MAMMIFERE NON-HUMAIN TRANSGENIQUE POUR LA REGION

CONSTANTE DE LA CHAINE LOURDE DES IMMUNOGLOBULINES

HUMAINES DE CLASSE G ET SES APPLICATIONS

La présente invention est relative à un mammifère non-humain transgénique pour la région constante de la chaîne lourde des immunoglobulines humaines de classe G et à ses applications pour la production d'anticorps humanisés de classe IgG, en particulier d'IgGl humanisées.

Les immunoglobulines ou anticorps sont des molécules bifonctionnelles capables de lier un grand nombre d'antigènes par leurs domaines variables (VH et VL) et d'interagir, par leurs domaines constants, avec des cellules du système immunitaire (monocytes, macrophages) et des systèmes effecteurs de l'organisme (système du complément, ADCC, opsonisation). La structure des immunoglobulines comprend deux chaînes légères identiques et deux chaînes lourdes identiques reliées par des ponts disulfures. Il existe cinq principales classes d' immunoglobulines ou anticorps (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) ainsi que des sous-classes ou isotypes (par exemple, IgGl à IgG4 chez l'homme) déterminées par le type de leur chaîne lourde. La classe des IgG, et en particulier la sous-classe des IgGl chez l'homme, correspond aux anticorps les plus actifs.

En effet, les immunoglobulines G (IgG) constituent l'essentiel de la réponse secondaire aux antigènes. La liaison de l'IgG à l'antigène a un effet direct de neutralisation (toxines, virus). La plupart des sous-classes d'IgG et notamment les IgGl chez l'homme, sont capables d'activer la cascade enzymatique du complément qui aboutit à la lyse des cellules cibles. Les IgG sont les anticorps les plus efficaces pour sensibiliser les cibles des réactions de cytotoxicité-dépendante d'anticorps (ADCC pour Antibody-Dependent CeIl Cytotoxicity). Les macrophages et les neutrophiles possèdent des récepteurs de Fcγ (RPcγ) qui participent à la capture des complexes immuns (phénomène d Opsonisation). En outre, les IgG franchisssent la barrière placentaire (chez l'homme).

Les IgG comprennent deux chaînes lourdes identiques (chaîne γ), d'isotype γl à γ4 (sous-classe IgGl à IgG4) chez l'homme, associées par l'intermédiaire de ponts disulfures, à deux chaînes légères identiques d'isotype kappa (K) OU lambda (λ).

La chaîne lourde γ, qui est spécifique de cette classe d'immunoglobulines, existe sous forme membranaire et sous forme sécrétée. La forme sécrétée comprend quatre domaines d'environ 110 acides aminés : un domaine variable VH et trois domaines constants CHl, CH2 et CH3, ainsi qu'une région charnière (« hinge » ou H) entre CHl et CH2. La forme membranaire comprend en outre un domaine hydrophobe (ml) permettant l'ancrage de la protéine dans la membrane, ainsi qu'un domaine intracytoplasmique (m2). La région de la chaîne lourde correspondant aux domaines CHl, CH2, H, CH3 (forme sécrétée) ou CHl ₅ CH2, H, CH3, ml, m2 (forme membranaire), est dénommée région constante par opposition à la région correspondant au domaine variable VH ₅ qui est dénommée région variable.

Les chaînes légères K et λ ₅ qui sont communes à l'ensemble des classes et sous-classes d'immunoglobulines, comprennent deux domaines : un domaine variable (VL) et un domaine constant (CL). Chez l'Homme, l'expression des chaînes K et λ est équivalente, alors que chez la souris l'expression du locus λ est très faible de telle sorte que 95 % des chaînes légères sont de type K. La région de la chaîne légère correspondant au domaine CL est dénommée région constante par opposition à la région correspondant au domaine variable VL ₅ qui est dénommée région variable.

Les gènes des immunoglobulines sont organisés en locus, un locus pour les chaînes lourdes (locus IgH) et un locus pour chacune des chaînes légères (locus lambda et kappa).

Les locus des chaînes légères comprennent chacun des gènes V et J codant pour le domaine variable et des gènes C codant pour le domaine constant ; au cours de la différenciation des lymphocytes B, un gène V est réarrangé avec un gène J et un gène C, et la région V subit en outre des mutations somatiques qui permettent de produire des anticorps de forte affinité pour l'antigène.

Le locus des chaînes lourdes comprend des gènes V ₅ D et J codant pour le domaine variable et des gènes C (Cμ, Cδ, Cγ, Cε et Ca) codant pour les domaines constants des isotypes des différentes classes d'immunoglobulines ; chaque gène C ₅ sauf Cδ, est précédé d'une séquence de commutation ou « switch « (S). Les gènes Cγ (Cγl à Cγ4 chez l'homme) contiennent des introns séparant les exons codant pour les domaines constants CHl, H, CH2, CH3 et les exons de membrane ml et m2.

Au cours de la différenciation des lymphocytes B, un gène V est réarrangé avec un gène D et un gène J ₅ et la région V subit également des mutations somatiques qui permettent de produire des anticorps de forte affinité pour l'antigène. En outre, alors que la réponse primaire à l'antigène est constituée principalement d'IgM, la réponse secondaire est associée au mécanisme de commutation de classe au cours duquel la séquence de commutation Sμ, située en amont de Cμ recombine avec une autre séquence de commutation conduisant ainsi la production d'une autre classe d'immunoglobuline (IgG, IgE ou IgA).

La diversité des anticorps produits en réponse à la stimulation par un antigène provient de la combinaison de plusieurs mécanismes : la multiplicité des gènes V, la mutation somatique de ces gènes V, la recombinaison somatique des gènes V et la recombinaison somatique des séquences de commutation.

Du fait de leur capacité de liaison aux antigènes qui est extrêmement spécifique et de leurs propriétés effectrices (neutralisantes, cytotoxiques), les anticorps monoclonaux et en particulier ceux de la classe des IgG, possèdent un vaste champ d'applications dans de nombreux domaines, notamment médical, pour le diagnostic et le traitement de pathologies (pathologies infectieuses, tumorales, allergies, rejets de greffe, intoxications...).

Toutefois, l'utilisation in vivo chez l'homme d'anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques (imagerie) ou thérapeutique est limitée du fait que la plupart des anticorps utilisables, sont des anticorps xénogéniques (anticorps de souris) qui sont mal tolérés et peu efficaces chez l'Homme et qu'il n'existe pas de méthode permettant d'obtenir des anticorps recombinants humains ou humanisés qui soient d'emblée majoritairement de la classe IgG, qui est la plus active. En effet, l'utilisation d'anticorps de souris en immunothérapie humaine conduit souvent à l'apparition d'anticorps humains anti-anticorps de souris, phénomène pouvant s'accompagner de réactions d'hypersensibilité et de l'apparition de taux importants de complexes immuns en sus des capacités bloquantes de ces anticorps vis-à-vis de l'anticorps mononoclonal. De plus les propriétés effectrices des anticoips: fixation au CIq, première étape de l'activation de la voie classique du complément qui aboutit à la lyse des cellules cibles, ou aux RFc, responsables de la

capture des complexes immuns ou de la cytotoxicité-dépendante d'anticorps (ADCC), ne sont pas optimales pour les anticorps de souris injectés chez l'homme.

Les problèmes observés avec les anticorps monoclonaux de souris sont résolus par l'utilisation d'anticorps humanisés et en particulier d'IgG humanisées, de structure très proche des anticorps humains et donc mieux tolérés et plus efficaces. On appelle anticorps humanisé, un anticorps dérivé d'un mammifère non-humain par fusion des domaines constants des chaînes lourdes et légères d'un anticorps humain avec les domaines variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps d'un mammifère non-humain. Toutefois, les méthodes de production d'anticorps recombinants humains ou humanisés de classe IgG actuellement disponibles sont peu efficaces et présentent les inconvénients suivants :

* Pimmortalisation de lymphocytes B humains spécifiques d'un antigène est peu efficace, * les méthodes in vitro reposent sur la production d'anticorps animaux, suivie du clonage des gènes codant leurs régions variables, de leur association par génie génétique avec des gènes correspondant aux régions constantes des anticorps humains, puis de l'expression in vitro dans des cellules CHO transfectées. Ces méthodes ne permettent pas de prédire l'activité potentielle des anticorps animaux chez l'homme du fait de leur structure qui est différente de celle des anticorps humains et de leur faible capacité à recruter des cellules effectrices humaines. A cause de ce problème, ce n'est qu'après un long travail d'immunisation in vitro qu'un tel anticorps peut être validé; les étapes de clonage et de construction des gènes chimériques sont longues et soumises à des aléas ; l'expression in vitro dans des cellules CHO transfectées a un rendement peu élevé.

