Triazinonverbindungen wie Triazindione, z. B. Diclazurile, sowie Triazintrione, z. B.

Toltrazurile, wurden zur Behandlung von unterschiedlichen Säugetieren, Insekten und Fischen gegen Krankheiten, die von verschiedensten Protozoen verursacht wer- den, verwendet ; siehe US-Patente 4, 631, 218 ; 4, 933, 341 ; 4, 935, 423 ; 5, 114, 938 ; 5, 141, 938 ; 5, 188, 832, 5, 196, 562, 5, 256, 631 und 5, 464, 837 oder auch EP A 170 316.

Zu den Protozoen, die gegen diese Verbindungen empfindlich sind, zählen Parasiten, die die Eingeweide von Vögeln, Säugetieren und Insekten infizieren und sich in Form von Durchfall, Schwachwüchsigkeit, Übelkeit und Erbrechen äußern. Im All- gemeinen besteht die Wirkweise der Triazinone darin, die in Darm-und Einge- weidewandzellen vorhandenen Zwischenstadien des Parasiten anzugreifen, wodurch das endoplasmatische Reticulum, die den Zellkern umgebende Zone sowie die Mitochondrien des Parasiten anschwellen. Dies stört vermutlich die Teilungsfähig- keit des Zellkerns, wodurch die Schizonten und Mikrogamonten klein bleiben und jeweils nur einige wenige Merozoiten und Mikrogameten bilden. Das Endergebnis besteht darin, dass diese späteren Parasitenstadien die Fähigkeit, in neue Säugetier- zellen einzudringen, verlieren, wodurch die Vermehrung des Parasiten im Wirt wirk- sam unterbunden wird.

Von besonderer Bedeutung sind bestimmte Protozoen, von denen seit den 70-er Jah- ren angenommen wird, dass sie Nervenkrankheiten verursachen und/oder zum Abortus bei Tieren führen. Die erfolgreiche Isolation und in-vitro-Kultivierung eini- ger solcher Protozoen erwies sich als schwierig. Zum Beispiel wurden Gehirnflüssig- keit oder Rückenmarkflüssigkeit erst in den späten 80-er Jahren erfolgreich isoliert.

Sobald feststand, dass Nervenkrankheiten von gehirninfizierenden Parasiten hervor- gerufen werden können und zum Abortus führende Krankheiten von den fotusinfizie- renden Parasiten hervorgerufen werden können, bestand ein Bedarf an effizient gegen Protozoen wirkenden Arzneistoffen, die die Blut-Gehirn-Schranke und die Plazenta- barriere überwinden können, ohne schädigende Nebenwirkungen hervorzurufen. Nur sehr wenige Arzneistoffe sind fähig, die Blut-Gehirn-Schranke oder die Plazen- taschranke von Tieren zu überwinden. Viele der aus dem Stand der Technik bekann- ten Arzneistoffe, die fähig sind, die Blut-Gehirn-Schranke und/oder die Plazen- taschranke zu überwinden, um parasitische Infektionen des Gehirns wirksam zu behandeln, üben schädigende Nebenwirkungen aus, so dass sie nicht ohne hohes Risiko verwendet werden können. Bis jetzt sind daher keine wirksamen Arzneistoffe genehmigt worden, die eine wirksame Behandlung solcher Nerven-und zum Abortus führender Krankheiten darstellen. Es folgt nun eine kurze Beschreibung der durch Parasiten hervorgerufenen Krankheiten.

Neospora caninum ist ein neuer Parasit aus der Gruppe der Protozoen, welcher erst- mals 1984 von BJERKAS et al. in einem norwegischen Hund beschrieben wurde. Natürliche Infektionen sind außer von Hund und Rind auch in Schaf, Ziege und Pferd nachgewiesen worden (Dubey and Rommel 1992, Dubey and Lindsay 1993). Expe- rimentell gelang die Infektion außer bei Hund und Rind auch bei Fuchs, Katze, Schaf und Maus. Der Endwirt von Neospora caninum ist vermutlich der Hund (McAllister et al. 1998), ansonsten gibt es über den vollständigen Entwicklungszyklus noch keine detaillierten Untersuchungen.

Viele verschiedene Zellen wie Makrophagen, Neutrophile, Fibroblasten, Endothel- zellen von Gefäßen, Myocyten, Epithelzellen der Nierentubuli, Hepatocyten und

Nervenzellen können für Neospora caninum als Wirtszellen dienen. Jedoch erfolgt die Vermehrung über Tachyzoiten bevorzugt in Organellen wie Muskel und Nerven- zellen. Daher treten die pathologischen Symptome nach einer natürlichen Infektion bevorzugt in diesen Geweben auf. So kommt es beim Hund nach einer natürlichen Infektion ab der 5. bis 6. Lebenswoche zu Krankheitssymptomen mit Anzeichen von Überempfindlichkeiten aufgrund von Nervenwurzelentzündungen und zunehmender Parese der Hinterbeine. Weitere histopathologische Befunde treten im Nervensystem, und zwar bevorzugt im Gehirn und Rückenmark auf. Hier dominieren ausgedehnte nichteitrige Entzündungen, Glia-Wucherungen und perivaskuläre Infiltrationen mit mononukleären Zellen (Makrophagen, Lymphocyten, wenige Plasmazellen) z. T. auch Eosinophile und Neutrophile. In der Muskulatur treten auch schon makrosko- pisch sichtbare nekrotisch-degenerative Veränderungen auf. Auffallend sind neben einer mehr oder weniger ausgeprägten Atrophie lange blasse Längsstreifen. Dies gilt insbesondere für die Hinterbeine. Histologisch stellen sich die Veränderungen als ausgeprägte Myositis mit leichten Nekrosen und nichteitrigen Gefäßentzündungen dar. Diese Veränderungen finden sich in abgeschwächter Form auch in der Musku- latur der Vorderbeine, des Zwerchfells und der Zungenmuskulatur. Hunde mit diesen Erscheinungen müssen im Alter von 5 bis 12 Wochen euthanasiert werden (Dubey et al. 1988). Neospora-Infektionen werden durch wiederholte transplazentale Übertra- gungen an die Folgegeneration weitergegeben. Dabei müssen in einem Wurf keines- wegs alle Tiere erkranken. Bei einer experimentellen Übertragung auf 6 Hündinnen am 21. Tag der Trächtigkeit brachte 1 Tier 3 lebende Junge zur Welt, während die anderen 5 N. caninum positiven Foeten abortierten. In den 3 lebend geborenen Jung- tieren ließ sich der Parasit nicht nachweisen (Cole et al. 1995).

Die erste historische Beschreibung im Rind erfolgte von Thilsted und Dubey (1989) im Hirngewebe eines abortierten Foetus aus New Mexico. Weitere Isolationen aus dem Rind erfolgten in den USA (Conrad et al. 1993, Barr et al. 1993, Marsh et al. 1995), Japan (Yamane et al. 1996) und Schweden (Stenlund et al. 1996). In Kalifor- nien und Australien gelten Neospora caninum Infektionen als Hauptursache für Aborte in Rinderherden (Barr et al. 1990).

Wahrscheinlich werden die mit Abstand meisten Neospora-infizierten Kälber im Alter von 3 bis 9 Monaten abortiert. In diesen Foeten sind vor allem Tachyzoiten in größerer Zahl zu finden. Zysten wurden bisher erst bei geborenen Kälbern nachge- wiesen. Infizierte Kälber sterben spätestens 3 bis 17 Tage nach der Geburt. Die Krankheitssymptome ähneln denjenigen beim Hund. Es treten Ataxien auf, die Gelenkreflexe sind stark abgeschwächt und es treten Paresen an den Hinterbeinen, z. T. an allen vier Beinen auf. Die histologischen Bilder ähneln denen, wie sie bei Hunden zu finden sind : Im Vordergrund stehen nichteitrige Meningitis und Myelitis.

