Triphenylphosphonium-Derivate zum gezielten Transport und Freisetzen von Substanzen in Mitochondrien sowie Verfahren zu deren Verwendung

Die Erfindung betrifft Triphenylphosphonium-Derivate sowie ihre Verwendung zur gezielten Anreicherung und Freisetzung von Substanzen in Mitochondrien, insbesondere um biologisch bzw. pharmakologisch wirksame Substanzen in die Mitochondrien einzubringen sowie dort zur Entfaltung ihrer Wirkung definiert anzureichern.

Anwendung finden diese Derivate beispielsweise bei der Induktion der Apoptose in Krebszellen (Chemotherapie), zur Steigerung der mitochondrialen Aktivität (z. B. oxidative Phosphorylierung) und damit zur Verzögerung altersassoziierter Erkrankungen, wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2.

Der Prozess des Alterns ist im gesamten Tierreich mit einem Verfall physiologischer Funktionen begleitet. Der Verlust von körperlicher Ausdauer, Fitness sowie Regenerationsfähigkeit lässt sich praktisch in allen Tierspezies feststellen und ist vermutlich auf die Beeinträchtigung des mitochondrialen Energiestoffwechsels zurückzuführen. Allgemeine Alterungsprozesse, aber auch spezifische altersassoziierte Erkrankungen, wie Krebs, Diabetes mellitus Typ 2, übergewicht/Adipositas sowie neurodegenerative Erkrankungen, stehen im engen Zusammenhang mit einer verminderten Mitochondrienaktivität.

Mitochondrien sind faden- bis kugelförmige Zellorganellen. Sie bestehen aus einer äußeren Hüllmembran und einer inneren Membran. Ihre wichtigste Funktion ist Energiegewinnung durch oxidative

Phosphorylierung bei der Zellatmung. Mitochondrien kommen verteilt im

Cytosol (Zellplasma) einer eukaryotischen Zelle vor. Ihre Größe beträgt etwa 0,5 μm bis 10 μm in der Länge. Besonders viele Mitochondrien finden sich in Zellen, die viel Energie verbrauchen (z. B. Muskelzellen,

Nervenzellen, Sinneszellen, Eizellen).

Seit Jahrzehnten kennt man aus Untersuchungen an verschiedenen Tierspezies den Zusammenhang einer erhöhten Lebenserwartung mit einer Kalorierestriktion (calorie restriction, CR). Als Ursache dieser Lebensverlängerung vermutet man eine Reduktion von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS).

Diese entstehen in der Atmungskette am Komplex I und III durch die so genannten „electron leaks", Elektronen, die sich mit Sauerstoff zu Radikalen verbinden. Sie können u. a. die mitochondriale DNA schädigen und somit einen weiteren Verlust der Mitochondrienaktivität verursachen. Die Kalorierestriktion, so die Hypothese, vermindert die Atmungsketten- Aktivität durch den Mangel an Substrat und führt so zu einer Verminderung von reaktiven Sauerstoffspezies.

Andere Modelle zeigen hingegen, dass eine Kalorierestriktion zu einer Aktivierung der Mitochondrien rührt. Dies kann durch hormonelle Faktoren, durch so genannte „uncoupling" Proteine, bzw. durch eine gesteigerte Aktivität und Effektivität der Atmungskette-Enzymkomplexe verursacht werden. In diesem Fall geht man von einer Reduktion der reaktiven Sauerstoffspezies aus.

In diesen gegensätzlichen Hypothesen stehen in beiden Fällen neben der Atmungskette und dem Krebs-Zyklus alternative Wege zur zellulären Energieproduktion im Zentrum der aktuellen Forschung.

Als Konsequenz wird zur Verminderung von reaktiven Sauerstoffspezies vor allem die Einnahme von Antioxidantien empfohlen. Antioxidantien wurden in einer Vielzahl von prospektiven Studien mit den oben genannten Krankheiten assoziiert, positive Resultate waren jedoch die Ausnahme (Halliwell, B.: Lancet 355, 2000, 1179-1180) und neuere Analysen zeigen sogar eine Reduktion der Lebenserwartung durch den übermäßigen Konsum von Antioxidantien und Supplementen (Bjelakovic, JAMA 297, 2007, 842- 57).

