La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne notamment l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine excrétée/sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou l'inhibition permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes, principalement par vaccination. L'invention permet une action croisée contre différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour prévenir et lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez les mammifères, les diagnostiquer plus précisément, et suivre l'évolution de l'infection après traitement. INTRODUCTION

Les trypanosomes (Trypanosoma) sont des protozoaires parasites infectant principalement les animaux mammifères, mais également les humains. L'infection provoque chez les animaux une trypanosomose, ou trypanosomiase, qui peut conduire à la mort de l'animal. Chez l'homme, la trypanosomose humaine africaine débute par un chancre d'inoculation, puis lui succède une phase lymphatico-sanguine, avec en particulier une fièvre, des adénopathies, une hépatosplénomégalie, un prurit et des œdèmes. Une phase méningoencéphalitique lui succède, lorsque le parasite rentre dans le système nerveux central, avec différents signes neurologiques et en particulier les troubles du sommeil (d'où son nom de maladie du sommeil). La maladie de Chagas (trypanosomose humaine américaine), est provoquée par Trypanosoma cruzi, transmis par les punaises. Lorsque T. cruzi pénètre à travers la peau, il peut apparaître une lésion cutanée érysipeloïde ou pseodofuronculeuse (chagome), puis ensuite parfois un œdème unilatéral bi-palpébral (Signe de Romana). La phase aiguë peut passer inaperçue, et plus rarement, se manifester par une hépatosplénomégalie fébrile. La phase chronique est dominée par la gravité des formes cardiaques et l'existence de formes digestives avec méga organes.

Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui joue sur le tropisme, la virulence, la transmissibilité, et la sensibilité aux trypanocides. Parmi les différents groupes de trypanosomes, on mentionnera particulièrement le groupe stercoraria, dans lequel se placent Trypanosoma cruzi, T. theileri, T. lewisi et T. musculi et le groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas. Le sous-genre Trypanozoon comporte des espèces de trypanosomes à développement extracellulaire qui infectent les animaux et l'homme, tandis que Duttonella et Nannomonas n'infectent que les mammifères non- humains. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec flagelle libre facultatif et kinétoplaste petit et en position subterminale (postérieur). Les principales espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi et T. équiper dum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, et qui se distinguent essentiellement par leur caractère infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux), il a été mis en évidence en Europe, Asie, Afrique et Amérique. Les trypanosomes du sous- genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin. Les principales espèces sont T. vivax et T. uniforme, qui ont un tropisme pour les ruminants sauvages et domestiques. Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont petits et n'ont pas de flagelle libre. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae, qui ont un tropisme important pour le bétail, le porc et le chien.

En Afrique, T. congolense, T. vivax, T. brucei et T. evansi sont les agents principaux responsables des trypanosomoses, notamment chez les mammifères domestiques tels que les ruminants, les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés et les canidés. T. brucei, et notamment la sous-espèce T. b. gambiense, est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce T. b. rhodesiense est l'agent responsable de la forme aiguë de la maladie du sommeil. T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés. T. equiperdum est également présent en Afrique. La sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes partout dans les régions d'élevage. Les cas humains provoqués par T. evansi sont exceptionnels. De rares cas de trypanosomoses provoquées par d'autres espèces de trypanosomes (trypanosomes du groupe lewisi, T. theileri) ont été rapportés chez l'homme et l'animal.

Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques, selon les sous-espèces. D'une manière générale, lors de l'infection, la glossine (ou mouche tsé-tsé) injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqûre les formes métacycliques infectantes. Les parasites se multiplient dans le derme au point d'inoculation, donnant naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, ainsi que différents organes, tels le cœur ou les reins, où ils provoquent d'importantes lésions. Les sources d'infection des animaux domestiques sont également les autres animaux domestiques infectés, ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. A l'heure actuelle, le contrôle de la maladie repose principalement sur le contrôle des vecteurs par l'utilisation d'insecticides, utilisés en particulier pour l'imprégnation de pièges, ce qui présente un impact environnemental. En Amérique du Sud, une lutte contre les punaises, vecteurs de la Maladie de Chagas, est entreprise avec des insecticides rémanents pulvérisés dans les habitations, associés à une amélioration de l'habitat. Chez les mammifères infectés, la capacité des trypanosomes à échapper aux défenses immunitaires de l'hôte en exprimant à leur surface des antigènes variables a empêché jusqu'à présent le développement de stratégies vaccinales efficaces. Seules quelques molécules trypanocides sont disponibles, mais elles induisent des effets secondaires importants et de nombreuses souches résistantes de parasites sont apparues. Sur le plan diagnostique, celui-ci se limite généralement à une suspicion basée sur l'observation de symptômes. Mais il n'existe pas à ce jour de marqueurs fiables permettant une détection rapide et spécifique d'une infection, à des coûts raisonnables.

Il existe donc un besoin dans l'art antérieur pour des approches efficaces de prévention, de traitement et de détection des infections à trypanosome.

RESUME DE L'INVENTION

La présente invention concerne des méthodes et compositions pour traiter et diagnostiquer une infection à trypanosome. Elle concerne l'utilisation d'antigènes excrétés/sécrétés (exoantigènes, sécrétome) et, plus particulièrement l'identification d'une protéine sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation (par des anticorps acquis par vaccination ou par injection) ou l'inhibition (par différentes molécules) permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination des trypanosomes. L'invention permet une action croisée contre différentes souches de trypanosomes, et offre ainsi des méthodes et compositions efficaces pour lutter contre les infections et pathologies induites par les trypanosomes chez leurs hôtes mammifères. Elle permet également la détection de cette protéine et d'anticorps dirigés contre elle dans tout prélèvement, ainsi que le suivi de l'évolution de la trypanosomose, avec ou sans traitement. Elle permet également la confection d'amorces et de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire, telle que la « polymerase chain reaction « (PCR) appliquées au diagnostic des trypanosomoses.

Un objet de l'invention réside ainsi dans des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires comprenant (i) la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse immunitaire.

Dans un mode particulier, l'invention concerne des compositions, telles que des vaccins, comprenant (i) la protéine TbKHCl, ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, complexé(e) à ou en association avec une ou plusieurs autres molécules de trypanosomes, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant choisi avantageusement pour renforcer une réponse anticorps.

Dans un autre mode particulier, l'invention concerne des compositions comprenant (i) un anticorps anti-TbKHCl, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire.

L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, pour son utilisation pour vacciner ou immuniser un mammifère contre le trypanosome et/ou les trypanosomoses.

L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide pour son utilisation pour protéger un mammifère contre les trypanosomoses.

L'invention a également pour objet une composition telle que définie ci-dessus, ou la protéine TbKHCl ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de celle-ci, pour son utilisation pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose.

L'invention concerne en outre l'utilisation de la protéine TbKHCl ou d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou d'un extrait de sécrétion enrichi en cette protéine, pour la préparation d'un vaccin pour immuniser ou protéger un mammifère contre le trypanosome.

Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine TbKHCl pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'un mammifère ayant une trypanosomose.

L'invention concerne également une méthode pour traiter un mammifère ayant une trypanosomose, comprenant l'inhibition de la protéine TbKHCl chez ledit mammifère. L'inhibition peut être obtenue par administration d'un inhibiteur (par exemple un anticorps ou une molécule interférant avec la fixation ou la fonction de cette protéine au niveau des tissus des hôtes mammifères), ou par vaccination dudit mammifère contre la protéine TbKHCl ou un antigène de celle-ci. L'invention propose ainsi de nouvelles immunothérapies des trypanosomoses utilisant tout anticorps anti- TbKHCl, notamment monoclonal, ou des dérivés de tels anticorps ou des constructions utilisant la séquence en acides aminés ou en nucléotides d'une partie de tels anticorps.

L'invention a en outre pour objet tout anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHCl .

Un autre objet de l'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHCl ou des peptides antigéniques de celle-ci ou d'anticorps dirigés contre cette protéine.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre cette protéine dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.

Un autre objet de l'invention concerne encore une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend l'identification et/ou la mesure de la quantité de protéine TbKHCl dans des échantillons du mammifère ou d'anticorps dirigés contre cette protéine prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement, et éventuellement après traitement.

L'invention concerne par ailleurs également

- des kits de mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun avec ledit anticorps, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immuno logique.

- des kits de détection des anticorps dirigés contre la protéine TbKHCl pour le diagnostic de l'infection utilisant la protéine TbKHCl, des peptides, ou des épitopes naturels ou synthétiques dérivés de cette protéine.

Un autre objet de l'invention concerne également toute méthode de diagnostic utilisant la séquence nucléotidique de la protéine TbKHCl pour le diagnostic de trypanosomose ou pour l'identification précise d'une espèce de trypanosome (par exemple, la confection d'amorces ou de sondes permettant l'utilisation de différentes techniques de biologie moléculaire telles que la PCR ou l'hybridation).