Im Gehirn finden sich-wie bei Hund und anderen Tieren mononukleäre Zellinfiltrate und Nekrosen insbesondere in perivaskulären Bereichen. Parasiten-vor allem Tachy- zoiten bzw. Pseudozysten mit Tachyzoiten finden sich vor allem-meist jedoch nur in geringer Zahl-herdförmig im Nervengewebe, selten auch in Muskelzellen.

Bemerkenswert und im klaren Kontrast zu Toxoplasma ist die Tatsache, dass Neospora von einem Muttertier mehrfach auf Nachkommen übertragen werden kann.

Dies ist für Hunde und für Rinder nachgewiesen (jerkas et al. 1984, Dubey and Rommel 1992, Dubey et al. 1988).

Im Vergleich konnte bis jetzt kein Unterschied zwischen N. caninum Isolaten aus Hund und Rind gefunden werden, weder auf der Ebene der morphologischen Ultra- struktur, der Proteinanalyse noch nach molekularbiologischem Sequenzvergleich der rRNA oder ITS 1 Sequenz (Holmdahl und Mattsson 1996).

Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung N. caninum konnte seit seiner Entdeckung 1984 inzwischen weltweit identifiziert werden (Review Dubey/Lindsay). Für Kalifornien wird der durch N. caninum bedingte Anteil an Aborten bei Kühen besonders hoch eingeschätzt. Von 468 abor- tierten Föten gingen 45, 5 % auf eine Neospora caninum Infektion zurück (Dubey and Lindsay 1993). In der Schweiz konnte Neospora-spezifische DNA im Gehirn von 29 % abortierter Foeten nachgewiesen werden, demnach werden die jährlichen Ver- luste mit 10, 2 Millionen Schweizer Franken geschätzt (Gottstein/Bern) sowie 100

Millionen Dollar in Australien (Johnson/Sydney). Bezüglich des Auftretens ergibt sich für Kalifornien eine Häufung im Winter von Dezember bis Februar. Entspre- chende Befunde liegen für Neuseeland vor (Thornton et al. 1991). Hier werden die meisten N. caninum bedingten Aborte von Mai bis Juli registriert. Eine wirksame Methode zur Behandlung, insbesondere zur prophylaktischen Behandlung von Infek- tionen mit N. caninum ist bislang nicht bekannt geworden.

Bei der protozoenbedingten Myeloenzephalitis der Pferde (EPM) handelt es sich um eine Nervenerkrankung, die hauptsächlich bei jungen Pferden unter Stress auftritt (z. B. Vollblut-Rennpferden und Reinzucht-Hochleistungspferden) und es handelt sich daher um eine Krankheit mit beträchtlichen finanziellen Auswirkungen für die Pferdewirtschaft. EPM, die erstmals in den 70-er Jahren als Krankheit erkannt wurde, wurde erst 1991 von einem Pferd mit EPM kultiviert und erhielt den Namen Sarcocystis neurona. Im Jahr 1997 wurde eine Neospora spp., die jetzt den Namen Neospora hugesi trägt, aus dem Gehirn eines Pferdes mit EPM isoliert. Dementspre- chend wird nun vorgeschlagen, dass EPM möglicherweise nur von diesem neuidenti- fizierten Organismus, nur von Sarcocystis neurona oder von einer Kombination dieser beiden Organismen verursacht wird. Am häufigsten führt EPM zum asymme- trischen Koordinationsversagen (Ataxie), zu Schwäche und zu Spastik. Die Krank- heit kann beinahe alle Nervenkrankheiten vortäuschen. Sie kann in perakuter oder chronischer Form auftreten. Die chronische Form ist zu Beginn häufig heimtückisch, bis zu einem späten Zeitpunkt im Krankheitsverlauf schwer zu diagnostizieren und kann zum Tod führen. Bei den mildesten Fällen kann das einzige klinische Anzei- chen eine unspezifische Lahmheit der Hüftgliedmaßen oder ein schwach ausgepräg- tes Atemgeräusch sein. Bei den schwersten Fällen sind die Pferde schluck-oder steh- unfähig. Es ist nun bekannt, dass bei den schwersten Fällen der Parasit, z. B. S. neurona, das Gehirn infiziert und dort erhebliche Schäden verursacht. Die klinischen Anzeichen von EPM werden durch direkte, von den Parasiten verursachten Nerven- schäden (am Gehirn und Rückenmark) sowie von Gehirnschäden aufgrund Infiltra- tion von Entzündungszellen, Ödem sowie mit Merozoiten und Meronten koexistie- rendem Absterben der Nerven im Zentralnervensystem (ZNS) verursacht. Zur Zeit

existiert keine wirksame Prophylaxe zur Kontrolle von EPM. Die Kombination der Humanarzneistoffe Trimethoprim und Sulphonamid wurde verwendet. Die Behand- lung ist jedoch teuer und erfordert viele Wiederholungsdosen.

Ein weiterer zur Gruppe der Coccidien gehörender Parasit, nämlich Toxoplasma gondii, ist seit geraumer Zeit bekannt und wurde zum ersten Mal aus den Eingewei- den und dem Muskelgewebe der Katze isoliert. Der Endwirt dieses Parasiten ist die Katze, und diese kann den Organismus über lange Zeit beherbergen, während der sich die Oocysten auf andere Tiere, darunter Rinder, Schafe, Schweine und Men- schen, ausbreiten. Die Infektion von Schafen, Rindern und Menschen wurde mit zum Abortus führenden Krankheiten und mit angeborenen Krankheiten, die hauptsächlich das Zentralnervensystem angreifen, in Zusammenhang gebracht. In jüngster Zeit wurde es auch mit dem Abortus und Missbildungen an Kätzchen, die von einer infi- zierten Mutter stammen, die vor der Infektion während der Trächtigkeit seronegativ war, in Zusammenhang gebracht. Nichtkatzenartige Wirte wie Rinder, Schafe, Schweine und Menschen produzieren keine Oocysten, es kommt jedoch zur Ent- wicklung von Tachyzoiten und Bradyzoiten und gegebenenfalls zur Invasion von Muskeln und Gehirn durch diese, wobei die Tachyzoiten und Bradyzoiten die klini- schen Anzeichen der Krankheit, nämlich neurologische Symptome sowie Abortus mit Missbildungen des Fötus, verursachen. Es wurde berichtet, dass 60 % aller Kat- zen serologisch positiv für T. gondii sind. Wiederum existiert keine Behandlung, insbesondere prophylaktische Behandlung für Toxoplasmose.