Aus pharmazeutischer Sicht bieten die Mitochondrien ein interessantes Ziel für Medikamente. Mitochondrien führen eine Vielzahl physiologischer Prozesse durch. Sie produzieren Adenosinrriphosphat (ATP), regulieren den intrazellulären Ca ²⁺ -Haushalt und leiten den programmierten Zelltod (Apoptose) ein. Mitochondrien benutzen ca. 90 % des aufgenommenen Sauerstoffs zur oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) bzw. ATP-Syn- these. Hierbei werden Elektronen zum Sauerstoff transportiert. Dieser Elektronentransport generiert einen Protonengradient, die treibende Kraft für die Produktion von Adenosinrriphosphat (ATP) aus Adenosindiphosphat (ADP). So entsteht eine negative Potentialdifferenz von 150-180 mV in der inneren Membran, das so genannte mitochondriale Membranpotential. Hieraus folgt, dass im Besonderen lipophile Kationen in der Lage sind, sich im Inneren der Mitochondrien anzureichern.

Die Bemühungen, biologisch wirksame Substanzen wie z. B. Antioxidantien, DNA oder Proteine in Mitochondrien einzuschleusen, werden unter dem Begriff der mitochondrialen Medizin, bzw. des mitochondrialen Targeting zusammengefasst (Weissig, V.: Expert Opin Drug Deliv 2, 2005, 89-102 oder Sheu, S. S., Nauduri, D. and Anders, M. W.: Biochim Biophys Acta 1762, 2006, 256-265). Hierbei wurden natürliche Antioxidantien kovalent an einen positiv geladenen Triphenylphosphonium(TPP)-Rest gebunden. Neben Vitamin E (MitoVit E) (Smith, R. A., Porteous, C. M., Coulter, C. V. and Murphy, M. P.: Ew J Biochem 263, 1999, 709-716) und einem Ubiquinonderivat (MitoQ) (Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteous, W. K., Ledgerwood, E. C, Smith, R. A., and Murphy, M. P.: J Biol Chem 276, 2001, 4588-4596) wurden auch nichtnatürliche Antioxidantien an den TPP- Tag gebunden, wie z. B. Ebselen (MitoPeroxidase) (Filipovska, A., Kelso, G. F., Brown, S. E., Beer, S. M., Smith, R. A., and Murphy, M. P.: J Biol Chem 280, 2005, 24113-24126), ein Glutathion-Peroxidase-Mimetikum oder der Spin-Trap MitoPBN (Murphy, M. P., Echtay, K. S., Blaikie, F. H., Asin-Cayuela, J., Cocheme, H. M., Green, K., Buckingham, J. A., Taylor, E. R., Hurrell, F., Hughes, G., Miwa, S., Cooper, C. E., Svistunenko, D. A.,

Smith, R. A. and Brand, M. D.: JBiol Chem 278, 2003 , 48534-48545), vgl. auch Abb. 1.

Es konnte eine bis zu lOOOfache Anreicherung dieser Verbindungen in den Mitochondrien erzielt werden.

In all den genannten Studien wurde die aktive Verbindung kovalent und damit dauerhaft an den Triphenylphosphonium-Tag (TPP-Tag) gebunden, was zur Folge hat, dass die Verbindungen als Antioxidanz bzw. Kofaktor wirken, jedoch nicht oder nur teilweise in ihrer natürlichen Umgebung, wie zum Beispiel im Mermembranraum (James, A. M., Cocheme, H. M., Smith, R. A., and Murphy, M. P.: JBiol Chem 280, 2005, 21295-21312). Daneben ist der Transport mitochondrialer Stoffwechselprodukte streng reguliert, und eine Anreicherung dieser Moleküle in den Mitochondrien ist kaum möglich, ohne den Gesamtorganismus zu belasten.

Darüber hinaus ist bekannt, dass bestimmte pharmakologisch interessante Wirkstoffe durch die äußere Hüllmembran in Mitochondrien diffundieren und auf diese Weise dort aufgenommen werden können (Galluzzi L. et al.: Oncogene 25, 2006, 4812-4830).