L'invention peut être mise en œuvre pour prévenir, traiter, détecter ou suivre l'évolution après vaccination ou traitement de toute affection provoquée par les parasites du genre Trypanosoma, chez tout mammifère, notamment chez les animaux domestiques ou d'élevages, ainsi que chez l'homme.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Un inhibiteur de TbKHCl inhibe la prolifération parasitaire in vitro.

Figure 2 : Un inhibiteur de TbKHCl diminue la charge parasitaire in vivo.

Figure 3 : Stratégie de vaccination.

Figure 4 : Taux de survie de souris (effet protecteur) à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention. Figure 5 : Détection d'une infection par mesure d'anticorps dirigés contre la protéine TbKHCl .

Figure 6 : Test de séroprotection : Les souris naïves reçoivent, 24 heures avant l'infection par T. Féo (2 000 parasites), 300 de sérum provenant de souris immunisées avec le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« Sérum PSF total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 100 kDa (« Sérum HPM>100 ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« Sérum HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« Sérum BPM<50 ») ou la fraction contenant les poids moléculaires compris entre 50 et 100 kDa (« Sérum 100<PM>50 »). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. Féo.

Figure 7 : test de séroprotection croisée. Les souris reçoivent, 24 heures avant l'infection par T. b. brucei (2 000 parasites), 300 de sérum provenant de souris immunisées avec le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« Sérum PSF total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« Sérum HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« Sérum BPM<50 ») ou du sérum de souris naïves. La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei.

Figure 8 : A : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), soit par le sécrétome total de T. b. gambiense Féo (« PSF Total ») ou la fraction contenant les hauts poids moléculaires supérieurs à 50 kDa (« HPM>50 ») ou la fraction contenant les bas poids moléculaires inférieurs à 50 kDa (« BPM<50 »). Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei. B : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), par le sécrétome total (« PSF Total ») de T. b. brucei ou de T. b. brucei KO pour la kinésine. Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours postinfection par T. b. brucei. C : Taux de survie de souris à une infection parasitaire après vaccination selon l'invention : les souris sont immunisées deux fois, en présence d'adjuvant (saponine), soit par le sécrétome total de T. evansi (« PSF Total »). Les souris témoins reçoivent l'adjuvant seul (« Témoins »). Les souris sont infectées 2 mois après par T. b. brucei (2 000 parasites). La survie des souris est suivie en fonction du nombre de jours post-infection par T. b. brucei.

Figure 9 : Profil protéique obtenu par migration électrophorétique de 5μg de chaque échantillon en condition dénaturante et non réductrice puis colorée au bleu de Coomassie. Les cadres identifient les bandes protéiques pouvant contenir la TbKHCl . Figure 10 : Immunoblot de équivalent protéine d'antigène après transfert semi-sec 3h30 24mA. Anticorps primaire (Anticorps Mabl purifié) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.

Figure 11 : Montage immunoblots. Dépôt ^g d'antigène, transfert humide O/N 4°C 10mA. Anticorps primaire (sérum anti-PSF T. Féo) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.

Figure 12 : Montage immunoblots. Dépôt ^g d'antigène, transfert humide O/N 4°C 10mA. Anticorps primaire (sérum anti-HPM50 T. Féo) dilué au l/200ème ; anticorps secondaire (anti-IgG total de souris) dilué au l/5000ème.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne des méthodes et compositions pour prévenir, traiter, diagnostiquer et suivre l'évolution d'une infection par un trypanosome basées sur la neutralisation ou l'inhibition de la protéine TbKHCl et sur sa détection ou celle d'anticorps dirigés contre celle-ci. L'invention permet de conférer une protection efficace contre l'infection, le développement ou la dissémination de différentes souches de trypanosomes, principalement par vaccination. Elle est utilisable chez tout mammifère. Définitions

Le terme « trypanosomose » ou « trypanosomiase » désigne, de manière générale, tous les troubles causés par un trypanosome chez des mammifères. Le terme trypanosomose inclut notamment la Nagana, la Surra, la Dourine, la maladie du sommeil, la trypanosomose africaine, la trypanosomose américaine, la maladie de Chagas, ainsi que toutes les lésions causées aux organes (e.g., rein, cœur, foie, testicule, tube digestif, cerveau) par une infection à trypanosome.

Le terme « traitement » ou « traiter » désigne toute amélioration de l'état d'un sujet. Le traitement peut être curatif ou préventif. Le traitement curatif est destiné à un mammifère infecté et vise à empêcher, réduire, ralentir ou retarder le développement d'une maladie chez le mammifère infecté. Il comprend notamment, chez un sujet infecté, la diminution de la charge parasitaire, la disparition du parasite, la diminution de sa prolifération ou de sa transmission, la diminution des troubles causés par le parasite et notamment des lésions aux organes, la réduction des symptômes, ou l'éradication totale de la maladie. Le traitement curatif utilise typiquement un inhibiteur du pathogène (immunothérapie ou chimiothérapie). Le traitement préventif est destiné à un mammifère non-infecté par le parasite et vise à empêcher, prévenir ou réduire l'infection chez un mammifère sain. Le traitement préventif utilise généralement un antigène du pathogène, permettant de générer une réponse immunitaire protectrice.

Identification d'un facteur de virulence

L'invention découle de l'identification de la protéine TbKHCl, sécrétée par les trypanosomes, dont la neutralisation ou le blocage permet d'inhiber la prolifération du parasite, sa transmission, et sa virulence. L'invention montre en outre qu'une immunisation avec une préparation contenant la protéine TbKHCl produite par différents trypanosomes, est possible et induit une protection croisée contre différents types de trypanosomes. Cette protéine représente donc une cible particulièrement pertinente et attractive pour toute stratégie thérapeutique ou diagnostique du trypanosome et des trypanosomoses.

Un objet de l'invention réside ainsi dans la protéine TbKHCl, ou un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine ou ledit peptide, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl, pour leur utilisation pour le traitement préventif ou curatif d'une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention réside également dans l'utilisation de la protéine TbKHCl, ou d'un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci, ou d'un inhibiteur de celle-ci, pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère. L'invention concerne également une méthode pour traiter une infection à trypanosome chez un mammifère comprenant une inhibition (e.g., une réduction, une neutralisation ou un blocage) de la protéine TbKHCl chez le mammifère. L'inhibition de la protéine comprend la réduction de la quantité ou l'inhibition de l'activité de la protéine et peut être obtenue par exemple (i) par immunisation ou vaccination du mammifère avec une préparation contenant la protéine TbKHCl, par exemple par administration d'une quantité immunogène de la protéine TbKHCl ou d'un ou de plusieurs fragments antigéniques de celle-ci ; et/ou (ii) par inhibition de la protéine TbKHCl présente chez le mammifère, par administration d'un inhibiteur ou d'un compétiteur de celle-ci.

Ainsi, au sens de l'invention, le terme « inhiber » ou « inhibition » d'une protéine désigne toute réduction de la quantité ou de l'activité de ladite protéine. L'inhibition désigne donc notamment une baisse ou une réduction de la quantité de ladite protéine par des composés affectant sa synthèse, sa sécrétion, ou sa structure. L'inhibition désigne également toute diminution de l'activité de la protéine par des composés (anticorps ou dérivés, peptides, molécules chimiques) agissant directement sur elle ou sur une ou plusieurs de ses molécules cibles chez les hôtes mammifères, afin d'interférer avec son action. Au sens de l'invention, le terme « protéine TbKHCl » désigne une protéine comprenant la séquence en acides aminés représentée dans SEQ ID NO : 2 ou tout variant naturel de cette séquence résultant de polymorphismes ou de variations entre espèces ou sous-groupes de trypanosomes, ou toute protéine de type kinésine sécrétée par un trypanosome et ayant une séquence ayant au moins 45% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 60%, plus préférentiellement au moins 70%>. Plus préférentiellement encore, l'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 est de 80% ou plus, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ; 98%, 99% ou plus. La séquence SEQ ID NO : 2 est représentée ci-dessous. Elle correspond à la protéine TbKHCl de T. brucei bruceï.