* les méthodes in vivo reposent sur la production d'immunoglobulines monoclonales humaines directement chez des souris transgéniques dans lesquelles tout ou partie des loci des gènes d'immunoglobulines de souris sont remplacés par tout ou partie des loci équivalents humains : XenoMouse® d'Abgenix (Brevets US 6,114,598 ; 6,162,963 : 6,150,584 ; 6,673,986 ; 6,395,514 et EP 1 690 935 ; Demandes US 2005/287630 et 2005/241006), HuMAb-Mouse® de Medarex (Demandes US 2003/14483 et Brevet CA 2508763) ; Brevet US 5,545,807 ;

TC Mouse™ de Kirin Brewery (Demande US 2002/0199213) et KM-Mouse® de Medarex et Kirin Brewery.

Initialement, deux types de souris transgéniques, permettant par croisement d'obtenir des souris productrices d'anticorps humains fonctionnels, ont été créées (Lonberg et al, Nature, 1994, 368 :856-859 ; Green et al , Nat. Genêt., 1994, 7, 13-21). Les unes avaient intégré un fragment de 80 kb artificiellement reconstruit correspondant à diverses parties du locus des chaînes lourdes humaines (soit 4 gènes VH, 15 segments D, 6 segments J, les séquences codantes pour les régions Fcμ et Fcγl ainsi que celles nécessaires à la commutation); les autres avaient intégré un fragment de 43 kb contenant 4 gènes VK, 5 segments JK, le gène CK et les séquences enhancers adéquates. Ces lignées de souris transgéniques sont généralement déficientes pour la production d'immunoglobulines murines, en particulier du fait de l'invalidation du locus kappa endogène (souris K -/-) et/ou d'une mutation qui inactive le locus IgH endogène (mutation μMT -/-). Les souris obtenues par croisement produisaient des anticorps humains de type IgM, ou IgG lors de réponses secondaires, indiquant que les fragments introduits permettent la commutation de classe; de plus, l'analyse des anticorps monoclonaux obtenus montra que des mutations somatiques affectaient les régions variables de ces anticorps lors de la réponse secondaire, indiquant l'existence d'une maturation apparemment correcte de la réponse anticorps. D'autres lignées de souris comprenant les gènes Cμ, Cδ et l'un des gènes Cγl, Cγ2, Cγ3 ou Cγ4 humains [IgGl, IgG2 et IgG4 : XenoMouse® d'Abgenix (Green et al, J. Immunol. Methods, 1999, 231, 11-23 ; Demande Internationale PCT WO 00/76310 et Demande américaine US 2006/0134780); IgGl et IgG3 : HuMab Mouse® de GenPharm-Medarex] ou le locus de la chaîne légère lambda (Demande US 2002/0088016)) ont également été obtenues.

Une autre approche consistant à introduire des fragments chromosomiques humains entiers (technologie "transchromosomique"), a permis de générer des souris contenant 100 % des gènes humains (TC Mouse™ de Kirin Brewery ; Tomizuka et al, Proc. Natl. Acad. Sd., 2000, 97, 722-727). Des lignées de souris hybrides (KM-Mouse® : HuMab-Mouse® x TC Mouse™) ont été ensuite établies et présenteraient l'avantage de développer des réponses immunitaires beaucoup plus élevées que celles observées avec les souris HuMab-Mouse®.

Ces méthodes in vivo ne permettent pas de cibler la production des immunoglobulines humaines vers la classe IgG. Les modèles de souris transgéniques pour des contigs du locus des chaînes lourdes humaines incluant quelques gènes variables et les gènes Cμ et Cγ qui codent pour les régions constantes des anticorps humains IgM et IgG ont un répertoire de faible diversité du fait de l'inclusion partielle du locus au sein du contig, avec un nombre limité de gènes V, et donc des difficultés à obtenir des anticorps de haute affinité et à obtenir des IgG, chez des animaux qui produisent surtout des IgM humaines.

Par ailleurs, la Demande Internationale PCT WO 2005/04733 décrit une lignée de souris transgéniques produisant des quantités importantes d'immunoglobulines humanisées de classe IgA (de l'ordre du gramme par litre). Dans cette lignée, le gène Cal codant pour la chaîne lourde d'immunoglobuline αl humaine a été inséré dans le locus IgH en lieu et place de la séquence de commutation Sμ (mutation alphal knock-in ou alphal-KI). Dans cette construction, la suppression de la séquence de commutation Sμ associée à l'insertion du transgène Ca en lieu et place de cette séquence, abolit l'expression du gène μ endogène responsable de la synthèse de chaînes lourdes d'IgM. En outre, celle des autres gènes de chaînes lourdes d'immunoglobulines (IgG, IgE) est fortement diminuée du fait du blocage de la commutation de classe vers les gènes constants d'immunoglobulines situés en aval de Cμ sur le locus IgH endogène. Ainsi, les animaux transgéniques obtenus produisent des quantités importantes d'IgA chimériques dont le domaine constant de la chaîne lourde est humanisé et les domaines variables sont d'origine murine.

Toutefois, l'état actuel des connaissances ne permet pas d'envisager de produire d'autres classes d'immunoglobulines humaines par une stratégie analogue à celle décrite pour les IgA dans la Demande Internationale PCT WO 2005/047333. En effet, chaque classe d'immunoglobuline (IgA, IgG, IgE, IgM) constitue un récepteur différent, inséré dans la membrane cellulaire par un domaine de séquence différente. Par conséquent, l'efficacité des IgA humaines à permettre la différenciation B ne permet pas de déduire qu'il en serait de même pour n'importe qu'elle autre classe d'immunoglobuline humaine. De plus, la tentative d'expression d'IgE humaines en lieu et place des IgM de souris, suivant une stratégie analogue à celle utilisée pour les IgA, a résulté en l'absence complète de cellules B chez les animaux homozygotes pour la

mutation. En outre, la différenciation des lymphocytes B par l'expression d'une immunoglobuline humaine de classe G chez la souris n'est pas connue.

Dans ce contexte, les Inventeurs ont construit une lignée d'animaux chez lesquels le gène Cγl codant pour la chaîne lourde d'immunoglobuline γl humaine a été inséré dans le locus IgH en lieu et place de la séquence de commutation Sμ (mutation gammal knock-in, gammal-KI ou γl-KI). Ils ont montré que de façon imprévisible, l'obtention de mutants homozygotes pour l'insertion γl dans le locus IgH permettait d'obtenir des souris produisant des lymphocytes B qui expriment très majoritairement la chaîne lourde γl humaine et à un taux très réduit (100 fois inférieur à la normale) les chaînes lourdes murines. Cette lignée dénommée "gammaprim", a été caractérisée comme capable de produire des IgGl humanisées au niveau de la chaîne lourde et comme capable de produire des anticorps spécifiques après immunisation. Cette lignée est utilisée pour la production d'anticorps monoclonaux humanisés de classe IgGl à des fins d'immunothérapie (anti -infectieuse ou anti- tumorale) ou de diagnostic. Cette lignée peut également être utilisée pour le criblage rapide d'anticorps monoclonaux ayant les propriétés effectrices d'une IgGl humaine dans des tests d'activité in vitro ou in vivo.

En conséquence, l'invention a pour objet un mammifère non-humain transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend un locus IgH modifié par remplacement de la séquence de commutation Sμ par tout ou partie d'un transgène constitué par le gène Cγ d'une immunoglobuline humaine de classe G, incluant au moins l'exon codant pour le domaine CH3 et les exons de membrane ml et m2.

Conformément à l'invention, le transgène Cγ ou la partie de ce transgène incluant au moins l'exon codant pour le domaine CH3 et les exons de membrane ml et m2, qui est inséré en lieu et place de la séquence de commutation Sμ, est donc situé entre l'activateur intronique Eμ, en 5' et le gène Cμ en 3 '(figure 1).

