Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Quali- tätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No : 487-96). Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene ist die Bereitstellung von in Pflanzen funktionellen Promotoren. Promotoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression bestimmter Gene in einer transgenen Pflanze zu steuern und so bestimmte Wesensmerk- mals der Pflanze zu erzielen.

Verschiedene in Pflanzen funktionelle Promotoren sind bekannt, zum Beispiel konstitutive Promotoren wie der Promotor. der Nopalinsynthase aus Agroba-kterium, der TR-Doppelpromotor oder der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313 : 810-812). Nachteilig bei diesen Promotoren ist, dass sie in fast allen Geweben der Pflanze konstitutiv aktiv sind. Eine gezielte Expression von Genen in bestimmten Pflanzenteilen oder zu bestimmten Entwicklungszeit- punkten ist mit diesen Promotoren nicht möglich. Besonders groß ist daher der Bedarf an Promotoren mit einem definierten Aktivi- tätsprofil und einer Spezifität für bestimmte pflanzliche Gewebe.

Beschrieben sind Promotoren mit Spezifitäten für verschiedene pflanzliche Gewebe wie Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln, Knollen oder Samen. Die Stringenz der Spezifi- tät, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich.

Die pflanzliche Blüte dient der geschlechtlichen Fortpflanzung der Samenpflanzen. Pflanzliche Blüten-vor allem die Blüten- blätter (Petalen)-akkumulieren häufig große Mengen sekun- därer Pflanzenstoffe, wie beispielsweise Terpene, Anthocyane, Carotinoide, Alkaloide und Phenylpropanoide, die der Blüte als Duftstoffe, Abwehrstoffe oder als Farbstoffe dienen. Viele dieser Substanzen sind von ökonomischem Interesse. Zudem ist die Blütenknospe und die Blüte der Pflanze ein empfindliches Organ, besonders gegen Stressfaktoren wie Kälte.

Blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen- synthase Promotor (WO 92/16635), der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) oder der Promoter des APETALA3 Gens (Hill TA et al.

(1998) Development 125 : 1711-1721) sind bekannt. Diese Promotoren weisen jedoch alle einen oder mehrere Nachteile auf, die eine breite Nutzung beeinträchtigen : 1) Sie sind innerhalb der Blüte spezifisch für ein oder mehrere Blütengewebe und gewährleisten nicht die Expression in allen Geweben der Blüte.

2 Sie sind-wie im Beispiel des an der Blütenentwicklung beteiligten APETALA3 Gens-während der Blütenentwicklung stark reguliert und nicht zu allen Phasen der Blüten- entwicklung aktiv.

3) Sie zeigen mitunter starke Nebenaktivitäten in anderen pflanzlichen Geweben.

Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, besteht ein Bedarf an Promotoren mit einer Spezifität für die pflanzliche Blüte, die über einen langen Zeitraum der Blütenentwicklung und Blüte eine hohe Expression gewährleisten.

Es bestand daher die Aufgabe, Verfahren und geeignete Promotoren für die gezielte, transgene Expression von Nukleinsäuren in den Blütengeweben bereitzustellen. Diese Aufgabe wurde durch Bereit- stellung von Promotoren der E-Cyclase gelöst. Diese Promotoren zeigen eine ungewöhnliche starke Expression in zahlreichen Blütenorganen.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur gezielten, transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in der in der pflanzlichen Blüte, wobei nachfolgende Schritte umfasst sind I. Einbringen einer transgenen Expressionskassette in pflanz- liche Zellen, wobei die transgene Expressionskassette min- destens nachfolgende Elemente enthält a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine e-Cyclase, und b) mindestens eine weitere Nukleinsäuresequenz, und c) gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente, wobei mindestens eine der besagten Promotorsequenzen und eine weitere Nukleinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz oder die pflanzliche Zelle heterolog ist, und II. Auswahl von transgenen Zellen, die besagte Expressions- kassette stabil in das Genom integriert enthalten, und III. Regeneration von vollständigen Pflanzen aus besagten trans- genen Zellen, wobei mindestens eine der weiteren Nuklein- säuresequenz in der Blüte exprimiert wird.

Ein weiterer Gegenstand betrifft transgene Expressionskassetten, wie sie z. B. in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können. Bevorzugt umfassen die transgenen Expressions- kassetten zur gezielten, transgenen Expression von Nukleinsäure- sequenzen in der pflanzlichen Blüte, a) mindestens eine Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine £-Cyclase, und b) mindestens eine weitere Nukleinsäuresequenz, und c) gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente, wobei mindestens eine Promotorsequenz und eine weitere Nuklein- säuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Promotorsequenz heterolog ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver- fahrens und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten meint "Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine E-Cyclase"eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus i) der Promotorsequenz der E-Cyclase aus Tagetes erecta gemäß SEQ ID NO : 1, der E-Cyclase aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO : 7, der E-Cyclase aus Oryza sativa gemäß SEQ ID NO : 8, und ii) funktionellen Äquivalenten der Promotorsequenzen gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 mit im wesentlichen der gleichen Promotoraktivität wie der Promotor der e-Cyclasen gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 und iii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Sequenzen unter i) oder ii) mit im wesentlichen der gleichen Promotoraktivität wie der Promotor der E-Cyclasen gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8.

Besonders bevorzugt meint"Promotorsequenz eines Gens kodierend für eine E-Cyclase"die Promotorsequenz aus Tagetes erecta gemäß SEQ ID NO : 1 und funktionell äquivalente Fragmente derselben.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weiteren genetischen Kontrollsequenzen und/oder zusätzliche Funktions- elemente enthalten.

Bevorzugt können die transgenen Expressionskassetten durch die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, und/oder die Expression eines. von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense-RNA, anti-sense-RNA oder doppelsträngigen RNA ermöglichen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgener Expressionsvektoren, die eine der erfindungsgemäßen Expressions- kassette enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, die eine der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren enthalten. Der Organismus kann aus- gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, nicht-menschlichen tierischen und pflanzlichen Organismen oder von diesen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut, bevorzugt ist der Organismus aus- gewählt aus der Gruppe der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher eine isolierte Nukleinsäuresequenz umfassend den Promotor der der E-Cyclase aus Tagetes erecta gemäß SEQ ID NO : 1 sowie funktionell äquivalente Fragmente derselben.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungs- gemäße Nukleinsäuresequenz bzw. die erfindungsgemäße transgenen Expressionskassette in Form einer funktionell äquivalenten Promotorsequenz neben der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 zudem noch die Sequenz kodierend für die 5'-untranslatierte Region des E-Cyclase-Gens aus Tagetes erecta. Besonders bevorzugt ist die durch SEQ ID NO : 2 beschriebene Sequenz.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz bzw. die erfindungsgemäße transgenen Expressionskassette in Form einer funktionell äqui- valenten Promotorsequenz neben der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 zu- dem noch die Sequenz kodierend für die 5'-untranslatierte Region des e-Cyclase-Gens aus Tagetes erecta und eine Sequenz kodierend für ein Transitpeptid, bevorzugt für das Transitpeptid des E-Cyclase-Proteins aus Tagetes erecta gemäß SEQ ID NO : 4. Bevor- zugt ist diese Sequenz in 3'-Richtung in Bezug auf einen der erfindungsgemäßen Promotoren orientiert. Als Promotorsequenz in diesem Zusammenhang besonders bevorzugt ist die durch SEQ ID NO : 3 beschriebene Sequenz.

Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung der erfindungs- gemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen, transgenen Expressions- vektoren oder transgenen Organismen zur transgenen Expression von Nukleinsäuren und/oder Proteinen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz zur Verminderung der Expression einer e-Cyclase. In diesem Rahmen sind-Expressions- kassetten erfindungsgemäß umfasst, die eine zu der Promotor- sequenz korrespondierende doppelsträngige RNA zu exprimieren vermögen.

Insbesonders bevorzugt ist die Verwendung der besagten trans- genen Organismen oder von diesem abgeleitete abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut zur Her- stellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wobei die Feinchemikalien bevorzugt Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fett- säuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma-oder Farbstoffe sind. Erfindungsgemäß umfasst sind ferner Verfahren zur Herstellung besagter Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut,

Pharmazeutika oder Feinchemikalien unter Einsatz der erfindungs- gemäßen transgenen Organismen oder von diesen abgeleitete abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile, Gewebe, Organe oder Vermehrungsgut.

Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten sind aus nachfolgendem Grund besonders vorteilhaft : a) Sie gewähren eine selektive Expression in der Blüte von Pflanze und ermöglichen zahlreiche Anwendungen, wie bei- spielsweise eine Resistenz gegen Stressfaktoren wie Kälte oder eine gezielte Synthese von sekundären Pflanzenstoffen.

Die Expression erfolgt über den gesamten Entwicklungszeitraum der Blüte mit hoher Aktivität.

"Expression"meint die Transkription der transgen zu exprimieren- den Nukleinsäuresequenz, kann aber-im Falle eines offenen Lese- rasters in"sense"-Orientierung-auch die Translation der trans- kribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid mit einschließen.

"Transgen"meint-beispielsweise in Bezug auf eine transgene Expressionskassette, einen transgenen Expressionsvektor, einen transgenen Organismus oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren-alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene Konstruktionen oder Verfahren unter Verwendung derselben, in denen entweder a) ein E-Cyclase-Promotor (z. B. gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) oder ein funktionelles Äquivalent desselben oder ein funktionell äquivalentes vErA nt der vorgenannten, oder b) die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor gemäß a), oder c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Bevorzugt ist die in den Expressions- kassetten enthaltene erfindungsgemäße Promotorsequenz (z. B. die Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) heterolog in Bezug auf die mit ihr funktionell verknüpfte, transgen zu exprimierende weitere Nukleinsäuresequzenz."Heterolog"meint in diesem Zusammenhang, dass die weitere Nukleinsäuresequenz nicht für das Gen kodiert,

das natürlicherweise unter der Kontrolle des besagten Promotors steht.

"Natürliche genetische Umgebung"meint den natürlichen chromo- somalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Biblio- thek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäure- sequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt-beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors gemäß SEQ ID NO : 1 und eines Gens kodierend für ein Protein gemäß SEQ ID NO : 10 oder 12 wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn diese durch nicht- natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispiels- weise einer in vitro Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565, 350 ; WO 00/15815 ; siehe auch oben).

"Transgen"meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz einer transgenen Expressionskassette, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus-entsprechend dem oben gegebenen Definitionen- realisierten Expressionen.

Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten, die von ihnen abgeleitete transgenen Expressionsvektoren und trans- genen Organismen können funktionelle Äquivalente zu den unter SEQ ID NO :, 1, 7.. oder 8-hesc » ruebenen £ Cyclase-Promotorsequenz umfassen.

Funktionelle Äquivalente umfasst auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang der durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 definierten Sequenzen abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen. Besonders bevorzugt sind die Sequenzen gemäß SEQ ID NO : 2 oder 3 umfasst, die neben der Promotorsequenz die 5'-untranslatierte Region bzw. die 5'-un- translatierte Region und die Region kodierend für das Transit- peptid der £-Cyclase aus Tagetes erecta enthalten.

Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschrie- benen E-Cyclase-Promotorsequenz sowie deren Homologen aus anderen Pflanzengattungen und-arten, welche weiterhin im wesentlichen

die gleiche Promotoraktivität wie der £-Cyclase-Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 aufweisen.

Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeich- net, wenn die Transkription eines bestimmten zu exprimierenden Gens unter Kontrolle von z. B. eines funktionellen Äquivalentes der durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen £-Cyclase-Promotor- sequenz oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes derselben - unter ansonsten unveränderten Bedingungen-in mindestens einem Blüten-Gewebe höher ist als in einem anderen Nicht-Blüten Gewebe, beispielsweise der Wurzel oder den Blättern. Dabei beträgt die Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren in einem Blüten-Gewebe bevorzugt mindestens das doppelte oder das fünffache, ganz besonders bevorzugt mindestens das zehnfache oder das fünfzigfache, am meisten bevorzugt mindestens das hundert- fache als in einem anderen Nicht-Blüten Gewebe, beispielsweise der Wurzel oder den Blättern.

"Blüte"meint allgemein einen Spross begrenzten Wachstums, dessen Blätter zu Fortpflanzungsorganen umgewandelt sind. Die Blüte besteht aus verschiedenen"Blütengeweben"wie z. B. den Kelch- blätter (Sepalen), den Kronblätter (Petalen), den Staubblätter (oder Staub"gefäßen" ; Stamina) oder den Fruchtblätter (Karpel- len). Als Androeceum wird in der Blüte die Gesamtheit der Staub- blätter (Stamina) bezeichnet. Die Staubblätter befinden sich innerhalb des Petalen-bzw. Sepalenkreises. Ein Staubblatt gliedert sich in ein Filament und eine am Ende sitzende Anthere.

Diese wiederum unterteilt sich in zwei Theken, welche durch ein Konnektiv miteinander verbunden sind. Jede Theke besteht aus je zwei Pollensäcken, in denen der Pollen gebildet wird.

"Gezielt"meint in Bezug auf die Expression in der pflanzlichen Blüten bevorzugt, dass die Expression unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren in mindestens einem pflanzlichen Blütengewebe mindestens das zehnfache, besonders bevorzugt mindestens das fünfzigfache, ganz besonders bevorzugt bevorzugt mindestens das hundertfache beträgt als in einem Nicht-Blüten- gewebe wie beispielsweise den Blättern.

Bevorzugt werden im Rahmen der Ermittlung der Expressionshöhe solche Sequenzen eingesetzt, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter- proteine (Schenborn E, Groskreutz D. (1999) Mol Biotechnol 13 (1) : 29-44) wie"green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al.

(1996) Curr Biol 6 : 325-330 ; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5) : 912-8), Chloramphenicoltransferase, Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10 : 324-414), ß-Glucuronidase

oder ß-Galactosidase. Ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuro- nidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907).

"Ansonsten unveränderte Bedingungen"bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden transgenen Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird. Unveränderte Bedingungen bedeutet ferner, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Pflanzenart, Entwicklungsstadium der Pflanzen, Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate etc.) zwischen den zu vergleichenden Expressionen identisch gehalten werden.

Funktionelle Äquivalente zu dem £-Cyclase-Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 umfasst bevorzugt solche Sequenzen die a) im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der E-Cyclase-Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 aufweisen und b) die eine Homologie aufweisen von mindestens 50 %, bevorzugt 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 99% zu der Sequenz des der e-Cyclase- Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8, wobei sich die Homo- logie über eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren, bevor- zugt mindestens 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt von mindestens 500 Basenpaaren erstreckt.

Dabei kann die Expressionshöhe der funktionellen Äquivalente sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Ver- gleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unver- änderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50 %, bevor- zugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten mit denen durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen Promotoren unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der trans- kribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % einen Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen Promotor übersteigt.

Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten oder transgenen Expressionsvektoren zum Ein- satz kommenden funktionell äquivalenten Promotorsequenzen lassen. sich beispielsweise in verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz zumindest teilweise bekannt ist, wie beispielsweise Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium annuus, Linum sativum oder Oryza sativa durch Homologievergleiche in Datenbanken leicht auffinden. Bevor- zugt kann man dazu von den kodierenden Regionen des Gens aus- gehen, dessen Promotor durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschrieben ist. Ausgehend von beispielsweise den cDNA Sequenzen dieser Gene beschrieben durch SEQ ID NO : 9,11, 13 oder 15 oder den davon abgeleiteten Proteinsequenz beschrieben durch SEQ ID NO : 10,12, 14 oder 16 können die entsprechenden homologen Gene-und damit die zugehörigen Promotorregiönen-in anderen Pflanzenarten durch Durchmusterung von Datenbanken oder Genbanken (unter Ver- wendung von entsprechenden Gensonden) leicht in der dem Fachmann geläufigen Weise identifiziert werden.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfassen funktionelle Äquivalente zu dem £-Cyclase-Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 solche Sequenzen, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, die für eine E-Cyclase kodiert.

E-Cyclase meint allgemein all solche Proteine, die eine e-Cyclase- Aktivität aufweisen.

Unter e-Cyclase-Aktivität wird die Enzymaktivität einer e-Cyclase verstanden.

Unter einer e-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen e-Ionon-Ring zu überführen.

