Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области органической химии и может найти применение в аналитической химии, биоорганической химии, биохимии и прикладной медицине.

Уровень техники

Сакситоксин (Thе Меrск Iпdех, 11 еd., Вudаvаri, S.; O ¹ MeI, M. J.; Smith, А.; Несkеlmашп, P. E., Еds., Меrсk & Со.: Rаhwау, 1989, соmроuпd по. 8344, р. 1330.), циклическая система которого характерна для целого семейства гуанидиновых биотоксинов, был впервые выделен в достаточно чистом виде из моллюска Sахidоmиs gigапtеиs (E. J. Sсhапtz, J. D. MoId, D. W. Stапgеr, J. Shаvеl, F. J. Riеl, J. P. Воwdеп, J. M. Lупсh, R. Sаvаgе Wуlеr, В. Riеgеl, H. Sоmmеr «Paralytic Shеllfish Роisоп. VI. А Рrосеdurе fоr thе Isоlаtiоп апd Рurifiсаtiоп оf thе Роisоп frоm Тохiс Сlаm апd Мussеl Tissues», опубликованной в J. Am. Сhеm. Sос. Vol.79 N.19 (1957) P. 5230-5235). Предположения о структуре сакситоксина были высказаны в работе W. Sсhuеtt, H. Rаророrt «Saxitoxin, thе Раrаlуtiс Shеllfish Роisоп. Dеgrаdаtiоп tо а Pyrrolopyrimidiпe» в J. Am. Сhеm. Sос. Vol.84 N.l 1 (1962) P. 2266- 2267. Структура данного соединения, установленная позднее, была приведена в статье E. J. Sсhапtz, V. E. Ghаzаrоssiап, H. К. Sсhпоеs, F. M. Strопg, J. P. Sрriпgеr, J. О. Реzzапitе, J. Сlаrdу «Structure оf saxitoxin» в J. Am. Сhеm. Sос. VoI. 97 N.5 (1975) P. 1238-1239.

В морской воде сакситаксин в опасных концентрациях выделяется различными динофлагеллятами (Diпорhуtа) - микроскопическими водорослями, скопления которых обуславливают так называемые «кpacныe пpиливы». Дальнейшее поглощение и накопление токсина в организмах промысловых моллюсков, ракообразных и рыб создает серьезную угрозу смертельно опасных отравлений среди потребителей данной продукции не только в США, но и в Японии и Европе. В пресной воде сакситаксин может образовываться и выделяться некоторыми сине-зелеными водорослями и, возможно, цианобактериями, что также может угрожать благополучию жителей регионов, потребляющих такую воду.

В настоящее время идентифицированы 12 основных токсинов ряда сакситоксина, структура и общепринятые сокращенные обозначения которых приведены ниже

R1 R2 RЗ R4

C2

Сакситоксин и его аналоги являются сильнейшими токсинами, ингибирующими ряд жизненно-важных процессов в организме животных. Прежде всего стало известно, что сакситоксин ингибирует транспорт натрия, в основном, через потенциалзависимые натриевые каналы, что было показано в ранних исследованиях (G. S. Wibеrg, N. R. Stерhепsоп. Тохiсоl. Аррl. Рhаrmасоl. VoI. 2. (1960) P. 607) и использовано позднее (см., например G. Striсhаrtz. J. Gеп. Рhуsiоl., VoI. 84. (1984) P. 281-305). Поскольку натриевые каналы играют важную роль в возникновении и развитии серьезных нейродегенеративных и сердечнососудистых заболеваний, изучение их функционирования представляет собой путь к пониманию патогенеза и созданию новых эффективных лекарств. Одним из методов исследования является анализ связывания радиоактивного лиганда с соответствующими рецепторами. Данный метод, по сравнению с хорошо зарекомендовавшим себя биологическим методом исследования (на мышах), имеет преимущества более высокой чувствительности (на 2-3 порядка) и производительности. С конца 1970-х годов метод весьма широко применяется для исследований свойств натриевых каналов, присутствующих в различных органах и тканях млекопитающих (см., например статью E. Мосzуdlоwski, В. M. Оlivеrа, W. R. Grау, G. R. Striсhаrtz «Discrimination оf тusсlе апd пеurопаl Nа-сhаппеl subtуреs bу biпdiпg сотреtitiоп bеtwееп [ ³ H]saxitoxin апd mu-coпotoxiпs», опубликованную в Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA VoI. 83 N. 14 (1986) P. 5321-5325). Однако существенным препятствием для его более широкого распространения является отсутствие водорастворимой формы меченого сакситоксина или его аналога с достаточным и стабильным в водной