Von gravierendem Nachteil ist, dass alle diese Diffusionsprozesse "ungerichtet" verlaufen und sowohl bezüglich der Einbringung der Wirkstoffe als auch deren Freisetzung in den Mitochondrien so gut wie nicht beeinflusst werden können und somit nicht steuerbar sind.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, Substanzen, insbesondere pharmakologische Wirkstoffe, in weit größerer Vielfalt definiert in Mitochondrien zu akkumulieren und dort gezielt sowie mit hoher Spezifität und Effektivität, wie auch ohne störende Nebeneffekte dieser Wirkstoffe, freizusetzen.

Erfindungsgemäß werden zur gezielten Anreicherung und Freisetzung von Substanzen in Mitochondrien Triphenylphosphonium-Derivate gemäß der allgemeinen Formel I

vorgeschlagen, wobei P = Phosphonium-Ion n (l, 2, 3, "-) = Laufzahl der Methylengruppe R ₂ = CO-Y

R ₃ = NH-X

X = Säurefunktion und

Y = Alkohol, Amin, Thiol sind.

Solche Derivate sind beispielweise Triphenylphosphonium-Ester der Formel II

oder der Formel III

Die genannten Triphenylphosphonium-Derivate erlauben es, gebundene biologisch aktive Substanzen in die Mitochondrien einzuschleusen und über eine Aldehyd-Dehydrogenase-2 (ALDH-2)-vermittelte Spaltung wieder freizusetzen. Unter biologisch aktiven Substanzen werden Nährstoffe, Antioxidantien, Protein-Agonisten und Protein-Antagonisten verstanden. Die Nährstoffe werden unterteilt in die endogenen Metabolite des mitochondrialen Stoffwechsels wie z. B. Verbindungen des Krebs-Zyklus (alpha-Ketosäuren, Dikarbonsäuren) sowie in exogene Verbindungen, die nicht ohne Transportsystem in die Mitochondrien eindringen können, wie z. B. Oxalat und Palmitat.

Mitochondrien werden im Körper als Hauptquelle der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) angesehen, daher scheint es sinnvoll, Radikalfänger bzw. Antioxidantien dort gezielt anzureichern. Antioxidantien, wie z. B. Tocopherole oder Liponsäure, können in den Mitochondrien endogen nicht akkumuliert werden und sollen über das hier beschriebene Transportsystem in die Mitochondrien gelangen.

Triphenylphosphonium-Derivate gemäß der allgemeinen Formel I sind somit in der Lage, beliebige Moleküle in die Mitochondrien einzuschleusen. Die Verbindungen können insbesondere Vorteile für folgende Indikation bieten:

a) Verwendung bei genetischen Defekten im mitochondrialen Stoffwechsel:

Mitochondriopathien zeichnen sich dadurch aus, dass es meist zu genetischen Defekten in mitochondrialen Enzymen kommt, die zur Energiegewinnung essentiell sind. üblicherweise akkumulieren die Stoffwechselprodukte Laktat oder Pyruvat im Plasma, was zu Azidosen führt. Gleichzeitig fehlen Stoffwechselprodukte, die durch den Mangel bzw. durch verminderte Aktivität von Enzymen nicht produziert werden. Mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verbindungen können diese Stoffwechselprodukte aufgefüllt werden, was die Bereitstellung von Energie über die Mitochondrien gewährleisten kann.

b) Verwendung zur metabolischen Aktivierung der Mitochondrien:

Kofaktoren dienen zur Aurrechterhaltung der mitochondrialen Enzymaktivität. Hierzu zählen Thiamin, alpha-Liponsäure, QlO, Vitamin E und andere. Der Transport dieser Verbindungen ist jedoch streng reguliert, bzw. die Synthese erfolgt direkt in den Mitochondrein (alpha-Liponsäure, QlO). Der Einsatz der Triphenylphosphonium-Derivate gemäß der allgemeinen Formel I kann den Mangel an diesen Faktoren beheben und damit die volle Funktion dieser Enzyme gewährleisten. Zu diesen Enzymen gehören unter anderen die Pyruvatdehydrogenase (alpha-Liponsäure und Thiamin), das 2-Ketoglutaratdehydrogenasesystem (alpha-Liponsäure) sowie die Enzyme der Atmungskette (QlO).

c) Verwendung zur Induktion der Apoptose von Krebszellen:

Der programmierte Zelltod (Apoptose) hat oftmals seinen Ursprung in den Mitochondrien. Der Organismus kann so kranke oder mutierte Zellen eliminieren. In Krebszellen hingegen ist dieser Mechanismus unterbunden, so dass es zu einer gesteigerten Proliferation und letztendlich zu einem manifesten Tumor kommt. Durch den Einsatz der besagten Verbindungen können Apoptose induzierende Chemotherapeutika in die Mitochondrien eingeschleust werden und über die Generierung von reaktiven

Sauerstoffspezies die Zelle in den Zelltod treiben. Durch die Kopplung an den Triphenylphosphonium-Anker ist es möglich, Chemotherapeutika in

einer deutlich verminderten Konzentration zu verabreichen und den Organismus dadurch weniger zu stressen.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert werden.

In der Zeichnung zeigen:

Abb. 1: Dünnschichtchromatographische Aufnahme der Inkubation von Mitochondrien mit einem Triphenylphosphonium-Ester der Formel II bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (vgl. Ausführangsbeispiel 3)

Abb. 2: Dünnschichtchromatographische Aufnahme der Inkubation von Mitochondrien mit einem Triphenylphosphonium-Ester der Formel II sowie Benomyl bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (vgl. ebenfalls Ausfuhrungsbeispiel 3)

Ausfuhrungsbeispiel 1 :

Herstellung von Triphenylphosphonium-Ester der Formel II

Der Triphenylphosphonium-Ester wird nach folgendem allgemeinen Reaktionsschema A hergestellt:

Reaktionsschema A

Verbindungen der allgemeinen Formel V, in welcher X jeweils unabhängig voneinander Chlor oder Brom ist, sind kommerziell erhältlich (n = 1, X = Chlor) oder werden gemäß Schritt 1 des vorstehenden Reaktionsschemas A (siehe auch Schmidt, U. et al.: Aαgew. Chem. 96, 1984, 310-311) aus der Verbindung der Allgemeinen Formel IV mit vorzugsweise einem äquivalent eines zyklischen Ethers (z. B. Oxetan; n = 2, Tetrahydrofuran; n = 3) umgesetzt, um das Phosphoniumsalz zu erhalten. Die Reaktion wird in einem aromatischen Lösungsmittel, wie z. B. Toluol, Xylol oder Benzol, vorzugsweise Toluol (bei einer Temperatur zwischen ca. 80 ⁰ C und ca. 140 ⁰ C), durchgerührt.

In einem zweiten Schritt des Reaktionsschemas A wird die Verbindung der Formel V bei Raumtemperatur in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril (CH3CN), Dimthylsulfoxid (DMSO) oder N ₅ N- Dimethylformamid (DMF), gelöst, mit Carbonsäure versetzt und in Gegenwart von 1,5 äquivalenten einer Base, wie beispielsweise Triethylamin, Diisopropyl-ethylamin (DIPEA) oder Dimethyl-aminopyridin (DMAP), vorzugsweise DMAP und 1,2 äquivalenten eines Kondensationsreagenz, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 18 bis 24 Stunden gerührt.

Der Ausdruck "Carbonsäure", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine natürlich oder nichtnatürlich vorkommende aliphatische oder aromatische

organische Säure, wie z. B. alpha-Liponsäure, Palmitinsäure, 5- Aminolävulinsäure, Lonidamine, Triiodthyronin, Thyroxin, Benzoesäure, Acetylsalicylsäure und andere.

Ausführungsbeispiel 2:

Herstellung von Triphenylphosphonium-Ester der Formel III

Der Triphenylphosphonium-Ester wird nach folgendem allgemeinen Reaktionsschema B hergestellt:

Reaktionsschema B

Schritt 2

Eine Verbindung der allgemeinen Formel VIII, in welcher X jeweils unabhängig voneinander Chlor oder Brom ist, wird in einem ersten Schritt aus einer Verbindung der allgemeinen Formel VII mit vorzugsweise einem äquivalent einer omega-bromierten Carbonsäure (z. B. 3- Bromopropionsäure; n = 1, 4-Bromobuttersäure; n = 2) umgesetzt, um das

Phosphoniumsalz zu erhalten (siehe auch JP 2002338587). Die Reaktion wird in einem aromatischen Lösungsmittel, wie z. B. Toluol, Xylol oder Benzol, vorzugsweise Toluol (bei einer Temperatur zwischen ca. 80 ⁰ C und ca. 140 ⁰ C), durchgeführt.