MSDADVKEGT AAGDSVAVPE SWKPDEGRR SRGESTGGTA AGDTGVPKNI ARCLVYCRLR

PRNKTDFKNG GFQLVTVSGN DIWKDQRFY KFDGAFGDEC TQSDIFEAVA VPCITHAFKG FCSALMCYGQ TGTGKSFTMC NTTPGQEGI I PRSAKLIFDK IQSDNARSYE VTGQFVQIYR

DNLGDLMSAT GRDRVDIHFD EQGGVELTGC SSHVLLSAQE FMRFYRIGND RRWTATAMN

PESSRGHTAL VLRIVSESPS DPEAGKLKGK ITFIDLAGYE RFSKTGITHD NPIMKDEAKC

INASLLSLGH WSCLSSGSR HIPWRDSKLT RILQDSIGGR SRTSIILTVG PSSDHLHETT

NSLQFGLRAM DVKVTAKQSV HVDYQKLAQK LQSLLDERDE RINLLEVQIA SRDAERHELM ERYNDRREDI DRRFEIEMAE LKRTGASEEQ MLNLREVYKA EVENLQEQQD EEFQYREEVY

SKEIVHLIRE QEHQEAKRRA EMKLAQDLI I AEFQKKLDNA REGTNDDLVR VLKQLSEKDA

ILASRANDTV RLHEHIEVLR EQVKELGGVP IEEATFPETF LDVGQVEEMR NRLEADVQRH

RAKGVELLAE VDRLSQLCSE RLEEINRLRD ENTQYRAALE NSGISLNDTD DLTEFLSEKR

TQMVDVSEME TLRVTMQADL DEAKAHNREL AREVEQLKFE LTATAIPLTA RLRCPPCATA RGPSPFDAAR NLCSTQRKPP QKDGTPSPNN TQNENLQRTV KQLTEQLEFS MRERKSLQDR VEAVETQLAS HGVEVPGPYV PPIKLGFPGS APVTSSETDA REPPEDTDMD VLLRVKEEEI DVLLETIERQ EHLLNAARSN EEFHRRVICE LQQQMVTAQI QVEDPQNAPP PVDAIAMDEY MSILRLVRES ERKLAAQLAE RDGEDGAEVE ALLEKKDAEL QMKEETILEK ASKAQYAAKL CIRLKNQMLR CGITPCCELP DSYNELIERE EEELNEQLMC QDELLARLRS EEEEKHRMQN MLKSLNEERE RQSSVIRTVQ ERCELVEKKQ LVTAAHLSRL ATEKSQREQI LEETLRRATQ ELLDCKIKMA MEKEAGSPGV LKRFLRRLRS N

Une recherche effectuée par les inventeurs a permis d'identifier d'autres protéines TbKHCl au sens de l'invention à partir d'autres espèces de trypanosomes, notamment à partir de T. brucei gambiense (99% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. brucei rhodesiense ; T. evansi ; T. equiperdum ; T. congolense (76% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. vivax (69% d'identité avec SEQ ID NO : 2) ; T. musculi (un parasite du groupe lewisi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2), et T. cruzi (61% d'identité avec SEQ ID NO : 2). La séquence des protéines TbKHCl de ces espèces est représentée dans SEQ ID NO : 3 (Trypanosoma brucei gambiense), SEQ ID NO : 4 (Trypanosoma congolense), SEQ ID NO : 5 (Trypanosoma vivax), et SEQ ID NO : 6 (Trypanosoma cruzi). Ces protéines représentent des exemples de protéines TbKHCl au sens de l'invention. Par ailleurs, l'homme du métier peut, sur la base des informations de la présente demande et des techniques classiques, identifier d'autres TbKHCl à partir d'autres sous-groupes de trypanosomes. Dans ce contexte, le terme «identité de séquence», appliqué à un acide nucléique ou une protéine, fait référence à la quantification (généralement en pourcentage) des correspondances de résidus de micléotides ou d'acides aminés entre deux séquences alignées en utilisant un algorithme normalisé tel que l'alignement de Smith- Waterman (Smith et Waterman (1981) J Mol Bioi 147: 195-197), CLUSTALW (Thompson et ai (1994) Nucieic Acids Res 22 : 4673- 4680; Altschul et al (1997) Nucieic Acids Res 17 : 3389-402), ou BLAST2 (Nucieic Acids Res 25: 3389-3402 ). BLAST2 peut être utilisé d'une manière standardisée et reproductible pour insérer des gaps dans l'une des séquences afin d'optimiser l'alignement et de parvenir à une comparaison plus significative.

La protéine TbKHCl peut être obtenue de différentes façons. Elle peut être sous forme pure, d'extrait enrichi (par exemple un extrait de sécrétion enrichi), recombinante, synthétique, etc. Elle peut tout d'abord être isolée sous forme de fraction éluée ou purifiée à partir d'une culture de trypanosomes. Pour cela, les parasites purifiés sont préférentiellement incubés dans un milieu de sécrétion (par exemple de type Ringer Lactate + glucose), puis les produits de sécrétion (sécrétome) sont récupérés, par exemple par centrifugation, filtrés pour stériliser, puis passés sur une colonne d'affinité comprenant un anticorps anti-TbKHCl . Après lavage, les molécules retenues sur la colonne sont éluées, permettant d'obtenir un extrait ou une fraction comprenant la protéine TbKHCl et/ou ses fragments. Dans une variante, la protéine TbKHCl est obtenue à partir du sécrétome par filtration différentielle sur filtres ayant des seuils de coupures de 50 ou 100 kDa, qui permettent de séparer une fraction contenant les molécules de hauts poids moléculaires (HPM) et une fraction contenant les molécules de bas poids moléculaires (BPM). La protéine TbKHCl est présente dans les fractions HPM, en particulier HPM50 et HPM 100.

La fraction enrichie en protéine TbKHC 1 obtenue peut en outre comprendre des protéines ou peptides de nature différente provenant de trypanosome. En particulier, la protéine TbKHCl ayant pour propriété de lier et/ou transporter d'autres molécules du trypanosome notamment grâce à sa structure coil-coil qui favorise son interaction avec d'autres molécules, la fraction obtenue peut comprendre la protéine TbKHCl, ou des peptides de celle-ci, en complexe ou association avec d'autres protéines ou peptides ou molécules de trypanosome. La protéine TbKHCl peut par ailleurs être concentrée et/ou purifiée davantage à partir de cette fraction, pour obtenir une pureté supérieure à 90%, par exemple de 95% ou plus, notamment de 98%> ou plus, en particulier une protéine TbKHCl dépourvue de toute autre protéine de trypanosome.

A cet égard, l'invention vise également un procédé de préparation d'une fraction antigénique, comprenant l'obtention d'un sécrétome de trypanosome, la fïltration différentielle du sécrétome sur filtre ayant un seuil de coupure de 50 ou 100 kDa, et la récupération de la fraction de haut poids moléculaire. Ce procédé présente différents avantages : il permet d'améliorer le rendement de production des fractions enrichies en TbKHCl, il améliore la reproductibilité (dosage protéique similaire pour les différents lots), et il conserve l'immunogénicité des antigènes (la fïltration différentielle altère moins la structure antigénique qu'une élution acide). L'invention concerne également la préparation obtenue par ce procédé et son utilisation vétérinaire ou pharmaceutique, comme illustré dans la présente demande.

La protéine TbKHCl peut également être produite par voie recombinante, en exprimant dans une cellule hôte un acide nucléique codant. A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans un procédé de production de protéine TbKHCl, comprenant la culture d'une cellule recombinante comprenant un acide nucléique codant TbKHCl dans des conditions permettant l'expression et, éventuellement la sécrétion de la protéine TbKHC 1 puis, la récupération et, éventuellement, la purification de la protéine TbKHCl . La cellule utilisée peut être procaryote (par exemple une bactérie telle que E. colï) ou eucaryote (par exemple une levure, une cellule de mammifère ou d'insecte). L'acide nucléique codant TbKHCl peut être de l'ADN ou de l'ARN, et sa séquence peut être déterminée par l'homme du métier en fonction de la séquence protéique à coder. A titre illustratif d'une séquence codant la protéine de SEQ ID NO : 2, on peut mentionner la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, qui est représentée ci-dessous :