среде уровнем радиоактивности (доклад «The Rесерtоr Вiпdiпg Аssау fоr thе Sахitохiпs: Imроrtапсе, Imреdimепts апd Solutions», представленный S. HaIl на конференции Wоrkshор on thе Usе оf Rесерtоr Вiпdiпg Аssау (RBA), 1-5 сентября 2003).

Из уровня техники известен водорастворимый дигидрохлорид сакситоксина формулы (I)

(I) Одними из первых метод введения тритиевой метки в молекулу сакситоксина изотопным обменом с тритиевой водой предложили J. M. Ritсhiе, R. В. Rоgаrt и G. R. Striсhаrtz («A пеw mеtlюd fоr lаbеlliпg sахitохiп апd its biпdiпg tо поп-mуеliпаtеd fibrеs оf thе rаbbit vаgus, lоbstеr wаlkiпg lеg, апd gаrfish оlfасtоrу пerves». J. Рhуsiоl. VoI. 261. Issuе 2. (1976) P. 477-494). Данный метод позволяет получать сакситоксин, меченный исключительно по положению 11. Однако данная метка является нестабильной вследствие обмена атома водорода в данном положении с водой как в период хранения, так и в условиях опыта. Продукт с уровнем радиоактивности 39 Kи/ммoль, выпускаемый фирмой Аmеrshаm и содержащий меченный тритием сакситоксин, также является нестабильными при хранении. Поэтому существует потребность в устойчивом меченном водорастворимом производном сакситоксина, которая до сих пор не удовлетворена. Для применения в анализах связывания рецептора требуется меченный тритием сакситоксин со степенью радиохимической чистоты более 95%.

Предпосылки создания изобретения Известны разные способы введения трития в органические соединения, среди которых предпочтительными являются изотопный обмен, гидрирование (в том числе селективное) и гидродегалогенирование. При этом реакции обмена с участием газообразного трития наиболее предпочтительны для получения

меченных тритием насыщенных и ароматических соединений. Обзор способов введения трития приведен, в частности, в публикации V.Р.Shеvсhепkо, I.Yu.Nаgаеv, N.F.Муаsоеdоv «Lipophilic соmроuпds lаbеllеd with tritium (Сhарtеr 3)» Моsсоw. Nаukа. 2003.

Твердофазный изотопный обмен является наиболее предпочтительным методом введения тритиевой метки в сакситоксин, так как не требует синтеза специальных предшественников. Однако для введения трития в это соединение необходимо подобрать условия, при которых сакситоксин не разрушается. Кроме того, из уровня техники известно, что в реакциях гидрирования тритием на палладиевых гетерогенных катализаторах кривые «выxoд радиоактивного пpoдyктa-тeмпepaтypa» при фиксированном времени пребывания и «выxoд радиоактивного продукта-время пребывания)) при фиксированной температуре проходят через максимум (H. W. Сооk, W. E. M. Lапds. Сап. J. Вiосhеm., VoI. 53 (1975) P.1220). Поэтому важной задачей является также оптимизация условий процесса для достижения выхода продукта, близкого к максимальному. Принимая во внимание вышеперечисленные обстоятельства и проведя систематические исследования, авторы настоящего изобретения разработали способ введения трития в молекулу сакситоксина для получения стабильно- меченого продукта и синтезировали меченный тритием сакситоксин, удовлетворяющий указанным ранее требованиям.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к меченному тритием дигидрохлориду сакситоксина формулы (I)

(I), имеющему радиоактивность 15-31 Ки/ммоль.

