-Helix und Anfang der D-Helix handeln (bei der schweren Kette des humanen Apoferritin beispielsweise die Aminosäuren 118 bis 141, bevorzugt 120-140). Der Begriff schließt auch Aminosäuren an der Außenseite der Apoferritin-Untereinheit ein. „Erleichterter Toxintransport“ (oder auch „verbesserter Toxintransport“) bedeutet hier, dass bei Inkubation mit einer vorgegebenen Toxinkonzentration unter geeigneten Bedingungen innerhalb einer gegebenen Zeitspanne bei einem im Bereich des Dreifachkanals veränderten Apoferritin- Nanopartikel im Vergleich zu einem nicht im Bereich des Dreifachkanals veränderten Apoferritin-Nanopartikel eine größere Anzahl Toxinmoleküle in den Hohlraum gelangt. Anstelle des Begriffs „Dreifachkanal“ wird hier synonym gegebenenfalls auch der Ausdruck „Pore“ verwendet.

Der Begriff „im Bereich eines Vierfachfachkanals“ in Bezug auf eine Apoferritin-Untereinheit bedeutet hier den Teil der Apoferritin-Untereinheit, insbesondere die Aminosäurereste dieser Apoferritin-Untereinheit, die sich an einem Vierfachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden. Im Bereich des Vierfachfachkanals befinden sich beispielsweise die Aminosäuren M 158, L 165, Y 168, L 169, H 173 (s. z.B. [41]). Der Begriff schließt Aminosäurereste der jeweiligen Untereinheit ein, die sich in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel an einem Vierfachkanal des Apoferritin-Nanopartikels befinden, beispielsweise in einem assemblierten Apoferritin-Nanopartikel den Vierfachkanal auskleiden oder an den Öffnungen des Kanals liegen, oder Aminosäurereste, die einen unmittelbaren Einfluss auf die Gestalt, beispielsweise den Durchmesser, oder die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Kanals haben.

Die Begriffe „redesigntes Apoferritin-Nanopartikel“ oder „redesignte Apoferritin-Untereinheit“ werden hier in Zusammenhang mit einem Apoferritin-Nanopartikel oder einer Apoferritin- Untereinheit mit einer gegenüber der Wildtypsequenz geänderten Aminosäuresequenz verwendet. Der Begriff schließt ein Apoferritin-Nanopartikel oder eine Apoferritin-Untereinheit mit veränderter Aminosäuresequenz ein, bei denen ein Teil oder sämtliche der ausgetauschten Aminosäurereste zusätzlich mit chemischen Gruppen funktionalisiert sind.

Der Begriff „funktionalisiert“ bedeutet, dass an einen geeigneten Aminosäurerest, beispielsweise Cystein, eine zusätzliche chemische Gruppierung oder ein Verbindungsrest kovalent gebunden ist. Ein Beispiel ist ein Cysteinrest, an den über dessen Thiol-Gruppe (SH- Gruppe) ein N-Phenylacetamid-Rest gebunden ist.

Der Begriff „organischer Verbindungsrest“ bezieht sich auf kohlenstoffhaltige chemische Seitengruppen oder Moleküle, die kovalent gebunden sind, beispielsweise an einen Cysteinrest. Es kann sich um einen aliphatischen oder aromatischen Verbindungsrest, wobei die Begriffe hier nicht auf reine Kohlenwasserstoffverbindungen beschränkt zu verstehen sind, sondern auch heteroaliphatische oder heteroaromatische Verbindungsreste, d.h. Verbindungsreste mit Heteroatomen wie Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor oder Schwefel, einschließt. Unter einem „aromatischen Verbindungsrest“ wird jeder Verbindungsrest verstanden, der eine aromatische oder heteroaromatische Gruppierung aufweist. Unter einem „aliphatischen Verbindungsrest“ wird jeder aliphatische oder heteroaliphatische Verbindungsrest verstanden, d.h. jeder organische Verbindungsrest, der keine aromatische Gruppe enthält.

Der Begriff „aliphatischer Verbindungsrest“ umfasst cyclische oder acyclische lineare (geradkettige) oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffverbindungsreste, die keine aromatischen Reste sind. Unter dem Begriff „heteroaliphatischer Rest“ werden aliphatische Reste verstanden, in deren Kohlenstoffgerüst ein oder mehrere C-Atome durch Heteroatome ersetzt sind, beispielsweise Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor.

Der Begriff „aromatischer Verbindungsrest" (auch als „Aryl“ bezeichnet) bezieht sich auf chemische Gruppen mit Aromatizität, einschließlich mehrgliedriger aromatischer Einzelringgruppen und multicyclischer Systeme mit mindestens einem aromatischen Ring. Beispiele für aromatische Verbindungsreste (Arylgruppen) umfassen Benzyl und Phenyl. Unter dem Begriff „heteroaromatischer Verbindungsrest" (auch „Heteroaryl“) werden aromatische Verbindungsreste verstanden, in deren Kohlenstoffgerüst ein oder mehrere C-Atome durch Heteroatome ersetzt sind, beispielsweise Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor.

Der Begriff „Dialysator“ bezieht sich auf eine austauschbare Blutreinigungseinheit eines Dialysesystems. Ein Dialysator kann beispielsweise ein Hohlfasermembranmodul sein, bei dem biokompatible semipermeable Polymermembranen in Form von Hohlfasern in einem Gehäuse angeordnet sind, so dass beispielsweise Blut durch die Hohlfasern strömen und ein Dialysat durch das Innere des Gehäuses an den Außenseiten der Hohlfasem entlang (beispielsweise im Gegenstrom zum Blutstrom) strömen kann, und vorzugsweise niedermolekulare Verbindungen wie beispielsweise Salze, Protein- oder Nukleinsäurefragmente aus dem Blut über die Membran hindurch in das Dialysat diffundieren und damit abtransportiert werden können.

Die Angabe eines Bereichs wie beispielsweise „1-10“ ist so zu verstehen, dass auch jeder Zwischenwert offenbart ist. Bei einer Angabe, die nur ganze Zahlen betreffen kann, wie beispielsweise eine Anzahl von Atomen, bedeutet dies auch, dass nur ganze Zahlen offenbart sind. Jeder engere Bereich aus einem breiteren Bereich ist durch Angabe des breiteren Bereichs ebenfalls offenbart, wobei der engere Bereich auch Bereiche umfasst, die keinen der Grenzwerte des breiteren Bereichs umfassen (z.B. einen Bereich von 2-5 aus einem Bereich von 1-10).

Aminosäuren werden hier gegebenenfalls in Form ihres Dreibuchstaben- oder Einbuchstabencodes angegeben. Eine Liste von Aminosäuren mit den entsprechenden Codes ist in der folgenden Liste wiedergegeben:

Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode

Alanin Ala A

Arginin Arg R

Asparagin Asn N

Asparaginsäure Asp D

Cystein Cys C

Glutamin Gin Q

Glutaminsäure Glu E

Glycin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

Mutationen in Proteinsequenzen in Form von Aminosäureaustauschen sind im Format X1PX2 angegeben, wobei Xi die ursprünglich an einer Position P stehende und ausgetauschte Aminosäure (im Einbuchstabencode), X2 die nach dem Austausch anstelle der ursprünglichen Aminosäure an derselben Position stehende Aminosäure (im Einbuchstabencode) und P die Position innerhalb der Aminosäuresequenz, an der der Austausch vorgenommen wurde, bezeichnet.

Das Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse kann in Bereich des inneren Hohlraums eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen, beispielsweise Cysteinreste an Positionen aufweisen, an denen in der Wildtypsequenz kein Cysteinrest vorhanden ist. Die Cysteinreste können weiter funktionalisiert sein. Alternativ oder auch zusätzlich kann das Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse im Bereich eines Dreifachkanals oder Vierfachkanals eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweisen, beispielsweise einen Aminosäureaustausch, der zu einem erleichterten Transport eines Toxins in den Hohlraum des Apoferritin-Nanopartikels führt.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten des Apoferritin-Nanopartikels im Bereich des inneren Hohlraums eine gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz auf. Für den Fall, dass das erfindungsgemäße Apoferritin-Nanopartikel aus leichter (L) und schwerer (H) Kette zusammengesetzt ist mit der generellen Struktur H _n L _m , wobei n und m Ganzzahlen sind und n + m = 24 ist, bedeutet dies, dass mindestens eine der Ketten, vorzugsweise eine der schweren Ketten, eine gegenüber der jeweiligen Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz aufweist. Ist die mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten mit geänderter Aminosäuresequenz eine Untereinheit aus der schweren Kette, ist diese gegenüber der Wildtypsequenz der schweren Kette geändert, ist die mindestens eine der Apoferritin-Untereinheiten mit geänderter Aminosäuresequenz eine Untereinheit aus der leichten Kette, ist diese gegenüber der Wildtypsequenz der leichten Kette geändert. Im Falle eines humanen Apoferritin-Nanopartikels, d.h. eines Apoferritin- Nanopartikels aus den jeweiligen humanen Protein-Untereinheiten, ist die entsprechende Referenz die Wildtypsequenz der jeweiligen humanen Untereinheit (s. UniProtKB Nr. P02794, 2007-01-23 v2 oder NCBI NP_002023.2 für die schwere Kette, UniProtKB Nr. P02792, 2007- 01-23 v2 oder NCBI NP_000137.2 für die leichte Kette). Die Wildtypsequenz der humanen schweren Kette ist in der vorliegenden Anmeldung auch als Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, die Wildtypsequenz der humanen leichten Kette auch als Sequenz mit der SEQ ID NO: 2 wiedergegeben, wobei hier, anders als bei den oben erwähnten Datenbank- Sequenzen das N- terminale Methionin weggelassen wurde, da es nicht Teil der Sequenz des fertigen Proteins ist.

SEQ ID NO: 1 : Schwere Kette des humanen Ferritins. TTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

SEQ ID NO: 2: Leichte Kette des humanen Ferritins.

SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEE K REGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLH ALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLK HD

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse ist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz dahingehend im Bereich des Hohlraums in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert, dass das Apoferritin-Nanopartikel im Vergleich zu einem Apoferritin-Nanopartikel aus Apoferritin-Untereinheiten mit gegenüber der Wildtypsequenz unveränderter Aminosäuresequenz eine höhere Bindungsaffinität gegenüber einem Toxin aufweist. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels ist die Änderung der Aminosäuresequenz bei mindestens einer der Apoferritin-Untereinheiten im Bereich des inneren Hohlraums vorzugsweise so ausgestaltet, dass die Bindungsaffinität eines Apoferritin- Nanopartikels mit der in seiner Aminosäuresequenz geänderten mindestens einen Untereinheit gegenüber einem aus Blut zu entfernenden Toxin höher ist als bei einem Apoferritin- Nanopartikel mit Untereinheiten, deren Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz unverändert ist. Die Änderung kann beispielsweise eine Erhöhung der Anzahl hydrophober Aminosäurereste vorsehen. Beispiele für Aminosäuren mit einem hydrophoben Aminosäurerest sind Alanin, Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan und Phenylalanin. Es kann zur Bindung bestimmter Toxine aber auch vorteilhaft sein, einen höheren Anteil polar neutraler, saurer oder basischer Aminosäuren bei der mindestens einen Apoferritin-Untereinheit vorzusehen. Beispiele für Aminosäuren mit polaren/neutralen Aminosäureresten sind Tyrosin, Threonin, Glutamin, Glycin, Serin, Cystein und Asparagin. Beispiele für saure Aminosäuren sind Glutaminsäure und Asparaginsäure. Beispiele für basische Aminosäuren sind Lysin oder Arginin. Weiterhin kann es auch vorteilhaft sein, zur Bindung bestimmter Toxine eine bestimmte Mischung und/oder Verteilung von Aminosäuren mit hydrophoben und polaren/neutralen Aminosäureresten vorzusehen. Die Bindungsaffinität gegenüber Toxinen, beispielsweise PBUTs, von entsprechend veränderten Apoferritin-Nanopartikeln gegenüber unveränderten Apoferritin-Nanopartikeln kann vom Fachmann leicht ermittelt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums mindestens einen im Vergleich zur Wildtypsequenz zusätzlichen Cysteinrest oder einen Cysteinrest an einer anderen Position in der Sequenz auf, wobei die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz durch kovalente Bindung eines organischen Verbindungsrestes, z.B. eines aliphatischen oder aromatischen Verbindungsrestes, an den Cysteinrest funktionalisiert oder funktionalisierbar ist. Eine Funktionalisierung dient bevorzugt zur Erhöhung der Bindungsaffinität des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels gegenüber aus dem Blut zu entfernenden Toxinen, beispielsweise proteingebundenen urämischen Toxinen.

Besonders bevorzugt sind bei der mindestens einen Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz etwaige natürlicherweise im Bereich des inneren Hohlraums vorhandene Cysteinreste durch andere Aminosäurereste, beispielsweise durch Alaninreste, ersetzt. Das erlaubt eine gezielte Positionierung der einzuführenden Cysteinreste und damit der Stellen, an denen die erfindungsgemäße Apoferritin-Untereinheit funktionalisiert werden kann. Bevorzugt werden bei der mindestens einen Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz daher etwaige im Bereich des inneren Hohlraums vorhandene Cysteinreste jeweils gegen einen anderen Aminosäurerest, z.B. einen Alaninrest, ersetzt und es wird mindestens ein Cysteinrest im Bereich des inneren Hohlraums an einer Position eingeführt, an dem im nativen Protein kein Cysteinrest vorhanden ist.

