Diese Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit mindestens ei¬ ner heterologen DNA-Sequenz, die einen erhöhten Gehalt an be¬ stimmten Sekundärstoffen aufweisen, Verfahren zu deren Her¬ stellung sowie deren Verwendung im Wald-, Weide-, Wiesen-, Zierpflanzen- oder Nutzpflanzenbau.

Pflanzliche Sekundärstoffe spielen bei der pflanzlichen Abwehr gegen Pathogene, Freßfeinde oder Parasiten eine wichtige Rolle (siehe z. B. Rhodes, Plant Molecular Biology 24 (1994), 1-20; Chasan, Plant Cell 6 (1994) 3-9) . Bisher sind jedoch keine Verfahren bekannt, den Gehalt an Sekundärstoffen über einen längeren Zeitraum deutlich zu steigern und dadurch eine er¬ höhte Pathogenresistenz und/oder eine erhöhte Resistenz gegen Freßfeinde oder Parasiten zu erreichen. Gegenwärtig beruht der Pflanzenschutz überwiegend auf der Behandlung von Pflanzen mit verschiedenen Pflanzenschutzmitteln, deren Toxikologie und ökologische Auswirkungen in vielen Fällen problematisch sind.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine per εe pathogenresistente und/oder gegen Freßfeinde oder Parasiten resistente Pflanze bereitzustellen, um die Verwendung von Pflanzenschutzmitteln zumindest teilweise einzuschränken und somit den Pflanzenschutz vom toxikologischen und ökologischen Standpunkt zu verbessern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer transgenen Pflanze mit mindestens einer heterologen DNA- Sequenz, die für mindestens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität kodiert, worin das Polypeptid exprimiert wird, in enzymatisch aktiver Form vorliegt und mindestens einen Sekun-

därstoff in einer gegen pflanzliche Schädlinge, insbesondere antiviral und/oder bakterizid und/oder fungizid und/oder in- sektizid und/oder als Repellent wirkenden Konzentration enzy- matisch erzeugt, gelöst.

Der Begriff "pflanzliche Schädlinge" umfaßt Nematoden, Insek¬ ten und pflanzliche Pathogene wie Viren, Pilze und Bakterien. Der Begriff "transgene Pflanze" bzw. "Pflanze" umfaßt die ganze Pflanze als solche sowie deren Teile, wie Wurzel, Sten¬ gel, Blatt, organspezifisches Gewebe oder Zellen, deren ver¬ mehrungsfähiges Material, insbesondere Samen, und deren Keim¬ linge.

Ferner umfaßt dieser Begriff Gymnospermae, Monocotyledoneae und Dicotyledoneae, insbesondere Nutzpflanzen, wie Getreide, beispielsweise Roggen, Mais, Weizen, Mais, Gerste, Reis, Hafer und Hirse,* Stärkeknollen und -wurzeln, beispielsweise Kartof¬ fel, Batate und Maniok; Zuckerpflanzen, beispielsweise Zucker¬ rohr und Zuckerrübe,* Hülsenfrüchte, beispielsweise Bohnen, Erbsen und Kichererbsen; Öl- und Fettfruchte, beispielsweise Sojabohne, Erdnuß, Sonnenblume, Ölbaum, Raps und Kokosnuß; Ge¬ müse, beispielsweise Tomate, Kohl, Zwiebel, Gurke, Karotte und Salat; Obst, beispielsweise Trauben, Citrusfrüchte, Banane, Apfel, Birne, Pfirsich und Ananas,- nußartigen Früchte, bei¬ spielsweise Walnuß, Haselnuß, Mandel und Cashew-Nuß; Genußmit¬ telpflanzen, beispielsweise Tabak, Kaffee, Tee, Kakao; Arten für pflanzliche Fasern, beispielsweise Baumwolle, Jute und Flachs; Arten forstlicher Nutzung, beispielsweise Fichte, Ei¬ che und Pappel; Zierpflanzen wie Impatiens, Begonia, Petunia, Pelargonium, Viola, Cyclamen, Verbena, Vinca, Tagetes, Pri- mula, Saintpaulia, Amaranthus, Ageratum, Anthirrhinum, Aquile- gia, Crysanthemum, Cineraria, , Dahlia, Datura, Delphinium, Gerbera, Gladiolus, Gloxinia, Hippeastrum, Mesembryanthemum, Salpiglossis und Zin; und Pflanzenarten zur Gewinnung von Rohmaterialien, beispielsweise Hevea brasiliensis (Kautschuk) und Jojoba.