Insbesondere meint £-Cyclase allgemein all solche Proteine, die befähigt sind, die Ringbildung von Lycopen zu 6-Carotin (und gegebenenfalls weiter zu E-Carotin) und/oder von Neurosporen zu a-Zeacarotin zu katalysieren. Bevorzugt hat die £-Cyclase eine Oxidoreduktase-Aktivität und/oder zeigt natürlicherweise eine überwiegende Lokalisation in den Plastiden insbesondere den Chloroplasten und Chromoplasten.

Bevorzugt wird unter einer E-Cyclase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Lycopin in 8-Carotin umzuwandeln. Dementsprechend wird unter £-cyclase-Aktivität die in

einer bestimmten Zeit durch das Protein E-Cyclase umgesetzte Menge Lycopin bzw. gebildete Menge 8-Carotin verstanden.

Die Bestimmung der E-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp-bzw. Referenz- pflanzen erfolgt vorzugsweise unter folgenden Bedingungen : Die £-Cyclase-Aktivität kann nach Fraser und Sandmann (Biochem.

Biophys. Res. Comm. 185 (1) (1992) 9-15) in vitro bestimmt werden, wenn zu einer bestimmten Menge an Pflanzenextrakt Kaliumphosphat als Puffer (ph 7.6), Lycopin als Substrat, Stromaprotein von Paprika, NADP+, NADPH und ATP zugegeben werden.

Die Bestimmung der e-Cyclase-Aktivität in erfindungsgemäßen gene- tisch veränderten Pflanzen und in Wildtyp-bzw. Referenzpflanzen erfolgt besonders bevorzugt nach Bouvier, d'Harlingue und Camara (Arch Biochem Biophys 346 (1) (1997) 53-64) : Der in-vitro Assay wird in einem Volumen von 0,25 ml durchgeführt. Der Ansatz ent- hält 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,6), unterschiedliche Mengen an Pflanzenextrakt, 20 nM Lycopin, 0,25 mg an chromoplastidärem Stromaprotein aus Paprika, 0,2 mM NADP+, 0,2 mM NADPH und 1 mM ATP. NADP/NADPH und ATP werden in 0,01 ml Ethanol mit 1 mg Tween 80 unmittelbar vor der Zugabe zum Inkubationsmedium gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 30°C wird die Reaktion durch Zugabe von Chloroform/Methanol (2 : 1) beendet. Die in Chloroform extrahierten Reaktionsprodukte werden mittels HPLC analysiert.

Ein alternativer Assay mit radioaktivem Substrat ist beschrieben in Fräser'.'. r d Sandmann (Biochem Biophys Res Comm 185 (1) (1992) 9-15). Eine weitere analytische Methode ist beschrieben in Beyer, Kröncke und Nievelstein (J Biol Chem 266 (26) (1991) 17072-17078).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen funktionelle Äquivalente des E-Cyclase-Promotors beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 all solche Promotoren, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, die für eine e-Cyclase mit einer Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevor- zugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 % zu einem Protein gemäß SEQ ID NO : 10,12, 14 oder 16 kodieren, wobei besagte Promotoren den natürlichen Promotor der besagten genomischen Sequenz darstellen.

Besonders bevorzugt umfassen funktionelle Äquivalente des £-Cyclase-Promotors beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 all solche Promotoren, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, die für eine Nukleinsäuresequenz kodiert, deren abgeleitete cDNA eine Homo- logie von mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 % zu der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 9,11, 13 oder 15 hat, wobei besagte Promotoren den natürlichen Promotor der besagten genomischen Sequenz darstellen und die cDNA für eine e-Cyclase kodiert.

Bevorzugt sind Promotoren, die einen Sequenzbereich von min- destens 250 Basenpaare, bevorzugt mindestens 500 Basenpaare, besonders bevorzugt 1000 Basenpaare, am meisten bevorzugt min- destens 2000 Basenpaare in 5'-Richtung gerechnet vom ATG-Start- kodon der besagten genomischen Sequenzen umfassen.

Besonders bevorzugt sind funktionelle Äquivalente des e-Cyclase- Promotors beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 all solche Promotoren, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, die für eine e-Cyclase kodiert, die mindestens eines der nachfolgenden Sequenzmotive enthält : 1. G (G/C) GPAGL (A/S) (V/L) A (SEQ ID NO : 17) 2. (L/I) (N/G/S) RXYG (K/R) (V/L) (SEQ ID NO : 18) 3. MVFMD (Y/W) RD (SEQ ID NO: 19) 4. PTFLY (A/V) M (P/A) (SEQ ID NO : 20) 5. AXMVHP (S/A) TGY (M/S) V (A/V) R (SEQ ID. NO : 21) 6.--LW. R (R./K) RQRXFF (SEQ ID NO. 22) Ganz besonders bevorzugt sind als funktionelle Äquivalente des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 solche Promo- toren, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, welche für ein Protein kodiert, wobei besagtes Protein mindestens eine der nachfolgenden Sequenzen umfasst : 1. die homologe Sequenz (H1) aus Lactuca sativa gemäß SEQ ID NO : 24, 2. die homologen Sequenzen (H2 und H3) aus Adonis palaestina gemäß SEQ ID NO : 26 oder 28, 3. die homologen Sequenz (H4) aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO : 30 4. die homologe Sequenzen (H5 und H6) aus Citrus x paradisi gemäß SEQ ID NO : 32 oder 34

5. die homologe Sequenz (H7) aus Citrus sinensis gemäß SEQ ID NO : 36 6. die homologe Sequenz (H8) aus Spinacea oleracea gemäß.

SEQ ID NO : 38 7. die homologe Sequenz (H9) aus Solanum tuberosum gemäß SEQ ID NO : 40 8. die homologen Sequenzen (H10 und Hll) aus Daucus carota gemäß SEQ ID NO : 42 oder 44 9. die homologe Sequenz (H12) aus Tomate gemäß SEQ ID NO : 46 Am meisten bevorzugt sind als funktionelle Äquivalente des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 solche Promotoren, die sich in einem pflanzlichen Organismus in 5'-Richtung vor einer genomischen Sequenz befinden, welche für eine Nukleinsäuresequenz kodiert, deren abgeleitete cDNA mindestens eine der nachfolgenden Sequenzen. umfasst : 1. die homologe Sequenz (H1) aus Lactuca sativa gemäß SEQ ID NO : 23, 2. die homologen Sequenzen (H2 und H3) aus Adonis palaestina gemäß SEQ ID NO : 25 oder 27, 3. die homologen Sequenzen (H4) aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NO : 29 4. die homologe Sequenzen (H5 und H6) aus Citrus x paradisi gemäß SEQ ID NO : 31 oder 33 7. die homologe Sequenz (H7) aus Citrus sinensis gemäß SEQ ID NO : 35 5. die homologe Sequenz (H8) aus Spinacea oleracea gemäß SEQ ID NO : 37 6. die homologe Sequenz (H9) aus Solanum tuberosum gemäß ,.-^FQ. ID NO :. 39 8. die homologen Sequenzen (H10 und Hll) aus Daucus carota gemäß SEQ ID NO : 41 oder 43 9. die homologe Sequenz (H12) aus Tomate gemäß SEQ ID NO : 45 Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten oder transgenen Expressionsvektoren zum Ein- satz kommenden funktionell äquivalenten Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise in verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz zumindest teilweise bekannt ist, wie beispielsweise Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Oryza sativa, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium annuus, Linum sativum durch Homologievergleiche in Datenbanken leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Nukleinsäuresequenz oder eines Teils derselben in Verfahren zur Identifikation und/oder Isolation von Promotoren

von Genen, die für besagte Nukleinsäuresequenz kodieren, wobei besagte Nukleinsäuresequenz für eine Aminosäuresequenzen kodiert, die mindestens ein Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO : 17,18, 1. 9, 20, 21 oder 22 oder eine für diese Sequenzmotive angegebene Variation umfasst. Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsäuresequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 24, 26,28, 30,32, 34,36, 38,40, 42,44 oder 46. Besonders bevor- zugt umfasst besagte Nukleinsäuresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 23,25, 27,29, 29,31, 33,35, 37,39, 41,43 oder 45."Teil"meint in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz bevorzugt eine Sequenz von mindestens 10 Basen, bevorzugt 15 Basen, besonders bevorzugt 20 Basen, am meisten bevorzugt 30 Basen.

Erfindungsgemäß umfasst sind ferner Verfahren zur Identifikation und/oder Isolation von Promotoren von Genen, die für einen Promotor mit Spezifität für die pflanzliche Blüte kodieren, wobei bei der Identifikation und/oder Isolation mindestens eine Nukleinsäuresequenz oder ein Teils derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsäuresequenz für eine Aminosäuresequenzen kodiert, die mindestens ein Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO : 17,18, 19,20, 21 oder 22 oder eine für diese Sequenzmotive angegebene Variation umfasst. Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsäure- sequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 24,26, 28,30, 32,34, 36,38, 40,42, 44 oder 46.

Besonders bevorzugt umfasst besagte Nukleinsäuresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 23,25, 27,29, 29,31, 33,35, 37, 39,41, 43 oder 45."Teil"meint in Bezug auf die Nukleinsäure- sequenz bevorzugt eine Sequenz von mindestens 10 Basen, bevor- zugt 15 Basen, besonders bevorzugt 20 Basen, am meisten bevor- zugt 30 Basen. In einer Bevorzugten Ausführungsform basiert das (rfindungsgemäße Verfahren auf der Polymerasekettenreaktion, wobei die besagte Nukleinsäuresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird.

Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren bekannt, um ausgehend von einer Nukleinsäuresequenz (z. B. einem Gentranskript wie bei- spielsweise einer cDNA) den Promotor des entsprechenden Genes zu identifizieren und zu isolieren. Dazu stehen beispielsweise prinzipiell alle Methoden zur Amplifikation flankierender chromosomaler Sequenzen zur Verfügung. Die beiden am häufigsten genutzten Verfahren sind die inverse PCR ("iPCR" ; schematisch dargestellt in Fig. 13) und die"Thermal Asymmetric Interlaced PCR" ("TAIL PCR"). Geeignet ist ferner auch das Verfahren des "PCR Walkings" (Devic et al. (1997) Plant Physiol Biochem 35 : 331-339).

Für die"iPCR"wird genomische DNA des Organismus, aus dem der funktionell äquivalente Promotor zu isolieren ist, mit einem gegebenen Restriktionsenzym komplett verdaut und anschließend werden in einem verdünnten Ansatz die einzelnen Fragmente rück- ligiert, also mit sich selbst zu einem ringförmigen Molekül ver- bunden. In der Vielzahl entstehender ringförmiger DNA-Moleküle befinden sich auch solche, die die bekannte Sequenz (beispiels- weise die Sequenz kodierend für das homologe Protein) enthalten.

Ausgehend davon kann das ringförmige Molekül mittels PCR amplifi- ziert werden, indem ein Primerpaar verwendet wird, bei dem beide Primer sich an den bekannten Sequenzabschnitt anlagern können.

Eine Ausführungsmöglichkeit für die"iPCR"ist beispielhaft in Beispiel 2 wiedergegeben.

Die"TAIL-PCR"beruht auf der Verwendung von einerseits einem Satz sukzessive verkürzter hochspezifischer Primer, die sich an die bekannte genomische Sequenz (beispielsweise die Sequenz kodierend für das homologe Protein) anlagern, und andererseits einem Satz kürzerer Zufallsprimer mit geringer Schmelztemperatur, so dass eine sequenzunspezifischere Anlagerung an die bekannte genomische Sequenz flankierende genomische DNA erfolgt. Die Anlagerung der Primer an die zu amplifizierende DNA kann mit einer solchen Primerkombination so gestaltet werden, dass eine spezifische Amplifikation der gewünschten Zielsequenz möglich wird. Eine Ausführungsmöglichkeit für die"TAIL-PCR"ist bei- spielhaft in Beispiel 2 wiedergegeben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Her- stellung einer transgenen Expressionskassette mit Spezifität für die pflanzliche Blüten, umfassend nachfolgende Schritte : I. Isolation einer Promotorsequenz, wobei bei der Isolation min- destens eine Nukleinsäuresequenz oder ein Teils derselben zum Einsatz kommt, wobei besagte Nukleinsäuresequenz für eine Aminosäuresequenzen kodiert, die mindestens ein Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO : 17,18, 19,20, 21 oder 22 oder eine für diese Sequenzmotive angegebene Variation umfasst.

II. Funktionelle Verknüpfung besagter Promotorsequzenz mit einer weiteren Nukleinsäuresequenz, wobei besagte Nukleinsäure- sequenz in Bezug auf den Promotor heterolog ist.

Bevorzugt kodiert besagte Nukleinsäuresequenz für eine Amino- säuresequenz umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 24,26, 28,30, 32,34, 36,38, 40,42, 44 oder 46. Besonders bevor- zugt umfasst besagte Nukleinsäuresequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 23,25, 27,29, 29,31, 33,35, 37,39, 41,43 oder

45."Teil"meint in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz bevor- zugt eine Sequenz von mindestens 10 Basen, bevorzugt 15 Basen, besonders bevorzugt 20 Basen, am meisten bevorzugt 30 Basen. In einer bevorzugten Ausführungsform basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Polymerasekettenreaktion, wobei die besagte Nukleinsäuresequenz oder ein Teil derselben als Primer eingesetzt wird. Im Rahmen der funktionellen Verknüpfung können dem Fachmann bekannte Verfahren wie z. B. Ligation etc. eingesetzt werden (s. u.).

Die Expressionshöhe eines funktionell äquivalenten Promotors kann sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu dem Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50 %, bevorzugt 25 %, besonders bevorzugt 10 % von einem Vergleichswert erhalten mit denen durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen Promotoren unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % einen Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevor- zugt ist als Vergleichswert die Expressionshöhe der natürlicher- weise von dem Promotor exprimierten mRNAs einer e-Cyclase oder des daraus resultierenden Proteins. Bevorzugt ist ferner als Ver- gleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nuklein- säuresequezen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren.

Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E & Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1) : 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6 : 325-330 ; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques.

23 (5) : 912-8), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10 : 324-414) oder die ß-Glucuronidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907).

Funktionelle Äquivalente umfassen auch natürliche oder künst- liche Mutationen der unter SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschriebenen Promotorsequenz. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleo- tidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation des E-Cyclase-Promotors gemäß SEQ ID NO : 1,

7 oder 8 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z. B. auch das Ein- fügen oder Entfernen von Restriktionsendonukleaseschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.

Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Trans- itionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese,"primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Transition meint einen Basenpaaraustausch eines Purin/Pyrimidin-Paares in ein anderes Purin/Pyrimidin-Paar (z. B. A-T gegen G-C). Transversion meint einen Basenpaaraustausch eines Purin/Pyrimidin-Paares gegen ein Pyrimidin/Purin-Paar (z. B. A-T gegen T-A). Deletion meint die Entfernung eines oder mehrerer Basenpaare.. Insertion meint die Einführung eines oder mehrerer Basenpaare.

Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion,"ohewing-back"oder Auffüllen von Überhängen für"blunt ends"können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 12 Length Weight : 4 Average Match : 2,912 Average Mismatch : -2, 003 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 nach obigem Programm- algorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von min- destens 50 % aufweist.

Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge ver- standen, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin,

Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2,912 Average Mismatch : -2, 003 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 60 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 10 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 10 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 60 % aufweist.

Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für den tCyclase-Promotorgemä$ SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Promotoreigenschaften haben. Der Begriff der Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint sowohl stringente als auch weniger stringente Hybridi- sierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Mole- cular Cloning-A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6. beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr-500C bevor- zugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0).

Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.

Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen- wart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritte sind infolge gegeben :

(1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel a) 4X SSC bei 65°C, oder b) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 Fg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder c) 4X SSC, 50 % Formamid, bei 42°C, oder d) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder e) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40 % Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung), oder f) 6x SSC bei 45°C, oder, g) 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 2 mM EDTA, 1 % BSA und 7 % SDS.

(2) Waschschritte mit zum Beispiel a) 0,1X SSC bei 65°C, oder b) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C, oder c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oder d) 0,2X SSC, 0, 1 % SDS bei 42°C, oder e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung), oder f) 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 1 % SDS, 2 mM EDTA.

Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äqui- valente umfassen bevorzugt die Einführung von Mutationen in den E-Cyclase-Promotor gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8. Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial-and-error"Prozedur durchmustert werden. Besonders vor- teilhafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise die Höhe der resultierenden Expression der eingeführten-. kleinsäure- sequenz in einem Blüten-Gewebe.

Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer"Site- specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154 : 367-382 ; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12 : 1656 ; Upender et al. (1995) Biotechniques 18 (1) : 29-30 ; US 4,237, 224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise transgenen Expressions- vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen

enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.

Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen eines erfindungs- gemäßen Promotors deletiert werden, ohne die genannten wesent- lichen Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktionell äquivalente Fragmente zu den Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 oder zu funktionellen Äquivalentes derselben dar. Die Eingrenzung der Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann z. B. mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotor- elemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements" ; Higo K et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (1) : 297-300), der BIOBASE Datenbank"Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig ; Wingender E et al. (2001) Nucleic Acids Res 29 (1) : 281-3) oder Datenbank PlantCARE (Lescot M et al.

(2002) Nucleic Acids Res 30 (1) : 325-7) vorgenommen werden.

Bevorzugt umfassen die funktionell äquivalenten Fragmente eines der erfindungsgemäßen Promotoren-beispielsweise der E-Cyclase- Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8-mindestens 200 Basenpaar, ganz besonders bevorzugt mindestens 500 Basen- paare, am meisten bevorzugt mindestens 1000 Basenpaare des 3'-Endes des jeweiligen erfindungsgemäßen Promotors-beispiels- weise der Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 -, wobei die Länge vom Translationsstart ("ATG"-Kodon) in 5'-Richtung stromaufwärts gerechnet wird.

Weitere funktionell äquivalente Fragmente können beispielsweise durch Deletion eventuell noch vorhandener 5'-untranslatierter Bereiche erzeugt werden. Zu diesem Zweck kann der Transkriptions- start der entsprechenden Gene durch dem Fachmann geläufige Ver- fahren (wie beispielsweise 5'-RACE) bestimmt und die 5'-untrans- latierten durch PCR-vermittelte Methoden oder Endonukleaseverdau deletiert werden. So können beispielsweise die in den Promotoren. gemäß SEQ ID NO : 7 oder 8 umfassten 5'-untranslatierten Regionen deletiert werden, ohne dass der Promotor seine wesentliche Funktionalität verliert. Entsprechende Deletionsvarianten sind ausdrücklich als funktionelle Äquivalente umfasst.

In erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten steht minde- stens einer der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Bei- spiel die sequentielle Anordnung eines der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer genetischer Kontrollsequenzen wie zum Beispiel einem Terminator oder einer Polyadenylierungssequenz derart, dass der Promotor seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz unter geeigneten Bedingungen erfüllen kann und die Expression der Nukleinsäuresequenz (d. h. Transkription und gegebenenfalls Translation) erfolgt."Geeignete Bedingungen" meint dabei bevorzugt das Vorliegen der Expressionskassette in einer pflanzlichen Zelle, bevorzugt einer pflanzlichen Zelle umfasst von einem pflanzlichen Blüte.

Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu expri- mierende Nukleinsäuresequenz hinter einem der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierenden Nuklein- säuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung eines transgenen*Expresss konstruktes kann mittels gängiger Rekombinations-und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) und in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience beschrieben sind.

Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann das trans- gene Expressionskonstrukt, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert

in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Kon- struktionen zu verstehen, bei denen einer der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8), ohne dass er zuvor notwendigerweise mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte endogene Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors-zum Beispiel durch eine homologe Rekombination-vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungs- gemäße Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides gezielt in der pflanzlichen Blüte steuert. Auch kann beispielsweise der natürliche Promotor eines endogenen Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) ausgetauscht und so das Expressions- verhalten des endogenen Gens modifiziert werden.

Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA oder eine doppelsträngige RNA (z. B. in Form eines invertierten"Repeats") zu der für ein bestimmtes Poly- peptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expression des bestimmten Polypeptides in der pflanzlichen Blüte heruhterreguliert oder ausgeschaltet.

Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäure- sequenz-zum Beispiel durch cJine § ologe Rekombination-hinter die Sequenz kodierend für einen der erfindungsgemäßen Promotoren (z. B. beschrieben durch SEQ ID NO : 1, 7 oder 8), die sich in ihrem natürlichen chromosomalen Kontext befindet, so plaziert werden, dass man eine erfindungsgemäße Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in der pflanzlichen Blüte steuert.

Die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten können weitere genetische Kontrollsequenzen umfassen. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion einer erfindungsgemäßen transgenen Expressions- kassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten 3'-stromab-

wärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nuklein- säuresequenz eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- steuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266 (26) : 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3) : 246-53) beschrieben.

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine transgene Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Promotoren kommen im Prinzip alle in Pflanzen funktionelle Promotoren in Frage. ~In Pflanzen funktionelle Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, ins- besondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen,-zellen, -geweben,-kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.

Bevorzugt sind konstitutive Promotoren, gewebespezifische Promotoren, entwicklungsabhängige Promotoren, chemisch-induzier- bare stress-induzierbare oder pathogen-induzierbare Promotoren.

Entsprechende Promotoren-azncs-2mn Fachmann allgemein bekannt.

Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren gram-positiver Bakterien wie amy und SP02 oder in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH zu finden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs- gemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die. 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein : The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)), bevorzugt

der Gene mit dem Genlocus At2g46720, At3g01980 und Atlg63140 aus Arabidopsis thaliana. Es kann gezeigt werden, dass derartige Regionen eine signifikante Funktion bei der Regulation der. Gen- expression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untrans- latierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 : 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al.

(1998) Plant J 15 : 435-440). Die unter SEQ ID NO : 2,7 oder 8 angegebenen Nukleinsäuresequenzen repräsentieren jeweils die Promotorregion und die 5'-untranslatierte Regionen bis zum ATG- Startcodon der jeweiligen Gene.

Das transgene Expressionskonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte"enhancer Sequenzen"funktionell ver- knüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die trans- gen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobakterium tumefaciens. Beispiele für besonders geeignete Terminator- sequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden.

Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebe- spezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung des trans- genen Expressionskonstruktes aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods 14 (4) : 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Eine transgene Expressionskassette und/oder die von ihm abgeleiteten transgenen Expressionsvektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist

breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Ein- fluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungs- gemäßen transgenen Expressionskonstrukte, der transgenen Expressionsvektoren oder der transgenen Organismen haben.

Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen : a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen Biozide wie Metabolismusinhibitoren (z. B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat ; WO 98/45456), Antibiotika (z. B. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin) oder-bevorzugt-Herbizide (z. B. Phosphino- tricin) verleihen. Als Selektionsmarker seien beispielhaft genannt : Phosphinothricinacetyltransferasen (bar und pat Gen), welche Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren, 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthase- gene), die eine Resistenz gegen Glyphosat (N-(phosphono- methyl) glycin) verleihen, Glyphosat degradierende Enzyme (gox-Genprodukt ; Glyphosatoxidoreduktase), Dehalogenasen, welche z. B. Dalapon inaktivieren (deh Genprodukt), Sulfonyl- urea-und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie Nitrilasen, welche z. B. Bromoxynil degradieren (bxn Genprodukt), das aasa-Genprodukt, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, Streptomycinphospho- transferasen (SPT), die eine Resistenz gegen Streptomycin gewähren, Neomycinphosphotransferasen (NPTII), die eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleihen, das Hygromycinphosphotransferasen (HPT), die eine Resistenz gegen Hygromycin vermitteln, das Acetolactatsynthasen (ALS), die eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleihen (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der S4 und/oder Hra Mutation). b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressions- ortes oder-zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevor- zugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D.

Mol Biotechnol. 1999 ; 13 (1) : 29-44) wie das"green fluore- scence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luzi- ferase (Ow et al. (1986) Science 234 : 856-859), das Aequorin- Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268), die ß-Galactosidase, ganz besonders bevor- zugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907).

c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs- gemäßen transgenen Expressionskonstrukte oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten.

Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al. : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentrans- formation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

"Einführen"umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet sind, eine Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine erfindungsgemäße Expressionskassette) direkt oder indirekt, in einen Organismus (z. B. ein Pflanze) oder eine Zelle, Komparti- ment, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial (z. B. Samen oder FRüchte) derselben einzuführen oder dort zu generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Das Einbringen kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz besagter Nukleinsäuresequenz führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen). Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Trans- fektion, Transduktion oder Transformation. Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet.

Das Einführen einer erfindungsgemäßen transgenen Expressions- kassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) kann vorteilhaft unter Verwendung'von-vktoren realisiert werden, in denen die trans- genen Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agro- bakterien sein. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor kann zunächst in E. coli eingeführt und amplifiziert werden. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressions- kassette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die ent- sprechende DNA (z. B. der Expressionsvektor) oder RNA in die

entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 : 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln ein- geführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektro- poration ist eine weitere geeignete Methode zum Einführen von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100 : 247-250 ; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228 : 104-112 ; Guerche et al. (1987) Plant Science 52 : 111-116 ; Neuhause et al.

(1987) Theor Appl Genet 75 : 30-36 ; Klein et al. (1987) Nature 327 : 70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208 : 1265 ; Horsch et al. (1985) Science 227 : 1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91 : 694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds. ) Academic Press Inc. (1988) ; and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).

Als Vektoren zur Expression in E. coli sind bevorzugt pQE70, pQE60 und pQE-9 (QIAGEN, Inc. ) ; pBluescript Vektoren, Phagescript Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.) ; ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Biotech, Inc.).

Bevorzugte Vektoren zur Expression in Säugerzellen umfassen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG (Stratagene Inc.) ; pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia Biotech, Inc. ). Als induzierbare Vektoren seien pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4/TO, pcDNA4/TO/ LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ, pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/TO/Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc. ) oder die pMAM-Serie (Clontech, Inc. ; GenBank Accession No. : U02443) zu nennen. Diese stellen bereits das induzierbare regulatorische Kontrollelement beispielsweise für eine chemisch, induzierbare Expression zur Verfügung.

Vektoren für die Expression in Hefe umfassen beispielhaft pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3. 5, PHIL-D2, PHIL-S1, pPIC3SK, pPIC9K, und PA0815 (Invitro- gen, Inc.).

Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572 ; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3) : 239-251 ; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31 : 10004-1012).

Prinzipiell sind für die Transformation tierischer Zellen oder von Hefezellen ähnliche Verfahren wie für die"direkte"Tran- formation von pflanzlichen Zellen anzuwenden. Insbesondere Ver- fahren wie die Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Trans- formation oder aber Elektroporation sind bevorzugt.

Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993) ; White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und Wu R, Academic Press, 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225 ; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73). Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur trans- ienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylen- glykol-induzierte DNA-Aufnahme, Calciumphosphat-vermittelte Transformation, DEAE-Dextran-vermittelte Transformation, Lipo- some& ermittelte Transformation (Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29 : 1353ff ; US 4,536, 475), biolistische Verfahren mit der Genkanone ("particle bombardment"Methode ; US 5,100, 792 ; EP-A 0 444 882 ; EP-A 0 434 616 ; Fromm ME et al. (1990) Bio/Tech- nology 8 (9) : 833-9 ; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2 : 603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA- haltiger Lösung, Elektroporation (EP-A 290 395, WO 87/06614), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 0 331 083, EP-A 0 175 966) oder andere Methoden der direkten DNA-Einführung (DE 4 005 152, WO 90/12096, US 4,684, 611). Physikalische Methoden der DNA-Einführung in pflanzliche Zellen sind im Überblick dar- gestellt bei Oard (1991) Biotech Adv 9 : 1-11.

Im Falle dieser"direkten"Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt.

Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pA- CYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen

aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, dass sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.

Neben diesen"direkten"Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobakterium (z. B. EP 0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553 ; US 4, 407, 956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161) oder mit- tels Pollen (EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4,684, 611) durchgeführt werden.

Bevorzugt erfolgt die Transformation mittels Agrobakterien, die "entwaffnete" (disarmed) Ti-Plasmidvektoren enthalten, wobei deren natürliche Fähigkeit zum Gentransfer auf Pflanzen genutzt wird (EP-A 0 270 355 ; EP-A 0 116 718).

Agrobakterium-Transformation ist weit verbreitet für die Trans- formation von Dicotyledonen, wird aber auch zunehmend auf Mono- cotyledonen angewandt (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6 : 1072-1074 ; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7 : 379-384 ; Zhang et al. (1988) Theor Appl Genet 76 : 835-840 ; Shimamoto et al.

(1989) Nature 338 : 274-276 ; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8 : 736-740 ; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9 : 957-962 ; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574 ; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep 11 : 585-591 ; Li et al. (1993) Plant Cell Rep 12 : 250-255 ; Rathore et al. (1993) Plant Mol Biol 21 : 871-884 ; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8 : 833-839 ; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2 : 603-618 ; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4 : 1495-1505 ; Walters et al.

(1992) Plant Mol Biol 18 : 189-200 ; Koziel et al. (1993) Bio- 4 » nw ology 11 : 194-200 ; Vasil IK (1994) Plant Mol Biol 25 :. 925-937 Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102 : 1077-1084 ; Somers et al.

(1992) Bio/Technology 10 : 1589-1594 ; WO 92/14828 ; Hiei et al.

(1994) Plant J 6 : 271-282).

Die für die Agrobakterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agro- bakterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzen- zelle integriert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre Vektoren (Mini-Ti-Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden.

Die Anwendung von Agrobakterium tumefaciens für die Trans- formation von Pflanzen unter Verwendung von Gewebekultur- explantaten ist beschrieben (u. a. Horsch RB et al. (1985)

Science 225 : 1229ff. ; Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80 : 4803-4807 ; Bevans et al. (1983) Nature 304 : 184-187).

Viele Stämme von Agrobakterium tumefaciens sind in der Lage, genetisches Material-beispielsweise die erfindungsgemäßen Expressionskassetten-zu übertragen, wie z. B. die Stämme EHA101 [pEHA101], EHA105 [pEHA105], LBA4404 [pAL4404], C58Cl [pMP90] und C58C1 [pGV2260] (Hood et al. (1993) Transgenic Res 2 : 208-218 ; Hoekema et al. (1983) Nature 303 : 179-181 ; Koncz and Schell (1986) Gen Genet 204 : 383-396 ; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13 : 4777-4788).

Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischen- vektor (englisch : shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterium replizieren können.

Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobakterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163 : 181-187). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobakterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region ent- halten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanz- liche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobakterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP-A 0 120 516 ; Hoekema, In : The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V ; An et al. (1985) EMBO J 4 : 277-287). Ver- schiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101. 2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA ; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12 : 8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.

Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, ins- besondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeig- neten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant

Molec Biol 42 : 205-225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionssysteme enthalten.

Stabil transformierte Zellen (d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten) können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionier- barer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen ein Biozid (z. B. ein Antibiotikum oder Herbizid (s. o. ) zu ver- leihen vermag (s. o. ). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Biozids zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untrans- formierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84).

Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be- kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen, einzelnen Zellen (z. B. Protoplasten) oder Blattscheiben aus (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press ; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press). Aus diesen noch undifferenzierten Kallus-Zellmassen. kann. von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.

Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11 : 567-570 ; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep.

14 : 273-278 ; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89 : 525-533).

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein- säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemver- mehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektions- methoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe ver- änderte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phänotyp der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Or- ganismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor,. sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile-wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. -oder Vermehrungs- gut abgeleitet von solchen Organismen.

Unter Organismus, Ausgangs-oder Wirtsorganismen werden prokaryotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevor- zugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.

Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobakterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synecho- cystis und weitere in Brock Biology of Microorganisms Eighth Edition auf den Seiten A-8, A-9, A10 und All beschriebenen Bakteriengattungen.

Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agro- bakterium turnefaciens. Besonders bevorzugte Mikroorganismen sind solche, die zur Produktion von Toxinen (z. B. Botulinus Toxin), Pigmenten (z. B. Carotinoiden oder Flavonoiden), Antibiotika (z. B. Penicillin), Phenylpropanoiden (z. B. Tocopherol), Poly- ungesättigten Fettsäuren (z. B. Arachidonsäure) oder Vitaminen (z. B. Vitamin B12) befähigt sind.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula ceer Pichia.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts-oder Ausgangs- organismen sind vor allem pflanzliche Organismen.

"Pflanzlicher Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines zur Photosynthese befähigten Organismus. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzen- reiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt.

"Pflanze"im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Ein- geschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saat- gut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Ver- mehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzen- organe, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zell-oder Kalluskulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungs- stadium.

Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grün- algen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt sind Synechocystis, Chlamydomonas und Scenedesmus.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind insbesondere pflanzliche Organismen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Blütenpflanzen (Phylum Anthophyta sind alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen. Bevorzugt ist die Pflanze aus nach- folgenden Pflanzenfamilien ausgewählt : Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruci- ferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifraga- ceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae und Umbelliferae.

Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt auf dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel den nachfolgenden 1) Kategorie : Dicotyledonae (Dicotyledonen). Bevorzugte Familien : - Aceraceae (Ahornhölzer) - Cactaceae (Kakteen) - Rosaceae (Rosen, Äpfel, Mandeln, Erdbeeren) - Salicaceae (Weiden) - Asteraceae (Compositae) besonders die Gattung Lactuca, ganz be- sonders die Art sativa (Salat), sowie Sonnenblume, Löwenzahn, Tagetes oder Calendula und andere mehr, - Cruciferae (Brassicaceae), besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea (z. B. Kohl, Blumenkohl oder Broccoli und weitere Kohlarten) ; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse, Rettich, Canola und andere mehr, - Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis, Gurken oder Zucchini und andere mehr, - Leguminosae (Fabaceae) besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohneo Soja sowie Arsal. fa, Erbset Bohnengewächsen, Lupine oder Erdnuss und andere mehr, - Malvaceae insbesondere Malve, Baumwolle, essbarer Eibisch, Hibiscus und andere mehr, - Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr, - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Auber- gine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Paprika), sowie Tabak, Petunie und andere mehr,

- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie bei- spielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr, - Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispiels- weise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr, - Umbelliferae (Apiaceae), besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte) ), Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie) ) sowie Petersilie und andere mehr ; sowie Lein, Hanf, Flachs, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den ver- schiedenen Baum-, Nuss-und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.

Darüberhinaus sind jedoch auch monokotyle Pflanzen geeignet.

Bevorzugt sind diese ausgewählt aus den monokotylen Kultur- pflanzen, wie zum Beispiel den Familien - Arecaceae (Palmen) - Bromeliaceae (Ananas, spanisches Moos) - Cyperaceae (Seggen) - Liliaceae (Lilien, Tulpen, Hyazinthen, Zwiebel, Knoblauch) - Orchidaceae (Orchideen) - Poaceae (Gräser, Bambusse, Mais, Zuckerrohr, Weizen) - Iridaceae (Blenden, Gladiolen, Krokusse) Ganz besonders bevorzugt sind Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer'sowie dem Zuckerrohr von Gräsern.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Expressionskassette kann die Expression einer bestimmten Nukleinsäure durch einen Promotor mit Spezifität für die pflanzliche Blüte zu Bildung von sense-RNA, antisense RNA oder doppelsträngiger RNA in Form einer inversen Wiederholung (dsRNAi) führen. Die sense-RNA kann infolge in be- stimmte Polypeptide translatiert werden. Mit der antisense-RNA und dsRNAi kann die Expression bestimmter Gene herunterreguliert werden.

Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference" ; dsRNAi) ist vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43 : 401-415 ; Fire A et al (1998) Nature 391 : 806-811 ; WO 99/32619 ; WO 99/53050 ; WO 00/68374 ; WO 00/44914 ; WO 00/44895 ; WO 00/49035 ; WO 00/63364). Auf die

in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen.

Die Spezifität der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte und Vektoren für pflanzliche Blüten ist besonders vorteilhaft.

Die Blüte hat eine Funktion im Anlocken von Nutzinsekten durch Pigmenteinlagerung oder Synthese flüchtiger Chemikalien.

Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Bei- spiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren, oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin (Vaeck et al. (1987) Nature 328 : 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne (Broglie et al. (1991) Science 254 : 1194-1197).

Kälteeinbrüche in der Blütezeit führen jedes Jahr zu erheblichen Ernteverlusten. Eine gezielte Expression schützender Proteine gezielt in der Blüteperiode kann einen Schutz gewähren.

Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz vor allem in den Petalen der Blüte vorteilhaft. Eine konstitutive Expression in der gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Verdünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw. die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchtigen. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing").

Hierzu sind Promotoren mit Spezifität für die Blüte vorteilhaft.

Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression in der Blüte vorteilhaft sind. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer ent- sprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für vor- teilhafte Effekte seien zu nennen : Das Erzielen einer Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, W-Strahlung) und biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten), die Verbesserung von Nahrungs-oder Futtereigenschaften, die Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages, das Erzielen einer längeren oder früheren Blütezeit, die Veränderung oder Verstärkung des Duftes oder der Farbgebung der Blüten. Für die in diesen Anwendungen einsetzbaren Nukleinsäuresequenzen oder

Polypeptide seien beispielhaft, aber nicht einschränkend, zu nennen : 1. Verbesserter UV-Schutz der pflanzlichen Blüte durch Ver- änderung der Pigmentierung durch Expression bestimmter Poly- peptide wie Enzyme oder Regulatoren der Flavonoidbiosynthese (z. B. Chalconsynthasen, Phenylalaninammoniumlyasen), der DNA-Reparatur (z. B. Photolyasen ; Sakamoto A et al. (1998) DNA Seg 9 (5-6) : 335-40), der Isoprenoidbiosynthese (z. B. Deoxyxy- lulose-5-phosphatsynthasen), der IPP-Synthese oder der Caro- tinoidbiosynthese (z. B. Phytoensynthasen, Phytoendesaturasen, Lycopincyclasen, Hydroxylasen oder Ketolasen). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Chalconsynthase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. -No. : M20308), die 6-4 Photolyase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No. : BAB00748) oder das Blaulicht-Photorezeptor/Photolyase-Homolog (PHHl) aus Arabi- dopsis thaliana (GenBank Acc. -No. : U62549) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

2. Verbesserter Schutz der pflanzlichen Blüte gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Bei- spiel durch Überexpression von dem"antifreeze"-Polypeptiden (z. B. aus Myoxocephalus Scorpius ; WO 00/00512), dem Arabi- dopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamat- dehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calci- neurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580 ; Pei ZM et al. (1998) Science 282 : 287-290), Ferritin (Deak M et al. (1999) Nature Biotechnology 17 : 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013 ; Dunwell JM (1998)-Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 15 : 1-32), DREBlA-Faktor (dehydration response element B lA ; Kasuga M et al. (1999) Nature Bio- technology 17 : 276-286), Genen der Mannitol-oder Trehalose- synthese (z. B. Trehalosephosphatsynthasen ; Trehalosephosphat- phosphatasen, WO 97/42326) ; oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBFl aus Arabidopsis thaliana (Gen-Bank Acc. -No. : U77378) oder das "antifreeze"-Protein"aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc. -No. : AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

3. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der Blüte. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Nematoden-

abwehr), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme, die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen-Resi- stenz-und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikro- biellen Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus verschiedenenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, a-Amylase- inhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsininhibitor), Glucanasen, Lektine (z. B. Phytohemagglutinin, Schnee- glöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin), RNAsen oder Ribozyme.

Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc. -No. : S78423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.- No. : U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

4. Erreichen einer Insektenabwehr oder-anlockung zum Beispiel durch erhöhte Freisetzung flüchtiger Duft-oder Botenstoffe durch zum Beispiel Enzyme der Terpenbiosynthese.

5. Erreichen einer Speicherfähigkeit in Blütengeweben, die normalerweise keine Speicherproteine oder-lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, z. B. durch Expression einer Acetyl-CoA-Carboxylase oder von Enzymen zur Veresterung von Metaboliten. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc. -No. : L25042) oder funktionelle Äge alers erselben kodieren.

6. Expression von Transportproteinen, die die Aufnahme von Meta- boliten, Nährstoffen oder Wasser in die Blüte verbessern und so das Blütenwachstum, die Metabolitenzusammensetzung oder den Ertrag optimieren, zum Beispiel durch Expression eines Aminosäuretransporters, der die Aufnahme von Aminosäuren beschleunigt, oder eines Monosaccharid-Transporters, der die Aufnahme von Zuckern fördert. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den kationische Aminosäure-Transporter aus Arabi- dopsis thaliana (GenBank Acc. -No. : X92657) oder für den Mono- saccharid-Transporter aus Arabidopsis thaliana (Gen-Bank Acc.-No. : AJ002399) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

7. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Fein- chemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen, Phenyl- propanoiden, Isoprenoiden oder Carotinoiden, in der Blüte bewirken. Beispielhaft seien die Deoxyxylulose-5-phosphat- synthasen, Phytoensynthasen, Lycopin-ß-cyklasen und die ß-Carotinketolasen genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Haematoccus pluvialis NIES-144 (Acc. No. D45881) Ketolase oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

8. Modifikation der Wachsesterbildung oder der Zusammensetzung der eingelagerten Oligosaccharide zur Verbesserung des Schutzes gegen Umwelteinflüsse oder zur Verbesserung der Verdaubarkeit beim Einsatz in Futter-oder Nahrungsmitteln.

Beispielhaft sein die Überexpression der Endoxyloglucantrans- ferase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Endo-xyloglucantransferase (EXGT-Al) aus Arabidopsis thaliana (Gen-Bank Acc. -No. : AF163819} oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

9. Expression von Genen, DNA Bindeproteinen, dsRNA und antisense Konstruktionen, zur Veränderung der Blütenmorphologie, des Blühzeitpunktes und der Blütenseneszenz sowie des Blütenmeta- bolismus. Bevorzugt sind Konstruktionen, die die Anzahl der Petalen erhöhen z. B. durch Herunterregulation von AGAMOUS und dessen homologen Genen (Yanofsky MF et al. (1990) Nature 346 : 35-39) den Blühzeitpunkt verfrühen z. B. durch Herunter- regulation von FLOWERING LOCUS C (FLC) (Tadege M et al.

(2001) Plant J 28 (5) : 545-53) oder verspäten z. B. durch Über- expression von FLC und die Seneszenz verzögern z. B. durch Vermittlung einer blütenspezifischen Ethyleninsensitivität.

10. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Befruchtung und/oder der Keimung mit Hilfe der Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins in Blüten.

11. Produktion von Nutraceuticals wie zum Beispiel a) Carotinoide und/oder Phenylpropanoide z. B. durch Opti- mierung der blüteneigenen Stoffwechselwege z. B. durch Expression von Enzymen und Regulatoren der Isoprenoid- biosynthese. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Chalconsynthase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.- No. : M20308), die 6-4 Photolyase aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. No. : BAB00748) oder den Blaulicht-Photo- rezeptor/Photolyase Homolog (PHHl) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No. : U62549) oder funktionelle

Äquivalente derselben kodieren. Ebenso bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für Enzyme und Regulatoren der Iso- prenoidbiosynthese wie die Deoxyxylulose-5-phosphat- synthasen und der Carotinoidbiosynthese wie die Phytoen- synthasen, Lycopincyclasen und Ketolasen wie von Toco- pherolen, Tocotrienolen, Phenylpropanoiden, Isoprenoiden oder Carotiniden, in der Blüte bewirken. Beispielhaft seien die Deoxyxylulose-5-phosphatsynthasen, Phytoen- synthasen, Lycopincyclasen und die Carotinketolasen genannt. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Acc. No. D45881) Ketolase oder funktionelle Äquivalente kodieren. b) Polyungesättigte Fettsäuren wie beispielsweise Arachidon- säure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosa- hexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder-desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevor- zugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S-Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No. : AB044391), die A6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc. -No. : AJ222980 ; Girke et al. (1998) Plant J 15 : 39-48), die A6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakura-dani et al 1999 Gene 238 : 445-453), die A5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. (1998) FEBS Letters 439 : 215-218), die A5-Fett- säuredesaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc. -No. : AF078796), die A5-Desaturase aus Mortìerella a (Michaelson et al. J Biol Chem 273 : 19055-19059), die A6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. (2000) Proc Natl. Acad. Sci.

97 : 6421-6426), die A6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. (2000,) Biochemical Society Transactions 28 : 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

12. Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Anti- körpern, Vakzinen, Hormonen und/oder Antibiotika wie z. B. be- schrieben bei Hood EE & Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4) : 382-6 ; Ma JK & Vine ND (1999) CurrTop Microbiol Immunol 236 : 275-92.

Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM (2000) Transgenic approaches to crop improvement.

J Exp Bot. 51 Spec No : 487-96.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile-wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs-oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressions- kassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder deren Biosynthese katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Ver- fahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma-und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden wie beispielsweise Astaxanthin. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE & Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4) 382-6 ; Ma JK & Vine NDn 99 rr Top Microbiol Immunol 236 : 275-92.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen e-Cyclase-Promotorsequenzen (bevorzugt der Sequenzen gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8) zur Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität einer e-cyclase.

Bei einer verminderten E-Cyclase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein e-Cyclase die umgesetzte Menge Lycopin bzw. die gebildete Menge 8-Carotin vermindert.

"Verminderung"oder"vermindern"ist im Zusammenhang mit einer E-Cyclase, bzw. sei Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Funktionalität einer

e-Cyclase in einer pflanzlichen Zelle, Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen.

Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst auch eine mengenmäßige Verringerung einer e-Cyclase bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen der e-Cyclase (d. h. fehlende Nachweisbarkeit von E-Cyclase-Aktivität oder fehlende immuno- logische Nachweisbarkeit dere-Cyclase). Dabei wird eine bestimmte e-Cyclases (bzw. die zugehörige Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität) in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um min- destens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt 100 % vermindert. Insbesondere meint Verminderung auch das vollständigen Fehlen der e-Cyclase (bzw. seiner Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität).

Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität dere-Cyclase umfasst.

Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung stehen, um die Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität einer e-Cyclase in gewünschter Weise zu beeinflussen.

Beispielhaft kann die Verminderung durch Einbringen mindestens einer doppelsträngigen Ribonukleinsäuresequenz, die eine zumindest teilweise Homologie zu den erfindungsgemäßen e-Cyclase- Promotorsequenzen aufweist (e-Cyclase-Promotor-dsRNA) realisiert werden. Alternativ können auch die dsRNA-Expression gewähr- leistende Expressionskassetten angebracht werden.

Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference" ; dsRNAi) ist viel- fach für tierische und pflanzliche Organismen beschrieben (z. B.

Matzke S^et v (2000) Plant Mol Biol 43 : 401-415 ; Fire A. et al (1998) Nature 391 : 806-811 ; WO 99/32619 ; WO 99/53050 ; WO 00/68374 ; WO 00/44914 ; WO 00/44895 ; WO 00/49035 ; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplemen- tären Strang-und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hoch- effiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechen- den knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 : 13959-64).

"Doppelsträngiges RNA-Molekül"meint im Rahmen der Erfindung bevorzugt eine oder mehr Ribonukleinsäuresequenzen, die aufgrund komplementärer Sequenzen theoretisch (z. B. gemäß den Basenpaar- regeln von Waston und Crick) und/oder faktisch (Z. B. aufgrund von Hybridisierungsexperimenten in vitro und/oder in vivo) in der

Lage sind, doppelsträngige RNA-Strukturen auszubilden. Dem Fach- mann ist bewusst, dass die Ausbildung von doppelsträngigen RNA- Strukturen, einen Gleichgewichtszustand darstellt. Bevorzugt ist das Verhältnis von doppelsträngigen Molekülen zu entsprechenden dissoziierten Formen mindestens 1 zu 10, bevorzugt 1 : 1, besonders bevorzugt 5 : 1, am meisten bevorzugt 10 : 1.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auf doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle), die bei Einbringen in einen pflanzlichen Organismus (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial) die Verminderung mindestens einer £-Cyclase bewirken. Das doppel- strängige RNA-Molekül zur Verminderung der Expression einer E-Cyclase (e-Cyclase-dsRNA) umfasst dabei bevorzugt a) einen"sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonu- kleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu min- destens einem Teil einer Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotorbereich einer E-Cyclase, und b) einen"antisense"-RNA-Strang, der zu dem RNA-NsenseN-Strang unter a) im wesentlichen-bevorzugt vollständig-komplemen- tären ist.

Bevorzugt meint ist der Promotorbereich der£-Cyclase durch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschrieben.

"Im wesentlichen identisch"meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Ver- gleich zu der E-Cyclase-Promotor Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirkt.

Bevorzugt beträgt die Homologie (nach weiter unten folgender Definition) mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem"sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und min- destens einem Teil der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen E-Cyclase-Promotor (bzw. zwischen dem"antisense"-Strang dem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz kodierend für einen E-Cyclase-Promotor). Dem Fachmann ist dabei bewusst, dass bei einem Homologievergleich zwischen RNA und DNA die Basen Uracil und Thymin als äquivalent zu werten sind.