Besonders bevorzugt weist die mindestens eine Apoferritin-Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz bei dem erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse im Vergleich zur Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums zwei, drei oder vier Cysteinreste auf, an die jeweils ein organischer Verbindungsrest kovalent gebunden ist oder gebunden werden kann. Bevorzugt ist bei dieser Ausführungsform, dass im Bereich des inneren Hohlraums drei oder vier Cysteinreste vorhanden sind, die jeweils identisch oder unterschiedlich funktionalisiert oder funktionalisierbar sind. Für den Fall, dass alle 24 Untereinheiten eines erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels auf diese Weise funktionalisiert oder funktionalisierbar sind, ergibt sich damit eine Zahl von 72-96 Funktionalisierungsstellen, d.h. Stellen innerhalb des Apoferritin-Nanopartikels, die funktionalisierbar oder funktionalisiert sind. Wie oben beschrieben, sind bevorzugt etwaige Cysteinreste des nativen Proteins im Bereich des inneren Hohlraums jeweils ersetzt durch beispielsweise Alaninreste, und zumindest einer der eingeführten Cysteinreste ist an einer Position eingeführt, an der im nativen Protein kein Cysteinrest vorhanden ist. Die in einem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel vorhandenen Funktionalisierungsstellen können identisch oder verschieden funktionalisiert sein, d.h. mit jeweils denselben oder unterschiedlichen chemischen Gruppen funktionalisiert sein.

Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich um einen hydrophoben, hydrophilen oder einen amphiphilen Verbindungsrest handeln. Hydrophobe Verbindungsreste sind für die Bindung von beispielsweise hydrophoben Urämietoxinen bevorzugt. Auch zur Bindung von hydrophoben Urämietoxinen kann es jedoch vorteilhaft sein, einen amphiphilen Verbindungsrest für die Funktionalisierung vorzusehen, oder unterschiedliche Cysteinreste im Bereich des inneren Hohlraums mit unterschiedlichen Verbindungsresten zu funktionalisieren, z.B. mit einer Mischung aus hydrophilen und hydrophoben Verbindungsresten. Die Einstellung der Hydrophobizität oder Hydrophilizität eines Verbindungsrestes ist dem Fachmann bekannt und kann gegebenenfalls durch Routineversuche ermittelt werden. Beispielsweise kann die Hydrophobizität eines Verbindungsrestes durch die Größe bzw. Länge eines Kohlenwasserstoffrestes beeinflusst werden, die Hydrophilizität durch Vorsehen polarer bzw. geladener Reste.

Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich beispielsweise um eine Acetamidyl- Verbindung der allgemeinen Struktur -CH2-C(0)-NH-R handeln. Der Rest R kann ein aliphatischer, heteroaliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Rest sein. Im Falle aliphatischer und heteroaliphatischer Reste ist eine maximale Kettenlänge, d.h. eine maximale Anzahl von den Verbindungsrest zusammensetzenden Atomen, von 35 Atomen bevorzugt, besonders bevorzugt eine maximale Kettenlänge von 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen. Im Falle aromatischer und heteroaromatischer Reste sind elektronenarme aromatische Systeme bevorzugt, die effektive 7t-7t Wechselwirkungen mit elektronenreichen aromatischen Systemen der Toxine erlauben. Beispiele für elektronenarme aromatische Reste sind zum Beispiel 3,4,5- trinitrophenyl-, 3,4,5-trihalogenyl- (z.B. 3,4,5-trifluorophenyl-) oder 3,4,5- tris(trihalogenylmethyl)phenylrest (z.B. 3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenylreste). Beispiele für elektronenarme heteroaromatische Gruppen sind Pyridin, Chinolin oder Isochinolin, deren elektronenarmer Charakter weiter mit elektronenziehenden Substituenten wie Nitrogruppen, tertiären Aminogruppen, positiv geladenen Gruppen oder Halogenatomen verstärkt werden kann. Bei aromatischen und heteroaromatischen Resten ist eine Molekülgröße von maximal 45, vorzugsweise maximal 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen bevorzugt, d.h. Reste, die aus maximal 45, vorzugsweise maximal 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen, einschließlich Heteroatomen, zusammengesetzt sind. Weiter bevorzugt ist bei aromatischen und heteroaromatischen Resten eine Molekülgröße von maximal 39 Atomen, besonders bevorzugt maximal 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen. Da der überwiegende Anteil der PBUTs unter physiologischen Bedingungen eine negative Formalladung trägt, sind amphiphile Verbindungsreste mit einer Kombination aus hydrophoben Gruppen mit positiv geladenen Gruppen bevorzugt. Beispiele für unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Gruppen sind primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Amine. Im Falle von heteroaliphatischen Verbindungen ist es bevorzugt, wenn diese Gruppen in der Kette enthalten sind. Abhängig von der Geometrie des zu bindenden Toxins könnten diese Gruppen auch alternierend in der Kette eingebaut werden, wobei bevorzugt eine maximale Kettenlänge von 35 Atomen, besonders bevorzugt 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen, nicht überschritten wird. Im Falle aromatischer und heteroaromatischer Reste sind die geladenen Gruppen bevorzugt in geeigneter Symmetrie zum aromatischen oder heteroaromatischen System angeordnet. Auch hier ist es bevorzugt, wenn dabei eine maximale Molekülgröße des Verbindungsrestes nicht überschritten wird, bevorzugt eine Molekülgröße von 45, vorzugsweise 44, 43, 42, 41 oder 40 Atomen, weiter bevorzugt eine Molekülgröße von 39 Atomen, besonders bevorzugt 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 oder 30 Atomen nicht überschritten wird. Für Toxine wie das -Kresylsulfat oder Phenylessigsäure eignen sich zum Beispiel l-amino-2 -phenylethyl- oder l,l-diamino-2-phenylethylreste. Bevorzugte Verbindungsreste zur Bindung proteingebundener Urämietoxine, die kovalent an den mindestens einen zusätzlichen oder an einer anderen Position in der Sequenz angeordneten Cysteinrest gebunden werden können oder gebunden sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-phenylacetamidyl, N-decylacetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylethyl)acetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylpropyl)acetamidyl, N-( l-amino-2 -phenylbutyll)acetamidyl, N-(l, 1- di ami no-2-phenyl ethyl )acetamidyl, N-(l, l-diamino-2-phenylpropyl)acetamidyl, N-(l, 1- diamino-2-phenylbutyll)acetamidyl, N-(3,4,5-tris(trifluoromethyl)phenyl)acetamidyl, N-(3,4,5- trinitrophenyl)acetamidyl, N-(l-amino-2-(3,4,5-trinitrophenyl)ethyl)acetamidyl und N-(2- (heptylamino)ethyl)acetamidyl. Die genannten Verbindungen werden bevorzugt über die Acetamid-Gruppe an den Cysteinrest kovalent gebunden. Hierzu können halogenierte Acetamid-Derivate eingesetzt werden, die mit der Thiol-Gruppe des Cysteins reagieren. Weiterhin ist es selbstverständlich auch möglich, andere geeignete Kopplungsgruppen, beispielsweise Haloalkyl- oder Maleimid-Derivate, für die Bindung an die Thiol-Gruppe zu verwendet.

Bei dem organischen Verbindungsrest kann es sich beispielsweise auch um einen Chelatbildner handeln, der Schwermetalle wie beispielsweise Blei, Antimon, Arsen, Cadmium, Nickel, Quecksilber, Thallium oder Uran, bindet. Beispiele für Chelatbildner (Komplexbildner) sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Dimercaptobernsteinsäure (DMSA) oder Dimercaptopropansulfonsäure (DMPS). Der Begriff „ Schwerin etall“ schließt Schwermetallionen ein.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse ist die mindestens eine Apoferritin- Untereinheit mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz - alternativ oder zusätzlich zu einer Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums - dahingehend im Bereich eines Dreifachkanals in ihrer Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtypsequenz geändert, dass der Transport eines Toxins in den Hohlraum des Apoferritin- Nanopartikels durch den Dreifachkanal gegenüber einem Apoferritin-Nanopartikel mit unveränderter Aminosäuresequenz erleichtert ist. Bei dieser Ausführungsform kann die Aminosäuresequenz mindestens einer Apoferritin-Untereinheit gegenüber der Wildtypsequenz lediglich im Bereich eines Dreifachkanals geändert sein, beispielsweise um lediglich den Transport in das Apoferritin-Nanopartikel hinein zu erleichtern, ohne dass auch Änderungen an der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums vorhanden sind, oder die Aminosäuresequenz mindestens einer Apoferritin-Untereinheit kann gegenüber der Wildtypsequenz auch im Bereich eines Dreifachkanals geändert sein, zusätzlich zu einer Änderung an der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums. Es ist bevorzugt, dass an mindestens zwei, vorzugsweise drei einen Dreifachkanal ausbildenden Apoferritin- Untereinheiten mindestens eine Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des Dreifachkanals vorhanden ist. Beispielsweise können jeweils eine, zwei, drei oder mehr, beispielsweise bis zu 12, Aminosäureänderungen an einer, zwei oder drei der einen Dreifachkanal ausbildenden Apoferritin-Untereinheiten vorhanden sein. Bei Änderungen an zwei oder drei der Apoferritin-Untereinheiten können diese bei jeder Untereinheit jeweils identisch oder verschieden sein, sind aber vorzugsweise identisch. Besonders bevorzugt ist ein Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, das aus identischen Untereinheiten zusammengesetzt ist, welche jeweils identische Änderungen an der Aminosäuresequenz gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich eines Dreifachkanals aufweisen, beispielsweise mindestens an einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf oder zwölf Positionen von Aminosäuren im Bereich des Dreifachkanals. Wie bereits erwähnt, können diese Änderungen allein oder auch in Kombination mit einer Änderung von Aminosäuren im Bereich des inneren Hohlraums vorliegen.

Bei dem im Rahmen einer Hämodialyse mit Hilfe des erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikels zu bindenden Toxin handelt es sich bevorzugt um ein proteingebundenes urämisches Toxin, das bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Indoxyl sulfat, para-Kresyl sulfat, Phenylacetat und p-Hydroxyhippursäure.

Bei dem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf. Vorzugsweise sind die Untereinheiten, aus denen das erfindungsgemäße Apoferritin-Nanopartikel zusammengesetzt ist, hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz identisch. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Apoferritin- Nanopartikel wie oben beschrieben gemäß einer Ausführungsform durch Einführung von Cysteinresten, die mit geeigneten chemischen Verbindungsresten funktionalisiert sind, geändert, wobei bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten in gleicher Weise modifiziert und funktionalisiert sind. In einer Ausführungsform, bei der das Apoferritin-Nanopartikel im Bereich eines Dreifachkanals eine geänderte Aminosäuresequenz aufweist, sei es allein oder in Kombination mit einer geänderten Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums, weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich eines Dreifachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse weisen vorzugsweise mindestens zwei, weiter bevorzugt mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun oder mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20 oder mindestens 22, besonders bevorzugt alle 24 Untereinheiten eine gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderte Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 13-24. Es ist dabei bevorzugt, dass die Untereinheiten mit gegenüber der Wildtypsequenz geänderter Aminosäuresequenz jeweils dieselbe Sequenz aufweisen. Wenn beispielsweise ein erfindungsgemäßes Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse 24 Untereinheiten mit einer gegenüber der Wildtypsequenz im Bereich des inneren Hohlraums und/oder im Bereich eines Dreifachkanals und/oder im Bereich eines Vierfachkanals geänderten Aminosäuresequenz aufweist, haben die 24 Untereinheit bevorzugt dieselbe Aminosäuresequenz, beispielsweise die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 24. Bevorzugt haben die Untereinheiten eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, oder SEQ ID NO: 24.

Es ist besonders bevorzugt, dass das Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung ausschließlich aus Untereinheiten bestehend aus der schweren Kette, besonders bevorzugt der humanen schweren Kette zusammengesetzt ist. Die Kette kann hinsichtlich der Aminosäuresequenz auch der an der Außenseite liegenden Proteinbereiche (z.B. die Helizes A und C) gegenüber der Wildtypsequenz geändert sein, beispielsweise zur Herstellung einer bestimmten äußeren Ladung, beispielsweise einer negativen oder positiven Ladung. Darüber hinaus ist es besonders bevorzugt, dass das Apoferritin-Nanopartikel gemäß der Erfindung keine Cysteinreste auf der Außenseite der Nanopartikel aufweist, sondern gegebenenfalls ausschließlich im inneren Hohlraum, so dass eine Funktionalisierung mit einem organischen Verbindungsrest ausschließlich an den Cysteinresten im inneren Hohlraum erfolgt. Eine Funktionalisierung kann erfolgen, indem das Apoferritin-Nanopartikel unter geeigneten Bedingungen in seine Untereinheiten disassembliert wird und die einzelnen Untereinheiten anschließend funktionalisiert werden. Nach Wiederherstellung der ursprünglichen Bedingungen bilden die Untereinheiten von selbst wieder das Apoferritin-Nanopartikel zurück. Geeignete Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in [31], [38], [39] sowie weiter unten beschrieben.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse, umfassend mehrere erfindungsgemäße Apoferritin- Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem oben beschriebenen ersten Aspekt der Erfindung. Eine derartige Zusammensetzung kann vorteilhaft als ein Adsorptionsmaterial zur Bindung von Toxinen im Blut eingesetzt werden, beispielsweise zur Bindung von proteingebundenen urämischen Toxinen (PBUTs) oder zur Bindung von Schwermetallen.

Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse können die mehreren erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse in amorpher Form oder in einer definierten Anordnung, beispielsweise in einer kristallinen Form, vorliegen. Unter einer in amorpher Form vorliegenden Zusammensetzung von Apoferritin-Nanopartikeln wird hier eine Zusammensetzung aus Apoferritin-Nanopartikeln verstanden, bei der die Apoferritin- Nanopartikel nur unter Ausbildung einer ungeordneten bzw. unbestimmten, insbesondere nichtkristallinen, Struktur untereinander verbunden sind. Eine definierte, z.B. kristalline, Anordnung von erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln kann auf eine dem Fachmann bekannte Weise erreicht werden (s. z.B. [31]). Im Falle einer Anordnung in zum Beispiel kristalliner Form sind die in der Anordnung enthaltenen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse vorzugsweise untereinander quervernetzt. Ein solches Adsorptionsmaterial weist erfindungsgemäße Apoferritin- Nanopartikel als Proteinkäfige auf, die zu einem definierten kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert sind. Dies ist nicht nur für vorteilhaft zur Erzielung einer hohen Reinheit des Materials, sondern auch für die Handhabung beim Einsatz als Sorptionsmaterial vorteilhaft. Beispielsweise lassen sich die untereinander zu einem kristallinen Gebilde vernetzten Apoferritin-Nanopartikel als Ganzes handhaben und beispielsweise von Blut trennen. Die Form des Kristalls kann beispielsweise an die Form des Hohlraums einer Sorptionskartusche angepasst werden. In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können die mehreren erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse beispielsweise in Wasser oder einer wässrigen Lösung, beispielsweise einer geeigneten wässrigen Pufferlösung, vorliegen. Die wässrige Lösung ist vorzugsweise eine biokompatible bzw. pharmazeutisch akzeptable Lösung, in der die Nanopartikel stabil sind. In einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Sorptionskartusche, die in ihrem Inneren mehrere Apoferritin-Nanopartikel zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem ersten Aspekt der Erfindung oder eine Zusammensetzung zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse nach dem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst. Eine erfindungsgemäße Sorptionskartusche kann beispielsweise so ausgestaltet sein, dass sie in ein Dialysesystem integrierbar ist. Dazu weist die Sorptionskartusche vorzugsweise einen Eingang für die Zufuhr von Blut und einen Ausgang zur Ausfuhr des Blutes auf.