Изобретение также предоставляет новый способ введения трития в молекулу сакситоксина изотопным обменом, включающий в себя следующие

стадии:

(a) загрузку твердой фазы, полученной объединением источника сакситаксина с катализатором, содержащим металл 10 группы Периодической системы элементов, в соотношении кaтaлизaтop:иcтoчник сакситаксина от 100 до 200 в реактор, вакуумирование реактора до остаточного давления от 0,05 Па до 0,5 Па и введение в реактор источника газообразного трития до достижения начального давления в интервале 200-500 гПа;

(b) нагревание реакционной смеси со стадии (d) в реакторе до температурs от 100 до 18O ⁰ C и проведение реакции при указанной температуре в течение периода времени от 5 минут до 30 минут;

(c) выделение из реакционной смеси продукта, содержащего [ ³ H]caкcитoкcин, и очистку выделенного продукта.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к стабильно меченному тритием сакситоксину или к его водорастворимой соли, такой как дигидрохлорид. Авторами изобретения был изготовлен препарат меченного тритием сакситоксина с молярной радиоактивностью 15-31 Ки/ммоль и радиохимической чистотой более 97%. Полученный меченый сакситоксин прошел тестирование в рамках программы NOAA Маriпе Вiоtохiпs в США и Чили. Исследования показали, что меченый препарат удовлетворяет требованиям, предъявляемыми к радиоактивным реагентам для анализов связывания рецептора, в частности он имеет очень низкое неспецифическое связывание. В результате он был рекомендован Nаtiопаl Осеап Sеrviсе, Charleston (USA), Центром безопасности продуктов питания при US FDA и Международным Агентством по атомной энергии (IAEA) для анализа сакситоксина в морепродуктах. Созданный препарат также может найти применение в качестве меченого аналитического реагента для изучения свойств подтипов натриевых каналов, присутствующих в тканях различных органов человека и других животных, взамен существующих меченых реагентов, отличающихся нестабильностью. Радиоактивность продукта составляет 15-20 Ки/моль, предпочтительно радиоактивность продукта составляет 25-31 Ки/моль. Радиохимическая чистота продукта превышает 95%, предпочтительно радиохимическая чистота продукта превышает 97%.

В соответствии со способом получения меченного тритием сакситоксина, предоставляемым настоящим изобретением, сакситоксин следует вводить в реакцию изотопного обмена в форме свободного основания или в форме его соли с кислотой. Для осуществления реакции используют источник газообразного трития и гетерогенный катализатор, содержащий переходный металл 10 группы Периодической системы элементов в редакции, рекомендованной IUPAC в 1989 году. Так как молекулы сакситоксина имеют не только легко протонируемые атомы азота и кислорода, но и два положительно заряженных фрагмента, взаимодействие молекул сакситоксина с тритием в данных условиях будет протекать преимущественно вблизи кетогруппы соединения, что повышает устойчивость получаемого токсина.

В качестве источника сакситоксина может быть использован любой продукт, обогащенный в достаточной мере сакситоксином или его солью. В качестве соли предпочтительна соль, образованная с неорганической кислотой, такой как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, хлорная кислота и другие приемлемые кислоты. Однако может быть использована соль, образованная с органической кислотой, при условии, что атомы водорода органической кислоты подвергаются твердофазному каталитическому изотопному обмену с тритием в существенно меньшей степени, чем сакситоксин. Такой органической кислотой может быть бензолсульфоновая кислота, и-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота и другие приемлемые кислоты. Наиболее предпочтительны неорганические кислоты, в частности, галогеноводородные кислоты.

Наиболее предпочтительно использовать обогащенный сакситоксином продукт, содержащий свободное основание сакситоксина или его дигидрохлорид. Содержание сакситоксина в источнике сакситоксина в пересчете на свободное основание составляет 85% (масс.) или более, пpeдпoчтитeльнo-90% (масс.) и наиболее пpeдпoчтитeльнo-95% (масс.) или более.

Источником газообразного трития для проведения реакции в соответствии с данным изобретением является любой подходящий газ, в достаточной мере обогащенный тритием, при условии, что балластные компоненты данного газа не оказывают нежелательного воздействия на активность катализатора, в частности,

не являются известными каталитическими ядами для катализаторов на основе переходных металлов. Предпочтительно источником трития является молекулярный водород, обогащенный тритием. Более предпочтительно источником трития является молекулярный водород, высокообогащенный тритием. Наиболее предпочтителен молекулярный тритий высокой степени чистоты.