Die Verwendung von Triazinonverbindungen wie Diclazuril, Toltrazuril oder Toltra- zuril-Sulphon (seit kurzer Zeit unter der neuen Bezeichnung"Ponazuril"bekannt) zur Behandlung, insbesondere prophylaktischen Behandlung, ohne nichtakzeptable Nebenwirkungen, von Tieren, die einem Infektionsrisiko mit Coccidien, insbeson- dere aus der Familie Sarcocystidae, ausgesetzt sind, ist aus Literaturangaben des Standes der Technik, darunter auch den eingangs genannten Literaturangaben, nicht bekannt bzw. wird in diesen nicht gelehrt. Es stellte sich daher die Aufgabe eine effi-

ziente Behandlung, insbesondere prophylaktische Behandlung für Tiere bereitzu- stellen, die einem Infektionsrisiko mit den genannten Parasiten ausgesetzt sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man durch Verwendung von Triazinonen zur Behandlung, insbesondere zur prophylaktischen Behandlung, einen durchgreifenden Schutz vor Infektionen mit parasitären Protozoen erreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Behandlung, insbe- sondere prophylaktischen Behandlung eines Tieres, das einem Infektionsrisiko mit parasitären Krankheit unterliegt, die sich als Nervenkrankheit oder als zum Abortus führende Krankheit manifestieren, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Tier eine Triazinonverbindung in einer pharmazeutisch wirksamen Menge verabreicht. Bei- spiele solcher Tiere, die jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen sind, sind Pferde, Rinder, Katzen, Hunde, Schweine, Schafe, Vögel, Insekten und Menschen.

Bei den Parasiten, welche die Infektion oder Krankheit verursachen, handelt es sich um Coccidien der Familie Sarcocystidae, die sich als Nervenkrankheiten oder zum Abortus führende Krankheiten manifestieren können. Beispiele zur Veranschau- lichung, die jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen sind, können aus der Gruppe Sarcocystis spp., Neospora spp. und Toxoplasma spp., ausgewählt werden. Typi- scherweise werden die Sarcocystidae ausgewählt aus der Gruppe S. neurona, A'. hugesi, N. caninum und T. gondii, insbesondere aus der Gruppe Neospora spp.. Zu den Protozoeninfektionen oder-krankheiten zählen EPM, Neosporosis und Toxo- plasmosis, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.

Bei der Durchführung der Erfindung führt die Behandlung, insbesondere prophy- laktische Behandlung der Tiere gegen die von den hier beschriebenen Protozoen verursachten parasitären Infektionen oder Krankheiten zur Verhinderung der Symp- tome und der damit verbundenen Krankheiten. Im allgemeinen zählen zu den Symp- tomen dieser Krankheiten Lahmheit, Ataxie, Lähmung, Abortus, schwächliche Neu- geborene sowie andere verwandte Störungen. Typischerweise dauert die Behandlung

ungefähr 1 bis 30 Tage, vorzugsweise ungefähr 1 bis 20, besonders bevorzugt 1 bis 10 und ganz besonders bevorzugt 1 bis 6 Tage. Natürlich kann für die Behandlung, insbesondere prophylaktische Behandlung das Behandlungsschema einmal pro Tag, zweimal oder mehrmals pro Tag, einmal alle zwei Tage oder sogar einmal pro Woche betragen, je nach Umständen wie Art des krankheitserregenden Parasiten.

Bevorzugte Dosierungen liegen bei 1-500 mg Wirkstoff pro kg Körpergewicht des zu behandelnden Tieres, besonders bevorzugt sind Dosen von 10 bis 200 mg/kg und ganz besonders bevorzugt sind Dosen von 20-150 mg/kg.

Ohne sich auf eine bestimmte Theorie der Erfindung festlegen zu wollen, wird ange- nommen, dass der unerwartete Erfolg der hier beschriebenen Behandlung, insbeson- dere prophylaktischen Behandlung, auf der Fähigkeit der Triazinonverbindungen, die Blut-Gehirn-Schranke oder die Plazentaschranke zu überwinden, beruht. Es wird angenommen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Blut-Gehirn- Schranke leicht überwinden und auch fähig sind, in die Plazenta einzudringen und die Protozoen in situ im Gehirn und in der Rückenmarkflüssigkeit im Rückenmark abtöten.

Bis Dato waren keine kostengünstigen, einfach zu verabreichenden Arzneistoffe für den wirksamen Schutz gegen diese Krankheiten, die keine bedenklichen Nebenwir- kungen wie Toxizität oder Mutagenität bei Tieren aufweisen, verfügbar. Die Triazi- nonverbindungen sollen nun im folgenden Text beschrieben werden, und zwar insbe- sondere im Hinblick auf Toltrazurilverbindungen, jedoch ohne sich hierauf zu beschränken. Die vorliegende Offenbarung und die beanspruchte Erfindung umfasst außerdem weitere Triazinonverbindungen, die im Sinne der Toltrazurilverbindungen nützlich sind. Die Triazintrione, Toltrazurile, die erfindungsgemäß verwendbar sind, weisen die Formel (I) auf

in der RI Halogenalkylthio, Halogenalkylsulfinyl oder Halogenalkylsulfonyl darstellt, R2 Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkylmercapto, Halogen, Halogen- alkyl oder einen gegebenenfalls substituierten Sulfamoylrest, wie einen Dial- kylsulfamoylrest, darstellt, und R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl darstellen, und X O oder S darstellt, sowie ihre physiologisch unbe- denklichen Salze.

Außerdem wurde gefunden, dass insbesondere die folgenden Triazintrione, Toltrazu- rile der Formel (I), worin R1 Halogen (C1-C4) alkylthio, Halogen (CI-C4) alkyl-sulfinyl oder Halogen (C1- C4) alkylsulfonyl darstellt, R2 Wasserstoff, (C 1-C4) Alkyl, (C1-C4)Alkoxy, Halogen, (C1-C4)Alkoxy-(C1- C4) alkyl, (Cl-C4) Alkylmercapto, (CI-C4) Dialkylaminosulfonyl oder Halo- gen-(Cl-C4) alkyl darstellt und R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff (CI-C4) Alkyl oder (C1-C4) Alkenyl darstellen und X O oder S darstellt, erfindungsgemäß ver- wendbar sind. Die erfindungsgemä# ebenfalls verwendbaren Triazindione, Diclazurile, weisen die Formel (Ia) auf,

in welcher Ria, R2a und R3a jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Triflu- ormethyl, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkyloxy, C1-C6-Alkylthio oder C1-C6- Alkylsulfonyl stehen, R4a und R5a jeweils unabhängig voneinander fur Wasserstoff, Halogen, Trifluor- methyl oder C1-C6-Alkyl stehen, und R für Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, Cyclo-C3-C6-Alkyl oder Phenyl, welches gegebenenfalls mit bis zu 3 Substituenten unabhängig voneinander aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl, Cl-C6-Alkyloxy, C1-C6- Alkylthio oder C1-C6-Alkylsulfonyl ausgewählt sind, stehen.

Bevorzugt verwendet werden solche Verbindungen der Formel (Ia), in welcher Rla und R2a jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Trifluor- methyl oder Cl-C6-Alkyl stehen,

R3a für Wasserstoff steht, R für Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, Phenyl oder Halogenphenyl steht, und R4a und R5a jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen, Trifluor- methyl oder CI-C6-Alkyl stehen.

Insbesondere bevorzugt verwendet werden solche Verbindungen der Formel (Ia), in welcher Rla für 4-Halogen steht, R2a und R3a für Wasserstoff stehen, R für Wasserstoff oder Methyl steht, und R4a und R5a jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Trifluormethyl szehen, wobei sich R4aund R5a in der 2-und 6-Stellung des sie tragenden Phenylrestes befinden.

Besonders bevorzugt verwendet werden speziell die Verbindungen Diclazuril, Toltrazuril und Ponazuril.

Ganz besonders bevorzugt verwendet werden die Verbindungen Toltrazuril und Ponazuril.