ATGTCGGATG CCGATGTGAA AGAGGGAACG GCGGCCGGCG ATTCAGTGGC CGTTCCCGAG TCGGTTGTAA AACCAGATGA AGGACGGCGG AGCAGAGGTG AGTCTACTGG CGGGACAGCT GCTGGGGATA CCGGTGTGCC AAAGAATATA GCACGGTGTC TTGTTTATTG CAGGTTGAGG CCACGGAACA AGACTGATTT TAAGAACGGT GGGTTCCAAC TAGTGACAGT AAGCGGGAAT GATATTGTTG TGAAGGATCA ACGCTTTTAC AAGTTTGATG GTGCTTTTGG CGACGAATGT ACACAAAGTG ATATATTTGA AGCGGTGGCC GTCCCTTGCA TAACACACGC A TAAAGGT TTTTGCTCAG CGTTGATGTG CTACGGACAG ACGGGTACAG GTAAGTCTTT CACTATGTGT AATACCACTC CTGGCCAAGA AGGCATCATT CCACGGTCCG CCAAACTTAT TTTCGACAAA ATTCAATCAG ACAATGCGCG GAGTTATGAA GTGACAGGAC AGTTTGTTCA GATTTACCGT GACAACCTTG GTGACTTGAT GAGTGCAACT GGAAGGGACC GAGTGGATAT TCACTTCGAC GAACAAGGGG GCGTAGAACT TACCGGTTGC AGCTCCCATG TTCTTCTGAG TGCCCAAGAG TTTATGCGCT TTTACCGCAT CGGCAATGAC CGTCGGGTTG TAACTGCGAC TGCTATGAAT CCGGAGTCCA GCCGCGGCCA TACAGCTTTA GTTCTCCGCA TCGTATCAGA GAGCCCCAGC GACCCAGAGG CAGGTAAACT GAAGGGAAAG ATTACATTCA TCGACTTAGC AGGATACGAG CGTTTTAGTA AAACTGGTAT TACACATGAC AACCCCATTA TGAAGGATGA GGCGAAGTGC ATCAACGCCT CTCTTCTTTC ACTTGGTCAC GTTGTGTCGT GTTTGTCGTC AGGTAGCCGG CACATTCCTT GGCGTGATTC GAAGCTGACG CGGATCCTGC AGGACTCTAT TGGCGGAAGG AGCCGTACCT CTATTATTTT GACTGTTGGG CCAAGTAGTG ATCACCTCCA CGAAACCACA AATTCACTGC AGTTTGGTTT GCGAGCAATG GATGTGAAGG TGACGGCCAA ACAGTCGGTT CATGTGGATT ACCAGAAGCT GGCCCAGAAG CTGCAATCAC TCTTGGATGA AAGGGACGAG AGAATCAATT TACTCGAAGT GCAGATCGCT TCTCGTGACG CAGAAAGACA CGAGTTAATG GAGCGTTACA ACGATCGCCG GGAAGACATT GACAGACGTT TTGAGATTGA GATGGCTGAA CTGAAGAGAA CTGGTGCATC GGAAGAGCAG ATGCTGAACC TGCGTGAAGT ATACAAGGCT GAGGTGGAAA ACCTCCAGGA GCAGCAAGAC GAGGAGTTCC AATACAGGGA GGAAGTGTAT TCAAAGGAGA TCGTCCACCT TATTCGCGAG CAGGAGCATC AGGAAGCGAA GCGACGGGCA GAGATGAAAT TGGCGCAAGA TCTTATCATT GCGGAGTTCC AAAAGAAGCT CGACAACGCG CGTGAGGGAA CAAATGATGA TCTCGTCAGA GTTTTGAAGC AACTGTCCGA AAAGGACGCC ATATTGGCCA GCCGAGCGAA CGACACGGTG AGACTCCACG AACATATTGA GGTGCTCAGG GAGCAAGTGA AGGAGCTCGG TGGAGTGCCT ATAGAGGAGG CGACGTTTCC CGAAACCTTT CTGGACGTTG GCCAGGTGGA GGAGATGCGG AACCGGCTGG AGGCGGATGT GCAACGCCAT CGTGCTAAGG GTGTGGAATT GCTTGCGGAA GTGGATCGTC TTTCGCAGCT CTGCTCTGAG CGGTTGGAGG AGATAAACCG ACTCCGCGAC GAAAACACAC AATATCGCGC CGCATTGGAA AACAGTGGCA TTTCATTGAA TGACACTGAT GATTTGACGG AATTCCTTTC TGAGAAGCGC ACTCAGATGG TGGATGTTTC TGAGATGGAA ACTCTTCGTG TCACCATGCA GGCCGACCTT GATGAAGCGA AGGCGCACAA CCGGGAGCTG GCGCGGGAGG TGGAGCAGTT GAAGTTTGAA TTAACCGCAA CCGCTATTCC ACTCACAGCC CGGCTTCGAT GTCCGCCGTG CGCAACTGCA CGAGGTCCTT CCCCGTTTGA CGCCGCGCGC AACCTGTGTT CGACGCAGCG TAAACCACCT CAAAAGGATG GCACGCCATC CCCAAACAAC ACTCAAAATG AAAACTTGCA AAGGACCGTG AAGCAGCTTA CGGAGCAACT GGAATTCAGC ATGCGTGAGA GGAAGTCGCT TCAGGACCGC GTTGAGGCTG TTGAGACGCA ACTTGCTTCG CATGGTGTTG AGGTTCCGGG GCCGTACGTA CCCCCAATCA AACTTGGTTT CCCCGGCTCT GCACCAGTGA CGTCATCGGA AACAGATGCA AGGGAGCCAC CGGAGGATAC CGATATGGAT GTGCTGCTCC GTGTAAAAGA GGAGGAAATC GATGTGTTAT TGGAAACAAT TGAACGGCAG GAGCACTTGC TCAATGCTGC GAGGTCGAAT GAAGAGTTTC ACCGACGCGT CATTTGTGAG TTGCAGCAGC AGATGGTGAC TGCGCAAATC CAGGTGGAAG ATCCTCAGAA CGCCCCTCCT CCTGTTGACG CCATTGCAAT GGATGAGTAT ATGTCAATTT TGCGTTTAGT TCGGGAGTCC GAACGCAAGT TGGCAGCTCA ATTGGCTGAG CGCGATGGAG AGGATGGCGC GGAGGTGGAG GCCCTGTTGG AGAAGAAGGA TGCGGAACTA CAAATGAAGG AGGAGACCAT ACTCGAGAAG GCGTCGAAGG CGCAGTATGC AGCGAAGCTC TGCATTCGTC TGAAGAACCA GATGCTGCGT TGTGGCATCA CACCGTGTTG TGAGCTTCCA GACTCGTATA ACGAGTTGAT CGAGCGCGAA GAGGAGGAAC TGAATGAGCA ACTAATGTGC CAAGATGAAC TGTTAGCCAG GCTTCGTTCG GAGGAGGAAG AAAAGCATCG CATGCAGAAT ATGCTGAAAT CACTTAATGA GGAGCGCGAG AGGCAATCCA GCGTCATTCG AACTGTTCAA GAGCGCTGTG AACTGGTGGA AAAGAAACAA TTGGTTACGG CAGCCCACTT GTCGCGATTG GCAACGGAAA AATCCCAGAG GGAGCAAATT CTTGAGGAAA CGCTACGACG TGCAACACAA GAATTGTTGG ATTGCAAGAT TAAGATGGCC A GGAAAAAG AAGCAGGTAG CCCGGGTGTG TTAAAGCGTT TCCTCCGCCG CCTGCGCTCC AACTGA

La séquence nucléique peut en outre être optimisée pour l'expression dans la cellule hôte choisie. Un autre objet de l'invention réside dans un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique codant la protéine TbKHCl, de préférence sous contrôle d'un promoteur. Un autre objet de l'invention réside dans une cellule hôte contenant un tel vecteur, ou contenant un acide nucléique codant la protéine TbKHCl inséré dans son génome.

La protéine TbKHCl peut également être obtenue par synthèse artificielle, en utilisant des synthétiseurs de protéines. Elle peut aussi être produite par une combinaison de ces méthodes.

Au sens de l'invention, le terme « peptide antigénique » ou « fragment antigénique » désigne un peptide dont la séquence ou une partie de la séquence correspond à une partie de la séquence de la protéine TbKHCl, et qui est capable d'induire une réponse immunitaire contre la protéine TbKHCl . Un peptide antigénique comporte donc généralement au moins un épitope spécifique de la protéine TbKHCl, permettant d'induire une réponse immune dirigée spécifiquement contre TbKHCl . Un peptide désigne au sens de l'invention une molécule ayant de 4 à 500 acides aminés, par exemple de 4 à 450 acides aminés, par exemple de 4 à 300 acides aminés, ou moins, comme par exemple de 4 à 50, 40, ou 30, ou moins encore. Des exemples de peptides antigéniques au sens de l'invention sont les peptides comprenant au moins les résidus 1000-1111, 900-1111, 800-1111, 700-1111, 687-1111, ou 500-1111, de la séquence SEQ ID NO :2 ou de variants naturels de celle-ci. Un peptide antigénique particulier est notamment un peptide comprenant les résidus 687-1111 de SEQ ID NO : 2.