Vorzugsweise ist die Sorptionskartusche so ausgestaltet, dass die mehreren Apoferritin- Nanopartikel, oder die mehrere Apoferritin-Nanopartikel umfassende Zusammensetzung, in der Sorptionskartusche durch geeignete Mittel in der Sorptionskartusche zurückgehalten werden. Beispielsweise können die mehreren Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung in einem ersten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche enthalten sein, das über eine oder mehrere Membranen von einem zweiten Kompartiment innerhalb der Sorptionskartusche getrennt ist, wobei die Membran oder die Membranen für ungebundene Toxinmoleküle und/oder für Proteine mit daran gebundenen Toxinmolekülen durchlässig sind, nicht jedoch für die Apoferritin-Nanopartikel. Blut, das von Toxinmolekülen, z.B. PBUTs, gereinigt werden soll, kann beispielsweise durch das zweite Kompartiment geleitet werden. Im Blut vorhandene Toxinmoleküle können, in freier Form oder gegebenenfalls auch an Protein gebunden, über die Membran(en) hinweg in das erste Kompartiment gelangen, z.B. durch Diffusion, und dort von den erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln gebunden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sorptionskartusche sind die mehreren Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung jedoch so in der Sorptionskartusche angeordnet, dass beim Betrieb, z.B. in einem Dialysesystem, ein direkter Kontakt mit dem aufzureinigenden Blut erfolgt. In dieser bevorzugten Ausführungsform befindet sich eine kristalline oder nichtkristalline (amorphe) Zusammensetzung der Apoferritin-Nanopartikel innerhalb der Sorptionskartusche oder zumindest innerhalb eines Kompartiments innerhalb der Sorptionskartusche, wobei Blut direkt mit der Zusammensetzung innerhalb der Sorptionskartusche kontaktiert werden kann. In dieser Form bildet das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial einen unlöslichen (amorphen oder kristallinen) Feststoff, der deutlich größer ist als die Bestandteile des Blutes (z.B. Erythrozyten mit ca. 2,5 pm). Der Größenunterschied macht die Abtrennung einfach. Das Sorptionsmaterial kann durch relativ grobe Filter zurückgehalten werden, während das Blut die Sorptionskartusche durchströmt. Hier erweist sich insbesondere die Biokompatibilität des erfindungsgemäßen Materials als vorteilhaft, da es nicht erforderlich ist, das Sorptionsmaterial vom Blut zu trennen, wodurch nicht nur ein engerer Kontakt zwischen dem Sorptionsmaterial und den abzutrennenden Toxinen ermöglicht, sondern und auch eine Integration in bestehende Dialysesysteme erleichtert wird.

In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Dialysesystem, umfassend einen Dialysator und mindestens eine Sorptionskartusche nach dem dritten Aspekt der Erfindung.

Die mindestens eine Sorptionskartusche kann in Flussrichtung des zu dialysierenden Blutes dem Dialysator a) vorgeschaltet, b) nachgeschaltet oder c) in einem Nebenkreislauf zum Dialysekreislauf angeordnet sein.

In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Dialyse von Blut, vorzugsweise menschlichem Blut, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Blutes mit einem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder mit einer Zusammensetzung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Der Schritt des Inkontaktbringens erfolgt bevorzugt über eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um ein im Blut enthaltenes Toxin, beispielsweise ein PBUT oder ein Schwermetall, an die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel oder die Zusammensetzung zu binden. Die Zusammensetzung kann die Apoferritin-Nanopartikel in amorpher oder vernetzter (kristalliner) umfassen. Der Begriff „Inkontaktbringen“ umfasst hier insbesondere ein direktes Inkontaktbringen von Blut mit den Apoferritin-Nanopartikeln oder der Zusammensetzung, d.h. ohne Trennung durch eine beispielsweise semipermeable Membran. Das erfindungsgemäße Dialyseverfahren ist besonders vorteilhaft zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK). In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung daher auch ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung (CNK) und/oder zur therapeutischen Linderung der Folgen einer chronischen Nierenerkrankung (CNK), umfassend ein Verfahren zur Dialyse von Blut gemäß dem obigen fünften Aspekt der Erfindung.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen und Ausführungsbeispiele rein zu Veranschaulichungszwecken näher erläutert.

Figur 1. Schematische Darstellung von Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikels. A. Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums; B. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums mit funktionalisierten Cystein-Resten; C. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich eines Dreifachkanals; D. Schematische Darstellung eines Apoferritin-Nanopartikels mit Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich des inneren Hohlraums (mit Funktionalisierung eines Cysteinrests), und mit zusätzlicher Änderung der Aminosäuresequenz im Bereich eines Dreifachkanals.

Figur 2. Schematische Darstellung einer kristallartigen Anordnung (unterer Teil der Abbildung) mehrerer erfindungsgemäßer Apoferritin-Nanopartikel, zusammengesetzt aus Apoferritin- Nanopartikeln aus Figur 1 (oberer Teil der Abbildung).

Figur 3. Schematische Darstellung von Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Dialysesystems. A. Dialysesystem mit vorgeschalteter erfindungsgemäßer Sorptionskartusche; B. Dialysesystem mit nachgeschalteter erfindungsgemäßer Sorptionskartusche; C. Dialysesystem mit erfindungsgemäßer Sorptionskartusche in einem Nebenkreislauf.

Figur 4. Ergebnisse von Adorptionsversuchen mit funktionalisierten Apoferritin-Nanopartikeln zur Bindung von PBUTs. a), b), c) Adsorptionskapazität von unbehandelten und funktionalisiertem Ferritin gegenüber repräsentativen PBUTs in Konzentrationen, die in CNK- Patientenblut zu erwarten sind [26], d) Lichtmikroskopisches Bild der als Adsorptionsmittel dienende Kristalle aus Ftn-Phe. e) Verhältnis von phosphorylierten AKT zu AKT als Maß für Aktivierung von Blutplättchen und damit verbundene Blutgerinnung f) Relative Konzentration von TMF a mRNA in Endothelial-Zellen. Ftn ^(neg) -Phe: mit 2-Iodo-N-phenylacetamid (Phe) funktionalisierte Ftn ^(neg Apoferritin-Nanopartikel; Ftn ^(neg) -C10: mit 2-Brom-N-decylacetamid (CIO) funktionalisierte Ftn ^(neg) - Apoferritin-Nanopartikel.

Figur 5. a) Adsorptionskapazität von gentechnisch modifizierten Ferritinvarianten gegenüber Indoxyl sulfat. Ftn ^(neg) -Dock: Variante mit Toxinbindestelle (Sequenz: Ftn ^(neg) -dock03, SEQ ID NO: 21); Ftn ^(neg) -Ap: Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (Sequenz: Ftn ^(neg) -Ap4, SEQ ID NO: 17); Ftn ^(neg) -Ap-Kanal: Variante mit verringerter negativen Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche und im Bereich des Dreifachkanals (Sequenz: Ftn ^(neg) -Ap4-3A, SEQ ID NO: 18). b) Indoxyl sulfat und seine Interaktionen mit drei Seitenketten in einer designten Toxinbindestelle (Computermodell).

Figur 6. Adsorptionskapazität von kristallinen (links) und nichtkristallinen (rechts) gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten gegenüber Indoxylsulfat (IS). Ftn ^(neg) : Apoferritin-Nanopartikel-Variante mit erhöhter negativer Ladung auf der äußeren Oberfläche (SEQ ID NO: 12); Ftn ^(neg) -Ap4: Variante mit 4 Mutationen gegenüber Ftn ^(neg) und dadurch veränderter verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (SEQ ID NO: 17); Ftn(neg)-Apl6: Variante mit 16 Mutationen gegenüber Ftn ^(neg) und dadurch veränderter verringerter negativer Oberflächenladung auf der inneren Oberfläche (SEQ ID NO: 20).

Figur 7. Adsorptionskapazität von kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten mit speziell entwickelten Bindungsstellen gegenüber Indoxylsulfat (IS) im Vergleich zu Ftn ^(neg) . Ftn ^(neg) -03 (= Ftn ^(neg) -dock03, SEQ ID NO: 21); Ftn ^(neg) -23 (= Ftn ^(neg) - dock23, SEQ ID NO: 22); Ftn ^(neg) -43 (= Ftn ^(neg) -dock43, SEQ ID NO: 22). Figur 8. Adsorptionskapazität von kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvarianten mit speziell entwickelten Bindungsstellen gegenüber para-Kresylsulfat (pCS) und Phenylacetat (PhAc) im Vergleich zu Ftn ^(neg) . Ftn ^(neg) -03 (= Ftn ^(neg) -dock03, SEQ ID NO:

21); Ftn ^(neg) -23 (= Ftn ^(neg) -dock23, SEQ ID NO: 22); Ftn ^(neg) -43 (= Ftn ^(neg) -dock43, SEQ ID NO:

22).

Figur 9. Adsorptionskapazität einer kristallinen gentechnisch modifizierten erfindungsgemäßen Ferritinvariante (Ftn ^(neg) -Ap4-3A-dock43; SEQ ID NO: 24) mit kombinierten Sequenzmodifikationen gegenüber Indoxylsulfat (IS) im Vergleich zu Ftn ^(neg) und den Varianten Ftn ^(neg) -Ap4 (SEQ ID NO: 17), Ftn ^(neg) -Ap4-3A (SEQ ID NO: 18) und Ftn ^(neg) - dock43 (SEQ ID NO: 23). Ftn ^(neg) -43 = Ftn ^(neg) -dock43; Ftn ^(neg) -Ap4-3A-43 = Ftn ^(neg) -Ap4-3A- dock43.

Figur 1 zeigt eine stark vereinfachte und schematische Darstellung von Ausführungsformen erfindungsgemäßer Apoferritin-Nanopartikel 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse. Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, weisen die Apoferritin-Nanopartikel 1 eine allgemein sphärische Gestalt auf, mit einer von Apoferritin-Untereinheiten 2 gebildeten Proteinhülle, die einen inneren Hohlraum 4 einschließt, und in der Kanäle 3 an den Schnittstellen zwischen den Apoferritin-Untereinheiten 2 gebildet sind, durch die Toxine aus der äußeren Umgebung beispielsweise durch Diffusion in den inneren Hohlraum 4 gelangen und dort gebunden werden können, beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkung. In Figur 1 sind schematisch vier einzelne Apoferritin-Nanopartikel 1 dargestellt, wobei in Figur 1 A eine Ausführungsform dargestellt ist, bei der im Bereich des inneren Hohlraums 4 Sequenzmodifikationsstellen 5 angeordnet sind, d.h. Stellen, an denen Modifikationen der Aminosäuresequenz der Apoferritin-Untereinheiten 2 vorgenommen wurden, d.h. einzelne Aminosäuren oder ganze Aminosäuresequenzbereiche gegenüber der Wildtypsequenz der jeweiligen Apoferritin-Untereinheit 2 gegen andere Aminosäuren oder Aminosäuresequenzbereiche ausgetauscht wurden. Eine Funktionalisierung von Aminosäuren, z.B. Cysteinresten, wurde hier nicht vorgenommen. Eine Bindung von Toxinen kann beispielsweise durch hydrophobe Wechselwirkung mit an den Sequenzmodifikationsstellen 5 vorgesehenen hydrophoben Aminosäureresten erfolgen. Bei der in Figur 1B dargestellten Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse wurden zunächst etwaige vorhandene native Cysteinreste durch Alanin ersetzt und anschließend an vier Sequenzmodifikationsstellen 5 vier Aminosäuren durch Cystein ersetzt, welches an dessen SH-Gruppe mit einem kovalent daran gebundenen organischen Verbindungsrestes (hier beispielhaft ein N-phenylacetamidyl-Rest) funktionalisiert wurde. In dem Beispiel sind vier Cysteinreste mit einem hydrophoben organischen Verbindungsrest für die Bindung von Urämietoxinen funktionalisiert. In Figur IC ist schematisch eine Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse dargestellt, bei der lediglich Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich eines Dreifachkanals vorgesehen sind, d.h. eine lediglich im Bereich eines Dreifachkanals gegenüber der Wildtypsequenz geänderte Aminosäuresequenz vorhanden ist. In Figur IC ist schematisch eine Ausführungsform eines Apoferritin-Nanopartikels 1 zur Anwendung als Toxin-Bindemittel bei der Hämodialyse dargestellt, bei der neben Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich eines Dreifachkanals auch Sequenzmodifikationsstellen 5 im Bereich des inneren Hohlraums 4 vorhanden sind, wobei hier beispielhaft eine der Sequenzmodifikationsstellen 5 als funktionalisierte Sequenzmodifikationsstelle 5 dargestellt ist.

In Figur 2 ist schematisch die Assemblierung von erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikeln 1 (oberer Teil der Abbildung) zu einer kristallartigen angeordneten Zusammensetzung 100 (unterer Teil der Abbildung) dargestellt. Die Apoferritin-Nanopartikel 1 können unter geeigneten Bedingungen zu einem wohldefinierten makroskopischen kristallinen Material mit gleichmäßig verteilten Lösungsmittelkanälen assembliert werden. Dies gewährleistet eine hohe Reinheit des Materials sowie eine einfache Handhabung, und ist auch hilfreich für die Materi al Charakterisierung. Zur Fixierung der Anordnung können die Apoferritin-Nanopartikel 1 gegebenenfalls untereinander quervernetzt werden.