Предпочтительным гетерогенным катализатором для реакции изотопного обмена, содержащим переходный металл 10 группы Периодической системы элементов, является палладиевый катализатор. Более предпочтительно палладиевый катализатор представляет собой катализатор, содержащий металлический палладий, нанесенный на подложку из стойкого к внешним воздействиям материала, такого как активированный уголь и углеродные волокна, карбонат кальция, сульфат бария, кизельгур, цеолиты и другие известные специалисту в данной области подложки. Еще более предпочтительно такой катализатор представляет собой Pd/BaSO ₄ , содержащий 3-15% (масс.) палладия. Наиболее предпочтительно использовать в указанной реакции восстановленный катализатор Pd/BaSO ₄ с содержанием палладия около 5% (масс).

Реакцию изотопного обмена можно проводить при различных значениях температуры и начального давления трития в реакционной системе. Температуру в ходе реакции предпочтительно поддерживать в интервале 100-180°C, более предпочтительна температура в интервале 100-160°C. Реакцию можно проводить при пониженном начальном давлении газообразного трития или при давлении, близком к атмосферному. В частности, по соображениям себестоимости продукта и безопасности проведения реакции, предпочтительно пониженное начальное давление газообразного трития. Более предпочтительно начальное давление газообразного трития в интервале 200-500 гПа. Наиболее предпочтительно начальное давление около 333 гПа.

Предпочтительно приводить реакцию изотопного обмена в двухфазной системе «гaз-твepдoe вeщecтвo», при этом более предпочтительно, чтобы источник сакситоксина представлял собой твердую фазу совместно с катализатором. Наиболее предпочтительно, когда источник сакситоксина

объединен с катализатором методом пропитки катализатора и испарения растворителя. Для пропитки источник сакситоксина необходимо растворить в растворителе, для чего следует использовать преимущественно спиртовый растворитель. Предпочтительным спиртовым растворителем является низший алифатический спирт или смесь таких спиртов, например этанол, метанол и их смеси. Наиболее предпочтителен метанол. Испарение растворителя проводят предпочтительно при пониженном давлении, например на роторном испарителе. Полученный в результате твердый остаток, содержащий катализатор, объединенный с источником сакситоксина, предпочтительно подвергают лиофилизации перед тем, как вводить его в реакцию изотопного обмена.

Реакцию предпочтительно проводят в герметизированном реакторе при заданном начальном давлении трития и соотношении кaтaлизaтop:иcтoчник сакситоксина. В лабораторных масштабах реактором предпочтительно является запаиваемая ампула, в которую помещают источник сакситаксина, объединенный с катализатором, и источник газообразного трития. Наиболее предпочтительно сначала загружать в ампулу катализатор, объединенный с источником сакситаксина, а перед заполнением ампулы газообразным тритием и запаиванием проводить операцию вакуумирования ампулы. Остаточное давление в ампуле после ее вакуумирования может составлять от 0,05 Па до 0,5 Па. Предпочтительно остаточное давление составляет от 0,05 Па до 0,2 Па. Наиболее предпочтительно остаточное давление составляет около 0,1 Па. Диапазоны начальных значений давления трития были рассмотрены выше.

Что касается соотношений катализатор :иcтoчник сакситоксина, реакция изотопного обмена может быть проведена при соотношении катализатор :иcтoчник сакситоксина от 100 до 200. Предпочтительным является соотношение от 100 до 150, а наиболее предпочтительным - около 100.

Продолжительность реакции зависит от многих факторов, среди которых, в первую очередь, следует упомянуть начальное давление трития, температуру в реакционной системе и активность катализатора. Специалист в данной области, ознакомленный с описанием настоящего изобретения, путем рутинного экспериментирования в объеме своей квалификации способен определить время окончания реакции. В качестве руководства авторы настоящего изобретения

сообщают, что для протекания реакции с достижением приемлемой степени превращения обычно требуется время от 5 минут до 30 минут. Предпочтительное время составляет от 5 до 20 минут, а наиболее предпочтительное время составляет от 5 до 15 минут. Для выделения из реакционной смеси продукта, содержащего

[ ³ H]caкcитoкcин, предпочтительно использование хроматографии, предпочтительно использование жидкостной хроматографии. Более предпочтительно использование высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) с изократическим элюированием первым элюентом. Состав элюента, в первую очередь, зависит от типа и свойств неподвижной фазы и может быть определен и оптимизирован специалистом в данной области, ознакомленным с описанием настоящего изобретения, путем рутинного экспериментирования в объеме своей квалификации. В руководства авторы настоящего изобретения сообщают, что элюент может быть приготовлен на основе стандартных буферных растворов с добавлением незначительных количеств алифатических спиртов и других общепринятых компонентов, например на основе 50 мМ стандартного буфера (рН 2,8) с добавлением 1% изо- пропанола. Перед хроматографическим разделением ОФ-ВЭЖХ предпочтительно проводить предварительную фильтрацию реакционной смеси через короткую колонку, содержащую модифицированный силикагель.