La protéine ou les peptides antigéniques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur spécificité immunologique. Ainsi notamment, ils peuvent être modifiés chimiquement pour améliorer leur stabilité, leur tropisme, leur solubilité, ou leur immunogénicité. Des exemples de modifications sont par exemple l'addition de phosphates, sucres ou acides myristiques, de polyéthylène glycol. Dans le cas plus particulier des peptides, ils peuvent comprendre, outre la séquence immunogène, un ou plusieurs résidus favorisant l'expression, la stabilité, ou l'immunogénicité. Les peptides peuvent aussi être couplés à des molécules porteuses, ou à d'autres épitopes, afin d'augmenter leur potentiel immunologique, ou complexés ou associés à d'autres protéines pour augmenter leur immunogénicité. Des peptides particuliers de l'invention sont des peptides consistant en une séquence immunogène de la protéine TbKHCl . Inhibiteur de TbKHCl

L'invention concerne également tout inhibiteur de TbKHCl et son utilisation pour le traitement d'infections à trypanosome. Le terme « inhibiteur de TbKHCl » désigne tout composé capable de réduire la quantité (par exemple la production ou la sécrétion) ou l'activité de la protéine TbKHCl . Il s'agit typiquement d'un inhibiteur spécifique, c'est-à-dire capable d'agir sur TbKHCl sans effet direct sur d'autres protéines produites par le trypanosome ou par le mammifère infecté. Le composé inhibiteur peut être un ligand de la protéine TbKHCl, comme par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique codant un anticorps ou fragment ou dérivé d'anticorps, un acide nucléique inhibiteur (antisens, siARN, ribozyme, etc.) inhibant la synthèse de la protéine, un peptide inhibant l'activité de TbKHCl, ou une molécule se liant spécifiquement aux molécules cibles reconnues par TbKHCl au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs transmettant le signal normalement induit par la protéine TbKHCl ou ses composantes, ou une combinaison de ceux-ci. Dans un mode particulier, l'inhibiteur est un composé capable de lier spécifiquement la protéine TbKHCl et de la neutraliser. Un exemple de tel composé est un anticorps, ou un fragment ou dérivé d'anticorps ou un inhibiteur véhiculé par cet anticorps. La liaison spécifique désigne le fait que l'inhibiteur spécifique lie la protéine TbKHCl et ne lie pas spécifiquement d'autres protéines, ou avec une affinité bien inférieure (d'un facteur 10 ou plus). De manière particulièrement préférée, l'inhibiteur est un anticorps liant TbKHCl et ne liant pas de protéines endogènes du mammifère infecté.

L'anticorps peut être un polyclonal, ou un monoclonal, ou un fragment ou dérivé d'anticorps tel que les fragments Fab, Fab'2, les CDRs, les anticorps simple-chaîne (par exemple les ScFv), les nanobodies, les anticorps humains ou humanisés, etc. Les anticorps peuvent être produits par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par exemple l'immunisation d'un animal non-humain, et la récupération du sérum ou des cellules productrices d'anticorps. La production de monoclonaux peut être obtenue par obtention d'hybridomes selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemples, des anticorps selon la présente invention peuvent être générés en injectant la protéine TbKHCl ou un peptide immunogène de l'invention à des animaux (par exemple un lapin ou une souris), puis en récoltant les sérums ou les cellules B. La sélectivité des anticorps peut ensuite être testée et confirmée par des tests classiques de type ELISA. Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al, Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al, Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al, Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; WO93/01288.

Un objet particulier de l'invention réside dans un anticorps liant spécifiquement la protéine TbKHCl . Plus préférentiellement, l'invention réside dans un anticorps liant un épitope contenu dans la région C-terminale de la protéine TbKHCl, par exemple un épitope contenu dans les résidus 687-1111 de la protéine TbKHCl . L'anticorps de l'invention est préférentiellement un anticorps monoclonal. Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps anti-TbKHCl susceptible d'être obtenu par immunisation d'un mammifère non- humain avec une composition immunogène comprenant un peptide comprenant un épitope compris entre les résidus 687 et 1111 de la protéine TbKHCl (bornes incluses).

Un autre objet de l'invention réside dans un fragment Fab ou Fab'2 d'un anticorps tel que défini ci-dessus.

Un autre objet de l'invention réside dans un anticorps simple-chaîne anti- TbKHC 1. Il peut s'agir de nanobodies, ScFv, anticorps Tandem, etc.

Un autre inhibiteur et objet de l'invention est un acide nucléique inhibiteur de TbKHCl, notamment un antisens, un ribozyme ou un ARN interférant spécifique de TbKHCl . De tels acides nucléiques comprennent une partie (généralement de 5 à 50 bases consécutives) de la séquence codante de TbKHC 1 ou de son brin complémentaire, par exemple une partie de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de son brin complémentaire, et permettent d'inhiber spécifiquement l'expression (transcription ou traduction) de la protéine.

Un autre inhibiteur et objet particulier de l'invention est une molécule inhibant l'effet de TbKHCl au niveau de l'hôte mammifère. Il s'agit en particulier de toute molécule se liant spécifiquement aux molécules-cibles reconnues par TbKHCl au niveau de l'hôte, en particulier des récepteurs de l'hôte transmettant le signai normalement induit par la protéine TbKHCl ou ses composantes. On peut citer à titre d'exemple des sucres, des peptides ou d'autres molécules (small drugs) bloquant la fixation de TbKHCl sur des récepteurs cellulaires ou humoraux de l'hôte.

Compositions vétérinaires et pharmaceutiques L'invention concerne toute composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) la protéine TbKHCl, un ou des peptides antigéniques de celle-ci, ou un inhibiteur de la protéine TbKHCl, et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHCl et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler.

Selon un premier mode de réalisation, les compositions de l'invention sont de type vaccin et permettent d'induire une immunité anti-parasitaire très puissante chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne des compositions comprenant (i) la protéine TbKHC 1 , ou un ou des peptides antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, et (iii) optionnellement un adjuvant. De telles compositions permettent de vacciner ou immuniser des mammifères contre la protéine TbKHC 1, et ainsi de protéger le mammifère contre une infection à trypanosome ou de traiter une telle infection.

Les vaccins peuvent comprendre plusieurs peptides antigéniques, de façon à augmenter le pouvoir immunogène du vaccin. Ainsi, ils peuvent comprendre plusieurs peptides, chevauchants ou non, comprenant de 5 à 100 acides aminés chacun et comprenant chacun une séquence d'acides aminés identique à un domaine de la protéine TbKHC 1 compris de préférence entre les résidus 687 et 1111. Les vaccins peuvent inclure d'autres molécules parasitaires associées à TbKHC 1. Dans un mode particulier, le vaccin comprend un seul peptide antigénique.

Dans un autre mode particulier, il comprend 2, 3 4, ou 5 peptides antigéniques distincts de TbKHC 1. A cet égard, un vaccin particulier de l'invention comprend des peptides antigéniques de protéines TbKHC 1 provenant de souches différentes de trypanosomes, permettant d'augmenter le potentiel du vaccin. Le vaccin peut ainsi comprendre un ou plusieurs peptides antigéniques d'une protéine TbKHC 1 d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes.

Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend une protéine TbKHC 1 entière.

Dans un autre mode particulier, le vaccin comprend un acide nucléique codant ladite protéine TbKHC 1 ou le(s) peptide(s) antigénique(s). Dans un mode particulier, la composition selon l'invention comprend la protéine de séquence SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle-ci, ou un acide nucléique codant ladite protéine.

Dans un mode plus particulier, la composition selon l'invention comprend un peptide comprenant les résidus 1000 à 111 1 de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant naturel de celle-ci, un variant de celui-ci ayant au moins 90% d'identité de séquence, ou une séquence nucléotidique codant ledit peptide.

Avantageusement, dans les compositions de l'invention, la protéine ou le(s) peptide(s) antigénique(s) ou la séquence nucléotidique sont sous forme pure ou d'extrait enrichi, recombinante, ou synthétique. Les compositions vaccinales vétérinaires de l'invention comprennent avantageusement une quantité immuno logiquement efficace de la protéine TbKHCl ou de peptides antigéniques issus de celle-ci, tels que précédemment décrits, ou d'un acide nucléique ou vecteur d'expression codant ou surexprimant la protéine TbKHCl ou le(s) peptide(s) antigénique(s) de celle-ci.

Les vaccins selon la présente invention peuvent comprendre un ou plusieurs adjuvants afin d'augmenter leur efficacité. Les adjuvants sont bien connus dans l'état de la technique. A titres d'exemples, on peut citer notamment les sels d'aluminium, tels que l'hydroxyde d'aluminium, les sels de métaux, les immunogènes bactériens tels le LPS, la CT ou la LT les adjuvants des classes TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, ou TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly-électrolytes. D'autres immunomodulateurs peuvent être utilisés, tels que les protéines de salive de mouche, les cytokines ou les protéines de choc thermique.

Les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents (c'est-à-dire induisant une réponse contre un seul type de pathogène) ou multivalents (c'est-à-dire capable d'induire une réponse protectrice contre plusieurs types de pathogènes distincts). Dans un mode particulier, l'invention vise ainsi un vaccin multivalent comprenant (i) la protéine TbKHCl, ou un ou des fragments antigéniques de celle-ci, (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire, (iii) optionnellement un adjuvant et (iv) au moins un antigène d'un autre parasite. Les vaccins selon la présente invention peuvent inclure plusieurs autres molécules parasitaires, en association avec TbKHCl, notamment d'autres kinésines.

