Allgemein stellt eine schlechte zelluläre Aufnahme von Arzneimitteln häufig eine Begrenzung von Therapien dar. So gelangen viele Therapeutika nicht in die Zellen, weil sie wasserlöslich sind und die Zellmembran nicht durchdringen können oder sie gelangen in alle Zellen, wenn sie lipidlöslich sind. Bei Tumor- erkrankungen unterschiedlichster Art, wo die Chemotherapie mit Zytostatika eine wichtige Saute der Therapie darstellt, ist die Auswahl der Zytostatika ein besonderes Problem. Hier muß der behandelnde Arzt die wichtige Entscheidung treffen, welches Zytostatikum aus der Vielzahl möglicher Zytostatika eingesetzt werden soll. Diese Entscheidung muß allerdings oft rividiert werden, da nach einiger Behandlungszeit festgestellt wird, daß das Zytostatikum nicht die ge- wünschte Wirkung entfaltet. Dies kann beispielsweise daran liegen, daß keine nennenswerte Aufnahme der Wirksubstanz im Tumor stattgefunden hat und das Zytostatikum schnell wieder ausgeschieden wird. In einem solchen Fall ist kostbare Behandlungszeit verloren gegangen und die Tumorerkrankung häufig weiter fortgeschritten. Man hat nun vor einiger Zeit herausgefunden, daß Sac- charid-gekoppelte Zytostatika Vorteiie für die Tumor-Chemotherapie bringen.

Diese sind besser wasserlöslich und häufig wirkungsvoller als ungekoppelte, da sie spezifischer wirken und weniger Nebenwirkungen haben. Saccharid-gekop- pelte Zytostatika können im Gegensatz zu den herkömmlichen Zytostatika wegen ihrer Wasserlöslichkeit nicht passiv durch Zellmembranen gelangen. Sie benötigen für den Eintritt in Zellen Transportproteine oder Kanäle. Saccharid- gekoppelte Zytostatika sind beispielsweise im europäischen Patent EP-B-0 369 182 beschrieben. Man wußte aber bisher nicht, über welche Transportmechanis- men diese Zytostatika in die Tumorzellen gelangen und hatte deshalb keine Möglichkeit, die zelluläre Aufnahme der Saccharid-gekoppelten Zytostatika zu modulieren und vorauszusagen. Was vorstehend für Zytostatika zum Eintritt in Tumorzellen beschrieben worden ist, gilt sinngemäß auch für andere Arznei- mittel, die in erkranktes Normalgewebe oder erkrankte Normalzellen gelangen müssen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt nun darin, eine Möglichkeit bereit- zustellen, mit dem erkrankte Zellen, insbesondere Tumorzellen, identifiziert werden können, die für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zyto- statika, zugänglich sind. Weiter besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Zellen mit einem Transporter auszustatten, damit diese befähigt werden, Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, zu transportieren.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen definierten Gegen- stände.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß bestimmte menschliche Zellen einen Transporter aufweisen, mit dem Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, leicht in die Zelle transportiert werden können. Bei diesem Transporter handelt es sich um eine Subtype von natriumabhängigen Zuckertransportern der sog. SGLT-Familie, die als SAAT1 bezeichnet wird. Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß diese Transportersubtypen im Gegen- satz zu den anderen Subtypen dieser Familie in der Lage ist, Saccharid-gekoppel- te Arzneimittel zu transportieren. Unter Saccharid-gekoppelten Arzneimitteln sollen erfindungsgemäß alle Medikamente verstanden werden, die mit einem Saccharid verbunden sind, vorzugsweise ß-glykosidisch mit D-Glucose oder D- Galactose. Insbesondere sollen darunter Saccharid-gekoppelte Zytotstatika verstanden werden, die sich für eine Chemotherapie von Tumoren eignen und mit einem Saccharid verbunden ist, vorzugsweise ß-glykosidisch mit Glucose oder Galactose verbunden ist. Ganz bevorzugt ist darunter ß-D-Glycosyliso- phosphoramid-Mustard (D-19575) zu verstehen. Diese Verbindung hat die folgende Formel : Außerdem sind weitere bevorzugte Saccharid-gekoppelte Zytostatika in EP-B-0 369 182 zu finden.