Der Begriff "heterologe DNA-Sequenz" bedeutet eine DNA-Se¬ quenz, die aus einer anderen Quelle als dem Wildtyp der erfin¬ dungsgemäßen transgenen Pflanze stammt. Geeignete Quellen sind prokaryontisehen, beispielsweise Escherichia coli , oder euka- ryontischen Ursprungs, einschließlich Archaebakterien. Bevor¬ zugt ist eine nicht-pflanzliche Quelle, insbesondere eine Quelle prokaryontisehen Ursprungs.

Der kodierende Bereich der heterologen DNA-Sequenz kann kodie¬ rende ("Exons") und nicht-kodierende ("Introns") Abschnitte enthalten. Ferner kann die heterologe DNA-Sequenz regulatori¬ sche Abschnitte, wie Promotoren, Enhancer und Terminationsse- quenzen, enthalten.

Der Begriff "Promotor" bedeutet insbesondere eine stromauf¬ wärts von der Startstelle der Transkription liegende Nukleo- tidsequenz, die alle für die Transkription erforderlichen re¬ gulatorischen Bereiche, einschließlich dem für die 5'' -nicht- translatierte Sequenz (" eader-Sequenz") der mRNA kodierenden Bereich, enthält, wobei die Leader-Sequenz die ribosomale Bin¬ dungsstelle umfaßt und den Start der Translation am AUG-Start- codon initiiert. Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten geeignet sind, bein¬ halten Promotoren, die aus Viren, Pilzen, Bakterien, Säugern und Pflanzen stammen, und die in Pflanzenzellen aktiv sind oder aktiviert werden können. Der Promotor kann die gewünschte DNA konstitutiv oder differentiell exprimieren. Beispiele für Promotoren, welche die DNA-Expression differentiell regulie¬ ren, sind durch Krankheitsträger, wie Thrips oder Pilze, indu¬ zierbare Promotoren, beispielsweise die sog. "wundinduzierbaren" Promotoren. Selbstverständlich soll der verwendete Promotor die Expression der heterologen DNA-Sequenz derart erhöhen, daß letztendlich eine biologisch wirksame Kon¬ zentration von Sekundärstoffen in der Pflanze bzw. in den ent¬ sprechenden Pflanzenteilen oder -zellen erzeugt wird. Beson¬ ders bevorzugte Promotoren sind der Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S (CaMV 35S) -Promotor und Derivate davon, und ein durch Ver¬ letzung bzw. Verwundung durch einen Krankheitsträger wie Thrips induzierbarer ("wundinduzierbarer") Promotor. Beispiele

weiterer geeigneter Promotoren schließen Promotoren des No- palinsynthase- und Octopinsynthase-Systems und dergleichen ein.

Der Begriff "Terminationssequenz" bedeuted eine Nukleinsäure- sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit, welche die Been¬ digung der Translation anzeigt. Terminationssequenzen sind insbesondere 3 ' -nicht-translatierte Sequenzen, die ein Polya- denylierungssignal enthalten, das eine Addition von Polya- denylatsequenzen an das 3 ' -Ende eines Primärtranskriptes in¬ itiiert. In Pflanzenzellen aktive Terminationssequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Sie können aus Bakterien, Pil¬ zen, Viren, Säugern oder Pflanzen isoliert werden. Beispiele für insbesondere in den erfindungsgemäßen Konstrukten zu ver¬ wendende geeignete Terminationssequenzen beinhalten die No- palinsynthase-Terminationssequenz aus A. tumefaciens, die 35S- Terminationssequenz aus CaMV und die Zein-Terminationssequenz aus Zea mays .

Bevorzugt ist eine heterologe DNA-Sequenz, die keine Introns enthält.