Selon un autre mode de réalisation, les compositions de l'invention comprennent un inhibiteur de la protéine TbKHCl et permettent de traiter de manière puissante et rapide une infection à trypanosome chez les mammifères. Ainsi, un objet particulier concerne une composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant (i) un inhibiteur de la protéine TbKHCl et (ii) un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. De telles compositions permettent de bloquer l'action de la protéine TbKHCl et ainsi d'empêcher une infection par trypanosome ou de la contrôler. Dans un mode préféré, l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHCl .

Ainsi, dans un mode particulier de mise en œuvre, l'invention concerne des compositions caractérisées en ce que l'inhibiteur est un anticorps anti-TbKHCl, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps. Dans les compositions de l'invention, tout type d'excipient acceptable peut être utilisé. A cet égard, on peut citer des solutions isotoniques, tampons phosphates ou autres solution salines et milieux de culture (par exemple eau physiologique, PBS, Ringer lactate, milieu 199, milieu Ham) et des excipients stabilisateurs et conservateurs (tels que acides, sucres, phénoxy-éthanol, milieu 199, albumine, acides aminés et dérivés, par exemple). Par ailleurs, les compositions de l'invention peuvent être sous forme liquide, ou solide (poudre). Elles peuvent être conditionnées dans tout conteneur adapté (ampoule, seringue, fiole, flacons, etc.).

Comme indiqué, les compositions comprennent avantageusement une quantité efficace de protéine TbKHCl ou de peptide antigénique. Cette quantité peut être aisément adaptée par l'homme du métier. D'une manière générale, une quantité efficace de protéine TbKHCl ou de peptide désigne une quantité permettant d'induire une réponse anticorps anti-TbKHCl chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,^g et lmg/dose, par exemple entre ^g et 50(^g/dose, notamment entre l(^g et 100 μg/dose. Dans le cas d'un inhibiteur de TbKHCl, la quantité efficace désigne une quantité permettant d'inhiber par au moins 10%, de préférence au moins 20%, 30%>, 40%), 50%o ou plus la production ou l'activité de TbKHCl in vitro ou in vivo, chez le mammifère traité. Une telle quantité est généralement comprise entre 0,^g et lmg d'inhibiteur/dose, de préférence entre ^g et 500μg/dose.

Les compositions de l'invention peuvent être utilisées seules, ou en combinaison avec d'autres traitements, comme par exemple des trypanocides tels que notamment Pentamidine, Eflornithine, Nifurtimox, NECT, Suramine, Melarsoprol, Fexinidazole, Oxaborole Diminazène, Isometamidium, Homidium.

L'invention peut être utilisée pour traiter tout mammifère susceptible d'être infecté par un trypanosome, tel que par exemple les bovidés, les ovidés, les félidés, les camélidés, les canidés, ou les humains. Les compositions selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter les pathologies induites par les trypanosomes comme notamment l'anémie, l'amaigrissement, et/ou une immunosuppression.

Production d'agents anti-trypanosomes

La présente invention concerne également une méthode d'identification, de production ou d'optimisation de composés anti-trypanosomes, comprenant une étape d'évaluation de la capacité d'un composé test à inhiber l'activité ou la production (ou sécrétion) de la protéine TbKHCl . Les composés doués d'une telle activité possèdent une action importante anti-trypanosome. L'invention concerne également tout composé identifié, produit ou optimisé selon la méthode précédente, pour son utilisation pour le traitement d'une infection à trypanosome. Diagnostic d'une infection à trypanosomes

La protéine TbKHCl constitue en outre une cible d'intérêt pour la détection, chez un mammifère, de la présence de trypanosome. Cette protéine étant sécrétée, elle peut être détectée ainsi que tout anticorps contre celle-ci (recherche d'antigène et/ou d'anticorps) ou tout acide nucléique codant TbKHCl, dans tout fluide du mammifère, en particulier dans le sang. Par ailleurs, la protéine comme les anticorps peuvent permettre non seulement de détecter la présence du parasite, mais également de suivre l'évolution d'une infection et/ou l'efficacité d'un traitement.

Ainsi, un objet de l'invention réside également dans une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose ou de détection de la présence de trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, ou la détection de la présence de la protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl .

Un objet de l'invention réside également dans une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.

L'invention concerne aussi une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl ou d'un acide nucléique codant la protéine TbKHCl ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement.

L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure, dans un échantillon dudit mammifère, de la présence de la protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl ou contre un ou plusieurs peptides antigéniques de celle-ci.

L'invention concerne en outre une méthode pour suivre l'évolution d'une infection à trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps.

L'invention concerne encore une méthode pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre le trypanosome chez un mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine TbKHCl, d'un fragment de celle-ci, d'une séquence nucléotidique codant TbKHCl, ou d'anticorps dirigés contre TbKHCl, dans des échantillons du mammifère prélevés à différents intervalles de temps au cours du traitement. La détermination de la présence ou de la quantité (relative) de protéine TbKHCl ou d'anticorps peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps, ou la protéine ou un de ses fragments ou un épitope ou un mimotope. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv), ou la protéine ou un de ses fragments ou un épitope ou un mimotope. Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité de protéine d'intérêt ou de ses fragments ou d'anticorps dans l'échantillon peuvent être détectées par la mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immuno logiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients humains ou des mammifères non-humains qui ne sont pas infectés, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin.

Toutes les techniques immunologiques basées sur les réactions antigènes- anticorps peuvent être mises en œuvre, utilisant soit la protéine TbKHCl ou ses fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques ou un épitope, un mimotope comme antigène, ou des molécules reconnaissant spécifiquement la protéine TbKHCl ou ses fragments ou des composés dérivés naturels ou synthétiques (par exemple, anticorps, fragments Fab, Fab', CDR, ou des dérivés d'un anticorps ou un nanobody). Les techniques immunologiques de base, par exemple, agglutination, précipitation, technique immunoenzymatique, immunoempreinte, western blot sont adaptées.

Dans une autre variante, l'invention détecte la présence d'acide nucléique codant TbKHCl . Cette détection peut être effectuée par des techniques connues en soi de l'homme du métier, comme notamment par Northern Blot, hybridation sélective, utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, amplification sélective d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, la LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), la RPA (Recombinase Polymerase Amplification), le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc.

Selon un mode préféré de mise en œuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence (ou de la quantité (relative)) d'un acide nucléique codant TbKHCl par hybridation sélective ou amplification sélective.

L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi- solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'un acide nucléique codant TbKHC 1. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base de la séquence SEQ ID NO : 1 selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides sondes comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.

Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection d'une infection par trypnanosome chez un sujet.

L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63°C pendant 2 à 18 heures. D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité, sont par exemple une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCl ou du EDTA peuvent également être utilisés.

Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence d'un trypanosome chez un mammifère, ou pour évaluer la réponse à un traitement contre le trypanosome, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon du mammifère et d'une sonde nucléique spécifique de TbKHCl, la formation d'un hybride étant indicative de la présence de trypanosome.

L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique codant TbKHCl . L'amorce peut être spécifique d'une séquence codante (par exemple SEQ ID NO : 1), ou d'une région flanquant la séquence codante. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection de la présence de trypanosome chez un sujet.

A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un du gène TbKHCl pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour détecter la présence de trypanosome chez un mammifère, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une amplification, des acides nucléiques issus d'un échantillon du mammifère et d'une d'amorce spécifique de TbKHCl, l'existence d'un produit d'amplification étant caractéristique de la présence de trypanosome chez ce mammifère.

La méthode de détection est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé. A ce titre, on entend de manière générale par « échantillon » au sens de l'invention tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, ganglion, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides ou des anticorps. Dans un mode de mise en œuvre préféré et particulièrement avantageux, l'échantillon utilisé pour la méthode de détection est un échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de plasma. L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité de la protéine ou de son acide nucléique, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.). Les acides nucléiques de l'échantillon peuvent par ailleurs être séparés, traités, enrichis, purifiés, rétro-transcrits, amplifiés, fragmentés, etc. Dans un mode particulier, les acides nucléiques de l'échantillon sont les ADN ou des ARN, notamment les ou des ARNm de l'échantillon. Dans un mode tout particulier, les acides nucléiques sont le produit d'amplification des ARN, notamment des ARNm ; ou les/des ADNc préparés à partir des ARN, notamment des ARNm de l'échantillon.

La présence de la protéine (ou d'un acide nucléique codant la protéine) TbKHC 1 dans l'échantillon est indicative de la présence de trypanosome chez le mammifère considéré. Kits

Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique de la protéine TbKHC 1, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction entre le ligand et la protéine TbKHC 1. De manière avantageuse, le ligand est un anticorps anti-TbKHCl et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un second ligand (e.g, anticorps) liant la protéine TbKHC 1 ou liant le premier ligand. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.).