Eine 100% ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem £-cyclase- Promotor ist nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Ver- minderung der E-Cyclase Expression zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenz- abweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Poly-

morphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können.

Die Länge des Teilabschnittes beträgt mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen.

Alternativ, kann eine"im wesentlichen identische"dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil einer £-Cyclase Gen-oder Promotorsequenz zu hybridisieren (z. B. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h).

"Im wesentlichen komplementär"meint, dass der"antisense"- RNA-Strang auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punkt- mutationen im Vergleich zu dem Komplement des"sense"-RNA- Stranges aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie min- destens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %, am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem"anti- sense"-RNA-Strang und dem Komplement des"sense"-RNA-Stranges.

"Teil einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase- Promotor"meint Fragmente einer für einen E-Cyclase-Promotor kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt den Promotorsequenzen gemäß SEQ ID NO : 1, 2 oder 3 oder funktionellen äquivalenten der- selben. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 20 Basen, bevorzugt mindestens 50 Basen, besonders be- vorzugt mindestens 100 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 500 Basen.

Dit « >Te<Wendung der t-Cyclase-Promotorregion zur Verminderung der £-Cyclase-Aktivität ist insbesondere vorteilhaft, da hier nur geringe Homologien zu anderen Genen vorliegen und so eine hohe Spezifität der Verminderung ohne Auswirkung auf die Expression anderer Gene erreicht werden kann.

Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen von Polyribonukleo- tiden bestehen. Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte um- fassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden. Die doppelsträngige dsRNA-Struktur kann ausgehend von zwei komplemen- tären, separaten RNA-Strängen oder-bevorzugt-ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären RNA-Strang gebildet werden.

In diesem Fall sind"sense"-RNA-Strang und"antisense"-RNA-Strang

bevorzugt kovalent in Form eines invertierten"Repeats"mitein- ander verbunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein weiterer Gegen- stand der Erfindung Ribonukleinsäuremoleküle umfassend a) mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil einer Nukleinsäure- sequenz kodierend für den Promotorbereich einer e-Cyclase, und b) mindestens eine weitere Ribonukleotidsequenz, die zu min- destens einem Teil der Ribonukleotidsequenz unter a) im wesentlichen komplementären ist, wobei a) und b) kovalent miteinander verbunden sind und zwischen a) und b) gegebenenfalls weitere Funktionselemente lokalisiert sein können.

Bevorzugt meint ist der Promotorbereich dere-Cyclase durch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, 7 oder 8 beschrieben.

Wie z. B. in WO 99/53050 beschrieben, kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem"sense"-und"antisense"- Strang durch eine verbindende Sequenz ("Linker" ; beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA- Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression einer RNA-Sequenz erfordern und die komplementären RNA-Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen. Bevorzugt kann ist die verbindende Sequenz ein Intron (z. B. ein Intron des ST-LS1 Gens a. artoffel ; Vancanneyt GF et al. (l990) Mol Gen Genet 220 (2) : 245-250).

Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies beispielhaft auf folgende Art geschehen : a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst, b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem"sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem"antisense"-Strang umfasst.

c) Kreuzung von zwei individuellen Pflanzenlinien, wobei die eine die Expressionskassetten mit dem"sense"-Strang, die andere die Expressionskassetten mit dem"antisense"-Strang umfasst.

Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden.

Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz kodierend für eine dsRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise einem Promotor) gebracht werden. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein. Bevorzugt ist die Expressionskassette für die E-Cyclase-Promotor-dsRNA auf dem Expressionsvektor enthalten.

Entsprechende Expressionsvektoren sind erfindungsgemäß umfasst.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression der dsRNA ausgehend von einem Expressionskonstrukt unter funktioneller Kontrolle eines blütenspezifischen Promotors.

Bevorzugt ist der in diesem Zusammenhang eingesetzte Promotor nicht der £-Cyclase Promotor, von dem die dsRNA abgeleitet wurde.

Es kann sich aber sehr wohl um einen £-Cyclase Promotor einer anderen Art handeln. So könnte beispielsweise der s-Cyclase Promotor aus Sonnenblume dazu verwendet werden, die dsRNA abge- leitet von dem £-Cyclase Promotor aus Tagetes erecta zu expri- mieren. Bevorzugt steht die Expression der dsRNA abgeleitet von einem E-Cyclase Promotor jedoch unter Kontrolle eines Promotors der kein E-Cyclase Promotor ist, besonders bevorzugt unter der Kontrolle des CHRC-Promotors aus Cucumis sativus (SEQ ID NO : 81) oder des AP3P-Promotors (SEQ ID NO : 77) oder eines funktionell äquivalenten Teils derselben Die Expressionskassetten kodierend für den"antisense"-und/oder den"sense"-Strang einer E-Cyclase-dsRNA oder für den selbst- komplementären-Strang der dsRNA, werden dazu bevorzugt in einen Transformationsvektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren in die pflanzliche Zelle eingebracht. Für das erfin- dungsgemäße Verfahren ist eine stabile Insertion in das Genom vorteilhaft.

Die dsRNA kann in einer Menge eingeführt werden, die zumindest eine Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z. B. mindestens 5,10, 100,500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.

Erfindungsgemäß umfasst sind ferner Verfahren zur Herstellung von Ketocarotinoiden, wobei die mRNA-Menge und/oder Aktivität mindestens einere-Cyclasevermindert wird durch Einbringen mindestens einer der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA- Sequenzen oder Ribonukleinsäuresequenzen oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressions- kassetten.

Ketocarotinoide meint Carotinoide, die mindestens eine Keto- Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin.

Sequenzen 1. SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor der e-Cyclase aus Tagetes erecta 2. SEQ ID NO : 2 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor der £-Cyclase einschließlich 5'-untranslatierter Region der e-Cyclase aus Tagetes erecta 3. SEQ ID NO : 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor einschließlich 5'-untranslatierter Region und Region kodierend für das Transit- peptid der E-Cyclase aus Tagetes erecta 4. SEQ ID NO : 4 Aminosäuresequenz kodierend für das mut- maßliche Transitpeptid der e-Cyclase aus Tagetes erecta 5. SEQ ID NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor der e-Cyclase einschließlich 5'-untranslatierter Region der e-Cyclase aus Tagetes erecta flankiert von Restrik- tionsschnittstellen für die Klonierung 6. SEQ ID NO : 6 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor einschließlich 5'-untranslatierter Region und Region kodierend für das Transit- peptid der e-Cyclase aus Tagetes erecta flankiert von Restriktionsschnittstellen für die Klonierung 7. SEQ ID NO : 7 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor der e-Cyclase einschließlich 5'-untranslatierter Region der e-Cyclase aus Arabidopsis thaliana 8. SEQ ID NO : 8 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor der e-Cyclase einschließlich 5'-untranslatierter Region der e-Cyclase aus Oryza sativa 9. SEQ ID NO : 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Tagetes erecta

10. SEQ ID NO : 10 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Tagetes erecta 11. SEQ ID NO : 11 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Tagetes erecta 12. SEQ ID NO : 12 Aminosäuresequenz kodierend für die £-Cyclase Tagetes erecta 13. SEQ ID NO : 13 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-cyclase aus Arabidopsis thaliana 14. SEQ ID NO : 14 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Arabidopsis thaliana 15. SEQ ID NO : 15 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Reis 16. SEQ ID NO : 16 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase aus Reis 17.-22 SEQ ID NO : 17 bis 22 : Sequenzmotive für e-Cyclase Proteine 23. SEQ ID NO : 23 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz Hl) aus Lactuca sativa 24. SEQ ID NO : 24 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H1) aus Lactuca sative 25. SEQ ID NO : 25 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H2) aus Adonis palaestina 26. SEQ ID NO : 26 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H2) aus Adonis palaestina 27. SEQ ID NO : 27 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H3) aus Adonis palaestina 28. SEQ ID NO : 28 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H3) aus Adonis palaestina

29. SEQ ID NO : 29 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine 8-Cyclase (homologe Sequenz H4) aus Arabidopsis thaliana 30. SEQ ID NO : 30 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H4) aus Arabidopsis thaliana 31. SEQ ID NO : 31 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H5) aus Citrus X paradisi 32. SEQ ID NO : 32 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H5) aus Citrus X paradisi 33. SEQ ID NO : 33 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H6) aus Citrus X paradisi 34. SEQ ID NO : 34 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H6) aus Citrus X paradisi 35. SEQ ID NO : 35 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H7) aus Citrus sinensis 36. SEQ ID NO : 36 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H7) aus Citrus sinensis 37. SEQ ID NO : 37 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-cyclase (homologe Sequenz H8) aus Spinacea oleracea 38. SEQ ID NO : 38 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H8) aus Spinacea oleracea 39. SEQ ID NO : 39 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H9) aus Solanum tuberosum

40. SEQ ID NO : 40 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H9) aus Solanum tuberosum 41. SEQ ID NO : 41 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz H10) aus Daucus carota 42. SEQ ID NO : 42 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H10) aus Daucus carota 43. SEQ ID NO : 43 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz Hll) aus Daucus carota 44. SEQ ID NO : 44 Aminosäuresequenz kodierend für eine E-Cyclase (homologe Sequenz Hll) aus Daucus carota 45. SEQ ID NO : 45 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine e-cyclase (homologe Sequenz H12) aus Tomate 46. SEQ ID NO : 46 Aminosäuresequenz kodierend für eine e-Cyclase (homologe Sequenz H12) aus Tomate 47. SEQ ID NO : 47 Nukleinsäuresequenz kodierend für e-Cyclase- spezifische Sonde (gecycl ; 510 bp) 48. SEQ ID NO : 48 Oligonukleotidprimer PR16 5 gaggcaaagcaaagg-3' 49. SEQ ID NO : 49 Oligonukleotidprimer PR22 5'-cgataagtgcgacattcaagc-3' 50. SEQ ID NO : 50 Nukleinsäuresequenz umfassend Teil des Promotors der E-Cyclase aus Tagetes erecta erhalten mittels iPCR 51. SEQ ID NO : 51 Nukleinsäuresequenz umfassend Teil des Promotors der E-Cyclase aus Tagetes erecta erhalten mittels TAIL-PCR 52. SEQ ID NO : 52 Oligonukleotidprimer PR50 5'-cgccttgtatctgtttggattgg-3'

53. SEQ ID NO : 53 Oligonukleotidprimer PR51 5'-ctaacaatcaatgagtatgagagc-3' 54. SEQ ID NO : 54 Oligonukleotidprimer PR60 5'-agagcaaggccagcaggaccacaacc-3' 55. SEQ ID NO : 55 Oligonukleotidprimer PR61 5'-ccttgggagcttttgggataggctag-3' 56. SEQ ID NO : 56 Oligonukleotidprimer PR63 5'-tcacgccttgtatctgtttggattgg-3' 57. SEQ ID NO : 57 Oligonukleotidprimer aus dem Satz der AD1 Primer, wie er in dem Amplifikat wieder gefunden wurde 5'-gtcgagtatggagtt-3' 58. SEQ ID NO : 58 Nukleinsäuresequenz kodierend iPCR-Fragment (734 bp) aus pTA-ecycP 59. SEQ ID NO : 59 Oligonukleotidprimer OL1 5'-ctcgagagtaaaatcgttagttatg-3' 60. SEQ ID NO : 60 Oligonukleotidprimer OL2 5'-ccatggccattgattgttagtaatgattc-3' 61. SEQ ID NO : 61 Oligonukleotidprimer OL3 5'-ccatggtaatttgcttcgtgtatctgatg-3' 62. SEQ ID NO : 62 Oligonukleotidprimer OL4 5'-ccatggcgctagcagcgacagtaatg-3' 63. SEQ ID NO : 63 Oligonukleotidprimer OL5 5'-gatatccggtgtgagggaactag-3' 64. SEQ ID NO : 64 Oligonukleotidprimer PR1 5'-gcaagctcgacagctacaaacc-3' 65. SEQ ID NO : 65 Oligonukleotidprimer PR2 5'-gaagcatgcagctagcagcgacag-3' 66. SEQ ID NO : 66 Nukleinsäuresequenz kodierend für Ketolase-35S-Terminator Konstrukt 67. SEQ ID NO : 67 Oligonukleotidprimer PR7 5'-gagctcactc actgatttcc attgcttg-3'

68. SEQ ID NO : 68 Oligonukleotidprimer PR8 5'-cgccgttaagtcgatgtccgttgatttaaacagtgtc-3' 69. SEQ ID NO : 69 Oligonukleotidprimer PR9 5'-atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac-3' 70. SEQ ID NO : 70 Oligonukleotidprimer PR10 5'-taagcttttt gttgaagaga tttgg-3' 71. SEQ ID NO : 71 Oligonukleotidprimer PR40 5'-gtcgactacg taagtttctg cttctacc-3' 72. SEQ ID NO : 72 Oligonukleotidprimer PR41 5'-ggatccggtg atacctgcac atcaac-3' 73. SEQ ID NO : 73 Oligonukleotidprimer PR124 5'-aagcttaccg atagtaaaat cgttagtt-3' 74. SEQ ID NO : 74 Oligonukleotidprimer PR125 5'-ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt t-3' 75. SEQ ID NO : 75 Oligonukleotidprimer PR126 5'-gtcgacaaca acaacaaaca acctttgc-3' 76. SEQ ID NO : 76 Oligonukleotidprimer PR127 5'-ggatccaaca acaacaaaca acctttgc-3' 77. SEQ ID NO : 77 Nukleinsäuresequenz kodierend für eine modifizierte Version (AP3P) des blüten- spezifischen Promoters AP3 aus Arabidopsis thaliana 78. SEQ ID NO : 78 Nukleinsäuresequenz kodierend für PIV2 Intron des ST-LS1 Gens aus Kartoffel.

79. SEQ ID NO : 79 Nukleinsäuresequenz kodierend für den sense- Strang der gegen den£-Cyclase Promotor gerichteten dsRNA.

80. SEQ ID NO : 80 Nukleinsäuresequenz kodierend für den antisense-Strang der gegen den E-Cyclase Promotor gerichteten dsRNA.

81. SEQ ID NO : 81 Nukleinsäuresequenz kodierend für den Promotor des Chromoplasten-spezifischen Carotenoid-assoziierten Proteins (CHRC) aus Cucumis sativus 82. SEQ ID NO : 82 Oligonukleotidprimer PRCHRC5 5'-gagctctaca aattagggtt ac-3' 83. SEQ ID NO : 83 Oligonukleotidprimer PRCHRC3 5'-aagcttatta tttccaaatt ccg-3' Abbildungen Die in nachfolgenden Abbildungen verwendeten allgemeinen Abkürzungen haben folgende Bedeutung : GUSI-Intron-GUSII : Reportergen (bakterielle ß-Glucuronidase) Intron : Intron NosT : Terminatorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS) RB/LB : Rechte bzw. linke T-DNA Begrenzung 35-T : 35S CaMV Terminator NptII : Kanamycin Resistenz NosP : Promotorsequenz der Nopalin-Synthase (NOS) aadA : bakterielle Spectinomycin Resistenz colEl : Replikationsursprung 1. Fig. 1 : Analyse der Ecyclase-Transkriptlevel Gesamt-RNA iso- liert aus Blättern (L) und Blütenstadien (1-7) von Tagetes erecta mittels RNA-Gel-Blot Analyse 2. Fig. 2 hematische Darstellung des Vektors pEcycPl : GUS zur blütenspezifischen Expression desß-Glucuronidase-Reportergens (GUS) unter Kontrolle des Tagetes erecta ecycPl-Regulations- elements (Promoter und 5'Untranslatierte Region) ecycPl : Promotor der e-Cyclase aus Tagetes erecta einschließlich 5'-untranslatierter Region (SEQ ID NO : 2) 3. Fig. 3 : Schematische Darstellung des Vektors pEcycP2 : GUS zur blütenspezifischen Expression des ß-Glucuronidase- Reportergens (GUS) unter Kontrolle des Tagetes erecta ecycP2-Regulationselements (Promoter und 5'Untranslatierte Region und Transitpeptid)

ecycP2 : Promotor der e-Cyclase aus Tagetes erecta einschließlich 5'-untranslatierter Region und Transitpeptid (SEQ ID NO : 3) 4. Fig. 4 : Schematische Darstellung des Vektors pEcycP2 : KETO zur blütenspezifischen Expression der Haematococcus pluvialis Ketolase (KETO ; SEQ ID NO : 66) unter Kontrolle des Tagetes erecta ecycP2-Regulationselements (Promoter und 5'-untrans- latierte Region und Transitpeptid ; SEQ ID NO : 3).