Die Erfindung ermöglicht, Gewebe und Organe zu identifizieren, bei denen Saccharid-gekoppelte Arzneimittel über einen Transporter aufgenommen werden können. Die Erfindung ermöglicht auch eine Voraussage von Nebenwirkungen bei der Behandlung mit Saccharid-gekoppelten Arzneimitteln, insbesondere Zytostatika. Nebenwirkungen sind nämlich in allen Organen möglich, die den Transporter enthalten. Für diese Organe können schützende Maßnahmen durch- geführt werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel kodiert. Diese Nucleinsäure kann eine RNA oder eine DNA sein.

Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Erfindungsgemäß ist dies eine Nucleinsäure, bevorzugt eine DNA, die folgendes umfaßt : (a) die Nucleinsäure von Fig. 1 bzw. Fig. 1 A, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA bzw. ein Fragment davon, (b) eine mit der Nukteinsäure von (a) hybridisierende DNA, oder (c) eine mit der Nukteinsäure von (a) oder (b) über den degenerierten geneti- schen Code verwandte DNA. Die unter (a) und (c) definierten Nucleinsäuremoleküle umfassen Nucleinsäure- moleküle, die sich gegenüber der in Figur 1 angegebenen Sequenz durch Dele- tion (en), Insertion (en), Austausch (e) oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden. Der Begriff"Nucleinsäurefragment"soll einen Ausschnitt bzw. Segment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch dieses Nucleinsäurefragment codierte Protein noch Transporter- aktivität aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann be- kannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäu- resequenz codiertes Protein noch über die biologische Aktivität eines Trans- porters verfügt. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß das Protein in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert und die Eier danach bezüglich ihrer Transportaktivität untersucht werden (Busch et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 51, S. 32599-32604,1996).

Der Ausdruck"hybridisierende DNA"weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert. Der Begriff"hybridisieren"bezieht sich dabei auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungs- bedingungen, bei denen als Lösung 5xSSPE, 1 % SDS, 1 xDenhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2xSSC, 1 % SDS und danach mit 0,2xSSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., supra). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das erfindungsgemäße Nuclein- säuremolekül von einem Säuger, vorzugsweise von einem Menschen. Auf Nucleinsäurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolie- rung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten cDNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in Figur 1 angebene Nuc ! einsäuresequenz oder einen Teil davon enthalten.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können auch in einen Vektor bzw. Ex- pressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nucleinsäuremolekule enthaltende Vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzuge- ben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculo- virus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den reguiatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-, trp-Promo- tor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1-oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV-oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I-und der Polyhedrin-Promotor.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen Nuclein- säuremoieküle enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus oder Vaccinia-Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungs- gemäßen Nucleinsäuremoleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Durch das genthera- peutische Einbringen des Transporters in Zellen, die diesen sonst nicht auf- weisen, werden diese für Saccharid-gekoppelte Arzneimittel empfänglich ge- macht und können in einer medikamentösen Therapie effizient behandelt wer- den. Im Falle von Tumorzellen erfolgt die Behandlung mit Saccharid-gekoppelten Zytostatika, die im Rahmen einer Chemotherapie effizient vernichtet werden.

Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und ge- eignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Der Fachmann weiß somit, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungs- gemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, der Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzelien sf9. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expres- sion der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Von den Erfindern wurde ein bevorzugter menschlicher Transporter für Sac- charid-gekoppelte Arzneimittel mit SAAT1 bezeichnet, und ein Clon, der eine cDNA-Teilsequenz von SAAT1 aus der Großhirnrinde des Menschen enthält, wurde am 11. Februar 1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorga- nismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, unter der Hinterlegungsnummer DSM 11991 hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität eines Transporters für Saccharid-gekop- pelte Arzneimittel, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vor- zugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Der Fachmann kennt dabei Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985), 237, LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187, Wong, Curr. Opin. B- iotech. 6 (1995), 517, Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527, Williams et al., Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 538, und Davies, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 543. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße Nu- cleinsäure exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinität- schromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codiertes oder nach dem vor- stehenden Verfahren erhaltenes Protein mit Aktivität für den Transport von Saccharid-gekoppelten Arzneimittel. Ein solches Protein ist in Fig. 2 bzw. Fig. 2A gezeigt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungs- gemäße Protein gemäß üblicher Verfahren modifiziert sein kann, wobei das Protein auch als Fusionsprotein vorliegen kann.. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im Wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen z. B."konservative"Austausche von Amino- säureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Sub- stitution eines hydrophoben Rests (z. B. Elsoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäu- re gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N-oder C-Terminus fehlen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen- des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Die Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv-oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen monoclonalen Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions) protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere"Booster"der Tiere können mit dem gleichen (Fusions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklo- nale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten wer- den. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekü- len codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikör- per können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine mit Transporteraktivität oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispiels- weise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend be- schriebenen Nucleinsäuren, Vektoren, Proteine und/oder Antikörper als Arznei- mittel. Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeu- tisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen bei- spielsweise Phosphat-gepufferte Kochsaiziösungen, Wasser, Emulsionen, bei- spielsweise ÖI/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Ver- abreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z. B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung.

Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium einer Erkrankung (z. B. eines Tumors), der Art der Verabreichung etc. ab.

Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuren Anwendung finden können. Andererseits kann das von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierte Protein direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien der für den Transporter codierenden Gene besitzen, Transporteraktivität herzustellen. Das Arzneimittel kommt bevorzugt dann zur Anwendung, wenn die nachstehend beschriebenen Verfahren den Nachweis darüber liefern, daß in dem betreffenden Gewebe eines Patienten biologisch aktive Transporter nicht oder in zu geringen Mengen gebildet werden.

Außerdem eignen sich die Gegenstände die vorliegende Erfindung für ein Ver- fahren zum Nachweis der Expression eines von dem vorstehenden Nucleinsäure- molekül codierten Transporters durch Bestimmung der Anwesenheit der diesen Transporter codierenden mRNA, wobei das Verfahren umfaßt : (a) Gewinnung von mRNA aus Gewebe, (b) Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit dem erfindungsge- mäßen Nucleinsäuremolekül als Sonde unter Hybridisierungsbedin- gungen, und (c) Nachweis der Anwesenheit der mit der Sonde hybridisierten mRNA, wodurch die Expression des Transporters in Gewebe nachgewiesen wird.

Dieses Verfahren eignet sich insbesondere für den Nachweis in Tumorgewebe.

Geeignete Methoden zur Durchführung dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt und dieser kann auch zur Gewinnung geeigneter Proben, zur Durch- führung geeigneter Extraktionsverfahren und Hybridisierungsverfahren und zum Nachweis spezifischer mRNAs nach den in den nachstehend angegebenen Beispielen genau beschriebenen Verfahren vorgehen.

Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die den Transporter codierende Sequenz flankie- ren. Insbesondere eignet sich eine RT-PCR. Dafür wird aus geeigneten Zellen RNA isoliert und einer reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion unter- worfen. Die Durchführung einer RT-PCR ist dem Fachmann geläufig und es gibt inzwischen auch käuflich erhältliche Kits dafür. Als Primer für menschliches SAAT1 können beispielsweise 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse) verwendet werden und in Form eines Kits zusammen mit den anderen üblichen Reagenzien für RT-PCR zur Verfügung gestellt werden. Die PCR-Produkte werden dann beispielsweise auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt, geblottet und bei 48°C an die 32P-markierten internen Oligonukleotide 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT (forward) hybridisiert.