Un autre objet de l'invention concerne un kit de détection ou mesure de trypanosomes dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand spécifique d'un anticorps anti-TbKHCl, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction entre le ligand et l'anticorps. De manière avantageuse, le ligand est une protéine TbKHC 1 ou un peptide antigénique de TbKHC 1, ou un produit de synthèse, et le réactif permet la détection d'un complexe immun. Le kit peut comprendre un support adapté (par exemple une plaque, colonne, puce, etc.) sur lequel le ligand est immobilisé, permettant une détection aisée de la formation d'un complexe. Le réactif de détection peut être un second ligand (e.g, anticorps) liant les anticorps. Il peut s'agir de tout autre réactif permettant de révéler la formation d'un complexe (enzyme, colorant, etc.).

Un autre objet concerne un kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 12 ou la protéine TbKHC 1 ou un peptide de celle-ci, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction immuno logique.

Un autre objet concerne un kit de détection ou mesure de trypanosome dans un échantillon test, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHCl, un milieu approprié pour la formation d'une hybridation, et au moins un réactif pour la détection d'une réaction d'hybridation.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand spécifique de la protéine TbKHCl . De préférence, le ligand est un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps anti-TbKHCl .

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une protéine TbKHCl ou un peptide antigénique de celle-ci.

Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisée au moins une sonde nucléique spécifique de TbKHCl . De préférence, la sonde nucléique est une molécule d'ADN simple-brin, de 10 à 200 nucléotides de longueur, ayant une séquence complémentaire du gène codant la protéine TbKHCl .

Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403. Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma préétabli, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable. Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.

D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. EXEMPLES

Matériels & Méthodes

Animaux

Souris Swiss femelles 25-30 gr (Charles River, Domaine des Oncins, 69592 L'arbresle cedex) entretenues au laboratoire selon les règlements sur la protection des animaux. Parasites

Les souches de parasites suivantes ont été utilisées :

Trypanosoma brucei brucei (Antat LI E)

Trypanosoma brucei gambiense "Féo" (ITMAP 1893)

Trypanosoma brucei gambiense « Biyamina » (MHOM/SD 82),

Trypanosoma brucei brucei EATRO 1125

Trypanosoma musculi « Partinico II »

Trypanosoma brucei rhodesiense (Etat 1.2/R)

Trypanosoma evansi (Mantecal EC8)

Trypanosoma congolense (E325)

Trypanosoma cruzi (MN cl2)

Préparation du sécrétome

Les parasites sont purifiés par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE cellulose) à partir du sang de souris infectées, et incubés pendant 2 heures dans un milieu de sécrétion (Ringer Lactate + glucose 50mM) à 37°C. Les produits de sécrétion sont récupérés par centrifugation (1200 g, 10 minutes 4°C). Ce surnageant est filtré sur 0,22μιη, aliquoté et conservé à -80°C. La quantité de protéines présentes est mesurée par la technique de Bradford. Ce sécrétome, aussi appelé PSF {Parasite Soluble Factor) ou produit de sécrétion, contenant la protéine TbKHCl, peut être utilisé tel quel.

Production d'un anticorps anti-TbKHCl

Des souris BALB/c ont été immunisées avec une préparation contenant la protéine TbKHCl pour réaliser des hybridomes par fusion. Les anticorps monoclonaux résultants ont été utilisés pour cribler une banque d'expression de T. b. gambiense. Les clones reconnus ont ensuite été utilisés pour la production de recombinants. L'anticorps monoclonal sélectionné, Mabl, fixe la région C-terminale de la kinésine, région qui est prédite pour être une région enroulée. Préparation d'une fraction enrichie en protéine TbKHCl par chromato graphie d'affinité

Les parasites sont purifiés par chromatographie échangeuse d'ions (DEAE cellulose) à partir du sang de souris infectées, et incubés pendant 2 heures dans un milieu de sécrétion (Ringer Lactate + glucose 50mM) à 37°C. Les produits de sécrétion (sécrétome) sont récupérés par centrifugation (1200 g, 10 minutes 4°C). Ce surnageant est filtré sur filtre 0,22μιη, aliquoté et conservé à -80°C. La quantité de protéines présentes est mesurée par la technique de Bradford.

L'anticorps monoclonal Mabl en solution tamponnée (carbonate 0 ,ΙΜ/NaCl 5M, pH 8,3) est greffé sur une colonne de chromatographie (Sephadex CNBr). Après 48 heures à 4°C, et 5 lavages en tampon carbonate, les produits de sécrétion sont déposés sur cette colonne. Après passage et lavages successifs en milieu de sécrétion, les molécules accrochées par l'anticorps sont éluées par additions successives de tampon glycine 1M/HC1 pH3 et de tampon glycine ΙΜ/NaOH, pHl l . Le pH de la fraction éluée est ajusté à pH8. Après dialyse en PBS 0,015M, la fraction enrichie est aliquotée dans des tubes conservés à -80°C. La quantité obtenue est mesurée selon la technique de Bradford. Le contenu de la fraction enrichie est analysé par électrophorèse sur gel et par Western blot.

Préparation d'une fraction enrichie en protéine TbKHCl par filtration différentielle Dans cet exemple, les fractions vaccinales ont été préparées à partir des produits de sécrétion par filtration différentielle. Les parasites ont été purifiés sur colonne échangeuse d'ions (DEAE cellulose) et mis à sécréter (200x 10 ⁶ /ml de milieu de sécrétion pendant 2 heures). Les produits de sécrétion (PSF) des souches des espèces de trypanosomes suivantes ont ainsi été obtenus: - T. brucei brucei (T. b. b) ;

- T. brucei brucei KO pour les deux allèles de TbKHCl (T. b. b KO);

- T. brucei gambiense (T. Féo) ;

- T. evansi (T. e). Les PSF ont ensuite été fractionnés par filtration différentielle permettant une séparation en hauts poids (HPM) et bas poids moléculaires (BPM). Différents seuils de coupure ont été utilisés pour les fîltrations : 50kDa, qui donne les fractions HPM 50 et BPM 50 ; et lOOkDa, qui donne les fractions HPM 100 et BPM 100. La fraction intermédiaire résulte du passage des PSF d'abord sur le filtre ayant le seuil de coupure de 50 kDa, puis ensuite sur le filtre ayant un seuil de coupure de lOOkDa, et correspond aux molécules ayant un PM >50kDa, mais <100kDa. Le sécrétome est placé sur un filtre ayant un seuil de coupure de 50 ou 100 kDa ; après centrifugation (4000g, 1 heure, 4°C), la fraction contenant les molécules ayant un poids moléculaire inférieur au seuil de coupure (BPM, bas poids moléculaire) est séparée de celle contenant les molécules ayant un poids moléculaire supérieur au seuil de coupure (HPM, haut poids moléculaire). La protéine TbKHCl est présente dans les fractions HPM. Les fractions sont aliquotées dans des tubes conservés à -80°C. La quantité obtenue dans chaque fraction est mesurée selon la technique de Bradford.

Exemple 1 : Inhibition de la croissance des parasites par un anticorps monoclonal dirigé contre la Kinésine

In vitro, l'anticorps monoclonal Mabl a été ajouté à des parasites en co-culture avec des cellules nourricières (feeder layers) (concentration en Mabl dans la culture 4μg/mL). Comparé au contrôle, il inhibe la croissance parasitaire tandis que F isotype contrôle IgG2b (concentration 4μg/mL) n'a pas d'effet (Figure 1).

In vivo, l'injection de Mabl (200 μg dans 200μί de PBS par voie intrapéritonéale) à des souris parasitées depuis 2 jours inhibe le développement de la parasitémie

(exprimée en loglO du nombre de parasites par mL de sang), l'isotype contrôle IgG2b (200 μg dans 200 de PBS par voie intrapéritonéale) est sans effet (Figure 2).

Exemple 2 : Protection in vivo contre les parasites par vaccination

La fraction enrichie en protéine TbKHCl est injectée (10-20 μg/souris) deux fois, à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée à la souris, avec ou sans adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris contrôles reçoivent le milieu seul avec ou sans adjuvant.

Les souris sont infectées 1, 2, ou 3 mois après la dernière injection (voir Figure 3).

La parasitémie des souris vaccinées et des contrôles (milieu seul ± adjuvant) est évaluée quotidiennement pendant les 25 jours suivant l'infection, puis une fois par semaine ensuite. Les résultats sont présentés sur la Figure 4.

Les souris contrôles ayant reçu le milieu avec ou sans adjuvant meurent vers le 7-8 ^eme jour post infection. De manière remarquable, 22 souris sur 26 (84,6%) ayant reçu 2 injections de protéine TbKHCl + adjuvant survivent. L'addition de l'adjuvant à la protéine TbKHCl augmente le taux de survie des souris vaccinées et la durée d'efficacité du vaccin.