Dans cette construction, la suppression de la séquence de commutation Sμ associée à l'insertion du transgène Cγ en lieu et place de cette séquence, abolit l'expression du gène μ endogène responsable de la synthèse de chaînes lourdes d'IgM. En outre, celle des autres gènes de chaînes lourdes d'immunoglobulines est également très fortement réduite du fait du blocage de la commutation de classe vers les gènes

constants d'immunoglobulines situés en aval de Cμ sur le locus IgH endogène. Ainsi, les animaux transgéniques obtenus produisent des quantités importantes d'IgG chimériques dont le domaine constant de la chaîne lourde est humanisé et les domaines variables sont d'origine murine. La chaîne lourde transgénique γ humaine bénéficie d'un répertoire totalement diversifié puisque correspondant au répertoire normal généré par les réarrangements des segments VH, D et JH du locus IgH murin. En outre, les animaux transgéniques sont capables de produire des anticorps humanisés de forte affinité en réponse secondaire à l'antigène, du fait que leurs lymphocytes B peuvent recruter le phénomène d'hypermutation somatique. Il en résulte l'obtention directe d'anticorps monoclonaux par immunisation des animaux et dérivation d'hybridomes, sans nécessité de clonage des gènes d'immunoglobulines. L'activité effectrice (cytotoxique, neutralisante) des anticorps monoclonaux ainsi obtenus peut être validée immédiatement, et ces anticorps monoclonaux peuvent rapidement progresser vers le stade des essais cliniques ou d'une utilisation en tant que réactif de diagnostic. Les animaux transgéniques selon l'invention constituent donc un outil précieux pour la production directe, le criblage et la validation fonctionnelle d'anticorps monoclonaux à visée thérapeutique ou diagnostique.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit mammifère non-humain transgénique est homozygote pour ledit locus IgH modifié.

Selon un autre un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit locus IgH est modifié par remplacement de la séquence de commutation Sμ par la totalité du gène Cγ, incluant les exons CHl, charnière (H ou "hinge"), CH2, CH3 et les exons de membrane (ml et m2), séparés par les introns correspondants. Selon un autre un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit locus IgH est modifié par remplacement de la séquence de commutation Sμ, par le segment du gène Cγ incluant l'exon codant pour le domaine CH3 et les exons de membrane ml et m2, séparés par les introns correspondants.

Selon un autre un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit gène Cγ est le gène Cγl .

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit mammifère non-humain transgénique comprend un autre transgène codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline humaine.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le dit transgène est un gène kappa humain (codant pour une chaîne légère kappa humaine).

De préférence, ledit transgène est un gène kappa humain comprenant Pactivateur intronique Eμ, en amont et le palindrome hs3a/hsl,2/hs3b, en aval. Ces séquences, qui sont décrites dans Chauveau et al, Gène, 1998, 222, 279-285, permettent d'obtenir une forte expression de la chaîne kappa humaine dans les cellules B et d'induire l'hypermutation somatique du transgène kappa humain. De manière préférée, ledit transgène est sous le contrôle du promoteur de la chaîne lourde humaine (pVH).

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit mammifère non-humain transgénique est dizygote pour ledit transgène. Selon une disposition avantageuse des modes de réalisation précédents de l'invention, lesdits mammifères non-humains transgéniques comprenant un autre transgène codant pour une chaîne légère kappa humaine possèdent un locus endogène de la chaîne légère kappa d'immunoglobulines inactivé (délété ou muté), notamment par recombinaison homologue. De préférence, lesdits mammifères non- humains transgéniques sont homozygotes pour ladite inactivation ; de manière préférée il s'agit de souris transgéniques. Parmi les mammifères non-humains transgéniques dont le locus endogène de la chaîne légère kappa d'immunoglobuline a été inactivé par recombinaison homologue, on peut citer notamment la lignée de souris décrite dans Zou et al, EMBO J., 1993, 12, 811-820 et la mutation KD décrite dans Sirac et al. , Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2006, 103, 7747-7752.

De tels mammifères non-humains transgéniques produisent des IgG humanisés dont la quasi-totalité des chaîne légères sont d'origine humaine.

L'invention englobe les animaux transgéniques issus de n'importe quelle espèce de mammifère, notamment des rongeurs de laboratoire. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit mammifère non-humain transgénique est une souris transgénique.

L'invention englobe notamment une lignée de souris transgéniques, dénommée lignée "gammaprim", comprenant :

- un locus IgH modifié par remplacement de la séquence de commutation Sμ par le gène Cγl d'une immunoglobuline humaine de classe G. L'invention englobe également une lignée de souris double-transgénique, dénommée lignée gammaprim/kappa, comprenant :

- un locus IgH modifié par remplacement de la séquence de commutation Sμ par le gène Cγl d'une immunoglobuline humaine de classe G, et

- un gène VK humain complet comprenant le gène VK 1 réarrangé avec un gène Jκ5, l'intron JK-CK et le gène CK ₅ SOUS le contrôle transcriptionnel du promoteur de la chaîne lourde humaine (pVH), de l'activateur intronique Eμ en amont, et du palindrome hs3a/hsl,2/hs3b en aval.

Les animaux de cette lignée double-transgénique produisent des IgGl partiellement humanisées pour la chaîne lourde et totalement humanisées pour ce qui concerne la chaîne légère.

En effet, l'expression de la chaîne kappa transgénique dans cette lignée est capable d'entraîner l'exclusion allélique, c'est-à-dire d'empêcher dans la plupart des cellules B transgéniques, l'expression des gène endogènes de chaînes légères d'immunoglobulines murines. Le répertoire de réponse aux antigènes de cette lignée de souris est normal étant donné que c'est essentiellement le domaine VH de la chaîne lourde qui contribue à la formation du site anticorps. Or, la chaîne lourde transgénique γ humaine bénéficie d'un répertoire totalement diversifié puisque correspondant au répertoire normal généré par les réarrangements des segments VH, D et JH du locus IgH murin, comme précisé ci-dessus.

En outre, les souris de cette lignée transgénique sont capables de produire des anticorps de forte affinité en réponse secondaire à l'antigène, du fait que leurs lymphocytes B peuvent recruter le phénomène d'hypermutation somatique, à la fois au niveau du gène de la chaîne lourde et du transgène de chaîne légère kappa. Les animaux transgéniques selon l'invention sont obtenus par les procédés classiques de transgénèse animale, selon les protocoles standards tels que décrits dans Transgenic Mouse: Methods and Protocols ; Methods in Molecular

Biology, Clifton, NJ., Volume. 209, Octobre 2002. Edité par : Marten H. Hoβer, Jan Van Deursen, Martern H. Hofker et Jan Van Deursen. Publié par Holly T. Sklar : Humana Press.

Les séquences des gènes humains et murins d'immunoglobulines qui servent à la construction des animaux transgéniques selon l'invention sont connues et accessibles dans les bases de données; elles peuvent être amplifiées par PCR à l'aide d'amorces appropriées. Par exemple, la totalité du gène Cγl (SEQ ID NO : 13) incluant les séquences de l'exon CHl, de la région charnière ("hinge"), des exons CH2, CH3 et des exons de membrane ml et m2, séparées par les introns correspondants, peut être amplifiée par PCR à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO: 1 et 8.

La construction du gène VK humain est telle que décrite dans Chauveau et al, Gène, 1998, 222, 279-285 ; la séquence du gène Vκl réarrangé avec le gène Jκ5 et le gène CK correspond à la séquence GenBank X64133 (SEQ ID NO : 9) qui code pour une chaîne légère humaine présentant la séquence correspondant au numéro d'accès CAA45494 (SEQ ID NO : 10) dans la base de données EMBL.