In Figur 3 ist schematisch ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 in verschiedenen Ausführungsformen dargestellt. Figur 2A zeigt eine Ausführungsform, bei der eine Sorptionskartusche 201 einem Dialysator 202, hier ein Hohlfasermembranmodul, in durch die Pfeile angegebenen Flussrichtung des Blutes vorgeschaltet ist. Die Flussrichtung wird durch eine entsprechende Pumpe, die hier nicht dargestellt ist, bestimmt. Die Körpergrenze ist hier schematisch durch die gestrichelte Linie 203 angedeutet. Über eine Leitung 205, z.B. ein Schlauch, wird Blut zur Sorptionskartusche 201 geleitet. In der Sorptionskartusche 201 befindet sich ein erfindungsgemäßes Adsorptionsmaterial, z.B. eine Zusammensetzung 100 in Form einer kristallinen Anordnung gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung. Das Blut kann in direkten Kontakt mit der die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel 1 enthaltenden Zusammensetzung 100 gebracht werden. Etwaige im Blut enthaltene, z.B. an Proteine gebundene Urämietoxine, können von dem Adsorptionsmaterial gebunden werden. Das von Toxinen befreite oder zumindest abgereicherte Blut wird zum Dialysator 202 und weiter über eine zum Körper führende Leitung 204 in den Körper des Patienten zurückgeführt. Ein Dialysatkreislauf 206 kann für einen Austausch bzw. einen Gegenstrom von Dialysat sorgen.

In Figur 3B ist ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 dargestellt, bei dem die erfindungsgemäße Sorptionskartusche 201 dem Dialysator 202 in Fließrichtung des Blutes nachgeschaltet ist. Ansonsten entspricht das Dialysesystem 200 in dieser Ausführungsform der in Figur 3 A dargestellten Ausführungsform, so dass für weitere Details auf die dortigen Ausführungen verwiesen wird. Auch hier kommt das von Toxinen zu befreiende oder ab zureichemde Blut in der Sorptionskartusche 201 direkt mit den Apoferritin-Nanopartikel 1 bzw. einer die Apoferritin-Nanopartikel 1 umfassenden Zusammensetzung 100 in Kontakt.

In Figur 3C ist ein erfindungsgemäßes Dialysesystem 200 dargestellt, bei dem die erfindungsgemäße Sorptionskartusche 201 mit erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln 1 in einem Nebenkreislauf 207 zum Blutkreislauf angeordnet ist. Anstelle oder zusätzlich zu einem hier nicht dargestellten Dialysatkreislauf kann Adsorptionsmaterial in den Dialysator 202 geführt werden, um aus dem Blut über die Membranen der Hohlfasem übertretende Toxine zu binden. Bei dieser Ausführungsform kommt das aufzureinigende Blut nicht in direkten Kontakt mit den Apoferritin-Nanopartikel 1 bzw. einer die Apoferritin-Nanopartikel 1 umfassenden Zusammensetzung 100. Beispiele

1. Chemische Modifikation (Funktionalisierung) der inneren Oberfläche von Apoferritin- Nanopartikeln

Apoferritin-Nanopartikel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurden durch chemische Modifikation der inneren Oberfläche mit kleinen hydrophoben Molekülen hergestellt. Dazu wurde das Protein gentechnisch so verändert, dass die Aminosäure Cystein nur an bestimmten exponierten Stellen an der inneren Oberfläche vorhanden ist. Diese Aminosäure verfügt als einzige Aminosäure in dem inneren Hohlraum über eine Thiol-Gruppe in ihrer Seitenkette, welche als Ankerpunkt für die Reaktion mit hydrophoben Molekülen genutzt wurde. Der Protein-Container kann unter sauren Bedingungen (pH-Wert von 2) in seine Untereinheiten fragmentiert werden. Die inneren Cysteine können anschließend mit den hydrophoben Molekülen funktionalisiert werden. Es wurden die Moleküle 2-Iodo-N- phenylacetamid und 2-Bromo-N-decylacetamid verwendet, die in Folge einer Substitutionsreaktion an die Thiolgruppe binden können. Da eine Thiolgruppe ausschließlich im Cystein vorkommt und das modifizierte Protein diese nur innerhalb der Kavität enthält, wird so selektiv nur die innere Oberfläche mit hydrophoben Gruppen modifiziert. Die vollständige Funktionalisierung kann durch eine signifikante Zunahme der Masse des Proteins durch ESI- MS Messungen verifiziert werden. Auf diese Weise kann auch ermittelt werden, ob jedes Cystein funktionalisiert wurde. Bisher können bis zu 96 hydrophobe Moleküle pro Nanopartikel eingebaut werden. Nach der Funktionalisierung lässt sich eine erhöhte Adsorptionskapazität für das IS und pCS sowie für Phenylacetat messen, wie aus Fig. 3a ersichtlich ist.

Material und Methoden

Allgemeines

Alle Chemikalien wurden aus kommerziellen Quellen bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Sofern möglich, wurden alle Lösungen mit Reinstwasser (hergestellt mit einem Purelab-Flex-2-System, spezifischer Widerstand 18,2 Mfi cm) und Reagenzien in Analysequalität hergestellt, sofern nichts anderes angegeben ist.

Mutagenese

Die Einführung von Cystein-Ankerstellen wurde durch mehrere Zyklen ortsspezifischer QuikChange™-Mutagenese mittels eines Protokolls zu einer zweistufigen Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt [30], Die verwendeten Primer für die verschiedenen Mutationsstellen sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1. Primersequenzen (in 5 '-3 '-Richtung) für PCR-Protokoll zur Mutagenes

Eine Mischung aus 2,9 pL pET-22b(+)-Plasmid enthaltend das interessierende Gen (7 ng pL ^x ), 1 pL 10 mM dNTP-Mix, 5 pL Reaktionspuffer lOx (100 mM KCl, 100 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 200 mM Tris-HCl pH 8,8, 20 mM MgSO ₄ , 1 % Triton® X-100, 1 mg mL ¹ nukleasefreies Rinderserumalbumin (BSA)), 1 pL Pfu-DNA-Polymerase (2,5 U pL ') und 38,1 pL Reinstwasser wurde hergestellt. Die Mischung wurde halbiert und 1 pL Forward- oder Reverse- Primer (10 pmol pL ') wurden jedem Röhrchen hinzugefügt. Ein PCR-Thermocycler (Eppendorf Mastercycler Nexus PCR Cycler) wurde vorbereitet durch einen anfänglichen Heizschritt für 30 s bei 95 °C. Der erste Schritt des PCR-Protokolls bestand aus 3 Zyklen von 30 s Denaturierung bei 95 °C, Tempern für 1 min bei 61 °C, gefolgt von Elongation für 6 min bei 68 °C. Nach den ersten 3 Zyklen wurden die getrennten Mischungen mit den Forward- und Reverse-Primem vereinigt und die PCR wurde für 16 weitere Zyklen fortgesetzt mit den gleichen Parametern wie bei den ersten 3 Zyklen, gefolgt von einer finalen Elongationsphase für 10 min bei 68 °C zum Abschluss der PCR. Der Verdau des elterlichen Plasmids wird durchgeführt durch Zugabe von 1 pL Dpnl (10 U pL ¹ ) und Inkubation über Nacht bei 37 °C. Dpnl wird deaktiviert durch 20 min Erhitzen auf 80°C und die Mischung wird mit dem NucleoSpin® Gel und PCR Clean-Up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Calcium-kompetente E. coli DH5a Zellen wurden mit 200 ng des gereinigten Plasmids für 30 min auf Eis inkubiert, gefolgt von einem Hitzeschock für 45 s bei 42 °C. Als nächstes wurden die Zellen für 1 h in „Super Otimal Broth“ (SOB) Medium inkubiert, bei 1000 g zentrifugiert, in 100 pL Medium resuspendiert, auf einer LB-Agarplatte ausplattiert und 16 h bei 37 °C inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde aufgenommen und über Nacht inkubiert bei 37 °C und 250 U/min in 5 mL sterilem LB-Medium, ergänzt mit 150 pg mL ¹ Ampicillin. Am nächsten Tag wurden die Plasmide mit dem NucleoSpin® Plasmid Miniprep-Kit gemäß den Angaben des Herstellers extrahiert.

Die Sequenz wurde bestätigt durch Mischen von 500 ng Plasmid mit 25 pmol T7 Forward- oder Revers-Primer in 10 pL Lösung und Einsenden zur DNA-Sequenzierung (Eurofins Genomics).. Plasmide mit den gewünschten Mutationen wurden dann als Stamm-Plasmide für die weitere Mutagenese ausgewählt, bis alle 5 Mutationen vorhanden waren.

Herstellung und Reinigung von Ferritin-Cystein-Varianten

Die Herstellung von negativ geladenen Ferritinvarianten (Ftn ^(neg) ) und Cy stein tragenden Varianten wurde vorgenommen wie zuvor veröffentlicht [31], Zuerst wurden Calciumkompetente E. coli BL21-Gold(DE3)-Zellen für 10 min auf Eis aufgetaut. Dann wurde 1 pL von 40 ng pL' ¹ Plasmidlösung zu den Zellen gegeben und die Mischung für 30 min auf Eis inkubiert. Hitzeschock wurde durchgeführt durch Inkubieren der Mischung bei 42 °C für 45 s, gefolgt von 2 min Inkubation auf Eis. Die Zellen wurden in 1 ml SOB-Medium suspendiert und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden bei 1000 g zentrifugiert und 1 ml der Mischung wurde entfernt. Das Zellpellet wurde in der restlichen Lösung resuspendiert und auf einer LB- Agarplatte mit 150 pg ml-1 Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zur Herstellung von Vorkulturen wurden Kolonien von transformierten E. coli BL21-Gold(DE3)- Zellen (Agilent) über Nacht in 5 ml sterilem LB-Miller-Medium, ergänzt mit 150 pg ml’ ¹ Natrium-Ampicillin, bei 37°C und 180 U/min inkubiert. Dann wurden 400 ml Terrific-Broth (TB)-Medium, mit 150 pg ml’ ¹ Natrium-Ampicillin, mit 4 ml der Vorkultur angeimpft. Die Zellen wurden bei 37°C und 180 U/min angezogen, bis eine ODeoo von 0,6 erreicht wurde. Die Proteinüberexpression wurde induziert durch die Zugabe von Isopropyl-ß-D-1- Thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,25 mM, und die Zellen wurden für weitere 48 h bei 18°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 g geerntet. Pellets wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

Zellen aus 400 ml Kultur wurden in 20 ml Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,3 M NaCl) resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch Beschallung (60% Amplitude) für sechsmal 1 min auf Eis mit 1 min Pause dazwischen mit einem Vibra-Cell VCX-130 Ultraschallprozessor (Sonics) erreicht. Die resultierende Suspension wurde bei 14.000 g für 20 min zentrifugiert, um die Zelltrümmer von den löslichen Proteinen zu trennen. Die Denaturierung der meisten E.coli- Proteine wurde durch Erhitzen des Überstands auf 65 °C für 10 min in einem Wasserbad erreicht. Die denaturierten Proteine wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 14.000 g abgetrennt. In der Lösung verbliebene Proteine wurden mit Ammoniumsulfat bei einer Endkonzentration von 70 % seiner Sättigungskonzentration ausgefällt, gefolgt von einer 20- minütigen Zentrifugation bei 14.000 g. Nach Umpuffem des Pellets in 10 ml Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl) wurde die Ammoniumsulfat-Präzipitation wiederholt. Das resultierende Pellet wurde in 50 ml IEC-Ladepuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl) gelöst und durch lonenaustauschchromatographie (IEC) mit einem linearen Gradienten von 0,15 bis 1 M NaCl unter Verwendung einer 5 ml HiTrap™ Q HP -Anionenaustauschsäule (Cytiva) gereinigt. Alle Ftn ^(neg) -4xCys enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit einer Sartorius Vivaspin® Turbo 15 (MWCO 30.000) Filtereinheit auf ein Endvolumen von 2 ml konzentriert. Abschließend wurde die Probe mittels Gelfiltration mit einer HiLoad 16/600 Superdex™ 200 pg Säule gereinigt. Alle Chromatographieschritte wurden auf einem Äkta pure System von Cytiva durchgeführt. Alle Ftn ^(neg) -4xCys enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Funktionalisierung mit 2-Iod-N-phenylacetamid

5 mg Ftn ^(neg) -3xCys oder Ftn ^(neg) -4xCys wurden für 4 h in Zerlegungspuffer (10 mM Phosphat; 50 mM NaCl, pH 2) inkubiert. Nach 3 /i h wurden 10 Äquivalente (Äq.) (bezogen auf jedes Cystein) Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP, Iris Biotech GmbH) aus einer 10 mg mL’ ¹ Stammlösung zur Lösung zugegeben. Anschließend wurde die Lösung mit Reassemblierungspuffer (50 M Tris, 50 mM NaCl, pH 7,6) auf 15 mL aufgefüllt und mit einem Membranfilter (Sartorius Vivaspin Turbo 15; 30 kDa MWCO) auf ein Endvolumen von 200 pl konzentriert. Erneut wurden 10 Äq. TCEP zugegeben und die Lösung auf ein Volumen von 2 mL aufgefüllt. Der pH-Wert wurde mit IM NaOH oder HCl auf 7,6 eingestellt. Anschließend wurden 2 mL Ethanol mit 20 Äq. 2-Iod-N-phenylacetamid (aber GmbH) zu der Lösung gegeben und die Mischung wurde für 1 h bei 300 U/min im Dunkeln gerührt. Anschließend wurde die Lösung wird mit Reassemblierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 30 ml aufgefüllt. Das Protein reassemblierte sich über Nacht. Schließlich wurde die Lösung auf 2 ml eingeengt und über Geifiltration auf einer HiLoad 16/600 Superdex™ 200 pg-Säule gereinigt. Proteinhaltige Fraktionen wurden gesammelt und zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

Funktionalisierung mit 2-Brom-N-decylacetamid

Die Funktionalisierung folgt genau dem Protokoll für die Funktionalisierung mittels 2-Iodo-N- phenylacetamid. Allerdings wurde während der Funktionalisierungsreaktion die Protein/TCEP- Lösung nicht auf 2 mL, sondern auf 800 pL aufgefüllt, und dann wurden 3,2 ml Ethanol, das 40 Äq. 2-Brom-N-decylacetamid (Sigma-Aldrich) enthält, zu der Lösung zugegeben. Alle anderen Schritte wurden dem Protokoll zu 2-Iod-N-Phenylacetamid entsprechend durchgeführt. Hanging-Drop-Kristallisation

Die Kristallisation kleiner Proteinmengen oder funktionalisierter Proteinvarianten erfolgte über die Technik der Dampfdiffusion mit hängenden Tropfen. Reservoirlösung (100 mM Tris, 500 mM MgOAc, pH 8,5) wurde in einem manuellen Plattenset mit 24 Vertiefungen hergestellt. Tropfen wurden auf silikonisierten Deckgläsern (Jena Bioscience) durch Mischen von 2 pL Reservoirlösungen mit 1 pL 50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5 Puffer und 1 pL der jeweiligen Ferritin-Variante hergestellt. Die Platten wurden bei 25°C inkubiert. Nach einem Tag waren erste Kristalle sichtbar.