5. Fig. 5 : Schematische Darstellung des Vektors pS5AI7 zur blütenspezifischen Expression von e-Cyclase-Promoter spezi- fischer dsRNA unter Kontrolle des AP3P Promoterfragments zur blütenspezifischen Verminderung der £-Cyclase Transkript- level.

AP3P : modifizierter AP3P Promoter (777 bp), P-sense : 358 bp Promoterfragment dere-Cyclase in sense Orientierung, intron : IV2 Intron des Kartoffel-Gens ST-LS1 P-anti : das 361 bp Promoterfragment £-Cyclase in antisense Orientierung.

6. Fig. 6 : Schematische Darstellung des Vektors pS5CI7 zur blütenspezifischen Expression von £-Cyclase-Promoter spezi- fischer dsRNA unter Kontrolle des CHRC Promoterfragments zur blütenspezifischen Verminderung der E-Cyclase Transkriptlevel CHRC : CHRC-Promoter (1537 bp), P-sense : 358 bp Promoterfragment der E-Cyclase in sense Orientierung, vnt n : IV2 Intron des Kartoffel-Gens ST-LS1 P-anti : das 361 bp Promoterfragment £-Cyclase in antisense Orientierung.

7. Fig. 7 : iPCR Amplifikat, das das 312 bp Fragment des £-Cyclase Promotors enthält 8. Fig. 8 : TAIL PCR Amplifikat, das das 199 bp Fragment des E-Cyclase Promotors enthält 9. Fig. 9 : Nukleotidsequenzvergleich zwischen der publizierten Sequenz der Haematococcus pluvialis Ketolase (GenBank Acc.- No. : X86782) und der im Rahmen der Erfindung bereitgestellten Sequenz (vgl. Beispiel 3).

10. Fig. 10 : Proteinsequenzvergleich zwischen der publizierten Sequenz der Haematococcus pluvialis Ketolase (GenBank Acc.- No. : X86782) und der im Rahmen der Erfindung bereitgestellten Sequenz (vgl. Beispiel 3).

11. Fig. 11 : Klonierungskassette zur Herstellung von Inver- ted-Repeat-Expressionskassetten für die blütenspezifische Expression vone-Cyclase dsRNAs.

AP. 3P : modifizierter AP3P Promoter (777 bp), rbcs : rbcS Transitpeptid aus Erbse (206 bp), intron : PIV2 Intron des ST-LS1 Gens (SEQ ID NO : 78) term : 35S Polyadenylierungssignal von CaMV (762 bp).

12. Fig. 12A-C : Sequenzvergleich verschiedener pflanzlicher e-Cyclasen.

A : GenBank Acc.-No. : AF152246 (524) Citrus x pardisi"lyco- pene cyclase" B : GenBank Acc. -No. : AF212130 (165) Daucus carota partial ecyclase sequence C : GenBank Acc. -No. : AF229684 (201) Daucus carota partial ecyclase sequence D : GenBank Acc. -No. : AF251016 (516) Tagetes erecta ecyclase E : GenBank Acc. -No. : AF321535 (529) Adonis palaestina ecyclase F : GenBank Acc. -No. : AF321536 (529) Adonis palaestina ecyclase G : GenBank Acc. -No. : AF321537 (382) Solanum tuberosum partial ecyclase sequence H : GenBank Acc. -No. : AF321538 (533) Lactuca sativa ecyclase I : GenBank Acc. -No. : AF450280 (262) Citrus sinensis ecyclase J : Gen-Bank. Acc. -No. : AF463497 (517) Spinacea oleracea ecyclase K : GenBank Acc. -No. : AF486650 (437) Citrus x pardisi ecyclase L : GenBank Acc. -No. : AP003332 (540) Reis ecyclase M : GenBank Acc. -No. : AY099485 (525) Tagetes erecta ecyclase N : GenBank Acc. -No. : L40176 (501) Arabidopsis"lycopene cyclase" 0 : GenBank Acc.-No. : NM125085 (524) Arabidopsis ecyclase P : GenBank Acc. -No. : 065837 ecyclase (526) Tomate 13. Fig. 13 : Schematische Darstellung der inverse PCR ("iPCR") Für die"iPCR"wird genomische DNA eines Zielorganismus mit der zu isolierenden Promotorsequenz mit einem gegebenen Restriktionsenzym komplett verdaut und anschließend werden in einem verdünnten Ansatz die einzelnen Fragmente rückligiert, also mit sich selbst zu einem ringförmigen Molekül verbunden.

In der Vielzahl entstehender ringförmiger DNA-Moleküle befinden sich auch solche, die die bekannte Sequenz (d. h. die Sequenz kodierend für ein homologes Protein) enthalten.

Ausgehend davon kann das ringförmige Molekül mittels PCR amplifiziert werden, indem ein Primerpaar verwendet wird, bei dem beide Primer sich an den bekannten Sequenzabschnitt anlagern können. Abkürzungen : P-Promotorsequenz ; CR- kodierende Region ; L-Ligationsstelle ; PCR-Polymerase- kettenreaktion. Pfeile geben die Bindestelle potentieller Oligonukleotidprimer im Bereich der kodierenden Region wieder.

Beispiele Allgemeine Methoden : Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet & Voet (1995), 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) er- folgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegel- elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombi- nanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press ; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durch- geführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle, erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Pro Natl Acad Sci USA 74¢S463-5467).

Beispiel 1 : Analyse von e-Cyclase RNA-Transkriptspiegeln während der Blütenentwicklung von Tagetes erecta Für die Präparation von Total-RNA aus Blättern und Blüten von Tagetes erecta wird Pflanzengewebe geerntet, in flüssigem Stick- stoff eingefroren und im Mörser pulverisiert. Anschließend werden 100 mg des gefrorenen, pulverisierten Pflanzengewebes in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Trizol-Puffer (Life- Technologies) aufgenommen. Die Suspension wird mit 0,2 ml Chloro- form extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12000 g wird der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reak- tionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert.

Die RNA wird mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyrocarbonat

(DEPC) bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst. Die RNA-Konzentration wird photometrisch bestimmt.

Die relative Menge an £-Cyclase Transkript in Tagetes Blättern und Blütenstadien wird mittels RNA Gel Blot wie in Sambrook & Russel (2001, Molecular Cloning : A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Kapitel 7, Protokoll 6) beschrieben, analysiert : Pro Probe werden ca. 10 bis 15 Rg Gesamt-RNA in einem Formaldehyd-Agarosegel auf- getrennt. Die relativen Mengen an Gesamt-RNA können anhand der mit Ethidiumbromid angefärbten rRNA Banden abgeschätzt werden (Fig. 1A). Zur Abschätzung der E-Cyclase Transkriptmengen wird die aufgetrennte RNA mittels eines Kapillarblots auf eine Nylonmem- bran übertragen.

Zur Herstellung einer radioaktiv markierten e-Cyclase-spezifischen Sonde wurde das Fragment SEQ ID NO : 47 (gecycl) mittels Poly- merasekettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA von Tagetes erecta unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (PR16 = 5'-ggcacgaggcaaagcaaagg-3', SEQ ID NO : 48) und eines antisense spezifischen Primers (PR22 = 5'-cgataagtgcgacattcaagc-3', SEQ ID NO : 49) amplifiziert.

Zur Präparation genomischer DNA aus Tagtes erecta wird Blatt- material von Tagetes erecta geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert. Anschließend werden 100 mg des gefrorenen, pulverisierten Pflanzengewebes in ein Reaktionsgefäß überführt, in 0,75 ml Extraktionspuffer auf- genommen und für 60 min bei 65°C inkubiert. Der Extraktionspuffer wird frisch hergestellt aus 25 ml Puffer l (0, 35 M Sorbitol, 0,1 M. Tris-Base, 5 mM EDTA, pH7. 5),. 25 ml Puffer 2 (0,2 M Tris-Base, 0,05 M EDTA, 2 M NaCL, 2 % CTAB), 10 ml 5 % N-Lauroylsarcosine- sodium) und 0,24 g Natriumbisulfit. Anschließend an die 65°C- Inkubation wird die Suspension mit 0,7 ml Chloroform/Isoamyl- alkohol (24 : 1) vermischt, dann 5 min bei 10000 g zentrifugiert.

Die obere wässrige Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß über- führt und die Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion wie beschrie- ben wiederholt. Anschließend wird die obere wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt, die DNA durch Zugabe von 1 ml Isopropanol und anschließende Zentrifugation für 5 min bei 10000 g pelletiert. Das DNA-Pellet wird mit 0,5 ml 75 % Ethanol gewaschen, dann getrocknet und anschließend in 0,05 ml sterilem Wasser durch 5 minütige Inkubation bei 65°C resuspendiert.

Die PCR-Bedingungen zur Amplikation eines £-Cyclase-spezifischen Fragmentes aus genomischer DNA aus Tagetes erecta sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation eines £-Cyclase-spezifischen Fragmentes erfolgt in einem 50 Al Reaktionsansatz, in dem enthalten sind : l jig genomische DNA aus Tagetes erecta - 0, 25 mM dNTPs 0, 2 {IM Primer PR16 (SEQ ID NO : 48) 0, 2 jiM Primer PR22 (SEQ ID NO : 49) - fil 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 (il R Taq Polymerase (TAKARA) -25, 8 1 steriles, destilliertes Wasser Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 51°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Abschließend ein Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit PR16 und PR22 resultiert in einem 510 bp-Fragment (SEQ ID NO : 47), das unter stringenten Hybridi- sierungsbedingungen spezifisch mit der E-Cyclase nicht aber mit der Lycopen ß-Cyclase aus Tagetes erecta hybridisiert. Das Ampli- fikationsprodukt wird mit dem NucleonSpin Extract Kit (Machery & Nagel) nach Herstellerangaben aufgereinigt und für eine radio- aktive Markierungsreaktion mit dem Highprime# Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben eingesetzt. Die Prähybridi- sierungs-, Hybridisierungs-, und Waschschritte werden wie bei Sambrook & Russel (2001, Molecular Cloning : A laboratory manual, 3rd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Kapitel 6, Protokoll 10) beschrieben durch- geführt. Der letzte Waschschritt mit 0, 1x SSC/0,1 % SDS bei 65°C bewirkt eine hohe Stringenz der Hybridisierung, die ausreicht, um mit der beschriebenen Sonde spezifisch die e-Cyclase, nicht aber die Lycopen ß-Cyclase, zu detektieren. Die relativen E-Cyclase Transkriptlevel können anhand der Hybridisationssignale, detek- tiert mithilfe eines Phosphoimagers, abgeschätzt werden. Wie in Fig. 1B ersichtlich liegen unter den gegebenen Versuchs- bedingungen £-Cyclase Transkriptlevel in den Blättern unterhalb der Nachweisgrenze, während die gesamte Blütenentwicklung hin- durch hohe Mengen an £-Cyclase Transkripten nachweisbar sind.

Beispiel 2 : Klonierung des E-Cyclase Promoters Ein 199 bp Fragment bzw. das 312 bp Fragment des Tagetes erecta e-Cyclase Promoters kann durch zwei unabhängige Klonierungs- strategien, Inverse PCR (iPCR ; adaptiert Long et al. Proc Natl Acad Sci USA 90 : 10370) und TAIL-PCR (Liu YG et al. (1995) Plant J 8 : 457-463) unter Verwendung genomischer DNA (wie oben beschrieben) aus der Tagetes erecta-Linie Orangenprinz isoliert werden.

Für den iPCR-Ansatz werden 2 Rg genomische DNA in einem 25 gel Reaktionsansatz mit EcoRV und RsaI verdaut, anschließend auf 300 jn. l verdünnt und über Nacht bei 16°C mit 3U Ligase religiert.

Unter Verwendung der Primer PR50 (SEQ ID NO : 52) und PR51 (SEQ ID NO : 53) wird durch PCR Amplifikation ein Fragment herge- stellt, das, jeweils in Sense-Orientierung, 354 bp der e-Cyclase cDNA (Genbank Acc. -NO. : AF251016), ligiert an 312 bp des E-Cyclase Promoters sowie 70 bp des 5terminalen Bereichs der e-Cyclase cDNA enthält (siehe Fig. 7).

Die Bedingungen der PCR-Reaktionen sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation des PR50-PR51 DNA-Fragmentes, das unter anderem das 312 bp Promoterfragment der E-Cyclase enthält, erfolgt in einem 50 ll Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 µl Ligationsansatz (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 IIM Primer PR50 (SEQ ID NO : 52) - 0, 2 JIM Primer PR51 (SEQ ID NO : 53) 5 5 1 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 p. l R Taq Polymerase (TAKARA) - 28, 8 gel steriles, destilliertes Wasser Die PCR-Reaktionen werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 53°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit Primer PR50 und PR51 resultiert in einem 734 bp-Fragment, das unter anderem das 312 bp Promoter- fragment der £-Cyclase enthält (Fig. 7). Das Amplifikat, wird unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungs- vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern M13 und T7 ergeben für das Amplifikat die Sequenz SEQ ID NO : 50.

Für den TAIL-PCR Ansatz werden drei sukzessive PCR-Reaktionen mit jeweils unterschiedlichen genspezifischen Primern ("nested primers") durchgeführt.

Die TAIL1-PCR erfolgt in einem 20 fol Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 100 ng genomische DNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 2 mM jedes dNTPs 0, 2 UM Primer PR60 (SEQ ID NO : 54) - 0, 2 FM Primermischung AD1 - 2 gel 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 5 U R Taq Polymerase (TAKARA) - mit sterilem, destillierten Wasser auf 20 Fl aufgefüllt Die Primermischung AD1 stellte dabei zunächst eine Mischung aus Primern der Sequenzen 5'- (a/c/g/t) tcga (g/c) t (a/t) t (g/c) g (a/t) gtt-3' dar. Der Primer mit der SEQ ID NO : 57 wurde in dem resultierenden Amplifikat wieder- gefunden.

Die PCR-Reaktion TAIL1 werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : - 1 Zyklus mit 93°C für 1 Minute und 95°C für 1 Minute, - 5 Zyklen mit 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten, - 1 Zyklus mit 94°C für 30 Sekunden, 25°C für 3 Minuten, dann ein Temperaturanstieg auf 72°C innerhalb von 3 Minuten, 72°C für 2,5 Minuten 15 Zyklen mit 94°C für 10 Sekunden, 68°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten ; 94°C für 10 Sekunden, 68°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten ; 94°C für 10 Sekunden, 29°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten ; - 1 Zyklus mit 72° für 5 Minuten.

Die TAIL2-PCR erfolgt in einem 21 gl Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 µl einer 1 : 50 Verdünnung des TAIL1-Reaktionsansatzes (hergestellt wie oben beschrieben) - 0,8 mM dNTP - 0, 2 UM Primer PR61 (SEQ ID NO : 55) - 0, 2 UM Primer AD1 (SEQ ID NO : 57) - 2 ul 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 5 U R Taq Polymerase (TAKARA) - mit sterilem, destillierten Wasser auf 21 u. l aufgefüllt

Die PCR-Reaktion TAIL2 wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : - 12 Zyklen mit 94°C für 10 Sekunden, 64°C für 1 Minute, 72°C für 2,5 Minuten ; 94°C für 10 Sekunden, 64°C für 1 Minute, 72°C für 2,5 Minuten ; 94°C für 10 Sekunden, 29°C für 1 Minute, 72°C für 2.5 Minuten ; - 1 Zyklus mit 72°C für 5 Minuten.

Die TAIL3-PCR erfolgt in einem 100 Fll Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 µ1 einer 1 : 10 Verdünnung des TAIL2-Reaktionsansatzes (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 8 mM dNTP 0, 2 jim Primer PR63 (SEQ ID NO : 56) 0, 2) lem Primer AD1 (SEQ ID NO : 57) - 10 µl 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 5 U R Taq Polymerase (TAKARA) mit sterilem, destillierten Wasser auf 100 p1 aufgefüllt Die PCR-Reaktion TAIL3 wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : - 20 Zyklen mit 94°C für 15 Sekunden, 29°C für 30 Sekunden, 72°C für 2 Minuten ; - 1 Zyklus mit 72°C für 5 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit Primer PR63 und AD1 resultiert in einem 280 Bp-Fragment, das unter anderem das 199 bp Promoterfragment der E-Cyclase enthält (Fig. 8).