Les insertions de fragments géniques dans le génome des mammifères non-humains peuvent être réalisées de façon aléatoire, de préférence elles sont réalisées de façon ciblée, par recombinaison homologue avec un vecteur de ciblage approprié comprenant éventuellement des séquences de recombinaison d'une recombinase site-spécifique comme les sites LoxP de la recombinase Cre. Les inacti- vations ou délétions de fragments géniques dans le génome des mammifères non- humains sont réalisées par recombinaison homologue avec un vecteur de ciblage approprié comprenant éventuellement des séquences de recombinaison d'une recom- binase site-spécifique comme les sites LoxP de la recombinase Cre. Les animaux double-transgéniques sont obtenus par croisement d'animaux transgéniques pour la chaîne lourde gamma avec des animaux transgéniques pour la chaîne légère, tels que définis ci-dessus. La lignée gammaprim/kappa est obtenue par croisement d'animaux de la lignée gammaprim telle que définie ci -dessus avec des animaux de la lignée K ARN exprimant une chaîne légère kappa d'immunoglobuline humaine telle que décrite dans la Demande Internationale PCT WO 2005/047333.

Les animaux double-transgéniques sont éventuellement croisés avec des animaux transgéniques dont le locus endogène de la chaîne légère kappa d'immunoglobulines a été inactivé par recombinaison homologue, tels que définis ci- dessus. La présente invention a également pour objet un vecteur de ciblage de la recombinaison homologue, caractérisé en ce qu'il comprend le gène Cγ d'une immunoglobuline humaine de classe G ou un segment de ce gène incluant au moins l'exon codant pour le domaine CH3 et les exons de membrane ml et m2, flanqué de fragments de séquences du locus IgH d'un mammifère non-humain qui sont adjacents à la séquence Sμ.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur de ciblage, il comprend une cassette d'expression d'un marqueur de sélection approprié, adjacente audit gène Cγ ou au segment dudit gène tel que défini ci-dessus.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite cassette d'expression est flanquée de séquences de recombinaison site-spécifique. De préférence, lesdites séquences sont les séquences LoxP de la recombinase Cre. Cette disposition permet éventuellement d'exciser ladite cassette d'expression.

Selon un autre mode de réalisation dudit vecteur de ciblage, lesdits fragments de séquences qui sont adjacents à la séquence Sμ sont d'origine murine. Selon un autre mode de réalisation dudit vecteur de ciblage, le gène

Cγ ou le segment dudit gène est flanqué en 5' d'un fragment d'environ 5 kb correspondant à la région JH/Eμ et en 3' d'un fragment d'environ 5 kb correspondant à la région Cμ, lesquels fragments correspondant respectivement aux positions 131281 à 136441 et 140101 à 145032 de la séquence GenBank AC073553 (SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12).

La présente invention a également pour objet des cellules embryonnaires d'un mammifère non-humain, modifiées par un vecteur de ciblage tel que défini ci-dessus.

Les dites cellules embryonnaires (cellules souches totipotentes) modifiées sont utiles pour l'obtention des mammifères transgéniques tels que définis ci-dessus ; elles sont injectées dans des blastocystes de mammifère, selon les techniques classiques de transgénèse animale.

La présente invention a également pour objet, l'utilisation d'un mammifère non-humain transgénique tel que défini ci-dessus pour la production d'anticorps humanisés de classe IgG ou de fragments de ces anticorps.

La présente invention a également pour objet un procédé de prépara- tion d'anticorps humanisés de classe IgG ou de fragments de ces anticorps, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :

- l'immunisation d'un mammifère non-humain transgénique tel que défini ci-dessus avec un antigène d'intérêt,

- la préparation, par tout moyen approprié, d'anticorps humanisés de classe IgG ou de fragments de ces anticorps, à partir du sérum, des sécrétions ou des lymphocytes B dudit mammifère non-humain transgénique.

La présente invention a également pour objet un procédé de criblage d'anticorps thérapeutiques, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - l'immunisation d'un mammifère non-humain transgénique tel que défini ci-dessus avec un antigène d'intérêt,

- la préparation, par tout moyen approprié, d'anticorps monoclonaux dirigés contre ledit antigène d'intérêt, à partir des lymphocytes B dudit mammifère non-humain transgénique, - l'évaluation de l'activité desdits anticorps monoclonaux, par tout moyen approprié, et

- la sélection des anticorps monoclonaux actifs.

L'activité desdits anticorps monoclonaux est notamment l'activité de liaison spécifique de l'antigène, l'activité neutralisante vis-à-vis d'un pathogène (virus, champignon, bactérie, parasite) ou d'une toxine ou bien l'activité cytotoxique vis-à-vis de cellules tumorales ou de cellules infectées par un pathogène tel que définit ci- dessus. Cette activité est mesurée in vitro ou in vivo par des tests classiques bien connus de l'Homme du métier.

Les mammifères non-humains transgéniques selon l'invention présentent l'avantage de permettre la production d'anticorps monoclonaux de classe IgG qui sont d'emblée des anticorps chimériques humanisés de classe IgG. Le procédé de production d'anticorps monoclonaux humanisés de classe IgG selon l'invention est

donc plus simple, plus rapide et plus économique que les procédés de l'art antérieur puisqu'il ne nécessite pas d'étapes additionnelles de clonage des gènes desdits anticorps et de fusion des domaines variables desdits anticorps avec les domaines constants d'immunoglobulines humaines. L'activité effectrice (cytotoxique, neutralisante) des anticorps monoclonaux ainsi obtenus peut être validée immédiatement par des tests d'activité in vitro ou in vivo. Ces anticorps monoclonaux peuvent rapidement progresser vers le stade des essais cliniques ou d'une utilisation en tant que réactif de diagnostic.

L'invention englobe la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux constitués par des IgG ou leurs fragments, notamment les fragments Fab, Fab'2 et Fc. De préférence, les dits fragments sont des fragments fonctionnels comprenant les domaines variables des chaînes lourdes et légères (Fab, Fab'2, Fv, scFv).

Les anticorps humanisés de classe IgG tels que définis ci-dessus et leurs fragments sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que celles décrites dans Antibodies : A Laboratory Manual, E. Howell and D Lane, CoId Spring Harbor Laboratory, 1988. De manière plus précise : - les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d'un mammifère non humain transgénique tel que défini ci-dessus avec un antigène d'intérêt, éventuellement couplé à la KLH ou à l'albumine et/ou associé à un adjuvant approprié tel que l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l'hydroxyde d'alumine ; après obtention d'un titre en anticorps satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques sont éventuellement purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne appropriée sur laquelle est fixé l'antigène tel que défini ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d'IgG monospécifiques.

- les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d'un mammifère non-humain transgénique tel que défini ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notamment dans

des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite ; alternativement, lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique comme décrit dans le brevet américain US 4,816,567. Par exemple, des mammifères non-humains transgéniques tels que défini ci-dessus sont immunisés de façon forte et répétée avec des antigènes choisis (antigènes de bactéries, de virus, de champignons, antigènes spécifiques de tumeurs tels que l'antigène carcino-embryonnaire, etc.), selon un protocole standard comprenant une première immunisation par injection intrapéritonéale de l'antigène dans un volume équivalent d'adjuvant complet de Freund puis une deuxième immunisation (rappel) 15 jours plus tard dans des conditions identiques mais avec cette fois de l'adjuvant incomplet de Freund. Les anticorps monoclonaux sont produits selon un protocole standard comprenant le sacrifice des animaux deux semaines après le dernier rappel, le prélèvement de la rate, la mise en suspension des lymphocytes spléniques et la fusion de ces lymphocytes avec la lignée cellulaire SP2/0 (cette lignée murine ne produit aucun anticorps murin, est immortalisée, et possède toute la machinerie de sécrétion nécessaire à la sécrétion d'immunoglobulines).

- les fragments d'anticorps sont produits à partir des régions VH et V _L clonées, à partir des ARNm d'hybridomes ou de lymphocytes spléniques d'un mammifère non-humain transgénique selon l'invention, immunisé ; par exemple, les fragments Fv ou Fab sont exprimés à la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299) ; après plusieurs étapes de sélection, les fragments d'anticorps spécifiques de l'antigène sont isoiés et exprimés dans un système d'expression approprié, par les techniques classiques de clonage et d'expression d'ADN recombinant.

Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont puri- fiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que la chromatographie d'affinité.

La présente invention a également pour objet, un anticorps humanisé de classe IgG susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend des chaînes lourdes chimérique dont les domaines constants sont d'origine humaine et les domaines variables sont issus dudit mammifère non-humain, et des chaînes légères humaines dont les domaines variables sont codés par Vκl- Jκ5.