Ein von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierter Transporter kann auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte : (a) Gewinnen einer Probe aus Gewebe, (b) Inkontaktbringen der so erhaltenen Probe mit dem vorstehend be- schriebenen Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die Bin- dung des Antikörpers an den Transporter erlauben, und (c) Nachweis des gebundenen Antikörpers, wodurch die Expression des Transporters in der Zelle nachgewiesen wird.

Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekann- ten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußver- fahren bekannt, die die Isolierung des Proteins auf eine solche Weise erlauben, daß dieses mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispiels- weise ELISA oder RIA.

Bei den obigen Verfahren ist unter einer Probe aus (Tumor) gewebe bzw. unter (Tumor) zellen beispielsweise eine Biopsie (z. B. Feinnadel-oder Stanzbiopsie), Serumprobe (vorzugsweise bei Blutzelltumoren), Liquorprobe oder Operations- material zu verstehen.

Desweiteren eignen sich die Gegenstände der vorliegenden Erfindung dazu, Tumore und Metastasen, welche diesen SAAT1-Transporter exprimieren zu identifizieren. Dies kann geschehen, indem man dem Patienten ein z. B. mit Jod'25 radioaktiv markiertes Saccharid-gekoppeltes Zytostatikum verabreicht und dann die Verteilung der Reaktivität im Körper des Patienten mit Hilfe einer Szintigraphie abtastet. Als zweite Methode kommt NMR mit'9F-markierten Zytostatika in Frage.

Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind außerdem geeignet, um neue Saccharid-gekoppelte Arzneimittel, insbesondere Zytostatika, zu entwickeln, die über den SAAT1-Transporter in Zellen aufgenommen werden. Dazu muß der SAAT1-Transporter in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis oder in anderen Expressionssystemen exprimiert werden und die Aufnahme neuer Saccharid-gekoppelter Arzneimittel gemessen werden (vgl. Fig. 3).

Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter beschrieben, welche zeigen : Fig. 1 : Nuklenisäuresequenz des SAAT1-Transporters des Mensc- hen (aus Großhirnrinde) Fig. 1 a : Nukleinsäureteilsequenzdes SAAT1-Transportes des Menschen (Ausschnitt aus Fig. 1 von Nukleotid 251 bis Nukleotid 741) Fig. 2 : Aminosäuresequenz des SAAT1-Transporters des Menschen (aus Großhirnrinde) Fig. 2a : Aminosäureteilsequenz des SAAt1-Transportes des Menschen (Ausschnitt aus Fig. 2 von Aminosäure 79 bis 241) Fig. 3 : Nachweis, daß ['4C]-ß-D-Glc-IPM nur von SAAT1 und keiner anderen Subtype der SGLT-Familie transportiert wird.

Fig. 4 : Nachweis, daß ein Saccharid-gekoppeltes Arzneimeittel (ß-D- Glycosyl-gentisinsäuremethylester) von SAAT1, aber nicht vom Transporter SGLT1 transportiert wird.