Batch-Kristallisation

Zur Kristallisation größerer Mengen von Ftn ^(neg) und funktionalisierter Varianten von Ftn ^(neg) wurde Batch-Kristallisationsansatz basierend auf einem Protokoll von Rayment verwendet [32], Für ein Standard-Experiment wurden 250 pL eines 50 mM Tris 1 M NaCl pH 7,5 Puffers sorgfältig mit gleichen Mengen von Ftn ^(neg) -Stammlösung mit einer Konzentration von 12 mg mL’ ¹ in 50 mM Tris 0,3 M NaCl pH 7,5 Puffer gemischt. Anschließend wurden 500 pL der Fällungsmittellösung (133 mM Tris, 333 mM MgOAc, pH 8,5) wird unter ständigem Schütteln zugetropft. Die Mischung wurde 7 Tage ruhend bei Umgebungstemperatur von 20 °C gelagert, bevor die Kristalle fixiert wurden.

Kristallfixierung

Für die Adsorptionsexperimente wurde eine Erhöhung der Stabilität der Kristalle vorgenommen. Dazu wurden sie mit dem Vernetzer Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-(N- maleimidomethyl)cyclohexan-l-carboxylat, Sigma-Aldrich) fixiert. Die Kristalle wurden 2 min bei 1000 g abzentrifugiert. In einem Standardversuch mit einer Gesamtmasse von 3 mg Kristallen wurde die Kristallisationslösung entfernt, bis 246 pL übrig waren. Anschließend wurden 64 pL einer frisch zubereiteten wässrigen Sulfo-SMCC-Lösung mit 4,8 mg mL ¹ hinzugegeben, was zu einer Endkonzentration von 1 mg mL ¹ führte. Die Mischung wurde 4 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und anschließend mit Reinstwasser auf 1 mL aufgefüllt. Die Kristalle wurden durch Zentrifugation bei 1500 g für 2 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kristalle anschließend in Reinstwasser resuspendiert. Das Verfahren wurde bis zu dreimal wiederholt, um die Kristalle von restlichem Vernetzungsmittel frei zu waschen. Das Material wurde bis zur weiteren Verwendung bei einer Umgebungstemperatur von 20°C gelagert. Kristalle wurden unter einem Leica S9D-Mikroskop mit einer FlexaCamCl fotografiert.

Zur Fixierung mit Glutaraldehyd (Merck) wurden zu 1 ml Kristalllösung, die 3 mg Kristalle enthält, 50 pl einer 2,5 % wässrigen Glutaraldehydlösung zugegeben, was zu einer Endkonzentrierung von 0,00119 % führte. Kristalle wurden für 4 h inkubiert und anschließend dreimal mit Reinstwasser gewaschen. Die Kristalle wurden bis zur weiteren Verwendung bei 20°C gelagert.

Nach der Glutaraldehyd-Vernetzung lösen sich die Kristalle noch in einer 60 mg mL’ ¹ BSA- Lösung. Durch einen zusätzlichen Fixierungsschritt konnte die Stabilität erhöht werden. Der Vorgang wurde wiederholt, aber die Kristalle wurden vor dem Waschen lediglich für 10 min inkubiert. Toxin-Adsorptionsassays zeigten jedoch eine signifikant verringerte Adsorptionskapazität. Es wird angenommen, dass die Polymerisation des Glutaraldehyds zu einer Blockierung der Poren führt.

Herstellung von nichtkristallinem Adsorbens

500 pL einer 6 mg mL’ ¹ Proteinlösung wurden mit 25 pL 2,5%iger Glutaraldehydlösung versetzt. Eine vollständige Durchmischung wurde durch dreimaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren der Lösung sichergestellt. Das Gemisch wurde über Nacht bei einer Umgebungstemperatur von 20°C gehalten. Am nächsten Tag bildete sich ein weißer Niederschlag. Das Material wurde dreimal mit Reinstwasser gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei 20°C gelagert. ESI-MS-Messungen

Die Proteinprobe wurde mit einem Amicon® Ultra 0,5 ml (MWCO 30.000 Da) Zentrifugalfilter auf ultrareines Wasser umgepuffert. Die Proteinprobe wird mit Reinstwasser auf ein Volumen von 500 pL aufgefüllt, auf etwa 20 pL konzentriert und auf 500 pL nachgefüllt. Die Umpufferung wird 5mal wiederholt und die Konzentration wurde zwischen 0,15 und 0,2 mg ml ¹ eingestellt. Die Masse der Proteine wurde mit Elektronenspray-Ionisationszeit-Flugzeit- Massenspektrometrie (Agilent 6224 ESI-TOF) bestimmt. Die Messung erfolgte im positiven Modus.

Toxin- Assay

Zur Bestimmung der urämischen Toxin- Adsorptionskapazität der Ferritin-Varianten wurden Adsorptionsexperimente durchgeführt. Alle Lösungen und Proben wurden in Glaswaren (Macherey-NAGEL Vials N9) gehandhabt, da in anfänglichen Experimenten eine Adsorption der Toxine an den Polypropylenwänden der Reaktionsröhrchen beobachtet wurde.

Zunächst wird eine Stammlösung des gewünschten Toxins mit einer Konzentration von 50 pg mL’ ¹ für pCS und IS und 500 pg mL’ ¹ für PheAc hergestellt. Aus den anfänglichen Stammlösungen wird eine Eichreihe mit Konzentrationen von 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,7 und 1 pg mL’ ¹ zur späteren Bestimmung der absoluten Toxinkonzentrationen in den Proben hergestellt.

Die Stammlösungen wurden weiter verdünnt, um die endgültigen urämischen Toxinkonzentrationen zu erreichen, die bei einem CNK-Patienten im Stadium 5 erwartet werden (41 mg L' ¹ für pCS, [33] 44 mg L' ¹ für IS [26] und 474 mg L' ¹ für PheAc [34]). Das Adsorptionsmittel wurde 2 min bei 1500 g abzentrifugiert und der komplette Überstand von der Probe entfernt. 150 pL der jeweiligen Toxinlösung wurden zugegeben und die Kristalle 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Zusätzlich wurden 150 pL der Toxinlösung als Kontrolle inkubiert. Von allen Proben wurden drei Aliquots von 10 pl entnommen und 100-fach in Reinstwasser verdünnt. Schließlich wurden die Kristalle mit Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gewogen.

Die Urämietoxin-Konzentration wurde durch ein Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (RP-HPLC) mit einer C18-Säule (Zorbax Extend-C18, Agilent), gekoppelt an ein Elektronenspray-Ionisations-Quadrupol-Liner- lonenfallen-Massenspektrometer (ESI-QTRAP), quantifiziert. Als Lösungsmittel wurde eine Mischung aus Wasser in HPLC-Qualität (LiChrosolv® Merck) und Acetonitril (LiChrosolv® Merck), beide mit Zusatz von 0,1 % Ameisensäure (Honeywell Fluka), verwendet. Die spezifischen Zusammensetzungen bei jedem Schritt während des 15-minütigen Chromatographieprogramms sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2. Sequenz des HPLC-Programms

Vor jeder mit den Kristallen inkubierten Probe wurde die Kontrolle gemessen.

Chromatogramme wurden mit der Analyst® Instrument Control and Data Processing Software ausgewertet. Peaks wurden integriert und die Toxinkonzentration wurde aus der Kalibrierungsreihe bestimmt. Aus der Konzentrationsdifferenz zwischen der Kontrolle und den Proben wurde die Menge an adsorbiertem Urämietoxin bestimmt. Die Adsorptionskapazität wurde dann bestimmt, indem die Masse der adsorbierten Toxine durch die Masse der Kristalle dividiert wurde.

Quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (qPCR) der mRNA-Expression in Endothelzellen der menschlichen Aorta Humane Aorta-Endothelzellen (hAoECs) (Promocell) wurden in einem Endothelial Cell Growth Medium MV (Promocell) kultiviert. Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (15 x 10 ⁴ Zellen/Vertiefung) bei 80 % Konfluenz ausgesät und für 6 h mit 100 ng mb ¹ Lipopolysacchariden (LPS) oder funktionalisierten oder unfunktionalisierten Proteinkristallen inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des RNAeasy- Minikits (Qiagen) extrahiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung von 1 pg Gesamt-RNA (600 ng), Zufall shexameren und Verso-Reverse-Transkriptase (Thermo Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für die Echtzeit-PCR wurden die Genexpressionsniveaus unter Verwendung der SYBR Green I-Farbstoffchemie auf einem LightCycler 480-System (Roche Applied Sciences) quantifiziert. Die folgenden Primer wurden zur relativen Quantifizierung der gezielten Genexpression verwendet - für humanes TNF-alpha: Forward-Primer 5'-GCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3' (SEQ ID NO: 8), Reverse-Primer 5'- TTGAGGGTTTGCTACAACATGG-3' (SEQ ID NO: 9) und für humanes Beta-Actin: Forward-Primer 5'-CAACCGCGAGAAGATGAC-3' (SEQ ID NO: 10), Reverse-Primer 5'- GTCCATCACGATGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 11). Die Daten wurden als mittleres Niveau der Genexpression relativ zur Expression des Referenzgens (ß-Actin) dargestellt.

Blutplättchen-Aktivierungsassay

Die Blutplättchen von drei Spendern wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 260 g isoliert. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt wurden Blutplättchen in Hepes-Puffer pH 6,6 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM MgCh und 5 mM Glucose) resuspendiert. Thrombozytensuspensionen wurden in Gegenwart von 1 :15 saurer Citratdextrose (ACD) und 1 U mL’ ¹ Apyrase erneut zentrifugiert und anschließend in Hepes-Puffer pH 7,45 (10 mM Hepes, 136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM MgCh, 5 mM Glucose und 0,1 % BSA) resuspendiert. 15 x 10 ⁶ Blutplättchen wurden für 15 min mit 4 nmol L' ¹ Thrombin in Gegenwart von 2 mmol L' ¹ CaCh oder verschiedenen Proteinkristallen inkubiert. Die Thrombozyten wurden mit 4 % SDS-Lysepuffer (200 mmol L' ¹ Tris, 600 mmol L' ¹ NaCl, 4 % SDS) einschließlich EDTA-freiem Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail (1 : 10; Sigma-Aldrich) und Halt- Phosphatase-Inhibitor-Cocktail lysiert (1 : 10; Sigma-Aldrich). Die Proteinmenge wurde gemäß dem Protokoll für den DC-Proteinassay (Bio-Rad) quantifiziert. Eine gleiche Proteinmenge aus jeder Probe wurde durch 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophorese aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembranen übertragen und mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Als primäre Antikörper wurden Anti -p-Akt- Antikörper (1 : 1000;

Zellsignalisierung) und Anti-Tubulin (1 : 1000; Zellsignalisierung) verwendet. Die Blots wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Ein zweiter Anti -Kaninchen- Antikörper (1 : 1000;

Zellsignalisierung) wurde verwendet und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Immunreaktive Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz sichtbar gemacht, und Densitometrie wurde unter Verwendung von „Quantity One Software“ (Bio-Rad Laboratories) durchgeführt.

Sequenzen

Die Aminosäuresequenzen der Ftn ^(neg) -Nanopartikel-Untereinheiten und der Cystein-haltigen Varianten Ftn ^(neg) -3xCys (mit 3 Cysteinresten) und Ftn ^(neg) 4xCys (mit 4 Cysteinresten) sind im Folgenden angegeben. Varianten mit nur einer (Ftn ^(neg) -lxCys) sowie zwei Cysteinresten (Ftn ^(neg) -2xCys) sind ebenfalls wiedergegeben. Für Ftn ^(neg) sind die Mutationen gegenüber der Wildtyp-H-Kette (SEQ ID NO: 1) angegeben. Mutationen im Vergleich zu Ftn ^(neg) (SEQ ID NO: 12), einschließlich ursprünglich vorhandener Cy steinreste, die zu Alaninresten geändert wurden, sind angegeben. Die Cysteinreste in den Cystein-haltigen Varianten sind durch Unterstreichung hervorgehoben.