L'invention englobe les anticorps humanisés de classe IgG dont la chaîne légère est codée par le gène Vκl-Jκ5 présentant la séquence Genbank X64133 (SEQ ID NO : 9) ou une séquence produite par hypermutation de cette séquence, notamment après activation des lymphocytes B en présence de l'antigène. La présente invention a également pour objet, un fragment d'un anticorps humanisé de classe IgG susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment desdites chaînes lourdes et légères telles que définies ci-dessus.

L'invention englobe les anticorps polyclonaux, les anticorps mono- clonaux ainsi que leurs fragments (Fab, Fc, Fab'2).

Les anticorps humanisés selon l'invention et leurs fragments tels que définis ci-dessus, sont bien tolérés chez l'Homme (minimisation du risque de réaction allergique par immunisation inter-espèce) et possèdent une demi-vie prolongée chez l'Homme, étant donné que la région constante de la chaîne lourde et la tota- lité de la chaîne légère de ces anticorps sont d'origine humaine.

La présente invention a également pour objet un anticorps humanisé de classe IgG ou un fragment de cet anticorps, tels que définis ci-dessus comme médicament ; un tel anticorps ou son fragment possédant des propriétés effectrices (neutralisante, cytotoxique) dirigées contre un antigène d'intérêt sont utilisés en immunothérapie pour la prévention et le traitement de pathologies telles que notamment les maladies infectieuses, les cancers, les intoxications, les allergies, les rejets de greffe.

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un anticorps humanisé de classe IgG ou un fragment de cet anticorps, tels que définis ci-dessus, associé par tout moyen approprié à une molécule thérapeutique; l'anticorps est de préférence dirigé contre un antigène membranaire, de façon à cibler le principe actif (toxine, agent antiviral, anticancéreux) dans la cellule cible.

Selon un mode de réalisation avantageux des compositions selon l'invention, elles contiennent en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des substances porteuses et/ou des adjuvants.

Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances

porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.

Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par des émulsions huileuses, de la saponine, des substances minérales, des extraits bactériens, de l'hydroxyde d'alumine et le squalène. Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par des liposomes unilamellaires, des liposomes multilamellaires, des micelles de saponine ou des microsphères solides de nature saccharidique ou aurifère.

Les compositions selon l'invention, sont administrées par voie intramusculaire, sous-cutanée, intra-péritonéale, intraveineuse, intracranienne, orale, sublinguale, intranasale, oculaire, nasale, rectale, par inhalation ou par application transdermique; la dose et le rythme d'administration varient en fonction de l'espèce

(humaine ou animale) et de la maladie à traiter.

La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic comprenant un anticorps humanisé de classe IgG ou un fragment de cet anticorps, tels que définis ci-dessus.

Les réactifs peuvent être couplés à des particules ou à un marqueur approprié. Les particules sont notamment des particules d'or, des liposomes (liposomes contenant un colorant) ou des érythrocytes (immunoagglutination). Le marqueur est une substance qui produit un signal détectable par les méthodes conventionnelles ou qui réagit avec une autre substance, de façon à produire un signal détectable. Parmi les marqueurs utilisables dans les méthodes de diagnostic selon l'invention, on peut citer notamment, les chromophores, les substances fluorescentes ou chimioluminescentes, les enzymes, les isotopes radioactifs et les agents complexants (Protéine A, Protéine G, biotine, lectine).

Les réactifs tels que définis ci-dessus peuvent également être immobilisés sur un support approprié, selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. Parmi les supports appropriés sur lesquels peuvent être immobilisés ces réactifs on peut citer notamment ceux en matière plastique (latex, polystyrène, poly- vinylchloride, polyuréthane, polyacrylamide, polyvinylacétate), en verre, ou en papier (nitrocellulose). Ces supports sont sous la forme de plaques (microplaques), de feuilles, de bandelette, ou de particules (billes). L'immobilisation des réactifs sur le

support peut être réalisée par formation d'un pontage entre le réactif et une molécule qui est couplée au support (hydrazide, Protéine A, glutaraldéhyde, carboiimide ou lysine), selon les techniques conventionnelles.

Les réactifs selon l'invention sont utilisables dans des méthodes de diagnostic qui mettent en œuvre des techniques d'immunochimie conventionnelles, par exemple : EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence, immunoagglutination, immunochromatographie, immunocytochimie, immunohistochimie, immunoblot, et immunoprécipitation.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anti- corps humanisé de classe IgG ou un fragment de cet anticorps, tels que définis ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et au traitement d'une pathologie sélectionnée dans le groupe constitué par: les maladies infectieuses, les cancers, les intoxications, les allergies et les rejets de greffe. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps humanisé de classe IgG ou un fragment de cet anticorps, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un réactif destiné au diagnostic d'une pathologie sélectionnée dans le groupe constitué par: les maladies infectieuses et les cancers.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation des mammifères non-humains transgéniques selon la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :

- la figure 1 illustre la structure du locus IgH modifié obtenu par recombinaison homologue entre le locus IgH murin et le vecteur de ciblage dénommé p-gammalKI, comprenant : i) un fragment de 6860 pb du gène d'immunoglobuline gammal humain incluant les exons codant pour les domaines constants CHl, charnière ("hinge"), CH2 et CH3 et les exons de membrane ml et m2 de la chaîne lourde d'immunoglobuline γl, ii) une cassette néo bordée de sites LoxP, iii) des séquences flanquantes homologues à une portion du locus murin des chaînes lourdes d'immunoglobulines, avec, en amont, un fragment d'environ 5 kb correspondant à la région JH-Eμ (fragment DQ 52/JH) et en aval un autre fragment d'environ 5 kb correspondant au gène Cμ (fragment Cμ). Les sites EcoRl sont indiqués, ainsi que la position de la sonde (3 'muXbάl-EcoRY) s'hybridant en dehors du site de recombinaison

homologue, en 5' du gène constant IgH Delta (δ) et de son site EcoRl. L'allèle recombinant est caractérisé par un fragment d'environ 7,5 kb représentant le fragment μ murin et la cassette néo alors que l'allèle sauvage est caractérisé par un fragment de 12 kb. - la figure 2 représente la séquence du fragment de 6860 pb (SEQ ID

NO : 13) du gène d'immunoglobuline gammal humain inséré au locus IgH des souris transgéniques gammaprim. Les exons codant pour les domaines constants CHl, charnière ("hinge"), CH2 et CH3 et les exons de membrane ml et m2 de la chaîne lourde d'immunoglobuline γl sont indiqués en caractères gras. Les sites d'épissages 5' et 3' sont soulignés et les sites de polyadénylation sont indiqués en caractères gras et soulignés. Les séquences correspondant aux amorces GamlCHl-5'F et Garni mbexon-3'R sont indiquées en grisé.

- la figure 3 illustre l'analyse en Southern-blot de l' ADN génomique de clones ES transfectés avec le vecteur de ciblage p-gammalKI ; l'ADN génomique digéré par EcoRl est hybride avec une sonde correspondant à la région 5' du gène δ. 1. clone recombinant (n°153). 2. ADN génomique sauvage. 3. sous-clone issu du clone n°153. 4. sous-clone issu du clone n°153. La présence d'un fragment de 7,5 kb indique que le clone a intégré le transgène γl humain par recombinaison homologue. Par comparaison, un fragment de 12 kb est présent dans l'ADN génomique sauvage. - la figure 4 illustre l'analyse en Southern-blot de l'ADN génomique de queue de souris; l'ADN génomique digéré par EcoRl est hybride avec une sonde située en 5' du gène δ. A. souris sauvage (WT). B. hétérozygote γl-KI. C. homozygote γl-KI . D. homozygote γl-KI "floxé" (excision du gène néo par la recombinase Cre). L'allèle recombinant correspond à un fragment d'environ 7,5 kb représentant le fragment μ murin et la cassette néo. L'allèle recombinant "floxé" correspond à un fragment d'environ 5,5 kb représentant le fragment μ murin seul (sans la cassette néo). L'allèle sauvage correspond à un fragment de 12 kb.