Exemple 3 : La vaccination avec TbKHCl induit une protection croisée

Les souris sont immunisées avec la protéine TbKHCl, puis infectées deux mois après soit avec le même trypanosome soit avec un trypanosome d'une autre espèce. Lots Origine de Nombre Infection 2 mois Etude

TbKHCl pour d'injections sous après la dernière parasitémie et immunisation cutanées + injection + survie

saponine adjuvant

Lot 1 (14 T. brucei 2 T. b. gambiense Aucun parasite souris) gambiense détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours

Lot 2 (14 T. brucei 2 T. b. brucei Aucun parasite souris) gambiense détecté dans les souris, toutes survivent à 50 jours

Ces résultats montrent une protection croisée, la protéine TbKHCl de T. brucei gambiense étant capable d'induire une protection contre une infection par T. brucei brucei.

Exemple 4 : Diagnostic de patients infectés

Présence d'anticorps anti-TbKHCl dans le sérum des malades atteints de trypanosomose humaine africaine et leur absence dans le sérum des sujets contrôles de la même région endémique.

Les résultats sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que des anticorps anti-kinésine TbKHCl ont été détectés chez tous les patients testés atteints de trypanosomose humaine africaine. Ces résultats illustrent ainsi la possibilité de discriminer les patients infectés par mesure d'anticorps dirigés contre TbKHCl . Exemple 5 : Essai de protection par sérothérapie

Des essais de sérothérapie effectués sur des lots de 5, 8 ou 10 souris, ont mis en évidence que les sérums de souris ayant reçu deux injections espacées de trois semaines de PSF de T. Féo totaux (30μg/injection), ou de fractions HPM 50 (20μg/injection) ou HPM 100 (20μg/injection), en présence de saponine {25 ig), protègent efficacement (100% de protection) les souris naïves expérimentalement infectées par T. Féo (2 000 parasites en sous-cutané) (Figure 6). En revanche, les sérums des souris ayant reçu deux injections espacées de un mois de fractions BPM50 ou intermédiaire (100<PM>50) n'ont pas d'effet protecteur chez les souris naïves infectées. Les souris recevant du sérum de souris normal avant l'infection (non indiquées sur la Figure 6) meurent 7 jours après l'infection.

De plus, les souris ayant reçu du sérum de souris immunisées avec les PSF de T. Féo ou avec la fraction HPM50 de T. Féo sont aussi protégées contre une infection à T. b. b (protection croisée) (Figure 7).

Exemple 6 : Essai de protection par vaccination

6.1. Vaccination avec une fraction de T. b. gambiense (Féo)

Les souris naïves reçoivent deux injections à 3 semaines d'intervalle, en présence de saponine (25μg/souris), de fractions provenant de T. b. gambiense (Féo) et, plus précisément, de PSF total (30μg/injection), de HPM50 (20μg/injection), ou de BPM50 (20μg/injection). Les souris sont ensuite challengées par des parasites vivants T. b. b (2 000 par souris) deux mois après l'administration de la deuxième immunisation.

Les résultats présentés sur la figure 8A montrent :

- que les antigènes protecteurs sont présents principalement dans les hauts poids moléculaires des PSF de T. Féo ; et

- qu'une protection croisée est obtenue contre une infection à T. b. brucei.

6.2. Vaccination avec une fraction de T.b. brucei

Les souris reçoivent deux injections de PSF total (50 de T. b. brucei ou de T. b. brucei KO pour la kinésine à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée avec adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris « contrôles » reçoivent l'adjuvant seul. Les souris sont infectées 2 mois après la dernière injection (J30) par 2000 parasites vivants de T. b. brucei.

Les résultats présentés sur la figure 8B montrent que toutes les souris ayant reçu le PSF de T. b. brucei survivent, alors que les souris ayant reçu le PSF de T. b. brucei KO pour la kinésine sont mortes 8 jours après l'infection, en même temps que les souris

« contrôles ». 6.3. Vaccination avec une fraction de T. evansi

Les souris reçoivent deux injections de PSF total (50 μg) de T. evansi, à 30 jours d'intervalle (J0 et J30), par voie sous cutanée avec adjuvant (saponine, 25 μg par souris). Les souris « contrôles » reçoivent l'adjuvant seul. Les souris sont infectées 2 mois après la dernière injection par T. evansi (2000 parasites).

Les résultats présentés sur la figure 8C montrent une survie améliorée des souris ayant reçu le PSF de T. evansi, alors que tous les témoins meurent.

Exemple 7 : Analyses protéomiques

7.1. Profils protéiques

Les profils protéiques, obtenus après migration en conditions dénaturantes et non réductrices du sécrétome ou de fractions du sécrétome (HPM ou HBM), montrent la présence d'une bande de haut poids moléculaire (autour de 125 kDa- encadré sur la Figure 9) suffisamment présente chez les espèces pathogènes de trypanosomes {T. Féo ; T. b. brucei ; T. rhodesiense ; T. evansi) pour être détectée après coloration au bleu de Coomassie. Cette bande correspond au poids moléculaire de la protéine TbKHCl . En revanche, cette bande semble absente ou en trop faible quantité chez T. b. brucei KO pour la kinésine. De manière significative, cette bande est bien présente dans les fractions HPM et peu révélée dans les fractions BPM.

7.2. Spectrométrie de masse

Tous les échantillons ont étés analysés par HPLC nano débit (Ultimate 3000, Dionex) couplée à un spectromètre de masse ayant une source nanoelectrospray (Orbitrap Elite, Thermo Fisher Scientific). Les peptides ont été séparés sur une colonne capillaire (phase inverse Cl 8, Nano Viper, Dionex) suivant un gradient de 0-40% de B en 60 min (run de 105 min) (A = 0,1% acide formique, 2% acétonitrile ; B = 0.1 % acide formique dans acétonitrile) à un débit de 300 nl/min. Les spectres ont été enregistrés via le logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Les données spectrales ont été analysées via le logiciel MaxQuant 1.5.0.0 puis retraités avec le logiciel Perseus 1.5.3.0 après utilisation du script Leading v2.2 développé par Oana Vigy. Nous avons utilisé comme base de données : Uniprot_Trypanosoma-all_2016_01.fasta avec les modifications suivantes : Carbamidomethylation (C) en fixe et Oxydation (M) en variable. Cette technique a permis d'identifier la présence de TbKHCl dans les échantillons protecteurs de T. Féo (PSF Féo et HPM50) et son absence dans la fraction BPM 50.

7.3. Analyse du profil immunologique par Western blot

Après filtration différentielle des produits de sécrétion PSF, les fractions HPM50 et HPM100 concentrent les antigènes protecteurs. Le sérum des souris immunisées par ces fractions et protégées a permis d'analyser les cibles antigéniques des anticorps protecteurs. Les marqueurs de poids moléculaire (MM) permettent d'estimer le poids moléculaire des antigènes révélés par les sérums.

Western blot révélés par le Mabl purifié (Figure 10):

L'anticorps monoclonal Mabl purifié cible la Kinésine TbKHCl . Il reconnaît des protéines de hauts poids moléculaire et notamment une protéine d'un poids moléculaire apparent d'environ 125 kDa ainsi qu'une protéine de 59 kDa qui semble commune à toutes les espèces de trypanosomes étudiées. Nos données montrent que l'antigène de 125 kDa correspond à la kinésine TbKHCl (125,89kDa). La protéine de 59kDa correspond à un fragment de la protéine. Cette reconnaissance pour la protéine de 125 kDa est très marquée dans les échantillons HPM 100 Féo et HPM50 Féo ; plus légère pour les échantillons PSF Féo, PSF T. b. brucei et faible voire inexistante pour les échantillons PSF T. b. brucei KO.

Western blot révélés par le sérum anti-PSF féo (Figure 11):

Deux complexes immunogènes majeurs, compris entre 198 et 120kDa et autour de 55kDa, sont révélés par le sérum anti-PSF Féo.

Western blot révélés par le sérum anti-HPM50 Féo (Figure 12) :

Le sérum anti-HPM 50 cible sélectivement l'antigène correspondant à un poids moléculaire de 125 kDa : La filtration différentielle >50 concentre donc bien cet antigène, qui correspond à la protéine kinésine TbKHCl (125,89kDa). L'antigène de 125 kDa n'est pratiquement plus reconnu par ce sérum dans le PSF T. b. brucei KO pour TbKHCl . Cela confirme bien que l'antigène de 125 kDa correspond bien à la kinésine TbKHCl . Western blot révélés par le sérum anti-HPM100 Féo :

Le sérum anti-HPM 100 cible aussi préférentiellement un antigène de 125 kDa : La fïltration différentielle >100 concentre cet antigène qui correspond à la protéine kinésine TbKHCl (125,89kDa).