Darüberhinaus umfaßt dieser Begriff Chimäre DNA-Sequenzen so¬ wie synthetische oder halbsynthetische DNA-Sequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz das ubiC-Gen aus Escherichia coli ; vgl. Fig. 1. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Nukleinsäuresequenzen, die zur in Fig. l gezeigten DNA-Sequenz ähnlich sind und die für Polypeptide kodieren, die gemäß vorliegender Erfindung mindestens einen Sekundärstoff, insbesodere Phenolderivate, enzymatisch erzeugen können. Der Begriff "ähnlich" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Testsequenz komplemen¬ tär ist, wobei diese Testsequenz zur Hybridisierung mit der in Fig. l gezeigten DNA-Sequenz befähigt ist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Teile der in Fig. 1 gezeigten DNA-Se¬ quenz und der vorstehend definierten ähnlichen Nukleinsäurese¬ quenzen.

Der Begriff "Polypeptid mit enzymatischer Aktivität" bedeutet ein Polypeptid, das von der vorstehend definierten heterologen

DNA-Sequenz kodiert wird, wobei die kodierende Sequenz ent¬ sprechend dem genetischen Code degeneriert sein kann. So kann gegebenenfalls die kodierende Sequenz nach bekannten Methoden derart degeneriert werden, daß sie in einer Pflanze besser ex¬ primiert wird.

Das Primärtranskript kann direkt translatiert werden oder durch "Spleißen" zu einer translatierbaren mRNA erzeugt wer¬ den. Ferner kann das primäre Translationsprodukt zur Bildung des enzymatisch aktiven Polypeptids post-translational modifi¬ ziert werden, beispielsweise durch Abspaltung einer Signalse¬ quenz, durch enzymatische Spaltung des inaktiven "Precursors" zur Überführung in die enzymatisch aktive Form oder durch Mo¬ difizierung der Seitenketten des Polypeptids, beispielsweise durch Phosphorylierung oder Glykosylierung.

Bevorzugte Beispiele dieser Polypeptide sind das Enzym Choris- mat-Pyruvat-Lyase aus Escherichia coli , dessen Primärsequenz in Fig. 2 dargestellt ist, und das Enzym Isochorismat-Pyruvat- Lyase (= Salicylat-Synthase) .

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Polypeptide, die zu der in Fig. 2 gezeigten Primärsequenz ähnlich sind, in diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "ähnlich" Polypeptide mit gleicher enzymatischer Funktion wie das in Fig. 2 gezeigte Po¬ lypeptid und mit einer Primärsequenz, die mindestens eine un¬ terschiedliche Aminosäure im Vergleich mit der in Fig. 1 ge¬ zeigten Primärsequenz aufweist. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Teile des in Fig. 2 gezeigten Polypeptids und der vorstehend definierten ähnlichen Polypeptide.

Erfindungsgemäß erzeugen diese Polypeptide unter Verwendung von in der transgenen Pflanze vorhandenen Substraten enzyma¬ tisch Sekundärstoffe, die vorzugsweise auch im Wildtyp in ge¬ ringen Mengen vorkommen ("pflanzeneigene Sekundärstoffe") . Die Synthese der Sekundärstoffe in Pflanzen, sofern sie auch im Wildtyp vorkommen, unterliegt vorzugsweise nicht mehr den zel¬ lulären Kontrollmechanismen der Pflanze, d.h. sie verläuft vorzugsweise über einen Biosyntheseweg, der in Pflanzen natür¬ licherweise nicht vorkommt. Diese Sekundärstoffe reichern sich

überraschenderweise in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze in einer biologisch wirksamen Konzentration an, wobei die Anreicherung entweder durch anabole oder katabole Folgere¬ aktionen oder durch Ablagerung in bestimmte Zellkompartimente zustande kommt.

Die Konzentration der in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze angereicherten Sekundärstoffe zeigt eine deutliche an- tivirale und/oder bakterizide und/oder fungizide und/oder in- sektizide und/oder fraßhemmende Wirkung. Vorzugsweise beträgt diese biologisch wirksame Konzentration der Sekundärstoffe (Einheit: μg Sekundärstoff/g Frischgewicht der Pflanze), ins¬ besondere in den zu schützenden Pflanzenteilen (Organe, Ge¬ webe) oder -zellen, mindestens das lOfache, mehr bevorzugt mindestens das 50fache, am meisten bevorzugt mindestens das lOOfache, bezogen auf die Konzentration dieser Stoffe in den Wildtyp-Pflanzen, insbesondere in den entsprechenden Teilen oder Zellen der Wildtyp-Pflanzen.