- la figure 5 illustre l'analyse en cytométrie de flux de l'expression membranaire des IgGl humaines à la surface des lymphocytes spléniques d'un animal homozygote de la lignée transgénique gammaprim comparé à un animal contrôle. Les lymphocytes spléniques ont été marqués avec des anticorps spécifiques de CD 19

(marqueur spécifique des cellules B) et d'IgGl humaines. Pour l'analyse en cytométrie, une fenêtre a été établie sur les lymphocytes CD 19+.

- la figure 6 illustre l'analyse en ELISA de la réponse en anticorps

IgGl humaines spécifiques, d'un animal de la lignée gammaprim immunisé par l'antigène p24 du VIH. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA) d'IgGl anti-p24 en fonction du temps en jours (les flèches représentent la première immunisation à JO, puis les rappels).

Exemple 1 : Obtention et caractérisation génotypique de la lignée de souris transgéniques homozygotes pour la mutation gammaprim Le gène de la chaîne lourde d'immunoglobuline gammal humaine, incluant les exons codant pour les domaines CHl, charnière ("hinge"), CH2 et CH3 et les exons de membrane (ml et m2), a été inséré par recombinaison homologue, en lieu et place de la région de commutation Sμ de la chaîne lourde murine (Sμ), de façon à bloquer la commutation de classe vers les gènes constants d'immunoglobulines situés en aval de Cμ sur le locus endogène (locus IgH murin, figure 1). La région ciblée abolit l'expression du gène μ endogène responsable de la synthèse de chaînes lourdes d'IgM, et diminue également de façon drastique celle des autres gènes de chaînes lourdes d'immunoglobulines. En conséquence, la lignée transgénique obtenue produit une forte quantité d'IgG chimériques dont le domaine constant humanisé correspond à l'isotype lgGl.

1) Construction du vecteur de ciblage de la recombinaison homologue

Les constructions plasmidiques ont été réalisées à partir du plasmide bluescript SK (pSK) (STRATAGENE) et de la souche bactérienne E. coli TGl (STRATAGENE), en utilisant les protocoles classiques de préparation, de clonage et d'analyse de l'ADN tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).

Le vecteur de recombinaison homologue ou vecteur de ciblage dérivé de pSK, dénommé p-gammalKI (figure 1), comprend : i) un fragment de 6860 pb (SEQ ID NO : 13) du gène d'immunoglobuline gammal humain incluant les exons codant pour les domaines constants CHl, charnière ("hinge"), CH2 et CH3 et les exons de membrane ml et m2 de la chaîne lourde d'immunoglobuline γl (figure 2), ii)

une cassette néo (fragment de 1 ,6kb), iii) des séquences flanquantes homologues à une portion du locus murin des chaînes lourdes d'immunoglobulines, avec, en amont, un fragment d'environ 5 kb correspondant à la région JH-Eμ (fragment DQ 52/JH) et en aval un autre fragment d'environ 5 kb correspondant au gène Cμ (fragment Cμ). De manière plus précise, les différents fragments ont été insérés dans le plasmide bluescript SK, selon les étapes suivantes :

- Dans une première étape, le fragment Cμ correspondant aux positions 140101 à 145032 de la séquence Genbank AC073553 (SEQ ID NO : 12) a été amplifié par PCR à l'aide d'amorces spécifiques appropriées puis clone au site Xhol de pSK pour donner le plasmide pA.

- Dans une seconde étape, le fragment DQ 52/JH correspondant aux positions 131281 à 136441 de la séquence GenBank AC073553 (SEQ ID NO : 1 1) a été amplifié par PCR à l'aide d'amorces spécifiques appropriées puis clone en 5' du fragment Cμ, entre les sites EcoRV et Clal du plasmide pA, pour donner le plasmide pB.

- Dans une troisième étape, la cassette néo décrite dans Pinaud et al., Immunity, 2001, 15, 187-199, a été insérée au site Sali entre DQ52/JH et Cμ, pour donner le plasmide pC.

- Dans une quatrième étape, le fragment Cγl de 6860 pb flanqué d'adaptateurs Clal et contenant le gène gammal humain a été amplifié en une seule étape de PCR grand fragment à l'aide du couple d'amorces GamlCHl-5'F (5' caatcgatgcccgtgagcccagac 3', SEQ ID NO: 1) et Garni mbexon-3'R (5' aaatcgatgctcccatcacgaagtacaa 3', SEQ ID NO: 8) puis les séquences de l'ensemble des régions codantes et des sites d'épissage ont été vérifiées par PCR à l'aide des amorces suivantes:

-GamlCHl-5'F (SEQ ID NO: 1)

- Garni CH1-3'R ; 5' gcttccagcagagacaccct 3' (SEQ ID NO: 2)

- Garni CH2-5'F : 5' cagctcggacaccttctc 3' (SEQ ID NO: 3)

- Garni CH2-3'R : 5'ccggcctctgtccatgtg 3' (SEQ ID NO: 4) - Garni CH3-5'F : 5'cacatggacagaggccgg 3 ' (SEQ ID NO: 5)

- Garni CH3-3'R : 5' ctgacccgtggaaagaac 3' (SEQ ID NO: 6)

- Garni mbexon-5'F : 5' agctgacctcaggacatt 3' (SEQ ID NO: 7)

- Garni mbexon-3'R (SEQ ID NO: 8)

Enfin, dans une dernière étape, le fragment Cγl de 6860 pb flanqué d'adaptateurs Clal et contenant le gène gamma 1 humain ainsi obtenu, a été inséré entre le fragment JH et la cassette néo au site Clal du plasmide pC pour donner le vecteur de ciblage dénommé p-gammalKI.

La séquence de p-gammalKI a été vérifiée par séquençage automatique et par analyse de restriction avec les enzymes Clal et Xhol, confirmant que le vecteur était apte à permettre une recombinaison homologue telle que schématisée à la figure 1. 2) Transfection de cellules ES et injection dans des blastocvstes

Des cellules ES ont été transfectées par électroporation de l'ADN de p-gammalKI linéarisé au site Notl. Les clones sélectionnés en présence de généticine ont été prélevés et l'ADN génomique digéré par EcoRl a été analysé par Southern Blot à l'aide d'une sonde radioactive s'hybridant en dehors du site de recombinaison homologue, en 5' du gène constant IgH Delta (δ) et de son site EcoRl (figure 1) ; cette sonde dénommée 3'muXbal-EcoRl, amplifiée par PCR à l'aide d'amorces spécifiques appropriées, correspond aux positions 145032 à 145945 de la séquence Genbank AC073553.

La présence d'un allèle recombinant est visualisée par un fragment d'environ 7,5 kb (représentant le fragment μ murin et la cassette néo) alors que Pallèle sauvage correspond à un fragment de 12 kb (figure 3). Dans ces conditions, sur 192 clones analysés, 1 s'est révélé positif.

La vérification du caryotype de deux des quatre clones recombinants n'a montré aucune anomalie chromosomique (aneuploïdie). Ce clone a été injecté dans des blastocystes de souris C57/Black 6 en utilisant les protocoles classiques de transgénèse tels que ceux décrits dans Transgenic Morne: Methods and Protocols, précité. Un mâle chimère, présentant un degré de chimérisme élevé, a été obtenu et mis en accouplement avec des femelles C57/Black 6 afin d'obtenir des animaux hétérozygotes qui ont été analysés par Southern-Blot (Figure 4), PCR et ELISA. Une lignée de souris homozygotes pour le locus IgH recombiné (Figure 4), dénommée ci-après lignée gammal knock-in, gammal-KI, γl- KI ou gammaprim a ensuite été obtenue par croisement des animaux hétérozygotes.

3) Détection du locus IgH recombiné portant le gène Cμ.1 humain (allèle gammal-KI) et du locus IgH sauvage (allèle u sauvage) par PCR

L'ADN génomique d'un échantillon de queue des animaux homozygotes obtenus comme précisé ci-dessus, a été analysé par PCR à l'aide des deux couples d'amorces suivants :

- couple spécifique du locus IgH murin non muté (allèle μ sauvage) :

- amorce UpstreamSpe I Smu : 5' gag tac cgt tgt ctg ggt cac 3' (SEQ ID NO: 14)

- amorce SacI-3'Imu : 5' gag ctc tat gat tat tgg tta ac 3' (SEQ ID NO: 15)

La réaction d'amplification a été réalisée avec une température d'hybridation de 61°C. Cette PCR amplifie en 30 cycles un fragment de 91 paires de bases-encadrant le site Spe /-spécifique du locus IgH murin non muté.