Ftn ^(neg) , (SEQ ID NO: 12): Variante mit erhöhter negativer Ladung auf der äußeren Oberfläche; A18E, C90E, C102E, K86Q, H105E TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQ SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Ftn ^(neg) -3xCys (SEQ ID NO: 13): Variante mit 3 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche; K53C, E64C, C130A, K143C

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLH Q SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Ftn ^(neg) -4xCys (SEQ ID NO: 14): Variante mit 4 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche;

K53C, E64C, C130A, K143C, S178C

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLH Q SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDCDNES

Ftn ^(neg) -lxCys (SEQ ID NO: 15): Variante mit 1 Cystein-Rest auf der inneren Oberfläche;

K53C, C130A

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLH Q SHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Ftn ^(neg) -2xCys (SEQ ID NO: 16): Variante mit 2 Cystein-Resten auf der inneren Oberfläche;

K53C, E64C, C130A

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYFLH Q SHEERCHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Sequenzen weiterer untersuchter Varianten sind im Folgenden wiedergegeben. Mutationen im Vergleich zu Ftn ^(neg) (SEQ ID NO: 12) sind angegeben. Der Begriff „Bindestelle“ steht hier für Toxin-Bindestellen, die durch bloßen Aminosäureaustausch (ohne zusätzliche Funktionalisierung) gebildet wurden.

Ftn ^(neg) -Ap4 (SEQ ID NO: 17): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im Bereich des inneren Hohlraums; E61V, E62A, D131F, E140W

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLH Q SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPHLCFFIETHYLNWQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES

Ftn ^(neg) -Ap4-3A (SEQ ID NO: 18): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im

Bereich des inneren Hohlraums und an den Poren, sowie vergrößerter Porengröße; E61 V,

E62A, T122A, D123A, N125A D13 IF, E140W

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLH Q SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLAAAKADPHLCFFIETHYLNWQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES

Ftn ^(neg) -Ap7 (SEQ ID NO: 19): Variante mit 7 hydrophoben Aminosäuren auf der inneren Oberfläche; E61V, E62A, H128F, D131W, N139V, E140W, K143V

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLH Q SHVAREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPFLCWFIETHYLVWQVVAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES

Ftn ^(neg) -Apl6 (SEQ ID NO: 20): Variante mit 16 hydrophoben Aminosäuren auf der inneren Oberfläche; K49V, Y54F, H57W, Q58L, E61V, E62A, H65L, H128F, H136Y, D131W, H136Y N139V, E140W, K143V, E147L, H151Y, N154A

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALVNFAKFFLW L SHVARELAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLATDKNDPFLCWFIETYYLVWQVVAIKLLGDYVTALRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES

Ftn ^(neg) -dock03 (SEQ ID NO: 21): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe des Dreifachkanals; E64R, H65K, K68E, K71R, Q75D, R76K, H128E, D131E, F132H, T135K, H136R, Y137H, N139R, E140R

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLH Q SHEERRKAEELMRLQNDKGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPELCEHIEKRHLRRQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHT LGDSDNES

Ftn ^(neg) -dock23 (SEQ ID NO: 22): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Mitte der Untereinheit; H57E, Q58R, H60I, E61G, E64G, K68D, T135D, H136K, Y137H, N139E, E140K, A144N

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLE R SIGERGHAEDLMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPHLCDFIEDKHLEKQVKNIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Ftn ^(neg) -dock43 (SEQ ID NO: 23): Variante mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe der E-Helix; H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y

TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLE R SHEERRKAEELMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLLE LHKLATDKNDPHLCDFIEDRHLRRQVKAIKYLGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKH TLGDSDNES

Ftn ^(neg) -Ap4-3A-dock43 (SEQ ID NO: 24): Variante mit verringerter negativer Oberflächenladung im Bereich des inneren Hohlraums und an den Poren, sowie vergrößerter Porengröße, und außerdem mit einer Bindestelle an der inneren Oberfläche in der Nähe der E- Helix; E61V, E62A, T122A, D123A, N125A D131F, H57E, Q58R, E64R, H65K, K68E, T135D, H136R, Y137H, N139R, E140R, E147Y TTASTSQVRQNYHQDSEEAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLER SHVARRKAEELMKLQNQRGGRIFLQDIQKPDEDDWESGLNAMEEALELEKNVNQSLL ELHKLAAAKADPHLCFFIEDRHLRRQVKAIKYLGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDK HTLGDSDNES

Ergebnisse:

Der Zusammenbau zu einem makroskopischen Material mit dem erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel als Baustein wurde durch Batch-Kristallisationstechniken erreicht (s.o.). Eine Proteinlösung wurde vorsichtig unter ständigem Schütteln gemischt, während die Fällungsmittellösung zugegeben wurde. Nach etwa 24 h konnten erste Kristalle beobachtet werden. Die Größe der Kristalle kann durch Veränderung der Protein- und Fällungsmittelkonzentration eingestellt werden. Zur Erhöhung der Stabilität wurden die Kristalle mit einem Vemetzungsmittel fixiert. Erste Versuche wurden mit Glutaraldehyd durchgeführt. Bei Stabilitätstests in einer 60 mg mL’ ¹ BSA-Lösung, die ausgewählt wurde, um den hohen Proteingehalt des Blutes zu simulieren, lösen sich die Kristalle jedoch auf. Daher wurde die Stabilisierung mittels eines Sulfo-SMCC-Vernetzers vorgenommen, der eine stabile Fixierung durch Aufrechterhaltung der Adsorptionskapazität ermöglichte.

Zur besseren Adsorption von hydrophoben und teilweise negativ geladenen PBUTs wurden hydrophobe Liganden in den inneren Hohlraum der erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel eingeführt. Die Erfindung stellt ein modulares Material bereit, das an die Art des Liganden angepasst werden kann. Hierzu wurde durch Einbau von Cysteinresten, die durch ihre Thiolgruppe als Ankerstelle für die chemische Derivatisierung modifizierbar sind, eine generische Stelle für die Modifikation erreicht. Andererseits wurden native Cysteinreste durch Alaninreste ausgetauscht, um eine Modifikation an unerwünschten Positionen zu verhindern. Wichtige Gestaltungskriterien für die Einführung von Cysteinresten auf der Kavitätsoberfläche waren der Abstand zwischen den Stellen und der für Lösungsmittel zugängliche Oberflächenbereich (solvent-accessible surface area, SASA). Ein hoher SASA-Wert sollte einer hohen Reaktivität entsprechen. Zu diesem Zweck wurden Ferritin-Varianten mit drei und vier eingeführten Cysteinen pro Untereinheit mit den Bezeichnungen Ftn ^(neg) -3xCys und Ftn ^(neg) - 4xCys entworfen. Die Gesamtzahl der Ankerstellen pro zusammengesetztem Proteinkäfig beträgt damit bei 24 Untereinheiten und 3 oder 4 Cysteinresten 72 oder 96. Die Mutationen wurden mit Quik-Change-Mutagenesetechniken in das Ftn( ^neg) -Gen eingeführt und die Varianten wurden in E. co/z-Bakterien überexprimiert. Die Reinigung folgte dem veröffentlichten Protokoll für Ftn ^(neg) [31], Bei der lonenaustauschchromatographie (IEC) und der Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde im Vergleich zum Ausgangsprotein keine nennenswerte Änderung des Elutionsverhaltens beobachtet. Die Einführung der gewünschten Mutationen wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) verifiziert, wobei die gefundene Masse zur berechneten Masse passte (nicht dargestellt).

Zur chemischen Modifikation von Cystein-Thiolgruppen wurden die a-Halogencarbonyle 2-Iodo-N-phenylacetamid (Phe) verwendet. Apoferritin-Nanopartikel, die mit den obigen Verbindungen funktionalisiert sind, werden als Ftn(neg)-Phe und Ftn(neg)-C10 bezeichnet. Die Gesamtstrategie für die chemische Modifikation der inneren Oberfläche und den anschließenden Zusammenbau zu einem heterogenen Material ist grundsätzlich wie folgt: Zunächst wird der Proteinkäfig unter sauren Bedingungen in seine Untereinheiten zerlegt. Im zerlegten Zustand sind die Thiolgruppen für die Halogenacetamid-Derivate gut zugänglich. Die zu bindenden Moleküle selbst sind in einer wässrigen Lösung nicht löslich. Daher wird die Funktionalisierung in einer Lösung durchgeführt, die hohe Anteile an Ethanol enthält, um die Löslichkeit der hydrophoben Moleküle zu erleichtern. Nach Inkubation der Reaktionspartner wird die Mischung verdünnt und der Proteinkäfig kann sich wieder zusammensetzen. Nach der Reinigung durch SEC zeigt das resultierende Chromatogramm ein ähnliches Elutionsvolumen wie der unfunktionalisierte Käfig (nicht dargestellt), was auf einen vollständigen Wiederaufbau des Proteinkäfigs hinweist. Dieser Befund wird in negativ gefärbten TEM-Bildern bestätigt, die intakte Käfigstrukturen zeigen (nicht dargestellt). Die SEC von funktionalisiertem Ftn ^(neg) -4xCys zeigt eine leichte Verschiebung zu einem höheren Elutionsvolumen in Verbindung mit einer leicht erhöhten Größe, was gut mit den Ergebnissen der dynamischen Lichtstreuungsmessungen (DLS) übereinstimmt.

Um die erfolgreiche und vollständige Funktionalisierung der Cystein-Ankerstellen zu überprüfen, wurden ESLMS-Messungen durchgeführt. In ersten Versuchen konnten mehrere Massenpeaks pro geladener Spezies nachgewiesen werden (nicht dargestellt). Jede von ihnen konnte der Ferri tin-Untereinheit mit einem bis vier der gewünschten Moleküle zugeordnet werden, was darauf hindeutet, dass in der Probe eine Mischung aus unterschiedlichen Funktionalisierungsgraden vorhanden war. Die Feinabstimmung der Reaktionsbedingungen, insbesondere des Ethanolanteils in der Mischung, des Verhältnisses von reaktiven Molekülen zu Cysteinen und die Zugabe eines Reduktionsmittels (TCEP) ermöglichten eine reproduzierbare, vollständige Funktionalisierung aller Stellen, wie durch ESI-MS nachgewiesen werden konnte (nicht dargestellt). Die Derivatisierung wurde auch mit Röntgenkristallographie des funktionalisierten Ferritins gezeigt (nicht dargestellt). Schließlich wurden makroskopische kristalline Materialien aus den funktionalisierten Varianten unter denselben bereits oben beschriebenen Bedingungen hergestellt, was darauf hinweist, dass die Funktionalisierung die äußere Oberfläche nicht beeinflusst hat. Anschließend wurden PBUT-Adsorptionsassays mit dem unfunktionalisierten proteinbasierten Material und dem mit aliphatischen oder phenylischen Molekülen funktionalisierten Material durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde die jeweilige Probe in Lösungen von drei verschiedenen urämischen Toxinen Indoxylsulfat (IS), p-Kresylsulfat (pCS) und Phenylessigsäure (PheAc) in Konzentrationen inkubiert, die bei einem CNK-Patienten im Endstadium zu erwarten sind [26, 33, 34], Nach Inkubation für 3 h wurde die PBUT -Konzentration im Überstand und den jeweiligen Kontrollproben durch HPLC-MS/MS-Techniken bestimmt. Die Bestimmung der Absolutwerte erfolgt durch Vergleich mit einem Kalibrierungsexperiment, das zu Beginn jedes Versuchsaufbaus und alle 20 Proben durchgeführt wurde. Außerdem wurden kurz vor jeder Probe Kontrollen gemessen, um eine direkte Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Eine Herausforderung war die unspezifische Adsorption des IS an den Fläschchen der Reaktionsgefäße aus Polymeren, die jedoch durch die Umstellung auf Glasfläschchen für die Inkubation und Lagerung der Proben überwunden werden konnte. Schließlich wurde das proteinbasierte Material vakuumgetrocknet und zur Bestimmung der Masse gewogen. Die Adsorptionskapazität, also das Verhältnis der adsorbierten PBUT -Masse zur Gesamtmasse des Materials, wurde berechnet und ist in Figur 4a-c dargestellt.

Kristalle des unfunktionalisierten Proteins Ftn ^(neg) adsorbierten alle drei getesteten Toxine mit einer Kapazität zwischen 247 und 283 pg g ¹ für pCS und IS und 2710 pg g ¹ für PheAc. Der Grund für die deutlich höhere Kapazität der PheAc- Adsorption ist höchstwahrscheinlich die 10- fach höhere Konzentration des PBUTs im Assay. Bei IS und pCS führt die Funkti onalisierung mit Phenylmolekülen (Phe) zu einer Erhöhung der Adsorptionskapazität auf 458 bzw. 372 pg g ' . Für die Funkti onalisierung mit den aliphatischen Molekülen (CIO) ist nur für IS eine verstärkte Adsorption beobachtbar (Fig. 4a). Für das Toxin PheAc konnte nach dem Einbau der hydrophoben Moleküle keine signifikante Verstärkung der Adsorption beobachtet werden. Um zu testen, ob ein hochgeordnetes Material mit gleichmäßiger Verteilung von Lösungsmittelkanälen und Poren für die Adsorption vorteilhaft ist, wurde das Material mit Proben von nichtkristallinem Proteinmaterial verglichen, das durch Zugabe eines Vernetzers zu einer Proteinlösung und Inkubation über Nacht hergestellt wurde (nicht dargestellt). Das resultierende Material wurde auf seine Adsorptionskapazität gegenüber IS getestet. Es konnte kein nennenswerter Unterschied zwischen den beiden Materialarten gefunden werden, was darauf hindeutet, dass die makroskopische Form des Materials die Adsorption des IS nicht beeinflusst. Die Kapazitäten des erfindungsgemäßen proteinbasierten Adsorbens liegen in einem ähnlichen Bereich, sind aber kleiner als die Werte anderer veröffentlichter Materialien, beispielsweise der P87-Zeolithe mit Kapazitäten von bis zu 1000 pg mL-1 [35] oder kohlenstoffbasierter Adsorbentien mit Kapazitäten von bis auf 3200 pg mL-1 [36] in Bezug auf IS. Nach Wissen der Erfinder ist das Adsorbens mit der höchsten bisher veröffentlichten Kapazität ein MOF auf Zirkoniumbasis mit einer Kapazität von bis zu 156 mg g' ¹ [24], Dennoch sind diese Materialien an sich gute Adsorptionsmaterialien, und es müssen Anstrengungen unternommen werden, um ihre Biokompatibilität zu verbessern. Demgegenüber weist das erfindungsgemäße proteinbasierte Material eine intrinsische Biokompatibilität auf. Die Adsorptionskapazität kann angepasst und weiter verbessert werden.