Der Begriff "Sekundärstoff" umfaßt Inhaltsstoffe von Pflanzen, die dem Sekundärstoffwechsel angehören, sowie deren Derivate, die entweder durch Folgereaktionen in der Pflanzenzelle, bei¬ spielsweise Hydroxylierung, Methylierung, Glykosylierung, Ver- etherung, Veresterung oder Polymerisierung, oder von dem vor¬ stehend definierten Polypeptid direkt enzymatisch erzeugt wer¬ den. Somit kann entweder der erfindungsgemäß erzeugte Sekun¬ därstoff (oder dessen Derivat) per εe die vorstehend defi¬ nierte biologische Wirkung aufweisen oder dessen durch Folge¬ reaktionen erzeugte(n) Derivat (e).

Beispiele für Sekundärstoffe sind Alkaloide, Isoprenoide, Phe¬ nolderivate, Phenylpropane, Chinone, Cumarine, Lignin und Fla- vonoide. Bevorzugt sind Phenolderivate wie Salicylsäure, ins¬ besondere p-Hydroxybenzoesäure und ihre Derivate.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze, worin eine Pflanzenzelle, gegebenenfalls in Protopla-

stenform, durch stabile Integration der heterologen DNA-Se¬ quenz in das genetische Material transformiert wird und die transformierte Pflanzenzelle zur transgenen Pflanze re¬ generiert wird.

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann das Ti-Plasmid oder ein binäres Plasmidsystem in Agrobacterium tumefaciens als Vektor zur stabilen Integration der heterologen DNA-Sequenz in das genetische Material der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze verwendet werden. Weiterhin kann die heterologe DNA- Sequenz z. B. auch durch das Ri-Plasmid von Agrobacterium rhi - zogenes, durch direkten Gentransfer mittels Polyethylenglykol, durch Elektroporation oder durch Partikelbeschuß in das gene¬ tische Material der transgenen Pflanze eingeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der zum Einführen des erfindungsgemäßen DNA-Kon- struktes bzw. der heterologen DNA-Sequenz in Pflanzen, vor¬ zugsweise zur stabilen Integration des DNA-Konstruktes bzw. der heterologen DNA-Sequenz in das genetische Material von Pflanzenzellen, befähigt ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze als pathogenresistente und/oder gegen Freßfeinde und/oder Parasi¬ ten resistente Pflanze im Wald, Weide-, Wiesen-, Zierpflanzen- und Nutzpflanzenbau.

Der Begriff "resistent" bedeuted insbesondere eine markante Herabsetzung der Empfindlichkeit für den Befall von Pflanzen durch Schädlinge.

Als Beispiele für Pathogene können als Viren das Tabak-Mosaik- Virus und das Blumenkohl-Mosaik-Virus, als Bakterien Erwinia amylovora, Pεeudomonaε εyringae, Corynebacterium michiganenεe und Xanthomonaε campeεtris, als Pilze Phytophtora infeεtanε, Clavicepε purpurea, Botrytiε cinerea und Uεtilago maydiε auf¬ geführt werden. Als Freßfeinde und Parasiten können insbeson-

dere Nematoden, Blattläuse, Käfer und Schmetterlingsraupen aufgeführt werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend definierten heterologen DNA-Sequenz zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze.

Die Figuren zeigen:

Fig. l (vgl. SEQ ID Nr. 1) zeigt die kodierende 495 bp lange Nukleinsäuresequenz des ubiC-Gens aus Escherichia coli .

Fig. 2 (vgl. SEQ ID Nr. 2) zeigt die 165 aa lange Aminosäure¬ sequenz der Chorismat-Pyruvat-Lyase aus Escherichia coli .

Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Transformationsvektoren pROK-ubiC und pROK-TPO-ubiC mit dem uJ iC-Gen aus Eεcherichia coli .

Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung:

Das Phenolderivat p-Hydroxybenzoesäure (PHB) ist sowohl in Bakterien als auch in höheren Pflanzen ein Schlüsselmetabolit in der Biosynthese von Ubichinon, einem Elektronenüberträger in der Atmungskette (Pennock und Threlfall (1983) , In: Biosyn- thesis of Isoprenoid Compounds (Porter und Spurgeon, Hrsg.) Vol. 2, 191-203) . In beiden Organismengruppen entsteht PHB aus Chorismat, jedoch auf völlig unterschiedlichen Wegen. In Pflanzen wird Chorismat zunächst im Laufe der aromatischen Aminosäure-Biosynthese über Prephenat in Phenylalanin umgewan¬ delt und dann über Zimtsäure und p-Cumarsäure zu PHB umgesetzt (Heide et al. , Phytochemistry 28 (1989), 2643-2645) . Dagegen wird in Bakterien das Chorismat in einem einzigen Schritt durch das Enzym Chorismat-Pyruvat-Lyase zu PHB und Pyruvat verstoffwechselt. Das für dieses Enzym kodierende Gen ubiC

wurde aus Eεcherichia coli kloniert (Siebert et al . , FEBS Let¬ ters 307 (1992), 347-350) ; vgl. Fig. 1 und 2.

(1) Konstruktion des Transformationsvektors mit dem uJbiC-Gen aus Eεcherichia coli

Zur Konstruktion eines Transformationsvektors wird das in pUBIC (Siebert et al . , Microbiology 140 (1994) , 897-904) enthaltene ubiC-Gen mit EcöRI und Sall gespalten, die En¬ den mit Klenow-Enzym aufgefüllt und in den binären Pflan¬ zenexpressionsvektor pROKl (Bevan et al., EMBO J. 4 (1985) , 1921-1926) kloniert, der zuvor mit BamHI lineari- siert wurde und dessen Enden ebenfalls mit Klenow-Enzym aufgefüllt wurden. Dieser Vektor ermöglicht eine Selektion transgener Pflanzen mittels eines Kanamycin-Resistenzgens, wobei das ubiC-Gen unter der Kontrolle eines 35S-CaMV-Pro- motors steht. Der so hergestellte Transformationsvektor wird als pROK-ubiC bezeichnet; vgl. Fig. 3.

Ein modifiziertes u iC-Gen wird so hergestellt, daß es un¬ ter Wahrung des Leserahmens am 5 '-Ende mit einem pla- stidären Transitpeptid (Sugita et al., Mol. Gen. Genet. 209 (1987) , 247-256) , das von der kleinen Untereinheit der Ribulose-bisphosphat-carboxylase stammt, über die Spalt- stelle Kpnl fusioniert wird, wobei das Konstrukt pTPO-ubiC erhalten wird. Das in pTPO-ubiC enthaltene Fusionsgen TPubiC wird dann wie oben beschrieben in den Vektor pROKl zum Erhalt des Transformationsvektors pROK-TPO-ubiC klo¬ niert; vgl. Fig. 3.

(2) Transformation von Tabakpflanzen

Zur Transformation von Tabakpflanzen (Kultivar Petite Ha¬ vanna SRI)- werden Blätter von steril kultiviertem Tabak in ca. 0,5 x 0,5 cm große Stücke geschnitten und für minde¬ stens eine Minute in eine Kultur von Agrobacterium tumefa - cienε (LBA4404 mit jeweils unter Punkt (1) beschriebenen

Transformationsvektoren) getaucht, die zuvor kurz abzen- trifugiert und in gleichem Volumen sterilem Leitungswasser resuspendiert worden ist. Die Blattstücke werden mit der Unterseite nach oben auf SHI-Medium (in einem Liter 4,6 g Salze nach Murashige und Skoog (Physiol. Plant. 15, (1962) 473-497), 30 g Saccharose, l mg 6-Benzylaminopurin, 0,1 mg Naphtylessigsaure, 100 mg Inositol, 10 mg Thiamin, l mg Pyridoxin, l mg Nicotinsäure und 7 g Agarose) in Petri- schalen ausgelegt und bei 25 °C für drei Tage mit den Agrobakterien cokultiviert. Dabei ist darauf zu achten, daß die Lichtmenge nicht zu groß ist (Streulicht, ca. 1000 bis 3000 Lux) .

Die Selektion gegen Agrobakterien und untransformier e Blatteile erfolgt durch Umlegen der Blattstücke auf SHI _Cef2 5o,κanioo" ^Med:LUin (Zusammensetzung wie das SHI-Medium mit zusätzlich 250 mg/1 Cefotaxim und 100 mg/1 Kanamycin) .