Fig. 5 : Verteilung von SAAT1 in menschlichen Organen und Gewe- ben Fig. 6 : Expression von SAAT1 in verschiedenen menschlichen Tu- morgeweben Fig. 7 : ['4C]-ß-D-Glc-IPM Aufnahme in suspendierte menschliche Karzinoma T84-Zellen durch SAAT1 Die folgende Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrie- ben : Beispiel 1 : Transkription von SAAT1 in menschlichen Tumorzellen Gesamt-RNA wurde gemäß Standardverfahren (Chomczynski et al., Anal. Bio- chem. 162, S. 156-159,1987) aus verschiedenen renalen Karzinomen gewon- nen (siehe Fig. 6 ; Nukleargrad 1-Nierentumor : Spur c ; Nukleargrad 2-Nierentu- mor : Spur d ; Nukleargrad 3-Nierentumor : Spur e ; menschl. Colonkarzinom aus Mäuse-Tumor-Xenografts : Spur f ; menschl. Ovarkarzinom aus Mäuse-Tumor- Xenografts : Spur g ; menschl. Karzinoma-Zellinie KTCTL30 : Spur h ; renale menschl. Karzinoma-Zellinie KTCTL104 : Spur i ; renale menschl. Karzinoma- Zellinie T84 : Spur k). Die RNAs und eine Kontrolle ohne RNA (Spur b) wurden 10 Min. bei 37°C mit DNase (2U DNase/, ug RNA) behandelt, um Reste genom- ischer DNA zu entfernen. Danach wurden sie einer reversen Transkriptase- Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) unterworfen. Die RT-PCR wurde mit Titan T- One Tube RT-PCR-System (Boehringer Mannheim) den Herstellerinformationen folgend unterworfen. Es wurde jeweils 1, ug RNA verwendet und die eingesetz- ten Primer waren 5'-GGA CTT CCC CAG TAA TGT-3' (forward) und 5'-CTT CTC GGT AAA GCT CTC-3' (reverse). Die PCR-Produkte und ein Größenmarker (Spur a) wurden auf einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Ein Teil des Gels wurde mit Ethidiumbromid angefärbt (Fig. 6, obere Spalte). Der andere Teil des Gels wurde geblottet und bei 48°C an das 32P-markierte Oligonukleotid 5'-CAT CTG TGT GGT TTT GTT-3' (forward) hybridisiert. Die Membran wurde bei 48°C mit 6xSSC enthaltend 0,05% (w/v) Natriumpyrophosphat gewaschen und zur Autoradiografie ein Film aufgelegt.

Als Kontrollexperiment wurde genomische DNA verwendet, mit der jede cDNA- Amplifikation aus genomischer DNA ausgeschlossen war.

Wie durch Fig. 6 verdeutlicht wird, ist das menschliche SAAT1-Fragment in Carcinomas der Niere, Darm und Ovarien, in Darmkrebszellen T84 und in zwei renalen Carcinoma-Zellinien nachweisbar.

Beispiel 2 : Transkription von SAAT1 in verschiedenen menschlichen Organen und Geweben Ein menschlicher RNA"Master-Blot" (Firma Clontech Laboratories, Palo Alto, Californien, USA ; Katalog-Nr. 7770) auf dem mRNA-Proben aus vielen mensch- lichen Geweben aufgetragen sind, wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll Nr. PT3004-1) mit einem radioaktiv markierten cDNA-Fragment des menschlichen SAAT1 (s. Fig. 1, Nukleotide 1730-2032) nach den Angaben des Herstellers hybridisiert und gewaschen. Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. Dort ist zu sehen, daß kleine Mengen von SAAT1 in vielen Organen transkribiert werden. Am stärksten wird SAAT1 in der Skelettmuskulatur (Fig. 5 A3), in der Prostata (Fig. 5 A7), im Dünndarm (Fig. 5 C3), in der Lunge (Fig. 5 D2) und in der fötalen Leber (Fig. 5 E4) transkribiert.

Beispiel 3 : Expression von [14C]-ß-D-Glc IPM Transport durch SAAT1 in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis.