Außerdem wurde gefunden, dass (a) die Verbindungen der Formel I erhalten werden, wenn man Verbindungen der Formel II in der R1, R2, R3 und X die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, mit einem substi- tuierten Carbonsäure-isocyanat der Formel III

R5 ein Halogenatom, eine Alkoxygruppe oder eine Aryloxygruppe bedeutet, umsetzt, und die so gebildeten substituierten 1, 3, 5-Triazinderivate der Formel IV in der R1, R2, R3 und X die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, gegebenenfalls isoliert werden und gegebenenfalls mit einer Verbindung der Formel V A-Z (V) in der A Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl darstellt und Z Halogen darstellt, umgesetzt werden ; oder dass man (b) Verbindungen der allgemeinen Formel I erhält, wenn man Verbindungen der Formel II, in der RI, R2, R3 und X die oben angegebenen Bedeutungen auf- weisen, mit Bis (chlorCarbonsäure) aminen der Formel VI

R6 Alkyl darstellt, gegebenenfalls in der Gegenwart von Säureakzeptoren um- setzt, oder dass man (c) zum Erhalt von Verbindungen der Formel I, in der die Substituenten R2, R3 und R4 sowie X die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen und Rl Halo- genalkylsulfinyl oder Halogenalkylsulfonyl bedeuten, Verbindungen der Formel in der R2, R3 und R4 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen und R1 Halogenalkylthio darstellt, mit der geeigneten Menge eines geeigneten Oxidationsmittels umsetzt.

Verwendet man bei der Verfahrensvariante (a) N- [3-Chlor-4- (4'-trifluormethylthio- phenoxy)-phenyl]-N'-methylharnstoff und Chlorcarbonsäureisocyanat, so lässt sich der Reaktionsablauf durch die folgende Gleichung ausdrücken :

Verwendet man in der Verfahrensvariante (b) N- [3-Ethoxy-4- (4'-trifluormethyl-thio- phenoxy)-phenyl]-thioharnstoff und N-Methyl-bis-(chlorcarbonsäure) amin als Aus- gangssubstanzen, so lässt sich der Verfahrensablauf durch die folgende Gleichung darstellen :

Die gemäß der Verfahrensvariante (a) oder (b) erhaltenen Verbindungen der allge- meinen Formel I, in der R1 Halogenalkylthio und X O bedeuten, können gemäß der Verfahrensvariante (c) zu den entsprechenden Halogenalkylsulfinyl-oder Halogen- alkylsulfonyl-derivaten oxidiert werden. Verwendet man als Oxidationsmittel Was- serstoffperoxid, so lässt sich der Verfahrensablauf durch die folgende Gleichung dar- stellen :

In den Formeln I, II, IV, V, VI und VII handelt es sich bei dem bei R2, R3, R4, R6 oder A definierten Alkyl um geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit vorzugsweise 1 bis 6, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise können gegebenen- falls substituiertes Methyl, Ethyl, n-und i-Propyl sowie n-, i-und t-Butyl genannt werden.

In den Formeln I, II, IV, V und VII bedeutet fur R3, R4 oder A definiertes Alkenyl geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit vorzugsweise 2 bis 6, insbesondere 2 bis 4, Kohlenstoffatomen. Beispielsweise können gegebenenfalls substituiertes Ethenyl, Propen-1-yl, Propen-2-yl und Buten-3-yl genannt werden.

In den Formeln I, II, IV, V und VII bedeutet für R3, R4 oder A definiertes Alkinyl geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit vorzugsweise 2 bis 6, insbesondere 2 bis 4, Kohlenstoffatomen. Beispielsweise können gegebenenfalls substituiertes Ethinyl, Propin-1-yl, Propin-2-yl und Butin-3-yl genannt werden.

In den Formeln I, II, III, IV und VII bedeutet für R2 oder RS definiertes Alkoxy geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit vorzugsweise 1 bis 6, insbesondere 1 bis 4, Kohlenstoffatomen. Beispielsweise können gegebenenfalls substituiertes Methoxy, Ethoxy, n-und i-Propoxy sowie n-und i-Butoxy genannt werden.

In den Formeln I, II, III, IV, V und VII bedeutet für R2, R5 oder Z definiertes Halo- gen vorzugsweise Fluor, Chlor, Brom und Iod, insbesondere Chlor und Brom.

In den Formeln I, II, IV und VII bedeutet für R1 definiertes Halogenalkylthio mit vorzugsweise 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Kohlenstoffatomen, und vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, gleichen oder unterschiedlichen Halogenatomen, wobei es sich bei den Halogenatomen vorzugsweise um Fluor, Chlor und Brom, insbeson- dere um Fluor und Chlor, handelt. Beispielhaft können Trifluormethylthio, Chlor- difluormethylthio, Brommethylthio, 2, 2, 2-Trifluorethylthio und Pentafluorethylthio genannt werden.

In den Formeln I, II und IV bedeutet für RI definiertes Halogenalkylsulfinyl Halogenalkinyl-sulfinyl mit vorzugsweise l bis 4, insbesondere 1 oder 2, Kohlen- stoffatomen und vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere l bis 3, gleichen oder unter- schiedlichen Halogenatomen, wobei es sich bei den Halogenatomen vorzugsweise um Fluor, Chlor und Brom, insbesondere Fluor und Chlor handelt. Beispielhaft kön- nen Trifluormethylsulfinyl, Chlordifluormethylsulfinyl, Brommethylsulfinyl, 2, 2, 2- Trifluorethylsulfinyl und Pentafluorethylsulfinyl genannt werden.

In den Formeln I, II und IV bedeutet für RI definiertes Halogenalkylsulfonyl Halo- genalkylsulfonyl mit vorzugsweise l bis 4, insbesondere 1 oder 2, Kohlenstoffato- men und vorzugsweise l bis 5, insbesondere l bis 3, gleichen oder unterschiedlichen Halogenatomen, wobei es sich bei den Halogenatomen vorzugsweise um Fluor, Chlor und Brom, insbesondere Fluor und Chlor handelt. Beispielsweise können Trifluormethylsuphonyl, Chlordifluormethylsulfonyl, Brommethylsulfonyl, 2, 2, 2- Trifluorethylsulfonyl und Pentafluorethylsulfonyl genannt werden.

In den Formeln I, II und IV bedeutet für R2 definiertes gegebenenfalls substituiertes Sulfamoyl vorzugsweise einen der folgenden Reste : SO2NH2, SO2NH-CH3, S02N (CH3) 2, S02NH-C2H5, S02-N (C2H5) 2, In der Forme ! III bedeutet für R5 definiertes Aryloxy vorzugsweise monocyclisches carbocyclisches Aryloxy oder bicyclisches carbocyclisches Aryloxy, insbesondere Phenoxy.

In der Formel III bedeutet Aryloxy in der Bedeutung von RS vorzugsweise Phenoxy.

Die meisten der substituierten Harnstoffe oder Thiohamstoffe der Formel II, die als Ausgangssubstanzen verwendet werden, waren bis Dato unbekannt, können jedoch mit als solchen bekannten Verfahren leicht hergestellt werden, und zwar dadurch, dass man (a) entweder substituierte 4-Aminodi-phenylether mit den entsprechenden substituierten Isocyanaten oder Isothiocyanaten in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C umsetzt oder, in umgekehrter Reihenfolge, (b) Ammoniak oder substituierte Amine und die entsprechenden substituierten Iso- cyanat-oder 4-Isothiocyanat-diphenylether miteinander unter den gleichen Bedin- gungen umsetzt, oder dadurch, dass man (c) substituierte 4-Hydroxyphenyl-han1- stoffe oder-thioharnstoffe mit aktiven halogensubstituierten aromatischen Verbin- dungen in aprotischen Lösungsmitteln wie Dimethylsulphoxid, Dimethylfonmamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid in der Gegenwart von Basen wie Natrium-

hydrid, Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat und anderen bei Temperaturen zwischen 20°C und 150°C kondensiert.