- couple spécifique du locus IgH recombiné portant le gène Cγl humain (allèle gammal knock-in ou Rammal-KX)

- amorce Neol : 5' gca tga tct gga cga aga gca 1 3' (SEQ ID NO: 16) - amorce Neo2 : 5' tcc cet cag aag aac teg tca a 3' (SEQ ID NO: 17)

La réaction d'amplification a été réalisée avec une température d'hybridation de 55 ⁰ C. Cette PCR amplifie en 30 cycles un fragment de 120 paires de bases spécifique du locus IgH recombiné portant le gène Cγl humain (mutation gammal knock-in ou gammal-KI ). Les animaux de la lignée gammaprim sont systématiquement et simultanément négatifs en PCR avec les amorces spécifiques de l' allèle μ sauvage et positifs en PCR avec les amorces spécifiques de l' allèle gammal knock-in.

Exemple 2 : Caractérisation phénotypique de la lignée de souris transgéniques homozygotes pour la mutation gammaprim 1) Dosage du taux des IgM murines et des IgGl humaines sériques totales en néphélométrie et en ELISA a) néphélométrie

Les IgGl humaines sériques ont été dosées par néphélométrie sur un automate BNII™ (BEHRING) en utilisant le kit de dosage des IgGl (BEHRING), selon les recommandations du fournisseur.

Les dosages d'IgGl humaines sériques ont donné des résultats totalement corrélés avec ceux du génotypage réalisé par les tests PCR :

- les animaux contrôle non mutants ont un taux nul d'immunoglobulines humaines de classe IgGl

- les animaux homozygotes γl-KI ont toujours un taux significatif d'IgGl humaines, ce taux variant entre 0,5 et 1 g/1 dans le sérum. Par contre, les IgM murines sont indétectables dans le sérum de ces animaux, b) ELISA

Les résultats obtenus en néphélométrie ont été confirmés en ELISA suivant les étapes suivantes : des anticorps non-marqués anti-IgG humaines (monoclonal anti-human IgG, SIGMA) ou des anticorps non-marqués anti-IgM murines (Southern Biotechnologies Associates) dilués au l/1000 ^ieme (anti-human IgG) ou au l/500 ^eme (anti-IgM murines) en tampon carbonate 0,1 M, pH 8,3, ont été incubées une nuit à + 4° C dans des plaques à 96 puits (Maxisorb™, NUNC; 100 microlitres/puits). Après 3 lavages avec du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween (PBS-Tween 0,1 %), les plaques ont été saturées en présence de PBS contenant 3 % de Sérum albumine bovine (BSA; 100 microlitres/puits). Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween 0,1 %, les sérums à tester, dilués au l/100 ^eme et au l/1000 ^eme en tampon PBS contenant 1 % BSA ont été ajoutés (100 microlitres/puits) et les plaques ont été incubées 3 heures à 37 ⁰ C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween 0,1 %, un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline (monoclonal anti- human IgG-AP, SIGMA) ou un sérum anti-IgM murines marqué à la phosphatase alcaline (Biosys) dilués au l/1000 ^eme dans du PBS-Tween 0,1 % (100 microlitres/puits) ont été ajoutés et les plaques ont été incubées 3 heures à 37 ⁰ C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween 0,1 %, les IgG humaines et les IgM murines fixées ont été révélées par addition de substrat de la phosphatase alcaline (p- nitrophenylphosphate, SIGMA) à 1 mg/ml en tampon Tris 0,2M, pH 7,0. La réaction a été bloquée par addition de soude 3N (30 microlitres/puits) puis la lecture a été effectuée à l'aide d'un spectromètre, à une longueur d'onde d'absorbtion de 405 nm.

Les données quantitatives sont obtenues par extrapolation avec une gamme d'un sérum étalon (BEHRING) pour le dosage des IgGl humaines, et d'une IgM monoclonale murine (SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES ASSOCIATES) pour le dosage des IgM murines.

Le dosage des IgGl sériques en ELISA montre une différence significative entre les homozygotes et les hétérozygotes ; les sérums d'homozygotes dilués au l/500 ^ieme contiennent 0,8 g/1 d'IgGl humaines, alors que des valeurs très faibles (0,03 g/1) sont observées pour les sérums d'hétérozygotes même à la dilution la plus faible (au l/100 ^eme ). A l'inverse lorsque les IgM murines sont dosées en ELISA, on observe un taux normal d'IgM murines (de l'ordre de 1 g/1) chez les souris contrôles « non mutantes » de même que chez les animaux hétérozygotes pour la mutation gammaprim. Par contre, le taux des IgM murines est nul chez les animaux homozygotes gammaprim. 2) Analyse de l'expression d'un récepteur membranaire de Ia classe des IgG humaines à la surface des lymphocytes spléniques de Ia lignée gammaprim

Les animaux homozygotes porteurs de la mutation γl-KI ont été phénotypés en cytométrie de flux, par double marquage à l'aide d'anticorps spécifiques d'IgGl humaine marqués à Alexa633 ou d'IgM murines marqués à la fluorescéine, et d'anticorps spécifiques des cellules B (anticorps anti-CD19) marqués à la phycoérythrine. De manière plus précise :

- Préparation des cellules lymphoïdes : la rate, organe lymphoïde secondaire a été choisie pour cet expérience. Cet organe a été prélevé chez différents animaux mutants homozygotes γl-KI puis dilacérés en tampon versène (Invitrogen), et filtrés sur tamis (40 microns) afin d'obtenir une suspension de cellules individuelles débarrassée des agrégats cellulaires. Les cellules spléniques ont alors été centrifugées et soumises à une étape supplémentaire de choc osmotique afin de lyser les globules rouges par remise en suspension du culot cellulaire dans 1 ml d'eau distillée. Les cellules des échantillons ont ensuite été immédiatement remises en suspension dans du milieu complet (RPMI + 10 % sérum de veau fœtal), comptées et conservées sur de la glace.

- Marquage à l'aide d'anticorps fluorescents : 10 ⁵ cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4° C avec une dilution au l/100 ^eme d'un anticorps anti- IgM de souris marqué à Pisothiocyanante de fluorescéine (Southem Biotechnologies), d'un anticorps anti-IgG humaines couplé à Alexa 633 et d'un anticorps spécifique des cellules B (anticorps anti-CD19) marqué à la phycoérythrine. Les cellules ont ensuite

été lavées dans 5 ml de PBS puis le surnageant a été décanté et les cellules ont été remises en suspension dans 100 microlitres de PBS, 0,5 % BSA, 0,1 mM EDTA.

- Analyse en cytofluorimétrie : les cellules marquées ont été analysées à l'aide d'un cytomètre de flux (COULTER XL™). Les résultats de la cytométrie de flux sont en accord avec ceux du dosage des immunoglobulines sériques. Chez les animaux homozygotes de la lignée gammal-KI, on ne détecte aucune expression dTgM murines. Pourtant en l'absence d'expression dTgM, un compartiment de cellules B périphériques CDl 9+ est capable de se différencier chez ces animaux et représente 6 % des lymphocytes spléniques. Ces cellules B périphériques expriment pour 40 % d'entre elles une immunoglobuline membranaire de la classe des IgGl humaines (figure 5). 3) Production d'anticorps spécifiques par Ia lignée gammaprim a) Immunisation

Les animaux ont été immunisés une première fois par injection intra- péritonéale de 20 microgrammes d'antigène p24 (protéine de la nucléocapside du

VIH-I) diluée dans 200 microlitres de sérum physiologique et mise en émulsion avec

200 microlitres d'adjuvant complet de Freund (SIGMA). Toutes les 2 semaines, les animaux ont subi un rappel vaccinal par injection intra-péritonéale de 20 microgrammes d'antigène 24 diluée dans 200 microlitres de sérum physiologique et mise en émulsion avec 200 microlitres d'adjuvant incomplet de Freund (SIGMA). b) Dosage des anticorps spécifiques de l'antigène p24