In Xenopus laevis Oozyten wurden 50 nl Wasser mit und ohne 10 ng cRNA von SGLT1 (Typ eines Saccharid-Transporter aus Kaninchen), SGLT1 (Mensch), Hu 14 (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Mensch), SMIT (Typ eines weiteren Saccharid-Transporters aus Hund) oder SAAT1 (Schwein) injiziert. Nach 2-4 Tagen Inkubation wurde die Expression des jeweiligen Transporters durch Messung der Phlorizin-inhibierbaren Aufnahme nach 30 Minuten Inkuba- tion mit 50, uM [14C] AMG (SGLT1, SAAT1), 1,25 mM [14C] AMG (Hu14) und 1 NM [3H] myo-Inositol gemessen. Die verwendeten Phlorizin-Konzentrationen waren 100, uM (SGLT1 aus Kaninchen), 200, uM (SGLT1 aus Mensch, Hu14, SAAT1) oder 500, uM (SMIT). Die exprimierte Phlorizin-inhibierbareAufnahmera- te von AMG und myo-tnositot waren 274 22 (AMG, SGLT1, Kaninchen), 48 5 (AMG, SGLT1, Mensch), 25 1 (AMG, Hu 14), 6,5 0,7 (myo-Inositol, SMIT) bzw. 18 2 (AMG, SAAT1) pmol x Oozyte-'x h-'. Unter identischen experimentellen Bedingungen wurden die gleichen Chargen injizierter Oozyten auf die Phlorizin-inhibierbare Aufnahme von 100, uM ['4C]-ß-D-Glc-IPM getestet.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt, woraus klar hervorgeht, daß nur SAAT1 das Saccharid-gekoppelte Zytostatikum zu transportieren vermag.

Beispiel 4 : Expression des Transportes von ß-D-Glycosylgentisinsäure- methylester durch SAAT1 Gentisinsäuremethylester ist ein Antioxidationsmittel, welches z. B. bei Morbus Parkinson, eingesetzt werden kann. Die Strukturformel von ß-D-Glycosylgen- tisinsäuremethylester (ß-D-Glc-GME) ist im oberen Teil von Fig. 4 dargestellt. In Xenopus laevis Oozyten wurden 50 ni Wasser mit oder ohne 10 ng cRNA von SAAT1 (Schwein) oder SGLT1 (Menschen) injiziert. Nach 3 Tagen Inkubation wurde der durch SAAT1 vermittelte Transport von R-D-Glycosylgentisinsäureme- thylester elektrisch gemessen. Dies ist möglich, da der SAAT1-Transporter ein sog. Na+-Kotransporter ist, der seine Substrate, also AMG oder ß-D-Glyco- sysigentisinsäuremethylester, immer zusammen mit Natriumionen transportiert.

Im vorliegenden Beispiel wurden die Oozyten entweder mit 1 mM AMG oder 1 mM ß-D-Glc-GME überströmt und der in die Oozyten gerichtete Natrium-Strom gemessen. Dabei wurde die Spannung über die Membran auf-50 mV"ge- klemmt" (sof. voltage-clamp Methode, s. Busch et al., J. of Biologicial Chemi- stry, Vol. 271, No. 51, S. 32599-32604,1996). Während die mit Wasser injizierten Oozyten nach Überströmung mit AMG oder ß-D-Glc-GME keinen Strom zeigten, induzierte ß-D-Glc-GME bei den Oozyten einen Strom, die SAAT1 exprimierten. Durch AMG konnten dagegen sowohl in den SGLT1 exprimieren- den als auch in den SAAT1 exprimierenden Oozyten Ströme gemessen induziert werden. Das Ergebnis ist in Fig. 4 gezeigt, d. h. daß die Saccharid-gekoppelte therapeutisch wirksame Substanz ß-D-Glc-GME von SAAT1, aber nicht von SGLT1 transportiert wird.

Beispiel 5 : [14C]-ß-D-Glc IPM Aufnahme in menschl. Carcinomazellen T84-Ze))en (ECACC Nr. 88021101), die von EACC (Salisbury, GB) erhalten wur- den, wurden bei 37°C in einer 1 : 1 Mischung von Dulbecco's modified Eagle's- Medium und Ham's T12 Medium (Fa. Sigma) bei 5 % CO2 auf Gewerbekultur- schalen der Firma Greiner kultiviert. Die Mischung enthielt weiter 10% fötales Rinderserum, 4 mM L-Glutamin, 10 U/ml Penicillin und 100, ug/ml Streptomycin.