Bei geeigneter Auswahl des Lösungsmittels kristallisieren die Reaktionsprodukte im allgemeinen beim Abkühlen der Lösung aus. Die Harnstoffe können jedoch auch alternativ aus Aminen und Isocyanaten nach der folgenden Literaturstelle hergestellt werden : Methoden der Org. Chemie (Houben-Weyl) IV. Ausgabe, Band VIII, Seite 157-158.

Einige der Bis (chlorcarbonsäure)-amine der allgemeinen Formel VI, die gemäß der vorliegenden Erfindung im Verfahren (b) verwendet werden können, sind bereits bekannt (vgl. Artikel in Synthesis 1970, Seite 542-543), und diejenigen, die bis jetzt noch nicht bekannt sind, lassen sich auf analoge Weise aus cyclischen Diacyldisulfi- den mittels Chlorierung in inerten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Koh- lenstofftetrachlorid, herstellen.

Als mögliche Verdünnungsmittel für die Umsetzung der Harnstoffe oder Thioharn- stoffe der Formel II sowohl mit den Carbonsäureisocyanaten der Formel III (Verfah- rensvariante a) als auch mit den Bis (chlor-carbonsäure)-aminen der Formel VI (Ver- fahrensvariante b) sowie für die Umsetzung der 1, 3, 5-Triazinderivate der Formel IV mit Verbindungen der Formel A-Z sind alle diejenigen organischen Lösungsmittel geeignet, die gegenüber diesen Reaktionen inert sind.

Zu diesen zählen außer Pyridin vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol, halogenierte aromatische Kohlenwasserstoffe wie Chlor- benzol und Dichlorbenzol, sowie Ether wie Tetrahydrofuran und Dioxan.

Die Chlorwasserstoffsäure, die sich während der Reaktion bilden kann, entweicht in Form eines Gases oder kann mittels organischer oder inorganischer Säureakzeptoren gebunden werden. Zu diesen Säureakzeptoren zählen vorzugsweise tertiäre organi- sche Basen wie Trialkylamine, zum Beispiel Triethylamin, aromatische N-

Hetero (mono- oder bi) cyclische Amine wie mono-oder bicyclische Pyridinaza- cycloalkylamine wie Diazabicyclononen, Diazabicycloundecen und viele andere mehr, oder inorganische Basen wie Alkalicarbonate,-oxide oder-hydroxide oder Erdalkali-carbonate,-oxide oder-hydroxide.

Die Reaktionstemperaturen für die oben genannten Reaktionsschritte können inner- halb weiter Grenzen schwanken. Im allgemeinen wird die Reaktion zwischen unge- fähr 0°C und ungefähr 150°C, vorzugsweise zwischen ungefähr 20°C und ungefähr 100°C, durchgeführt.

Die oben genannten Reaktionsschritte können unter Normaldruck oder unter erhöh- tem Druck vorgenommen werden. Im Allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.

Mögliche Oxidationsmittel für die Umsetzung nach Verfahrensvariante (c) der Trifluormethylthioverbindungen der allgemeinen Formel (I), in der Y Sauerstoff dar- stellt, zu den entsprechenden Sulfinyl-oder Sulfonylverbindungen sind jeweils H202/Eisessig, H202/Essigsäureanhydrid, H202/Methanol, Persäuren wie zum Bei- spiel m-Chlorperbenzoesäure, sowie Chromsäure, Kaliumpermanganat, Natrium- periodat, Cer (IV) ammoniumnitrat sowie Salpetersäure.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel (Ia) ist in EP A 170 316 und US 4, 631, 278 beschrieben. Nach den dort beschriebenen Methoden können diese Ver- bindungen erhalten werden.

Eine erhaltene Verbindung der Formel (I) oder Formel (Ia) kann zum Beispiel durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Base in ein entsprechendes Additionssalz umgewandelt werden.

Bei der Durchführung der Erfindung kann die Triazinonverbindung zur Verabrei- chung an Tiere auf eine beliebige Weise formuliert werden. Formulierungen, die sich für die orale Verabreichung, die in diesem Zusammenhang bevorzugt ist, eignen,

können Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Gele, Pasten, Boli oder Präpa- rate in Form von Pulvern, Granulaten oder Pellets sein. Zu weiteren Verabreichungs- möglichkeiten zählen die parenterale, topische, intramuskuläre und intramucosale Verabreichung oder andere Verabreichungswege, die dem Fachmann bekannt sind.

Die topische Verabreichung in Form eines Mittels zum Aufgießen (pour-on) ist eben- falls bevorzugt.

Eine besonders effektive Anwendung ist die Kombination der Wirkstoffe der For- meln (I) und (Ia) mit Lebend-oder Totvaccinen gegen parasitäre Protozoen, insbe- sondere gegen Neospora spp. Hierbei können auch wirkungssteigernde Effekte beobachtet werden.

Mittel und Formulierungen werden durch Mischen der Komponenten in geeigneten Apparaturen wie Rührkesseln und anderen geeigneten Geräte hergestellt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die der Veranschaulichung dienen, jedoch nicht beschränkend sind, genauer beschrieben :

Beispiele Neospora caninum Infektionen Grundlage einer Diagnose von Neospora caninum und die Abgrenzung zu Toxoplasma gondii sind klinische, mikroskopische, immunhistochemische und molekularbiologische Parameter. Klinisch tritt eine Lähmung von Extremitäten und eine wiederholte transplazentare Übertragung auf. Mikroskopisch können Tachy- zoiten und Zysten in Muskulatur und Nervengewebe auftreten. Zysten mit einer aus- geprägten dickwandigen Zystenwand treten nur in geringer Zahl und ausschließlich im Nervengewebe auf. Im indirekten Immun-Fluoreszenztest (IFAT) unter Verwen- dung von in Zellkultur erzeugten Tachyzoiten, gelten Titer ab 1 : 200 als spezifisch.

Bei bereits vorliegenden klinischen Symptomen können Titer bis 1 : 20. 000 auftreten.

Molekularbiologisch gelingt eine schnelle und eindeutige Identifikation von Neospora caninum durch eine in vitro Amplifikation der ITS 1-Region (internal transcriber spacer 1) (Holmdale and Mattsson 1996).

Beschreibung des in vitro Testsystems Kultivierung von VERO-Wirtszellen Neospora caninum ist ein obligat intrazellulärer Parasit. VERO-Zellen (Nierenzellen einer afrikanischen grünen Meerkatze, ATCC Nr. : CCL 81 Vero) dienten als Hilfs- mittel, den Parasiten unter standardisierbaren und definierbaren Bedingungen zur Reproduktion zu bringen. Vero-Zellen wurden in folgendem Medium kultiviert : 87 % RPMI 1648 (ICN, 12-602-54) 10 % FCS (foetales Kälberserum, ICN, 29-101- 49) 1 % 200 mM L-Glutamin (ICN, 15-801-13) 1 % Natriumbicarbonat (ICN, 16- 883-49) 1 % Penicillin/Streptomycin (ICN, 16-700-49). Die Haltung und Passage nicht infizierter Kulturen erfolgte in Gewebekulturflaschen von 25 cm2 (Falcon, B 769031) und 75 cm2 (Falcon, B 769051). Vero-Zellen wurden bei 37°C unter 5 % CO2-Atmosphäre in einem CO2-Inkubator (Heraeus) bis zur Ausbildung eines Monolayer-Zellrasens kultiviert.