Das Amplifikat, wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert.

Sequenzierungen mit den Primern M13 und T7 ergeben die Sequenz SEQ ID NO : 51. Diese Sequenz ist im Überlappungsbereich identisch mit der Sequenz SEQ ID NO : 50, die mit der iPCR Strategie iso- liert wird, und repräsentiert somit die Nukleotidsequenz in der verwendeten Tagetes erecta Linie Orangenprinz.

Der pCR2.1-Klon, der das 734 bp-Fragment (SEQ ID NO : 58), das durch die iPCR-Strategie isoliert wird, enthält, heißt pTA-ecycP und wird für die Herstellung der Expressionskonstrukte verwendet.

Beispiel 3 : Herstellung von transgenen £-cyclase-Expression kassetten und Expressionsvektoren Das £-cyclase-Regulationselement ecycPl, enthaltend ein Promoter- fragment und die 5nicht-translatierte Region der £-cyclase aus Tagetes erecta, wird verwendet, um die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907) in Tomatenblüten (Lycopersicon esculentum) zu exprimieren. Weiterhin wird das E-Cyclase-Regu- lationselement ecycP2, enthaltend ein Promoterfragment, die 5-nichttranslatierte Region sowie das mutmaßliche Transitpeptid der e-Cyclase aus Tagetes erecta, verwendet, zur Expression ent- weder der ß-Glucuronidase oder der Haematococcus pluvialis Keto- lase in Plastiden von Tomatenblüten.

Die Herstellung der transgenen Expressionsvektoren pEcycPl : GUS, pEcycP2 : GUS, pEcycP2 : KETO für die Agrobakterium vermittelte Transformation in Lycopersicon esculentum erfolgte unter Ver- wendung des binären Vektors pS0301 (WO 02/00900). Zur Her- stellung der Transformationsplasmide werden die Fragmente ecycPl und ecycP2 mittels PCR unter Verwendung des Klones pTA-ecycP sowie der Primer OL1 (SEQ ID NO : 59) und OL2 (SEQ ID NO : 60) (für ecycPl) bzw. der Primer OL1 (SEQ ID NO : 59) und OL3 (SEQ ID NO : 61) (für ecycP2) hergestellt.

Die PCR zur Amplifikation eines E-Cyclase-spezifischen Fragmentes erfolgt in einem 50 jll Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 50 ng pTA-ecycP Plasmid - 0, 25 mM dNTPs - 0,2 µM Primer OL1 (SEQ ID NO : 59) - 0, 2 KM Primer-OL2 (SEQ'ID NO : 60) für ecycp1 bzw.

Primer OL3 (SEQ ID NO : 61) für ecycP2 - 5 gui 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 lil R Taq Polymerase (TAKARA) - 25, 8 fil steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten, 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten, abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit OL1 und OL2 resultiert in einem 456 bp-Fragment (ecycPl, SEQ ID NO : 5), die PCR-Amplifikation mit OL1 und OL3 resultiert in einem 543 bp-Fragment (ecycP2, SEQ ID NO : _6). Die Amplifikate ecycPl bzw. ecycP2 werden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und die Klone pTA-ecycPl bzw.

pTA-ecycP2 erhalten. Sequenzierungen der beiden Klone bestätigen Sequenzen, die im jeweiligen Überlappungsbereich zu SEQ ID NO : 47 bzw. SEQ ID NO : 58 identisch sind. Diese Klone werden daher für die Ligation in den Transformationsvektor pS0301 (WO 02/00900) verwendet.

Zur Herstellung des Transformationsplasmids pEcycPl : GUS wird das 454 bp XhoI-NcoI ecycPl Fragment aus pTA-ecycPl isoliert und in den XhoI-NcoI geschnittenen Vektor pS0301 ligiert. Der Klon, der das ecycPl-Fragment in der korrekten Orientierung enthält, heißt pEcycPl : GUS (Fig. 2, Konstruktkarte).

Zur Herstellung des Transformationsplasmids pEcycP2 : GUS wird das 541 bp XhoI-NcoI ecycPl Fragment aus pTA-ecycP2 isoliert und in den XhoI-NcoI geschnittenen Vektor pS0301 ligiert. Der Klon, der das ecycP2-Fragment in der korrekten Orientierung enthält, heißt pEcycP2 : GUS (Fig. 3, Konstruktkarte).

Zur Herstellung des Transformationsplasmids pEcycP2 : KETO wird die Region"GUSI/intron/GUSII/35ST"begrenzt durch eine NcoI-und eine HindIII-Restriktionsschnittstelle in pEcycP2 : GUS gegen eine "Ketolase/35S-Terminator"-Region ausgetauscht. Hierzu wird das Plasmid pEcycP2 : GUS nach Standardmethoden mit HindIII lineari- siert, die dabei entstehenden 5-Überhänge mit Klenow-Fragment aufgefüllt und abschließend die"GUSI/intron/GUSII/35ST"-Region durch Restriktionsverdau mit NcoI entfernt.

Die"Ketolase/35STerminator"-Region wird hergestellt durch 1. Klonierung einer Ketolase-cDNA, hergestellt mit aus Hemato- coccus pluvialis (Flotow em. Wille) lsoliertea-RM7,-gefolgt von 2. Herstellung einer transkriptionellen Ketolase/Terminator- Fusion durch Ligation der Ketolase-Sequenz in den Vektor pJIT117, was dann als Vorlage für 3. die PCR Amplifikation der Ketolase/35S-Terminator Region, dient.

Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis codiert, wird mittels PCR aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80 der"Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen") Suspensionskultur amplifiziert.

Für die Präparation von Total-RNA aus einer Suspensionskultur von Haematococcus pluvialis (Stamm 192. 80)/die 2 Wochen mit indirektem Tageslicht bei Raumtemperatur in Haematococcus-Medium (1,2 g/1 Natriumacetat, 2 g/1 Hefeextrakt, 0,2 g/l MgCl2 x 6 H20,

0,02 CaCl2 x 2 H20 ; pH 6,8 ; nach Autoklavieren Zugabe von 400 mg/1 L-Asparagin, 10 mg/1 FeS04 x H2O) angezogen wird, werden die Zellen geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert. Anschließend werden 100 mg der gefrorenen, pulverisierten Algenzellen in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0,8 ml Trizol@-Puffer (LifeTechnologies) aufgenommen. Die Sus- pension wird mit 0,2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 12000 g wird der wässrige Überstand abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen Ethanol extrahiert. Die RNA wird mit einem Volumen Isopropanol gefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und das Pellet in DEPC Wasser (über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumen Diethylpyro- carbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklaviert) gelöst.

Die RNA-Konzentration wird photometrisch bestimmt.

Für die cDNA-Synthese werden 2,5 µg Gesamt-RNA für 10 min. bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits (Ready-to-go-you-prime-beads Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines antisense spezifischen Primers (PR1 SEQ ID NO : 64) in cDNA umgeschrieben.

Die Nukleinsäure kodierend eine Ketolase aus Haematococcus plu- vialis (Stamm 192.80) wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) aus Haematococcus pluvialis cDNA unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR2 ; SEQ ID NO : 65) und eines antisense spezifischen Primers (PR1 ; SEQ ID NO : 64) amplifiziert. Die PCR- Bedingungen sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation der cDNA, die für ein Ketolase Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz codiert, erfolgt in einem 50 tl Reaktionsansatz, in dem enthalter." -4 Fl einer Haema tococcus pl uvial is cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 JIM Primer PR1 (SEQ ID NO : 64) -0, 2 FM Primer PR2 (SEQ ID NO : 65) - fil 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 go R Taq Polymerase (TAKARA) -25, 8 Al steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten ; 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 53°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit PR1 und PR2 resultiert in einem 1155 bp-Fragment, das für ein Protein bestehend aus der gesamten Primärsequenz codiert. Unter Verwendung von Standardmethoden wird das Ketolase-Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-Teasy (Promega) kloniert und der Klon pGKET02 erhalten.

Sequenzierung des Klons pGKET02 mit dem T7-und dem SP6-Primer bestätigt eine Sequenz, die sich lediglich in den drei Codons 73, 114 und 119 in je einer Base von der publizierten Sequenz (Gen- bank Acc. No. : X86782) unterscheidet. Diese Nukleotidaustausche werden in. einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reprodu- ziert und repräsentieren somit die Nukleotidsequenz im ver- wendeten Haematococcus pluvialis Stamm 192.80 (Fig. 9 und 10, Sequenzvergleiche). Dieser Klon wird für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res 16 : 11380) verwendet. Die weitere Klonierung erfolgt durch Iso- lierung des 1031 bp SpHI-Fragmentes aus pGKET02 und Ligierung in den SpHI geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon, der die Haemato- coccus pluvialis Ketolase in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, heißt pJKET02.

Mittels PCR unter Verwendung von pJKET02 sowie der Primer OL4 (SEQ ID NO : 62) und OL5 (SEQ ID NO : 63) wird die 1795 bp Keto- lase/35S-Terminator-Region hergestellt. Die Bedingungen der PCR- Reaktionen sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation des OL4-OL5 DNA-Fragmentes, das die kodierende Region der Ketolase gefolgt vom 35S Terminator aus caMV enthält, erfolgt in einem 50 ul Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : l) il pJKET02 (l ng Plasmid-DNA) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 JIM Primer OL4 (SEQ ID NO : 62) 0, 2 jiM Primer OL5 (SEQ ID NO : 63) -5 Al 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 Rl R Taq Polymerase (TAKARA) -28, 8 fol steriles, destilliertes Wasser Die PCR-Reaktionen werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 53°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten.

Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit Primer OL4 und OL5 resultiert in einem 1795 bp-Fragment, das die kodierende Region der Ketolase gefolgt vom 35S-Terminator aus CaMV enthält. Dieses 1795 bp Amplifikat wird unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonie- rungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon"pTA-KETO/ Term"erhalten. Sequenzierungen des Klones bestätigt eine im jeweiligen Überlappungsbereich zu SEQ ID NO : 66 bzw. pJIT117 identische Sequenz. Dieser Klon wird daher für die Ligation in den Transformationsvektor pEcycP2 : GUS (s. o. ) verwendet. Zur Her- stellung des Transformationsplasmids pEcycP2 : KETO wird das 1791 bp NcoI-EcoRV"KETO/Term"-Fragment aus pTA-KETO/Term isoliert und in den linearisierten Vektor pEcycP2 : GUS, enthaltend ein NcoI-5Überhang und ein Blunt-End, ligiert. Der Klon, der das ecycP2-Fragment in der korrekten Orientierung enthält, heißt pEcycP2 : KETO (Fig. 4, Konstruktkarte).

Beispiel 4 : Herstellung und Analyse transgener Tomatenpflanzen Die Konstrukte pEecycPl : GUS, pEcycP2 : GUS und pEcycP2 : KETO wurden durch Agrobakterium tumefaciens vermittelte Transformation in Tomate transformiert. Als Ausgangsexplantat für die Trans- formation dienen Kotyledonen und Hypokotyle sieben bis zehn Tage alter Keimlinge der Linie Microtom. Für die Keimung wird das Kulturmedium nach Murashige und Skoog (Murashige & Skoog (1962) Physiol Plant 15,473-497) mit 2 % Saccharose, pH 6,1 verwendet.

Die Keimung findet bei 21°C bei wenig Licht (20 bis 100 jE) statt. Nach sieben bis zehn Tagen werden die Kotyledonen quer geteilt und die Hypokotyle in ca. 5 bis 10 mm lange Abschnitte geschnitten und auf das Medium MSBN (MS, pH 6,1, 3 % Saccharose mit 1 mg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0,1 mg/1 Naphthalenacetat (NAA) gelegt, das am Vortag mit suspensio-_kultivierten Tomaten- zellen beschickt wurde. Die Tomatenzellen werden luftblasenfrei mit sterilem Filterpapier abgedeckt. Die Vorkultur der Explantate auf dem beschriebenen Medium erfolgt für drei bis fünf Tage.

Anschließend werden die Explantate mit dem Agrobakterium tume- faciens Stamm LBA4404, der das binäre Plasmid mit dem zu trans- formierenden Gen trägt, wie folgt infiziert : Der Stamm, der über Nacht in YEB Medium mit dem Antibiotikum für das Binärplasmid bei 28°C kultiviert bei worden ist wird zentrifugiert. Das Bakterien- pellet wird mit flüssigem MS Medium (3 % Saccharose, pH 6,1) resuspendiert und auf eine optische Dichte von 0,3 (bei 600 nm) eingestellt. Die vorkultivierten Explantate werden in die Sus- pension überführt und für 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend werden die Explantate mit sterilem Filterpapier getrocknet und für die dreitägige Co-Kultur (21°C) auf ihr Vorkulturmedium zurück gelegt.

Nach der Co-kultur werden die Explantate auf MSZ2 Medium (MS pH 6,1 mit 3 % Saccharose, 2 mg/1 Zeatin, 100 mg/1 Kana- mycin, 160 mg/1 Timentin) transferiert und für die selektive Regeneration bei 21°C unter Schwachlicht Bedingungen (20 bis 100 RE, Licht/Dunkel-RhythmuS 16h/8h) aufbewahrt. Alle zwei bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate bis sich Sprosse bilden. Kleine Sprosse können vom Explantat abgetrennt werden und auf MS (pH 6,1 mit 3 % Saccharose) 160 mg/1 Timentin, 30 mg/1 Kanamycin, 0,1 mg/1 IAA bewurzelt werden. Bewurzelte Pflanzen werden ins Gewächshaus überführt.

Die Transgenizität bewurzelter Tomatenpflanzen wird mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA bestätigt. Das Aktivitätsprofil des e-Cyclase-Promoterfragments lässt sich im Fall des ecycP : GUS Konstruktes durch GUS-Assay nach Standardmethoden untersuchen (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907). Das Aktivitäts- profil des e-Cyclase-Promoterfragment lässt sich im Fall des Konstruktes pEcycP2 : KETO durch Northernblot-Analyse nach Standardmethoden unter Verwendung einer Ketolase-spezifischen Hybridisierungssonde oder durch Ketolase-spezifische Realtime-PCR (Sambrook & Russel, 2001, Molecular Cloning : A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) untersuchen.

Beispiel 5 : Herstellung eines transgenen Expressionsvektors zur Herstellung von doppelsträngigen e-Cyclase-Ribo- nukleinsäuresequenz Die Expression von invertierten-"Repeat"Transkripten bestehend aus Fragmenten des E-Cyclase-Promotors in Tagetes erecta erfolgt unter Kontrolle einer modifizierten-dreien (AP3P) des blüten- spezifischen Promoters AP3 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. -NO. : AL132971 : Nukleotidregion 9298 bis 10200 ; Hill et al.

(1998) Development 125 : 1711-1721). Das invertierte-"Repeat" Transkript enthält jeweils ein Fragment in korrekter Orientierung (Sense-Fragment) und ein sequenzidentisches Fragment in entgegen- gesetzter Orientierung (Antisense-Fragment), die durch ein funktionelles Intron, das PIV2 Intron des ST-LH1 Genes aus Kartoffel (Vancanneyt G et al. (1990) Mol Gen Genet 220 : 245-50) miteinander verbunden sind.

Die cDNA, die für den AP3 Promoter (-902 bis +15) aus Arabidopsis thaliana kodiert, wird mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA (nach Standardmethode aus Arabidopsis thaliana isoliert) und der Primer PR7 (SEQ ID NO : 67) und PR10 (SEQ ID NO : 70) hergestellt. Die PCR-Bedingungen sind die folgenden :

Die PCR zur Amplifikation der DNA, die das AP3-Promoterfragment (-902 bis +15) kodiert, erfolgt in einem 50 gl Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 gel (entsprechend 20 ng) genomischer DNA aus A. thaliana (1 : 100 verd. ; hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 WM Primer PR7 (SEQ ID NO : 67) - 0, 2 µM Primer PR10 (SEQ ID NO : 70) _ 5 Al 10X PCR-Puffer (Stratagene) -0, 25 pl Pfu Polymerase (Stratagene) - 28,8 µl steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Das 922 bp Amplifikat wird unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pTAP3 erhalten. Sequenzierung des Klons pTAP3 be- stätigt eine Sequenz, die sich lediglich in durch eine Insertion (ein G in Position 9765 der Sequenz GenBank Acc. -No. : AL132971) und einen Basenaustausch (ein G statt ein A in Position 9726 der Sequenz GenBank Acc. -No. : AL132971) von der publizierten AP3 Sequenz (GenBank Acc. -No. : AL132971, Nukleotidregion 9298 bis 10200) unterscheidet (Position 33 : T statt G, Position 55 : T statt G). Diese Nukleotidunterschiede können in einem unab- hängigen Amplifikationsexperiment reproduziert werden und repräsentieren-somit di-e--Nukleod-. iseZuenz in der verwendeten Arabidopsis thaliana Pflanze.