In einem zweiten Schritt des Reaktionsschemas B wird die Verbindung der Formel VIII bei Raumtemperatur in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril (CH3CN), Dimthylsulfoxid (DMSO) oder NjN-Dimethylformamid (DMF), gelöst, mit Alkohol (Thiol/Amin) versetzt und in Gegenwart von 1,5 äquivalenten einer Base, wie z. B. Triethylamin, Diisopropyl-ethylamin (DIPEA) oder Dimethyl-aminopyridin (DMAP), vorzugsweise DMAP und 1,2 äquivalenten eines Kondensationsreagenz, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), 18 bis 24 Stunden gerührt. Der Ausdruck "Alkohol (Thiol/Amin)", wie er hier verwendet wird, bezeichnet natürlich oder nichtnatürlich vorkommende aliphatische oder aromatische organische Alkohole, Thiole oder Amine, wie beispielsweise alpha-Tocopherol, Tocotrienol, und andere.

Ausrührungsbeispiel 3 :

Gezielte Freisetzung von biologisch aktiven Substanzen mittels mitochondrialer Enzymsysteme am Beispiel des Triphenylphosphonium- Esters der Formel II

Zur Demonstration der Wirkungsweise wurden Mitochondrien isoliert, indem frische Schweineleber klein geschnitten und in einem 15 ml Dounce-

Potter zerkleinert wurde. Nachdem die Stücke homogenisiert worden sind, wurde 10 min. zentrifugiert, und der überstand verworfen. Das Pellet (Mitochondrien-Fraktion) wurde mit 5 ml (2x2.5 ml) Puffer suspendiert, aliquotiert und für die Versuche verwendet.

Der Triphenylphosphonium-Ester gemäß Formel II wurde als Stocklösungen (ca. 10 mM) vorzugsweise in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. In je einem 1 ml Probengefäß wurden 200 μl Succrose Puffer vorgelegt und je 10 μl isolierte Mitochondrien hinzugegeben. 10 μl der Stocklösung wurden dazu pipettiert und im Thermoschüttler bei 37 C für 1, 5, 10, 15, 20, 30 und 60 Minuten inkubiert.

Nach der entsprechenden Zeit wurden jeweils 90 μl CR ₃ CUMeOH dazugeben, 30 Sekunden geschüttelt und 1 Minute bei 10 000 U/min zentrifugiert. Die obere Phase wurde abpipettiert und verworfen. Ein Aliquot der organischen Phase ist auf eine Dünnschichtfolie aufgetüpfelt und mit CH ₃ ClZMeOH entwickelt. Die Folie wurde getrocknet und mit Jod- Dampf angefärbt sowie digital gespeichert.

Abb. 1 zeigt als dünnschichtchromatographische Aufnahme die Umsetzung des Substrats (Verbindung der Formel II) durch mitochondriale Enzyme.

Die Inkubation der Mitochondrien mit dem Triphenylphosphonium-Ester der Formel II ist zu unterschiedlichen Zeiten (in Minuten) dargestellt (Kl = Positiv-Kontrolle, K2 = Negativ-Kontrolle, -OH

Triphenylphosphoniumbutanol mit organischer Phase). Nach 60 Minuten ist das Substrat vollständig umgesetzt.

Der Ursprung der mitochondrialen Esteraseaktivität konnte durch die Wiederholung des Versuchs mit gleichzeitiger Inkubation mit Benomyl (10 μM) geklärt werden. Benomyl ist ein selektiver Inhibitor der ALDH-2. Abb. 2 zeigt diese Inkubation (und vergleichsweise zu Abb.l) ebenfalls als dünnschichtchromatographische Aufnahme wiederum in Darstellung zu

unterschiedlichen Zeiten (Kl=Positiv-Kontrolle, K2=Negativ-Kontrolle, - OH=Triphenylphosphoniumbutanol mit organischer Phase).

Aus Abb. 2 ist ersichtlich, dass hier der Triphenylphosphonium-Ester der Formel II nicht umgesetzt wurde, was in diesem Fall auf eine Inhibierung des Enzyms schließen lässt.