Kultivierung von ED-Zellen ED-Zellen (dermale Pferdezellen, ATTC Nr. CCL 57) wurden in folgendem Medium kultiviert : 87 % EMEM (ICN, 12-106-54) 10 % FCS (foetales Kälber- serum, ICN, 29-101-49), 1 % 200 mM L-Glutamin (ICN, 15-801-13), 1 % NEA (Nichtessentielle Aminosäuren, Gibco, 11140-035), 1 % Penicillin/Streptomycin (ICN, 16-700-49). Die Haltung und Passage nicht infizierter Kulturen erfolgte in Gewebekulturflaschen von 25 cm2 (Falcon, B 769031) und 75 cm2 (Falcon, B 769051). ED-Zellen wurden bei 37°C ohne CO2-Atmosphäre in einem Inkubator (Hereus) bis zur Ausbildung eines Monolayer-Zellrasens kultiviert.

Passagieren von Zellen Wirtszellen wurden passagiert, d. h. auf neue Zellkulturgefäße verteilt, wenn der Zell- rasen einer Kultur in den Kulturflaschen dicht geschlossen war. Bei einem Gehalt von 10 % FCS im Kulturmedium erfolgte dies in der Regel zweimal pro Woche.

Zunächst wurde das Kultur-Medium dekantiert, der Zellrasen mit 5 ml Trypsin- EDTA (ICN, 16-891-49) gespült und mit weiteren 5 ml Trypsin-EDTA 5-10 min bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert, bis sich die Zellen vom Boden gelöst hatten.

Die Trypsin-EDTA-Zellsuspension wurde zusammen mit 1-2 ml vorgewärmtem FCS bei 1500 UpM (Varifuge 3. 0, Heraeus) 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 15 ml Medium gelöst (92 % RPMI 1640, 5 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Natriumbikarbonat, 1 % Penicillin/Streptomycin). Pro Gewebe- kulturflasche wurden 3 neue Flaschen mit jeweils 5 ml Zellsuspension angeimpft, d. h. die Teilungsrate betrug 1 : 3.

Gefrierkonservierung von Zellen im flüssigen Stickstoff Zellen aus Kulturflaschen wurden entweder im C541-Medium (50 °, 0 RPMI 1640, 40 % foetalem Kälberserum (FCS), 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO, Merck 9578) oder im C2-Medium (86 % RPMI 1640, 10 % DMSO, 2 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Streptomycin/Penicillin) eingefroren. Zuvor wurden die Zellen wie beschrieben (s. oben) trypsiniert, die abgelösten Zellen zentrifugiert und in 3 ml C541-Einfrier-

medium oder C2-Medium resuspendiert und in 2 ml-Kryoröhrchen überführt. Die Endlagerung erfolgte im füssigen Stickstoff bei-196°C, dort sind Zellen unbegrenzt haltbar. Vor der Endlagerung im flüssigen Stickstoff wurden die Kryoröhrchen mit den Zellinien in einer Styroporbox von I cm Wanddicke langsam auf-80°C abge- kühlt. Die Styroporbox ermöglicht eine kontinuierliche Abkühlgeschwindigkeit von 1-2°C pro Minute, bei der die Zellen Gelegenheit haben über Osmose ihr intrazellulä- res Wasser zu verlieren. Dies ist für die Vitalität der Zellen von entscheidender Bedeutung.

Auftauen gefrierkonservierter Zellen Der Auftauvorgang der Kryoröhrchen aus flüssigem Stickstoff erfolgte so schnell wie möglich in einem 37°C warmen Wasserbad. Die Zellsuspension wurde in 10 ml Medium pipettiert und anschließend auf zwei 50 ml-Gewebekulturflaschen gleich- mäßig verteilt. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C und 5 % CO2. Nach 24 h wurde das Zellkulturmedium gewechselt, um das im Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen.

Infektion von Zellkulturen mit Neospora caninum Für die Infektion von Zellkulturen wurden folgende Neospora caninum Isolate verwendet : NC-1 (Isolat aus dem Hund DUBEY (1988) und NC Swe B-1/9. Passage (Isolat aus dem Rind ; National Veterinary Institute Uppsala, Schweden). Als Infek- tionsmaterial dienten infizierte Zellkulturen aus dem Stickstofflager (s. oben) oder gereinigte Tachyzoiten infizierter Kulturen (s. unten).

Aufreinigung von Tachyzoiten aus Zellkulturen mittels Sephadex Die Reinigung von Neospora caninum aus infizierten VERO-oder ED-Monolayern erfolgte unter sterilen Bedingungen. Zunächst wurden infizierte Zellkulturen mit einem Zellschaber (Tec No Mara, 3010) vom Flaschenboden gelöst und mit einer 23- er Kanüle (Luer 23 Gxl, 0, 6x25 mm) in eine 10 ml Einwegspritze gezogen. Bei diesem Vorgang wurden Wirtszellen und darin enthaltene Gewebezysten mechanisch zerstört. Die Zellsuspension wurde anschließend bei 1500 UpM (Varifuge 3. 0,

Heraeus) 7 min lang zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Proben-Pellet in genau 2, 5 ml physiologischem Phosphat-Puffer (PBS : 1 mM P04, 12 mM NaCI, 0, 87 mM KCL, pH 7. 4) resuspendiert. Die weitere Aufreinigung erfolgte über eine Sephadex-Säule (PD-IOTM/Sephadex G-25 M, Pharmacia Biotech, 17-0851). Die Säule wurde zunächst mit 25 ml PBS equilibriert, das Probenvolumen in 2, 5 ml PBS aufgetragen und danach mit 5 ml PBS eluiert. Tachyzoiten laufen schnell durch die Säule und befinden sich in den ersten 3 ml des Eluates. Hochmolekulare Zelltrümmer und Membranen verlassen zeitlich verzögert die Sephadex-Säule. Um unerwünschte Zellorganellen und freie Wirtszell-DNA zu entfemen wurde die Probe bei 1500 UpM 7 min lang zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet 3mal in 40ml PBS gespült.

Testen von Substanzen an infizierten Neospora caninum Zellkulturen Das Testen von Substanzen fand in 96-well-Platten (Falcon 3872) statt, weil in diesem System nur geringe Mengen an Ausgangssubstanz (ca. 1 mg) benötigt werden. Auf den Zellkulturplatten wurde zunächst ein Zellkultur-Monolayer der Wirtszellen (Vero oder ED) angelegt. Hierfür wurden zwei 50 ml Gewebekulturfla- schen (insgesamt 50 cm2 Zellkulturfläche) mit einem ausgebildeten nicht infizierten Monolayer benötigt. Der Zellrasen dieser Kultur wurde mit 5 ml Trypsin-EDTA (Gibco, 45300-019) im CO2-Brutschrank bei 37°C abgelöst. Nach 10 min. Inkuba- tionszeit hatten sich die Zellen zum größten Teil abgelöst. Mit einer 5 ml-Pipette wurde die Zellsuspension in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen (Greiner, B769331) überführt, indem ca 1 ml angewärmtes foetales Kälberserum vorgelegt wurde. Nach 5 min Zentrifugation bei 1500 UpM (Varifuge 3. 0, Heraeus) wurde der Überstand verworfen und das Zell-Pellet in 100 ml RPMI-Medium (95 % RPMI 1640, 2 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat, 1 % Penicillin/Streptomycin) resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden 150 nul pro well einer 96-well Platte einpipettiert. 100 ml Medium reichen für die Beschichtung von 6-Mikrowellplatten.