Nach 4 bis 6 Wochen werden die regenerierten Sprosse, die an den Schnittstellen entstanden sind, abgetrennt und in ^PM c _ef i ₂₅ ,κ _a nioo~ ^Me<: ium (Zusammensetzung wie das entspre¬ chende SHI-Medium, aber ohne Zusatz von Naphthylessig- säure, 6-Benzylaminopurin, Inositol, Thiamin, Pyridoxin und Nicotinsäure) in 450 ml Weckgläsern zur Bewurzelung gesteckt. Bei einer Größe von ca. 10 cm werden die Pflan¬ zen vorsichtig an den Wurzeln vom Agarmedium befreit und in sterilisierte Erde gesetzt.

(3) Analyse der transgenen Tabakpflanzen auf PHB-Gehalt

Blattmaterial der unter Punkt (2) erhaltenen transgenen Pflanzen wird unter flüssigem Stickstoff gemδrsert. Für die Extraktion der frei in den Pflanzen vorliegenden PHB wird das gepulverte Blattmaterial in 0,75 M Natriumacetat- Lδsung pH 4,0 suspendiert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird abgenommen, zur Trockene einge-

dampft, in Methanol/Wasser/Ameisensäure (30 : 69,3 : 0,7) aufgenommen und HPLC-chromatographisch untersucht.

Zur Bestimmung der gebundenen PHB (z.B. Ester, Glucoside) wird das gepulverte Pflanzenmaterial in l M HCl eine Stunde bei 80°C hydrolysiert, mit Ethylacetat extrahiert und wie oben beschrieben analysiert.

Transformierte Pflanzen zeigen im Vergleich zur Wildtyp- Pflanze einen um den Faktor 50 erhöhten Gehalt an freier PHB (2,3 μg/g Frischgewicht) sowie einen um den Faktor 1150 erhöhten Gehalt an gebundener PHB. Die PHB liegt in den transgenen Pflanzen zu ca. 50 % glucosidisch gebunden vor. Ihr Gehalt an PHB-Glucosid beträgt ca. 0,3 mg/g Frischgewicht. Zudem werden weiter phenolische Substanzen angereichert.

(4) Biologische Wirkung der erhöhten Konzentration bestimmter Sekundärstoffe in den transgenen Tabakpflanzen auf Tabak- Mosaik-Virus (TMV)

Zum Test auf TMV-Resistenz wird eine Suspension des Virus mit Kieselgur unter leichtem Druck mit einem Pinsel auf die Blätter von transgenen und Wildtyp-Tabakpflanzen (Kultivar Petite Havanna SRI) aufgetragen.

Da sich in den Petite Havanna-Pflanzen das Virus syste¬ misch ausbreitet und keine lokalen Läsionen bildet, werden nach ca. 10 Tagen die Blätter der Tabakpflanzen gemδrsert und der Extrakt wie vorstehend beschrieben auf Blätter des Tabakkultivars Nicotiana tabacu cv. Xanthi aufgetragen. Nach ca. drei Tagen werden die bei diesen Pflanzen aufge¬ tretenen lokalen Läsionen beobachtet.

Als Ergebnis zeigt sich, (i) daß sich in den untransfor- mierten Kontrollpflanzen von N. tabacum cv. Petite Havanna ein hoher TMV-Titer etablieren kann, (ii) daß die TMV-ver-

mehrung in transgenen mit pROK-TPO-ubiC transformierten Pflanzen deutlich vermindert wird und (iii) daß in trans¬ genen mit pROK-ubiC transformierten Pflanzen im wesentli¬ chen kein TMV nachweisbar ist.

Zusammengefaßt kann festgestellt werden, daß die erfindungsge¬ mäßen transgenen Tabakpflanzen, die das ubiC-Gen aus Escheri ¬ chia coli enthalten, eine deutlich erhöhte Pathogenresistenz im Vergleich mit Wildtyp-Pflanzen zeigen und keine neuen In¬ haltsstoffe mit unbekannter Wirkung und Toxikologie bilden, sondern sie enthalten überraschenderweise eine erhöhte Menge an p-Hydroxybenzoesäure (eine in allen Organismen natürlich vorkommende Substanz mit bekannten Eigenschaften) und deren Derivate, insbesondere p-Hydroxybenzoesäureglucosid, die für die Pathogenresistenz verantwortlich sind.