Nach Konfluenz der Zellen wurden diese durch 1-stündige Inkubation für 1 Std. bei 37°C mit Mg2+ - Ca2+-freiem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) enthal- tend 0,5 mM EDTA, 10 mM Hepes und 28 mM NaHCO3, pH7,4 abgelöst, bei 1000g sedimentiert und in PBS resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden 30 Sek. mit PBS, enthaltend verschiedene Konzentrationen D-[14C] ß-D-Glc-IPM inkubiert. Die lnkubationen wurden mit eiskaltem PBS enthaltend 1 mM Phlorizin (bekannt ais Inhibitor für Glucosetransporter) gestoppt. Die Zellen wurden zweimal mit dieser Stoplösung gewaschen, mit 4M Guanidinthiocyanat solubili- siert und auf Radioaktivität untersucht.

Dieses Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt. Aus dem Ergebnis geht klar hervor, daß T84-Zellen über einen Transporter verfügen, der es ermöglicht, daß ß-D-Glc-IPM aufgenommen wird.

Beispiel 6 : Herstellung von Antikörpern Mit einem Gel-gereinigten Transporter-Proteinfragment gemäß Fig. 2 wurden Tiere wie folgt immunisiert : polyklonaleAntikörperimKaninchenImmunisierungsprotokllfür Pro Immunisierung wurden 35, ug Gel-gereinigtes Protein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0 : 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 14 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 28 : 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 : 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 : Ausbluten Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kanin- chens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen- lgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36, uM 5'Bromo-4-chloro- 3-indolylphosphat, 400, uM Nitroblau-tetrazolium, 100mM Tris-HCI, pH 9.5,100 mM NaCl, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn Pro Immunisierung wurden 40, ug Gel-gereinigtes Protein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0.1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 50 : 3. Immunisierung (icFA) Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus Pro Immunisierung wurden 12pg Gel-gereinigtes Protein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt ; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.

Tag 0.1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans) Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans ; icFA) Tag 56 : 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 : 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 : Fusion Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungs- gemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

UBERDIEINIERNATIONALEBUDAPESTERVERTRAG ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FOR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALESFORMBLATT Bayrische Julius- Maximilians-Universität Anatomisches Institut I Prof. Dr. Koepsell Koellikerstr. 6 97070 Würzburg EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestelltgemaß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALENHINTERLEGUNGSSTELLE 1. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen : Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER : hSAAT1 DSM 11991 n WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde (X) eine wissenschaftliche Beschreibung (X) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereiche (Zutreffendes ankreuzen). 111. EINGANG UND ANNAHME Diese intemationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1998-02-11 (Datum der Ersthinterlegung) l eingcgilngen ist. Ersthinterlegung)'eingegangen ist.IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Intemationaien Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hinteriegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemaß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person (en) oder des (der) von ihr ermachtigten Bediensteten : Anschrift : Mascheroder Weg lb D-38124 BraunschweigX C' Datum : 1998-02-13 'Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist.

BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALESFORMBLATT Bayrische Julius- Maximilians-Universität Anatomisches Institut I Prof. Dr. Koepsell Koellikerstr. 6 97070 Würzburg LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALENHINTERLEGUNGSSTELLE 1. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS Name : Bayrische Julius-Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE Maximilians-Universität zugeteilte EINGANGSNUMMER : Anschrift : Anatomisches Institut I DSM 11991 Prof. Dr. Koepsell Koellikerstr. 6 Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung': 97070 Würzburg 1998-02-11 m. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 19 98-02-11 geprüRt worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus (X)'lebensfahig ()'nichtmehr lebensiahig IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN ZIST V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE Name : DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift (en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Penon (en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten : Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig Datum : 1998-02-13 Aufgabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine emeute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datums<BR> <BR> <BR> der jeweils lerzten emeuten Hinterlegung oder Weiterleitung.<BR> <P>2<BR> InInden in Regel aZifferiiundiiivorgeshenenFällenAngabederlerztenLebensfähi gkeitsprüfung.Buchstabe <BR> 3<BR> <BR> Zutreffendesankreuzen.

4 Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.