Beschichtete Zellkultur-Platten wurden im Brutschrank bei 37°C unter 5 % CO2 für 24 h kultiviert. Danach erfolgte eine Infektion mit gereinigten Neospora caninum Tachyzoiten bei einer Konzentration von 48. 000 Tachyzoiten pro well und einer

weiteren Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 für 24 h. Die zu testenden Substanzen wurden in 1, 5 ml Eppendorfreaktionsgefäße eingewogen, wobei die eingewogenen Menge bei 0, 5-1, 5 mg lag. Anschließend wurde pro mg Substanz 1 ml DMSO zupipettiert, was einer Verdünnung von 1x10-3 g/ml entspricht. Das Medium zur Behandlung, indem die weiteren Verdünnungsreihen erfolgten, bestand aus 87 % RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat, 1 % Penicillin/- Streptomycin. Beim ersten Screening wurden die Konzentrationen 10 ppm, 25 ppm und 50 ppm eingesetzt. 24 h nach der Infektion durch Neospora caninum wurden die verdünnten Präparate in einem Volumen von 150 Ill/Well auf die Zellkulturplatten übertragen. In der ersten Reihe wurde unbehandeltes Medium verwendet, diese Reihe enthielt sowohl die infizierte Kontrolle als auch die nicht infizierte Kontrolle.

Danach erfolgte eine Inkubation der Zellplatten für 5 Tage bei 37°C und 5 % CO2.

Innerhalb dieser Zeit vermehren sich die Tachyzoiten innerhalb der Wirtszellen und führen dadurch zur Zerstörung des Monolayers. Bei voller Wirksamkeit einer Sub- stanz werden die Tachyzoiten abgetötet und der Monolayer bleibt erhalten. Ein intakter Monolayer kann durch einen Protein-Bindungs-Test (Lebendfärbung) nach- gewiesen werden. Eine Methode hierfür ist die Färbung mit 0, 25 % Crystal Violet (Sigma C 3886). Vor Färbung wurden die Testplatten mit 100 u. I PBS gespült und mit 100 nl Methanol fixiert. Die mikroskopische Auswertung erfolgte 4 Tage nach Behandlungsbeginn und 5 Tage nach der Infektion bei einer Vergrößerung von 25 x 10 in einem Umkehrmikroskop nach folgendem Bewertungsschema : Bewertung Optischer Eindruck 0 = keine Wirkung Monolayer vollständig zerstört 1 = schwache Wirkung Monolayer teilweise zerstört, Parasitennester zu erken- nen 2 = volle Wirkung Monolayer unzerstört, keine Tachyzoiten zu erkennen T = cytotoxisch Zellen abgestorben, abgekugelt Tabelle 1 : Wirksamkeit von Toltrazuril gegen Neospora caninum in VERO Zellen Substanz 50 ppm 25 ppm 10 ppm Infizierte Kontrolle 0 0 0 Toltrazuril 2 2 1 reiner Wirkstoff Toltrazuril 2 2 1 2, 5 % Lösung

* 100 ml Lösung enthalten : 2, 50 g Toltrazuril 30, 00 g Triethanolamine 80, 70 g Polyethylene glycol, die Komponenten werden einfach gemischt.

Bewertung Optischer Eindruck 0 = keine Wirkung Monolayer vollständig zerstört 1 = schwache Wirkung Monolayer teilweise zerstört, Parasitennester zu erken- nen 2 = volle Wirkung Monolayer unzerstört, keine Tachyzoiten zu erkennen T = cytotoxisch Zellen abgestorben, abgekugelt

II. In vivo Wirksamkeit Für die in vivo-Wirksamkeit von Substanzen liegen bis jetzt nur sehr wenige Anga- ben vor, da adäquate in vivo-Testsysteme noch entwickelt werden müssen. Bei expe- rimentell infizierten Mäusen erwies sich Sulfadiazin (über das Trinkwasser verab- reicht) nur als wirksam, wenn die Behandlung prophylaktisch, d. h. vor der Infektion begann. Dann wurden klinische Symptome verhindert, ohne dass es zu einer parasi- tologischen Heilung kam. Ein späterer Behandlungsbeginn war erfolglos (Bjerkas et al. 1984, Dubey et al. 1988, Lindsay and Dubey 1989, Lindsay and Dubey 1990).

Beim Hund hat die Behandlung mit Sulfadiazin und Clindamycin nur dann eine Erfolgsschance, wenn sie sehr frühzeitig bei dem ersten Auftreten klinischer Symp- tome infolge der Nervenwurzelentzündungen beginnt.

Beschreibung des Testmodells in der Maus Die Versuchsplanung und Durchführung erfolgten im Auftrag der BAYER AG durch Dr. Simone Eperon & Prof. Bruno Gottstein am Institut für Parasitologie der Vete- rinänmedizinischen und der Medizinischen Fakultät der Universität Bern (Eperon et al. 1999, Parasite Immunology 21 : 225-236.) Mäuse Weibliche Wt C57BL/6-Mäuse. Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Behandlung : 7 1/2 Wochen.

Neospora caninum Tachvzoiten Neospora caninum Tachyzoiten wurden über VERO Zellen passagiert, über Säu- lenchromatographie gereinigt und in sterilem PBS in Konzentrationen von 2x106 Parasiten/100 nl aliquotiert. Eine Lebendfärbung mit Trypan Blau ergab 97 % an lebensfähigen Tachyzoiten.

Für die Prophylaxe eingesetzte Substanzen (Tabelle 2) Toltrazuril reiner Wirkstoff wurde als Stocklösung mit 50mg/10 ml H2O + 100 p1 Cremophor angesetzt. In 0, 1 ml dieser Lösung befanden sich pro Applikation 0, 5 mg reiner Wirkstoff. In einer 20 g Maus entspricht dies einer Anwendungskonzentration von 25 mg/kg. Die Substanzen wurden mittels Schlundsonde peroral an 6 aufein- anderfolgenden Tagen verabreicht, dies entspricht einer Gesamtaufnahme von 150 mg/Maus.

Toltrazuril 2, 5 % formulierte Lösung (100 ml Lösung enthalten : 2, 50 g Toltrazuril, 30, 00 g Triethanolamine, 80, 70 g Polyethylene glycol ; die Komponenten werden einfach gemischt.) : Es wurden 6, 25 ml der 2, 5 % igen Lösung in 250 ml Wasser verdünnt und den Mäusen an 6 aufeinanderfolgenden Tagen über das Trinkwasser verabreicht.

Infektion Vier Stunden nach prophylaktischem Behandlungsbeginn wurde jede Maus mit 2xlO6Parasitenstadien/100 111 sterilem PBS infiziert.

Euthanasie 14 Tage nach der Infektion wurden die Versuchsmäuse mit CO2 getötet. Sie wurden über Randomisierung mit Nummern versehen um eine zufällige Reihenfolge bei der Auswertung einzuhalten (Blindauswertung). Die Blutentnahme erfolgte aus dem Herzmuskel für die Serumgewinnung. Das Gehirn wurde sorgfältig präpariert und eine Hälfte bei-80°C für die PCR-Analyse gespeichert. Der Rest wurde in 4 % Paraformaldehyd/PBS fur Immunhistologische Untersuchungen fixiert (IFAT).

Ervebnisse 1. IgG im Serum (Tabelle 3) Anti-N. caninum gesamt Immunglobulin G (IgG) wurde über ELISA gemessen ent- sprechen der Methode von Eperon et al., 1999, Parasite Immunology 21 : 225-236.

Behandelte Gruppen werden mit einer nichtinfizierten und einer infizierten Kontroll- gruppe verglichen. Die positive Kontrollmaus wurde mit einem Rohextrakt von N. caninun Tachyzoiten geimpft und im folgenden mit 106 N. caninum Stadien infiziert.