La présence d'anticorps spécifiques de l'antigène p24 a été recherchée par ELISA, 2 semaines, puis 4 semaines après la deuxième injection de l'antigène suivant la technique suivante : - adsorption de l'antigène p24 (1 microgramme/ml en tampon carbonate 0,1 M pH 8,3) sur des plaques 96 puits (Maxisorb, NUNC; 100 microlitres/puits ) par incubation une nuit à 4 ⁰ C,

- 3 lavages en PBS-Tween 0,1 %,

- saturation des plaques en milieu complet (PBS, 3 % BSA; 100 microlitres/puits) ,

3 lavages en PBS-Tween 0,1 %,

- distribution des sérums à tester dilés au l/100 ^ème et au l/200 ^ème en tampon (PBS ₅ 1 % BSA; 100 microlitres/puits),

- incubation 3 heures à 37 °C,

- 3 lavages en PBS-Tween 0,1 %, - distribution d'un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline (monoclonal anti-human IgG-AP, SIGMA) dilué au l/1000 ^eme (100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS-Tween 0,1 %,

- révélation de la réaction enzymatique par addition de p- nitrophenylphosphate en tampon TRIS 0,2M (SIGMA) ₃

- blocage de la réaction par addition de soude 3N (30 microlitres/puits),

- lecture en spectrométrie à une longueur d'onde d'absortion de 405 nm, - le taux des anticorps IgG anti-p24 est exprimé en unités arbitraires

(UA), établies pour la moyenne des sérums dilués au l/100 ^eme et l/200 ^eme en fonction du rapport Densité optique sérum testé / Densité optique du sérum témoin.

La présence d'anticorps spécifiques de l'antigène p24 a été détectée par ELISA à partir de J26 (après 2 immunisations - 100 UA), et est fortement démontrée à J47 (3 semaines après la deuxième injection de l'antigène — 450 UA; figure 6). En comparaison, il a été vérifié qu'en l'absence d'immunisation des animaux, le taux des anticorps IgGl anti-p24 détectés restait inférieur à 5 unités.

Exemple 3 : Obtention et caractérisation de la lignée double-transgénique gammaprim/kappa exprimant une chaîne lourde gammal chimérique et une chaîne légère kappa d'immunoglobulines humaines

Le croisement des lignées KARN exprimant une chaîne légère kappa d'immunoglobuline humaine, telle que décrite dans la Demande Internationale PCT WO 2005/047333 et gammal -KI décrite aux exemples précédents, génère des souris doubles transgéniques gammaprim/kappa. Pour ce faire, les animaux homozygotes pour la mutation gammal -

KI et homozygotes pour le transgène K ARN ont été croisés entre eux. En première génération (Fl) après ce croisement, tous les animaux obtenus sont hétérozygotes pour la mutation gammal -KI et hétérozygotes pour le transgène K ARN. Ces animaux Fl

ont donc été à nouveau croisés : à la génération suivante (F2) les lois de la génétique Mendélienne permettent d'obtenir 1 animal sur 4 homozygote pour la mutation gammal-KI et un animal sur 4 homozygote pour le transgène K ARN. Parmi ces animaux F2, un animal sur 16 a donc pu être sélectionné comme portant à la fois la mutation gammal-KI à l'état homozygote et comme portant le transgène K ARN à l'état homozygote. Ces animaux sont les fondateurs de la lignée gammaprim/kappa et ils transmettent de façon stable à leur descendance les gènes permettant simultanément la production d'une chaîne lourde gammal humanisée en remplacement de la production d'IgM murines ainsi que la production et la diversification par hypermutation d'une chaîne K humaine.

Cette lignée de souris doubles transgéniques est dénommé lignée gammaprim/kappa a) présence du transgène K

La transmission du transgène K ARN au cours des croisement d'animaux transgéniques a été suivie par Southern Blot à l'aide d'une sonde spécifique de la région CK humaine (fragment EcoRl-EcoRl de 2,5 kb incluant la totalité de l'exon CK humain).

L'expression du transgène K chez les animaux mutants a été détectée par dosage en ELISA de chaînes kappa libres humaines éliminées dans les urines des animaux. De manière plus, précise : des plaques à 96 puits (Maxisorb®, NUNC) ont été incubées une nuit à + 4° C en présence d' un anticorps non marqué anti-κ humain (Kallestad) dilué au l/1000 ^ème en tampon carbonate 0,1 M pH 8,3 (100 microlitres/puits). Après 3 lavages avec du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween (PBS-Tween 0,1 %), les plaques ont été saturées en présence de PBS contenant 10 % sérum de veau fœtal (100 microlitres/puits). Après 3 lavages avec du tampon PBS- Tween O ₃ I %, les échantillons d'urine à tester, dilués au l/100 ^ème et au l/500 ^ème en tampon PBS contenant 10 % de sérum de veau fœtal ont été ajoutés (100 microlitres/puits) et les plaques ont été incubées 3 heures à 37 °C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween 0,1 %, un antisérum anti-κ humain marqué à la phosphatase alcaline (SIGMA) dilué au l/1000 ^ème dans du PBS-Tween 0,1 % (100 microlitres/puits) a été ajouté et les plaques ont été incubées 1 heure à 37 °C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween 0,1 %, les chaînes légères kappa humaines fixées

ont été révélées par addition de substrat de la phosphatase alcaline (p-nitrophényl- phosphate, SIGMA) à 1 mg/ml en tampon Tris 0,2M, pH 7,0. La réaction a été bloquée par addition de soude 0,5 N (50 microlitres/puits) puis la lecture a été effectuée par spectrométrie à une longueur d'onde d'absorbtion de 405 nm. Alternativement, l'expression du transgène kappa humain a été analysée en cytométrie de flux, par double-marquage à l'aide d'un anticorps anti-kappa murin (marqué à la phycoérythrine) en conjonction avec un anticorps anti -kappa humain (marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine), selon le protocole décrit à l'exemple 2. Les résultats montrent que la présence du transgène K ARN entraîne un phénomène important d'exclusion allélique, tel que parmi les lymphocytes périphériques plus de 50 % expriment la chaîne légère humaine et ne réarrangent donc pas les gènes de chaîne légères murines pour exprimer une chaîne légère murine. b ) homozygotie pour la mutation gammal— KI

Le premier élément simple indiquant l'homozygotie gammal -KI est la présence d'un taux élevé d'IgGl humaines dans le sérum des animaux. En outre l'homozygotie a été confirmée en PCR par la positivité de la « PCR gammal-KI » associée à la négativité de la « PCR allèle μ sauvage ». Enfin, après sacrifice des animaux, l'analyse en cytométrie de flux a permis de montrer sur les lymphocytes de la rate que la totalité des lymphocytes B (CD 19+) expriment des IgGl humaines membranaire alors qu'en parallèle aucune cellule B n'exprime d'IgM murine. c) Vérification de la présence simultanée de la mutation alphal-KI et du transgène K ARN chez les animaux gammaprim/kappa et leur descendance.

Les animaux double-transgéniques gammaprim/kappa ont été caractérisés comme ceux répondant simultanément aux deux spécificités décrites ci- dessus : présence du transgène K ARN à l'état homozygote et homozygotie pour la mutation gammal-KI. De plus, ces animaux se reproduisent en préservant ces deux spécificités et le phénotype de leur descendance possède les propriétés suivantes, simultanément et de façon stable :

- la production d'IgGl humanisée à un taux conséquent (facilement vérifïable par ELISA ou néphélométrie sur un simple prélèvement de sang réalisé chez les animaux vivants au niveau du sinus rétro-orbitaire)

- la production de chaîne légère K humaine (facilement vérifiable par ELISA sur un simple prélèvement d'urines réalisé chez les animaux vivants).

Le répertoire de réponse aux antigènes de ces souris est attendu comme subnormal puisqu'on sait que c'est essentiellement le domaine VH de la chaîne lourde qui contribue à la formation du site anticorps (or la chaîne lourde transgénique γl humaine bénéficie d'un répertoire totalement diversifié puisque correspondant au répertoire normal généré par les réarrangements des segments VH,

D et JH du locus IgH murin.). Ces souris sont capables de produire des anticorps de forte affinité en réponse secondaire, ce qui résulte du fait que leurs lymphocytes B peuvent recruter le phénomène d'hypermutation somatique à la fois au niveau du gène de chaîne lourde et du transgène de chaîne légère K ARN.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.