Um die Biokompatibilität des erfindungsgemäßen Materials zu zeigen, wurden Endothelzellen und isolierte Blutplättchen mit dem kristallinen Material inkubiert. Endothelzellen zeigen keine Expression von Tumornekrosefaktor-a (TNF-a), was auf keine Endotoxinkontamination durch den bakteriellen Ursprung des Materials hinweist (Fig. 4d). Blutplättchen zeigten keine Aktivierung, was darauf hinweist, dass das Material keine Blutgerinnung induzierte (Fig. 4c). Ähnliche Ergebnisse wurden für mit Glutaraldehyd vernetzte Kristalle erzielt (nicht dargestellt). Außerdem war kein großer Unterschied zwischen den chemisch modifizierten und nicht modifizierten Proteinmaterialien zu beobachten, was darauf hindeutet, dass die Funktionalisierung die Biokompatibilität nicht beeinflusst hat.

Insgesamt zeigt sich die gute Eignung des erfindungsgemäßen synthetisierten Materials basierend auf der Bottom-up-Assemblierung von Proteinkäfigen für Blutreinigungsanwendungen. Das resultierende Material zeigt Stabilität in blutähnlichen Systemen und eine gute Adsorption von drei PBUTs. Kristalline und nichtkristalline Adsorptionsmaterialien weisen ein ähnliches Verhalten auf. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass durch die Einführung von Ankerstellen bis zu 96 wasserunlösliche aliphatische und phenylische Moleküle in den Hohlraum des Ferri tin-Proteinkäfigs eingebaut wurden. Nach der Modifikation konnte keine Abnahme der Biokompatibilität beobachtet werden. Eine Erhöhung der Adsorptionskapazität aufgrund der chemischen Modifikationen ist zu beobachten. Durch Vorsehen anderer als ausschließlich hydrophober Liganden, beispielsweise amphiphiler Liganden, einer Mischung aus hydrophoben und hydrophilen Liganden oder der Modifikation der Aminosäurereste in der Umgebung der Liganden, kann die Adsorptionskapazität sehr wahrscheinlich noch gesteigert werden, da PBUTs hydrophobe und hydrophile Eigenschaften aufweisen. Der modulare Charakter des erfindungsgemäßen Materials ermöglicht eine Adaption für andere Anwendungen, beispielsweise Behandlungsstrategien bei Schwermetallvergiftungen durch Einbau von Chelatbildnern. Darüber hinaus können durch genetische Modifikationen positiv geladene Aminosäuren um die Ankerstellen herum eingeführt werden, um die negative Ladung der PBUTs zu befriedigen, während der hydrophobe Teil der Toxine an die eingefügten Moleküle gebunden wird. All diese Modifikationen an der Innenfläche haben keinen Einfluss auf den Zusammenbau des Materials.

2. Modifikation der inneren Oberfläche und des Kanalbereichs von erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikeln (ohne zusätzliche chemische Funktionalisierung).

Eine effiziente Adsorption an die erfindungsgemäßen Apoferritin-Nanopartikel kann auch durch eine geeignete Kombination von Aminosäuren mit hydrophoben, aromatischen, polaren oder geladenen Seitenketten erreicht werden, wodurch bereits im unfunktionalisierten Protein Bindestellen im Inneren des Proteincontainer geschaffen werden. Dies ist beispielhaft in Figur 5b gezeigt. Hier wird das delokalisierte und hydrophobe Ringsystem des IS von dem Ringsystem der Aminosäure Tyrosin gebunden, während die polare negativ geladene Sulfatgruppe von partial positiv geladenen Stickstoffatomen in der Aminosäure Histidin stabilisiert wird. Zum Design dieser Proteinvarianten wurde mit Hilfe von „Ligand-Docking“- Protokollen des Softwarepakets Rosetta die Bindungsaffinität der Proteine zu den Toxinen bestimmt. Anschließend wurden im Computermodell zufällig diverse Aminosäuren im Protein verändert und die Affinität ein weiteres Mal bestimmt. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis keine Affinitätssteigerung mehr zu beobachten war. Die auf diese Weise designten Proteincontainer wurden im Labor hergestellt, sind weiterhin löslich und assemblieren zu vollständigen Containern. Die eingeführten Mutationen wurden durch ESI-MS Messungen bestätigt. Varianten mit erhöhter Affinität für IS wurden designt und erfolgreich hergestellt. Adsorptionsmittel aus diesen Varianten zeigten teilweise eine deutlich erhöhte Adsorptionskapazität gegenüber dem entsprechenden Toxin, wie in Fig. 5a (Ftn ^(neg) - Dock = Ftn ^(neg) -dock03, SEQ ID NO: 21) zu erkennen ist.

Weiterhin können Aminosäuren des Apoferritin-Nanopartikel gezielt ausgetauscht werden, um die Eigenschaften des Apoferritin-Nanopartikel zu verändern. Beispielsweise konnte durch Austausch von negativ geladenen Aminosäuren mit hydrophoben Aminosäuren das negative Oberflächenpotential im Bereich der inneren Kavität reduziert werden. Dadurch konnte eine deutliche Erhöhung der Adsorptionskapazität für die unter physiologischen Bedingungen ebenfalls negativ geladenen PBUTs erreicht werden (Figur 5a, Ftn ^(neg) -Ap = Ftn ^(neg) -Ap4, SEQ ID NO: 17). Da der modifizierte Bereich in der Nähe des Dreifachkanals liegt, kann angenommen werden, dass die erhöhte Adsorption auf einem verbesserten Stofftransport in den Inneren Bereich des Apoferritin-Nanopartikel zurückzuführen ist. Der Stofftransport in den Bereich der inneren Kavität kann weiterhin durch Modifikationen im Bereich des

Dreifachkanals verbessert werden. Beispielsweise führte der Austausch von Aminosäuren mit geladenen oder sterisch anspruchsvollen Resten mit der Aminosäure Alanin zu einer deutlichen Erhöhung der Adsorptionskapazität (Figur 5a, Ftn ^(neg) -Ap+Kanal = Ftn ^(neg) -Ap4-3 A, SEQ ID NO: 18). Durch Aminosäureaustausch geschaffene Bindestellen können mit Modifikationen, die den Stofftransport verbessern, kombiniert werden, um die Adsorption weiter zu verbessern. Außerdem sind auch Varianten mit mehr als einer Bindestelle pro Apoferritin-Untereinheit möglich.

Bei der oben schon erwähnten Variante Ftn ^(neg) -Ap4 (SEQ ID NO: 17) wurden Aminosäuren mit negativ geladenen Seitenketten, wie Glutamin- und Asparaginsäure, an vier Positionen (E61, E62, D131 und El 40) pro Untereinheit im inneren Hohlraum durch unpolare oder aromatische Derivate (E61V, E62A, D131F und E140W) ersetzt. Anhand des Oberflächenpotentials zeigte sich eine Verschiebung der Polarität von negativ nach ungeladen (nicht dargestellt). Allerdings verblieb ein negativ geladener Bereich auf der inneren Oberfläche, da die verantwortlichen Aminosäuren teilweise im Proteinrückgrat verborgen sind und Mutationen an diesen Stellen weggelassen wurden, um die Stabilität des Proteins aufrechtzuerhalten. Da die eingeführten Aminosäuren hydrophobe oder sogar aromatische Seitenketten tragen, ist es möglich, dass diese Reste auch als Adsorptionsstellen für die teilweise hydrophoben PBUTs fungieren können. Um unterscheiden zu können, ob mögliche Auswirkungen auf die Adsorptionskapazitäten auf eine allgemeine Verringerung der negativen Oberflächenladung oder auf eine spezifische Adsorption an hydrophobe Reste zurückzuführen sind, wurde eine weitere Variante mit der Bezeichnung Ftn ^(neg) -Apl6 entwickelt (SEQ ID NO: 20). Wie bei der Ap4-Variante wurden die vier geladenen Aminosäuren an den Positionen 61, 62, 131 und 140 durch unpolare Derivate (D an Position 131 nicht durch F, sondern durch W) ersetzt und zwölf zusätzliche unpolare Aminosäuren an oberflächenexponierten Positionen eingeführt.

Die Adsorptionskapazitäten von Ftn ^(neg) -Ap4 und Ftn ^(neg) -Apl6 wurden im Vergleich zu Ftn ^(neg) sowohl für kristalline als auch für nichtkristalline Formen ermittelt (s. Fig. 6; kristalline Formen linke Balken; nichtkristalline Formen rechte Balken). Beim Vergleich der Adsorptionskapazitäten der kristallinen Materialien gegenüber Indoxylsulfat (IS) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen unmodifiziertem (Ftn ^(neg ) und modifiziertem Ferritin (Ftn ^(neg) -Ap4, Ftn ^(neg) -Apl6) festgestellt werden (s. Fig. 6). Für das nichtkristalline Material konnte bei beiden Ap-Varianten jedoch eine deutliche Steigerung der Adsorptionskapazität beobachtet werden. Trotz der 12 zusätzlichen hydrophoben Aminosäuren ist die Adsorptionskapazität von Ftn ^(neg) -Apl6 ähnlich der von Ftn ^(neg) -Ap4. Die Verringerung der negativen Oberflächenladung scheint daher der Hauptgrund für die erhöhte PB UT -Adsorption zu sein. Das stimmt mit der Annahme überein, dass die Einführung hydrophober Moleküle nahezu keine signifikante Verbesserung der Adsorptionskapazität mit sich bringt, und die Änderung in der Absorptionskapazität auf eine allgemeine Verringerung negativer Ladungen zurückzuführen ist. Neben der Reduzierung der negativen Ladung im inneren Hohlraum und in den Poren des Proteinkäfigs wurde eine weitere Strategie zur Erhöhung der Adsorption von PBUTs verfolgt. Um sowohl den polaren als auch den hydrophoben Teil der PBUTs zu stabilisieren, wurde die Schaffung einer eindeutigen Bindungsstelle durch Einführung geeigneter Aminosäuren angestrebt. Zu diesem Zweck wurden Liganden-Docking-Protokolle der Rosetta-Software-Suite (s. [40]) eingesetzt. Als Ligand wurde IS eingesetzt. Drei weitere mögliche Ferritin-Varianten wurden ermittelt, Ftn ^(neg) -dock03 (SEQ ID NO: 21), Ftn ^(neg) -dock23 (SEQ ID NO: 22) und Ftn ^(neg) -dock43 (SEQ ID NO: 22). Die Bindungsstellen befinden sich in der Nähe des Dreifach- Kanals (Ftn ^(neg) -dock03), im Zentrum der Untereinheit (Ftn ^(neg) -dock23) und in der Nähe des 4- fach-Kanals (Ftn ^(neg) -dock43).

Die Adsorptionskapazitäten der neuen Varianten in Bezug auf IS wurden für kristalline Anordnungen bestimmt und sind in Figur 7 dargestellt. Wie aus Figur 7 ersichtlich, konnte die Adsorptionskapazität für alle drei Varianten im Vergleich zu unmodifiziertem Ftn ^(neg) deutlich verbessert werden (Ftn ^(neg) -03 = Ftn ^(neg) -dock03, Ftn ^(neg) -23 = Ftn ^(neg) -dock23, Ftn ^(neg) -43 = Ftn ^(neg) -dock43). Die Variante Ftn(neg)-03 zeigte die höchste Adsorptionskapazität mit einem nahezu verdoppelten Wert.

Die speziell für IS entwickelten drei Varianten Ftn ^(neg) -dock03, Ftn ^(neg) -dock23 und Ftn ^(neg) - dock43 wurden auch hinsichtlich ihrer Adsorptionskapazität gegenüber pCS und PheAc bestimmt, wie in Abbildung 8 dargestellt. Hier konnte ein interessanter Trend beobachtet werden: Während für IS die Varianten Ftn ^(neg) -03 und -43 beide besser abschnitten als Ftn ^(neg) - 23, schnitt die Variante Ftn ^(neg) -23 in Bezug auf pCS- und PheAc-Adsorption besser ab die anderen Varianten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Art Selektivität in den Bindungsstellen eingeführt werden kann, indem auf einzigartige Merkmale der Toxine abgezielt wird.

Es wurde darüber hinaus getestet, ob die verschiedenen Merkmale zur Erhöhung der Bindungskapazität der Proteine in einer Struktur kombiniert werden können. Die Mutationen, die die Bindungsstelle in Ftn ^(neg) -43 aufbauen, wurden mit den Mutationen von Ftn ^(neg) -Ap4-3 A kombiniert, um die Oberflächenladung am inneren Hohlraum und dem Dreifachkanal zu verringern, wodurch sich die Variante Ftn ^(neg) -Ap4-3A-43 ergab.

Die Adsorptionskapazität dieser Variante wurde für das Adsorbermaterial mit nichtkristalliner Morphologie bestimmt und mit den Ergebnissen für unmodifiziertes Ftn ^(neg) und die zuvor genannten Varianten verglichen (Figur 9). Die Messwerte deuten darauf hin, dass einzelne positive Effekte aufgrund unterschiedlicher Modifikationen durch die Kombination der Mutationen in einer Struktur addiert werden können. Die Variante Ftn ^(neg) -Ap4-3 A-43 zeigte die höchsten Adsorptionskapazitäten aller in dieser Studie untersuchten Varianten.

Der Vorteil einer bloßen Änderung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Apoferritin- Nanopartikel durch Aminosäureaustausch ist, dass die Proteine ohne weitere chemische Modifikation verwendet werden können. Dies senkt die Wahrscheinlichkeit für allergische Reaktionen oder weitere Nebeneffekte und macht es in seiner Herstellung kostengünstiger als funktionalisierte Varianten. Stärkere Bindestellen können designt werden. Weiterhin eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, weitere Apoferritin-Nanopartikel oder Apoferritin- Nanopartikel-Zusammensetzungen mit weiter verbesserter, gegebenenfalls an bestimmte Toxine angepasster, Affinität bereitzustellen.