Die modifizierte Version AP3P wird mittels rekombinanter PCR unter Verwendung des Plasmids pTAP3 hergestellt. Die Region 10200 bis 9771 wird mit den Primern PR7 (SEQ ID NO : 67) und Primern PR9 (SEQ ID NO : 69) amplifiziert (Amplifikat A7/9), die Region 9526 bis 9285 wurde mit den PR8 (SEQ ID NO : 68) und PR10 (SEQ ID NO : 70) amplifiziert (Amplifikat A8/10). Die PCR- Bedingungen sind die folgenden :

Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation der DNA-Fragmente, die für die Regionen Region 10200 bis 9771 und 9526 bis 9285 des AP3 Promoters kodieren, erfolgt in 50 gl Reaktionsansätzen, in denen enthalten ist : - 100 ng AP3 Amplifikat (oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 pH Primer PR7 (SEQ ID NO : 67) bzw.

Primer PR8 (SEQ ID NO : 68) - 0, 2 RM Primer PR9 (SEQ ID NO : 69) bzw.

Primer PR10 (SEQ ID NO : 70) - (il 10 X PCR-Puffer (Stratagene) - 0, 25 Rl Pfu Taq Polymerase (Stratagene) -28, 8 1 steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die rekombinante PCR beinhaltet Annealing der sich über eine Sequenz von 25 Nukleotiden überlappenden Amplifikate A7/9 und A8/10, Vervollständigung zu einem Doppelstrang und anschließende Amplifizierung. Dadurch entsteht eine modifizierte Version des AP3 Promoters (AP3P) in dem die Positionen 9670 bis 9526 dele- tiert sind. Die Denaturierung (5 min bei 95°C) und Annealing (langsame Abkühlung bei Raumtemperatur auf 40°C) beider Ampli- fikate A7/9 und A8/10 erfolgt in einem 17,6 µl Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 0, 5 p. g A7/9 - 0, 25 Rg A8/10 Das Auffüllen der 3'-Enden (30 min bei 30°C) erfolgt in einem 20 ll Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 17, 6 gl A7/9 und A8/10-Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) -50 WM dNTPs 2 p. l IX Klenow Puffer - 2 U Klenow Enzym Die Nukleinsäure kodierend für die modifizierte Promoterversion AP3P wird mittels PCR unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (PR7 SEQ ID NO : 67) und eines antisense spezifischen

Primers (PR10 SEQ ID NO : 70) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation des AP3P Fragmentes erfolgt in einem 50 jil Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : -1 Rl Annealingsreaktion (hergestellt wie oben beschrieben) - 0, 25 mM dNTPs - 0, 2 JIM Primer PR7 (SEQ ID NO : 67) - 0, 2 MM Primer PR10 (SEQ ID NO : 70) -5 pl 10 X PCR-Puffer (Stratagene) -0, 25 Fl Pfu Taq Polymerase (Stratagene) -28, 8 fol steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit den Primern PR7 (SEQ ID NO : 67) und PR10 (SEQ ID NO : 70) resultiert in einem 777 bp Fragment, das für die modifizierte Promoterversion AP3P kodiert (SEQ ID NO : 77).

Das Amplifikat wird in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen mit den Primern T7 und M13 bestätigten eine zur Sequenz GenBank Acc. -No. : AL132971, Region 10200 bis 9298 identische Sequenz, wobei die interne Region 9285 bis 9526 deletiert ist, Dieser Klon wird für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res 16 : 11380) verwendet.

Die Klonierung erfolgt durch Isolierung des 775 bp SacI-HindIII Fragmentes aus pTAP3P und Ligierung in den SacI-HindIII ge- schnittenen Vektor pJIT117. Der Klon, der den Promoter AP3P anstelle des ursprünglichen Promoters d35S enthält, heißt pJAP3P.

Ein DNA-Fragment, das das PIV2 Intron des Gens ST-LS1 enthält wird mittels PCR unter Verwendung von Plasmid-DNA p35SGUS INT (Vancanneyt G. et al. (1990) Mol Gen Genet 220 : 245-250) sowie der Primer PR40 (SEQ ID NO : 71) und PR41 (SEQ ID NO : 72) hergestellt.

Die PCR-Bedingungen sind die folgenden :

Die PCR zur Amplifikation der Sequenz des Intron PIV2 des Gens ST-LS1, erfolgt in einem 50 Fl Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 50 ng p35SGUS INT - 0, 25 mM dNTPs - 0,2 µM Primer PR40 (SEQ ID NO : 71) - 0, 2 p. M Primer PR41 (SEQ ID NO : 72) - 5 l l 10X PCR-Puffer (TAKARA) - 0, 25 A1 R Taq Polymerase (TAKARA) - 28, 8 jll steriles, destilliertes Wasser Die PCR wird unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 53°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute. Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit PR40 und PR41 resultiert in einem 212 bp-Fragment (SEQ ID NO : 78). Unter Verwendung von Standard- methoden wird das Amplifikat in den PCR-Klonierungsvektor pBluntII (Invitrogen) kloniert und der Klon pBluntII-40-41 erhalten. Sequenzierungen dieses Klons mit dem Primer SP6 be- stätigt eine Sequenz, die identisch ist mit der entsprechenden Sequenz aus dem Vektor p35SGUS INT. Dieser Klon wird für die Klonierung in den Vektor pJAP3P (s. o. ) eingesetzt. Die Klonierung erfolgt durch Isolierung des 210 bp SalI-BamHI Fragmentes aus pBluntII-40-41 und Ligierung mit dem SalI-BamHI geschnittenen Vektor pJAP3P. Der Klon, der das Intron PIV2 des Gens ST-LS1 in der korrekten Orientierung anschließend an das 3Ende des rbcs Transitpeptides enthält, heißt pJAI1 und ist geeignet, Expressionskassettencfür die blütenspezifische Expression von Inverted-Repeat Transkripten herzustellen.

Beispiel 6 : Herstellung von invertierten-"Repeat"-Expressions- kassetten für die blütenspezifische Expression von e-cyclase-Promotor dsRNAs in Tagetes erecta Die Expression von invertierten-"Repeat"Transkripten bestehend aus Promoterfragmenten der £-Cyclase in Tagetes erecta erfolgte unter Kontrolle einer modifizierten Version (AP3P) des blüten- spezifischen Promoters AP3 aus Arabidopsis (siehe Beispiel 5) oder des blütenspezifischen Promoters CHRC (Genbank Acc.-No.

AF099501). Das invertierte-"Repeat"Transkript enthält jeweils ein e-Cyclase-Promoterfragment in korrekter Orientierung (Sense- Fragment) und ein sequenzidentisches E-Cyclase-Promoterfragment in entgegengesetzter Orientierung (Antisense-Fragment), die durch

ein funktionelles Intron (siehe Beispiel 5) mit einander ver- bunden sind.

Die Promoterfragmente werden mittels PCR unter Verwendung von Plasmid-DNA (Klon pTA-ecycP, siehe Beispiel 2) und der Primer PR124 (SEQ ID NO : 73) und PR126 (SEQ ID NO : 75) bzw. der Primer PR125 (SEQ ID NO : 74) und PR127 (SEQ ID NO : 76) hergestellt. Die Bedingungen der PCR-Reaktionen sind die folgenden : Die PCR zur Amplifikation des PR124-PR126 DNA-Fragmentes, das das Promoterfragment der e-Cyclase enthält, erfolgt in einem 50 Zl Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 µl pTA-ecycP (10 ng/µl; siehe Beispiel 2) - 0, 25 mM dNTPs 0, 2 jus Primer PR124 (SEQ ID NO : 73) 0, 2) iM Primer PR126 (SEQ ID NO : 75) - 5 gl 10X PCR-Puffer (Stratagen) -0, 25 fol Pfu Polymerase (Stratagen) - 28, 8 fl steriles, destilliertes Wasser Die PCR zur Amplifikation des PR125-PR127 DNA-Fragmentes, das das 312bp Promoterfragment der £-Cyclase enthält, erfolgt in einem 50 jll Reaktionsansatz, in dem enthalten ist : - 1 µl pTA-ecycP (10 ng/l ; siehe Beispiel 2) - 0, 25 mM dNTPs 0, 2 {IM Primer PR125 (SEQ ID NO : 74) -0, 2 pM Primer PR127 (SEQ ID NO : 76) - 5 gl 10X PCR-Puffer (Stratagen) - 0,25 µl @polymerase (Stratagen) 28, 8} il steriles, destilliertes Wasser Die PCR-Reaktionen werden unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt : 1 Zyklus mit 94°C für 2 Minuten. 35 Zyklen mit 94°C für 1 Minute, 53°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute.

Abschließend 1 Zyklus mit 72°C für 10 Minuten.

Die PCR-Amplifikation mit Primer PR124 und PR126 resultiert in einem 358 bp-Fragment, die PCR-Amplifikation mit Primer PR125 und PR127 resultierte in einem 361 bp-Fragment.

Die beiden Amplifikate, das PR124-PR126 (HindIII-SalI sense) Fragment und das PR125-PR127 (EcoRI-BamHI antisense) Frag- ment, werden unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR-BluntII (Invitrogen) kloniert.

Sequenzierungen mit dem Primer SP6 bestätigen jeweils eine

Sequenz, die abgesehen von den eingeführten Restriktionsstellen identisch ist zu SEQ ID NO : 58. Diese Klone werden daher für die Herstellung eines Inverted-Repeat Konstrukts in dem Klonierungs- vektor pJAI1 (siehe Beispiel 5) verwendet.

Der erste Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 356 bp PR124-PR126 HindIII-SalI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR-BluntII (Invitrogen) und Ligierung mit dem HindIII-SalI geschnittenen Vektor pJAIl. Der Klon, der das E-Cyclase Promoter- fragment in der sense Orientierung enthält, heißt cs43. Durch die Ligation wird das Sense-Fragment des £-cyclase Promoters zwischen den AP3P Promoter und das Intron eingefügt. Der zweite Klonierungsschritt erfolgt durch Isolierung des 359 bp PR125-PR127 BamHI-EcoRI Fragmentes aus dem Klonierungsvektor pCR- BluntII (Invitrogen) und Ligierung mit BamHI-EcoRI geschnittenen Vektor cs43. Der Klon, der das E-Cyclase Promoterfragment in der antisense Orientierung enthält, heißt cs44. Durch die Ligation entsteht eine transkriptionelle Fusion zwischen dem Intron und dem Antisense-Fragment des S-Cyclase Promoters.

Für die Herstellung einer invertierten-"Repeat"Expressions- kassette unter Kontrolle des CHRC-Promoters wird ein CHRC- Promoterfragment unter Verwendung genomischer DNA aus Petunie (nach Standardmethoden hergestellt) sowie der Primer PRCHRC5 (SEQ ID NO 82) und PRCHRC3 (SEQ ID NO : 83) amplifiziert. Das Amplifikat wird in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Sequenzierungen des resultierenden Klons pCR2.1-CHRC mit den Primern M13 und T7 bestätigen eine zur Sequenz GenBank Acc. -No. : AF099501 identische Sequenz. Dieser Klon wird daher fürdie Klonierung in den Expressionsvektor cs44 verwendet. Die Klonier-ung, lgt durchtIsolierung des 1535 bp SacI-HindIII Fragments aus pCR2.1-CHRC und. Ligierung in den SacI-HindIII geschnittenen Vektor cs44. Der Klon, der den Promoter CHRC anstelle des ursprünglichen Promoters AP3P enthält heißt cs45.

Die Herstellung der Transformationsplasmide für die Agro- bacterium-vermittelte Transformation des AP3P-kontrollierten Inverted-Repeat Transkripts in Tagetes erecta erfolgt unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO 02/00900).

Zur Herstellung des Transformationsplasmides pS5AI7 wird das 1683 bp SacI-XhoI Fragment aus cs44 mit dem SacI-XhoI geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Fig. 5, Konstruktkarte).

Zur Herstellung des Transformationsplasmides pS5CI7 wird das 2448 bp SacI-XhoI Fragment aus cs45 mit dem SacI-XhoI geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert (Fig. 6, Konstruktkarte).

Beispiel 7 : Herstellung und Analyse transgener Tagetespflanzen Die Transformationsplasmides pS5AI7 und pS5CI7 werden durch Agro- bakterium tumefaciens vermittelte Transformation in Tagetes transformiert.

Tagetessamen werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS-Medium ; Murashige & Skoog (1962) Physiol Plant 15 : 473-497) pH 5,8, 2 % Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Temperatur/Licht/Zeitintervall von 18 bis 28°C/20 bis 200 je/ 3 bis 16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21°C, 20 bis 70 RE, für 4 bis 8 Wochen.

Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10 bis 60 mm2 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt.

Ein beliebiger Agrobakterium tumefaciens Stamm, bevorzugt aber ein supervirulenter Stamm, wie z. B. EHA105 mit einem entsprechen- den Binärplasmid, das ein Selektionsmarkergen (bevorzugt bar oder pat) sowie ein oder mehrere Trait-oder Reportergene tragen kann wird, über Nacht angezogen und für die Co-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet. Die Anzucht des Bakterienstammes kann wie folgt erfolgen : Eine Einzelkolonie des entsprechenden Stammes wird imufDB (0, 1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rindfleischextrakt, 0, 5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H20) mit 25 mg/1 Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 h ange- zogen. Anschließend wird die Bakteriensuspension durch Zentri- fugation bei 6000 g für 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, daß eine OD600 von ca. 0,1 bis 0,8 ent- stand.

Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbewahrt worden sind, durch die Bakterien- suspension ersetzt. Die Inkubation der Blättchen in der Agrobakteriensuspension erfolgte für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z. B. 0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispiels- weise 3 mg/1 Benzylaminopurin (BAP) sowie 1 mg/1 Indolylessig- säure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem

Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, dabei können folgende Bedingungen angewendet werden : Lichtintensität : 30 bis 80 AMol/m2 x sec, Temperatur : 22 bis 24°C, hell/dunkel Wechsel von 16/8 Stunden. Anschließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstums- regulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zusätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrückung des Bakterienwachstums enthält.

Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/1 ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt.

Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/1 selek- tiert sehr effizient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfahrens sind denkbar. Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium bis sich Sprossknospen und kleine Sprosse ent- wickeln, die dann auf das gleiche Basalmedium einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsre- gulatoren, nämlich z. B. 0,5 mg/1 Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/1 Gibberillinsäure GA3, zur Bewurzelung übertragen werden.

Bewurzelte Sprosse können ins Gewächshaus überführt werden.

Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteil- hafte Modifikationen möglich : - Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12 Tage, bevorzugt 3 bis 4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vorinkubiert werden.

Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben.

- Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5,8) kann auf pH 5,2 gesenkt werden. Dadurch wird die Kontrolle des Agro- bakterienwachstums verbessert.

- Die Zugabe von AgNO3 (3 bis 10 mg/l) zum Regenerations- medium verbessert den Zustand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.

- Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem Fach- mann bekannt sind, wie z. B. Zitronensäure, Ascorbinsäure, PVP u. v. a. m., wirken sich positiv auf die Kultur aus.

Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium Verwendung finden. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen Trägern, die auf dem flüssigen Medium positioniert werden inkubiert werden.

Die Transgenizität bewurzelter Sprosse kann anhand isolierter genomischer DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter- sucht werden. Die Verminderung der E-Cyclase-Transkriptmengen (im Vergleich mit dem zur Transformation verwendeten Wildtyp) infolge Transformation mit dem Transformationsplasmid pS5AI7 oder pS5CI7 kann untersucht werden durch Northerngelblotanalyse nach Standardmethoden (Sambrook & Russel, 2001, Molecular Cloning : A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) unter Verwendung einer e-Cyclase-spezifischen Hybridisierungssonde, beispielsweise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Weiterhin kann die Ver- minderung der E-Cyclase-Transkriptmengen (im Vergleich mit dem zur Transformation verwendeten Wildtyp) mittels E-Cyclase-spezifischer Realtime PCR untersucht werden.