In dieser Maus waren die Parasiten-spezifischen IgG Werte besonders hoch.

In Mäusen, die mit Toltrazuril (reinem Wirkstoff) behandelt wurden, zeigte sich ein verringerter Anteil von Neospora caninum spezifischen IgG Antikörpern als in der infizierten und unbehandelten Kontrollgruppe. Dieser Anteil war in den Mäusen, die mit Toltrazuril 2, 5 % formulierter Lösung behandelt wurden, deutlich niedriger (Annäherung zur nichtinfizierten Kontrollgruppe).

2. PCR-Analyse (Tabelle 4) Die Isolation von DNA aus dem Gehirn infizierter Mäuse und die Durchführung einer Neospora caninum spezifischen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde ent- sprechend Eperon et al 1999, Parasite Immunology 21 : 225-236, durchgeführt. Alle nichtinfizierten Mäuse waren in der N. caninum-specifischen PCR-Reaktion negativ.

Alle infizierten Kontrollmäuse waren PCR-positiv. In der Gruppe, die mit Toltrazuril reinem Wirkstoff prophylaktisch behandelt wurde, waren 4/7 Mäusen PCR-negativ.

In der Gruppe, die mit 2, 5 % formulierter Toltrazuril-Lösung behandelt wurden, waren alle Mäuse PCR negativ.

3. Immunofluoreszenz Test (IFAT, Tabelle 4) Paraformaldehyd fixierte Gehirnproben wurden in Paraffin eingebettet und entwäs- sert. Drei aufeinanderfolgende saggitale Schnitte wurden durchgefuhrt. Einer wurde mit Hematoxilin-Eosin gefärbt, die beiden anderen wurden für die Immunfluores- zenzmarkierung aufbereitet (Eperon et al., 1999. Parasite Immunology 21 : 225-236) mit folgenden Veränderungen : der erste Antikörper war ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen gegen ganze N. caninum Tachyzoiten mit einer Verdünnung von

1 : 400 in 1 % BSA in PBS. Der zweite Antikörper war ein Ziege-anti-Kaninchen FITC markierter Antikörper in einer Konzentration von 1 : 100 in 0, 5 % BSA in PBS.

Die Hematoxilin-Eosin gefärbten Schnitte zeigten in allen Gruppen keinerlei Läsio- nen oder abnorem Veränderungen, darum wurde die Immunmarkierung mit spezifi- schen N. caninum Antikörpern hinzugezogen, um Parasitenstadien im Hirngewebe zu markieren. Bei der Beurteilung wurden die ganzen Schnitte untersucht. Auftretende Parasitenstadien wurden gezählt und folgende Bewertung angewendet : Bewertung (-) = keine Tachyzoiten Bewertung (+) = weniger als 10 Tachyzoiten Bewertung (++) = zwischen 10 und 200 Tachyzoiten Bewertung (+++) = mehr als 200 Parasiten Die Bewertung (+++) trat nur bei der Positivkontrolle auf. Die Positivkontrolle war eine knock-out Mutante (aMT-Maus), die keine Antikörper produziert und aufgrund der Infektion am Tag 31 nach der Infektion verstarb. Alle nicht infizierten Mäuse waren im IFAT-Test negativ. Alle mit Toltrazuril behandelten Gruppen waren im IFAT-Test negativ.

Tabelle 2 : Wirksamkeit von Toltrazuril gegen Neospora caninum in der Maus Tag Datum Toltrazuril Toltrazuril Infizierte Nichtinfi- Reiner Wirkstoff 2, 5 Kontrolle zierte 25 mg/kg/Tag p. o. Formulie- Kontrolle rung i. W. BL/6-7 Mäuse 5 Mäuse 5 Mäuse 5 Mäuse Mäuse Tag 0 21. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % i. W. Infektion 21. 06. 99 2x 106 2x 106 2x 106 Keine 4 h später Tachyzoiten Tachyzoiten Tachyzoiten Infektion i. p. i. p. i. p. Tag 1 p. i. 22. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % i. W Tag 2 p. i. 23. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % i. W Tag 3 p. i. 24. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % i. W Tag 4 p. i. 25. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % i. W Tag 5 p. i. 26. 06. 99 25 mg/Maus 2, 5 % I. W-- Tag 14 p.i. 5.07.99 Euthanasie Euthanasie Euthanasie Euthanasie

p. i. = post infectionem p. o. = per oral i. W. = im Wasser

Tabelle. 3 : Anti-Neospora caninum IgG im Serum von einzelnen Mäusen, sowie Mittelwert der IgG Konzentration im Serum pro Behandtunss-Gruppe Versuchsgruppe Maus Nr. * OD (anti Neospora IgG im OD Mittelwert Serum) Nicht inf. Kontrolle 242 0. 034 0. 0340 Nicht inf. Kontrolle 228 0. 03 (+/-0. 0044) Nicht inf. Kontrolle 240 0. 028 Nicht inf. Kontrolle 227 0. 045 Nicht inf. Kontrolle 233 0. 033 Inf. Kontrolle 239 0. 178 0. 2352 Inf. Kontrolle 224 0. 224 (+/-0. 0542) Inf. Kontrolle 246 0. 168 Inf. Kontrolle 234 0. 242 Inf. Kontrolle 222 0. 364 Toltrazuril 25 mg/kg 241 0. 338 0. 1689 Toltrazuril 25 mg/kg 225 0. 271 (+/-0. 0807) Toltrazuril 25 mg/kg 244 0. 056 Toltrazuril 25 mg/kg 220 0. 066 Toltrazuril 25 mg/kg 231 0. 18 Toltrazuril 25 mg/kg 235 0. 103 Toltrazuril 25 mg/kg 245 0. 168 Toltrazuril 2, 5 % i. W. 230 0. 085 0. 0838 Toltrazuril 2, 5 % i. W. 238 0. 109 (+/-0. 0254) Toltrazuril 2, 5 % i. W. 243 0. 121 Toltrazuril 2, 5 % i. W. 221 0. 022 Toltrazuril 2, 5 % i. W. 229 0. 082 Positivkontrolle 14 0. 381 0. 381 (+/-0) Tabelle 4 : N. caninum-spezifische PCR und IFAT Versuchsgruppe Maus Nr. * Neospora-PCR IFAT Nicht inf. Kontrolle 242 Nicht inf. Kontrolle 228 Nicht inf. Kontrolle 240 _ Nicht inf. Kontrolle 227-- Nicht inf. Kontrolle 233 Inf. Kontrolle 239 + + Inf. Kontrolle 224 + + Inf. Kontrolle 246 + ++ Inf. Kontrolle 234 + Inf. Kontrolle 222 + + Toltrazuril 25 mg/kg 241 + Toltrazuril 25 mg/kg 225 Toltrazuril 25 mg/kg 244 Toltrazuril 25 mg/kg 220 - - Toltrazuril 25 mg/kg 231 + Toltrazuril 25 mg/kg 235 - - Toltrazuril 25 mg/kg 245 + Toltrazuril 2, 5 % i. W. 230 - - Toltrazuril 2, 5 % i. W. 238 - - Toltrazuril 2, 5 % i. W. 243 - - Toltrazuril 2, 5 % i. W. 221 - - Toltrazuril 2, 5 % i. W. 229 - - Positivkontrolle 14 + +++

* Die Nummern wurden durch Randomisieren vergeben, um eine unbeeinflusste Auswertung zu gewährleisten, daher erscheint hier keine logische Abfolge.