Referenzen

[1] Bikbov, B. et al., 2020, Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017, The Lancet 395, 709 - 733

[2] Schlieper, G., Hess, K, Floege J., Marx, N., 2016, The vulnerable patient with chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation 31, 382-390, doi.org/10.1093/ndt/gfv041

[3] Ito, S.; Yoshida, M. Protein-Bound Uremic Toxins: New Culprits of Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease Patients. Toxins 2014, 6, 665-678. doi.org/10.3390/toxins6020665

[4] Karbowska, M.; Kaminski, T.W.; Marcinczyk, N.; Misztal, T.; Rusak, T.; Smyk, L.;

Pawlak, D. The Uremic Toxin Indoxyl Sulfate Accelerates Thrombotic Response after Vascular Injury in Animal Models. Toxins 2017, 9, 229. doi.org/10.3390/toxins9070229 [5] Dou L., Bertrand, E., Cerini, C., Faure, V., Sampol, J., Vanholder, R., Berland, Y„ Brunet, P., 2004, The uremic solutes p-cresol and indoxyl sulfate inhibit endothelial proliferation and wound repair, Kidney International 65, 442-451, doi.org/10.1111/j .1523-1755.2004.00399.x

[6] Lekawanvijit, S., Kompa, A.R., Krum, H., 2016, Protein-bound uremic toxins: a long overlooked culprit in cardiorenal syndrome, Am J Physiol Renal Physiol 311 : F52-F62, doi.org/10.1152/ajprenal.00348.2015

[7] Sun CY, Chang SC, Wu MS (2012) Uremic Toxins Induce Kidney Fibrosis by Activating Intrarenal Renin-Angiotensin-Aldosterone System Associated Epithelial-to-Mesenchymal Transition. PLOS ONE 7(3): e34026. doi.org/10.1371/joumal. pone.0034026

[8] Yu M, Kim, YJ, Kang, D-H, 2011, Indoxyl Sulfate-Induced Endothelial Dysfunction in Patients with Chronic Kidney Disease via an Induction of Oxidative Stress, CJASN 6, 30-39; DOI: 10.2215/CJN.05340610

[9] Liabeuf, S., Barreto, D.V., Barreto, F.C., Meert, N., Glorieux, G., Schepers, E., Temmar, M., Choukroun, G., Vanholder, R., Massy, Z.A., on behalf of the European Uraemic Toxin Work Group (EUTox), 2010, Free p-cresyl sulphate is a predictor of mortality in patients at different stages of chronic kidney disease, Nephrology Dialysis Transplantation 25, 1183-1191, doi.org/10.1093/ndt/gfp592

[10] Bammens, B., Evenepoel, P., Keuleers, EL, Verbeke, K., Vanrenterghem Y., 2006, Free serum concentrations of the protein-bound retention solute p-cresol predict mortality in hemodialysis patients, Kidney International 69, 1081-1087, doi.org/10.1038/sj.ki.5000115

[11] Sirich, T.L., Fong, K., Larive, B., Beck, G.J., Chertow, G.M., Levin, N.W., Kliger, A.S., Plummer, N.S., Meyer, T.W., 2017, Limited reduction in uremic solute concentrations with increased dialysis frequency and time in the Frequent Hemodialysis Network Daily Trial, Kidney International 91, 1186-1192, doi.org/10.1016/j.kint.2016.11.002

[12] Vanholder, R., De Smet, R., Glorieux, G., Argiles, A., Baurmeister, U., Brunet, P., Clark, W., Cohen, G., De Deyn, P.P., Deppisch, R., Descamps-Latscha, B., Henle, T., Jörres, A,. Lemke, H.D., Massy, Z.A., Passlick-Deetjen, J., Rodriguez, M., Stegmayr, B., Stenvinkel, P., Tetta, C., Wanner, C., Zidek, W., 2003, For the European Uremic Toxin Work Group (EUTox), Review on uremic toxins: Classification, concentration, and interindividual variability, Kidney International 63, 1934-1943, doi.org/10.1046/j.1523-1755.2003.00924.x [13] Jansen, J., Jankowski, J., Gajjala, P.R., Wetzels, J.F.M., Masereeuw, R., 2017, Disposition and clinical implications of protein-bound uremic toxins, Clin Sei (Lond) 131, 1631-1647, doi.org/10.1042/CS20160191

[14] Itoh, Y., Ezawa, A., Kikuchi, K. et al. Protein-bound uremic toxins in hemodialysis patients measured by liquid chromatography/tandem mass spectrometry and their effects on endothelial ROS production. Anal Bioanal Chem 403, 1841-1850 (2012). doi . org/10.1007/s00216-012-5929-3

[15] Madero, M., Cano, K.B., Campos, I., Tao, X., Maheshwari, V., Brown, J., Cornejo, B., Handelman, G., Thijssen, S., Kotanko, P., 2019, Removal of Protein-Bound Uremic Toxins during Hemodialysis Using a Binding Competitor, CJASN 14, 394-402, doi: 10.2215/CJN.05240418

[16] Urquhart, B.L., Freeman, D.J., Spence, J.D., House, A.A., 2006, The Effect of Mesna on Plasma Total Homocysteine Concentration in Hemodialysis Patients, American Journal of Kidney Diseases, Volume 49, Issue 1, 109-117, doi.org/10.1053/j.ajkd.2006.10.002

[17] Perna, A.F., Violetti, E., Lanza, D., Sepe, I., Bellinghieri, G., Savica, V., Santoro, D., Satta, E., Cirillo, G., Lupo A., Abaterusso, C., Raiola, I., Raiola, P., Coppola, S., Di Iorio, B., Tirino, G., Cirillo, M., Ingrosso, D., De Santo, N.G., 2012, Therapy of Hyperhomocysteinemia in Hemodialysis Patients: Effects of Folates and N-Acetylcysteine, Journal of Renal Nutrition 22, 507-514. el, doi.org/10.1053/j.jm.2011.10.007

[18] Yamamoto, S., Kazama, J., Omori, K. et al. Continuous Reduction of Protein-Bound Uraemic Toxins with Improved Oxidative Stress by Using the Oral Charcoal Adsorbent AST- 120 in Haemodialysis Patients. Sei Rep 5, 14381 (2015), doi.org/10.1038/srepl4381

[19] Rocchetti, M.T.; Cosola, C.; di Bari, I.; Magnani, S.; Galleggiante, V.; Scandiffio, L.; Dalfino, G.; Netti, G.S.; Atti, M.; Corciulo, R.; Gesualdo, L. Efficacy of Divinylbenzenic Resin in Removing Indoxyl Sulfate and P-cresol Sulfate in Hemodialysis Patients: Results from an In Vitro Study and an In Vivo Pilot Trial (xuanro4-Nature 3.2). Toxins 2020, 12, 170. doi . org/ 10.3390/toxins 12030170

[20] Saar-Kovrov, V, Zidek, W, Orth-Alampour, S, Fliser, D, Jankowski, V, Biessen, EAL, Jankowski, J (University hospital, Aachen, Germany; Maastricht University Medical Center, Maastricht, the Netherlands; Charite - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany; Saarland University Medical Center, Homburg, Germany). Reduction of protein-bound uraemic toxins in plasma of chronic renal failure patients: A systematic review (Review). J Intern Med 2021; 290: 499- 526.

[21] Brettschneider, F., Tölle, M., von der Giet, M., Passlick-Deetjen, J., Steppan, S., Peter, M., Jankowski, V., Krause, A., Kühne, S., Zidek, W. and Jankowski, J. (2013), Thoughts and Progress. Artificial Organs, 37: 409-416. doi.org/10.1111/j. l525-1594.2012.01570.x

[22] Falkenhagen, D., Strobl, W., Vogt, G., Schrefl, A., Linsberger, I., Gemer, F.J. and Schoenhofen, M. (1999), Fractionated Plasma Separation and Adsorption System: A Novel System for Blood Purification to Remove Albumin Bound Substances. Artificial Organs, 23: 81-86, doi.org/10.1046/j.1525-1594.1999.06292.x

[23] Stemkopf, M.; Thoröe-Boveleth, S.; Beck, T.; Oleschko, K.; Erlenkötter, A.; Tschulena, U.; Steppan, S.; Speer, T.; Goettsch, C.; Jankowski, V.; Jankowski, J.; Noels, H.; The European Uremic Toxin Work Group-EUTox. A Bifunctional Adsorber Particle for the Removal of Hydrophobic Uremic Toxins from Whole Blood of Renal Failure Patients. Toxins 2019, 11, 389, doi.org/10.3390/toxinsl 1070389

[24] Kato, S., Otake, K., Chen, H., Akpinar, I., Burn, C.T., Islamoglu, T., Snurr, R.Q., Farha, O.K., 2019, Zirconium-Based Metal-Organic Frameworks for the Removal of Protein-Bound Uremic Toxin from Human Serum Albumin, Journal of the American Chemical Society 141, 2568-2576, DOI: 10.1021/jacs.8bl2525

[25] Berge-Lefranc, D., Vagner, C., Calaf, R., Denoyel, R., Brunet, P., Ghobarkar, H., Schaf, O., 2012, In vitro elimination of protein bound uremic toxin p-cresol by MFI-type zeolites. Microporous and Mesoporous Materials 153, 288-293, 10.1016/j.micromeso.2011.11.024.

[26] Barreto, F.C., Barreto, D.V., Liabeuf, S., Meert, N., Glorieux, G., Temmar, M., Choukroun, G., Vanholder, R., Massy, Z.A., on behalf of the European Uremic Toxin Work Group (EUTox), 2009, Serum Indoxyl Sulfate Is Associated with Vascular Disease and Mortality in Chronic Kidney Disease Patients, CJASN 4 (10) 1551-1558; DOI: 10.2215/CJN.03980609

[27] Rifai K, Ernst T, Kretschmer U, Bahr MJ, Schneider A, Hafer C, Haller H, Manns MP, Fliser D. Prometheus— a new extracorporeal system for the treatment of liver failure. J Hepatol. 2003 Dec;39(6):984-90. doi: 10.1016/s0168-8278(03)00468-9. [28] Zhang, C.; Zhang, X.; Zhao, G. Ferritin Nanocage: A Versatile Nanocarrier Utilized in the Field of Food, Nutrition, and Medicine. Nanomaterials 2020, 10, 1894. doi . org/ 10.3390/nano 10091894

[29] Hempstead PD, Yewdall SJ, Fernie AR, Lawson DM, Artymiuk PJ, Rice DW, Ford GC, Harrison PM. Comparison of the three-dimensional structures of recombinant human H and horse L ferritins at high resolution. J Mol Biol. 1997 May 2;268(2):424-48. doi:

10.1006/jmbi.1997.0970. PMID: 9159481.

[30] Wang W, Malcolm BA. Two-stage PCR protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions and insertions using QuikChange Site-Directed Mutagenesis.

Biotechniques. 1999 Apr;26(4):680-2. doi: 10.2144/99264st03. PMID: 10343905

[31] Künzle, M., Eckert, T., Beck T., 2016, Binary Protein Crystals for the Assembly of Inorganic Nanoparticle Superlattices, J. Am. Chem. Soc. 138, 12731-12734, doi.org/10.1021/jacs.6b07260

[32] Rayment, I., 2002, Small-Scale Batch Crystallization of Proteins Revisited: An Underutilized Way to Grow Large Protein Crystals, Structure 10, 147-151, doi . org/ 10.1016/S0969-2126(02)00711 -6

[33] Hida M, Aiba Y, Sawamura S, Suzuki N, Satoh T, Koga Y. Inhibition of the accumulation of uremic toxins in the blood and their precursors in the feces after oral administration of Lebenin, a lactic acid bacteria preparation, to uremic patients undergoing hemodialysis.

Nephron. 1996;74(2):349-55. doi: 10.1159/000189334. PMID: 8893154.

[34] Jankowski J., van der Giet M., Jankowski, V., Schmidt, S., Hemeier, M., Mahn, B., Giebing, G., Tölle, M., Luftmann, H., Schlüter, H., Zidek, W., Tepel M., 2003, Increased plasma phenylacetic acid in patients with end-stage renal failure inhibits iNOS expression, J Clin Invest. 112(2):256-264, doi.org/10.1172/JCH5524

[35] Lu L., Yeow J.T.W. An adsorption study of indoxyl sulfate by zeolites and polyethersulfone-zeolite composite Mater 2017;120:328-335. doi: 10.1016/j.matdes.2017.01.094

[36] Pavlenko, D., Giasafaki, D., Charalambopoulou, G. et al. Carbon Adsorbents With Dual Porosity for Efficient Removal of Uremic Toxins and Cytokines from Human Plasma. Sei Rep 7, 14914 (2017), doi.org/10.1038/s41598-017-15116-y [37] van Gelder MK, Middel IR, Vemooij RWM, Bots ML, Verhaar MC, Masereeuw R, Grooteman MP, Nube MJ, van den Dörpel MA, Blankestijn PJ, Rookmaaker MB, Gerritsen KGF, 2020, Protein-Bound Uremic Toxins in Hemodialysis Patients Relate to Residual Kidney Function, Are Not Influenced by Convective Transport, and Do Not Relate to Outcome, Toxins 12(4):234, doi: 10.3390/toxinsl2040234. PMID: 32272776;

[38] Kim, M., Rho, Y., Jin, K.S., Ahn, B., Jung, S., Kim, H., Ree, M., 2011, pH-Dependent Structures of Ferritin and Apoferritin in Solution: Disassembly and Reassembly, Biomacromolecules 2011, 12, 5, 1629-1640, doi.org/10.1021/bm200026v

[39] Liu, X., Jin, W., Theil, E.C., 2003, Opening protein pores with chaotropes enhances Fe reduction and chelation of Fe from the ferritin biomineral, PNAS 100, 3653-3658, doi. org/10.1073/pnas.0636928100

[40] Moretti, R., Bender, B.J., Allison, B., Meiler, J. (2016), Rosetta and the Design of Ligand Binding Sites, In: Stoddard, B. (eds) Computational Design of Ligand Binding Proteins, Methods in Molecular Biology 1414, pp. 47-62, Humana Press, New York, NY, doi : 10.1007/978-1 -4939-3569-7_4