Для очистки реакционной массы с целью получения продукта, обладающего достаточной степенью радиохимической чистоты предпочтительно использование высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) с изократическим элюированием вторым элюентом. Состав второго элюента, предпочтительно, отличается от состава первого элюента. Он может быть определен и оптимизирован специалистом в данной области, ознакомленным с описанием настоящего изобретения, путем рутинного экспериментирования в объеме своей квалификации. В руководства авторы настоящего изобретения сообщают, что элюент может быть приготовлен на основе стандартных буферных растворов с добавлением незначительных количеств алифатических спиртов и других общепринятых компонентов, например на основе буфера 15 мМ NH ₄ OAc (рН 5) с добавлением 1% изо-

пропанола.

В том случае, если в реакцию изотопного обмена вводили сакситоксин в виде основания, для получения водорастворимой формы сакситоксина следует дополнительно проводить реакцию полученного продукта с подходящей неорганической кислотой, предпочтительно - с галогеноводородной кислотой, и наиболее предпочтительно - с хлористоводородной кислотой. Для этого может быть использован раствор требуемой кислоты в подходящем растворителе, содержащий соответствующее количество кислоты. Например, соотношение одноосновная киcлoтa:oчищeнный меченый сакситоксин может составлять 2 моль кислоты/моль основания сакситоксина. В случае кислоты большей основности кислоты пересчет очевиден среднему специалисту в данной области. Получение требуемой соли можно проводить, смешивая продукт реакции изотопного обмена, содержащий определенное анализом количество целевого соединения, с соответствующим количеством кислоты, взятой в виде раствора в подходящем растворителе. Подходящими растворителями являются, например, вода, низшие алифатические спирты и любые их смеси.

Альтернативно, если кислота является летучей, можно применять избыток раствора такой кислоты с последующим умеренным нагреванием реакционной смеси, предпочтительно при пониженном давлении, для удаления избытка летучей кислоты, не вступившей в реакцию. Предпочтительна летучая хлористоводородная кислота. Альтернативно, если требуется соль с органической кислотой, например, для улучшения доставки в живой организм или культуру клеток, такая соль органической кислотой может быть образована, например, с аспарагиновой кислотой, аргининовой кислотой, аскорбиновой кислотой и другими приемлемыми кислотами с использованием методик, хорошо известных специалисту в данной области.

В наиболее предпочтительных вариантах изобретения для получения меченого сакситоксина использовали предварительно восстановленный, диспергированный 5% PoVBaSO ₄ при соотношениях катализатор-токсин от 100 до 200, при температурах от 100 до 16O ⁰ C, реакцию проводили от 5 до 15 мин.

Краткое описание чертежей На фигуре 1 изображена кривая насыщения для определения параметра

связывания KD.

На фигуре 2 изображена сигмоидная кривая «дoзa-oтвeт» для определения параметров связывания - коэффициента Хилла и IC ₅₀ .

Далее изобретение будет далее пояснено со ссылкой на примеры, приведенные исключительно в иллюстративных целях. Поэтому данные примеры реализации изобретения не следует рассматривать в качестве ограничений объема изобретения, определенного формулой изобретения, изложенной далее.

Пример 1

Получение очищенного препарата меченного тритием сакситаксина Раствор 0,5 мг дигидрохлорида сакситоксина в 0,05 мл метанола добавляли к 50 мг 5% (масс.) Pd/BaSO ₄ . Метанол удаляли выпариванием на роторном испарителе и твердый остаток лиофилизировали. Катализатор с нанесенным на него веществом переносили в реакционную ампулу. Затем ампулу вакуумировали до достижения остаточного давления 0,1 Па, заполняли газообразным тритием до достижения давления 333 гПа и выдерживали при температуре 100°C в течение 15 мин. Избыток газообразного трития затем удаляли вакуумированием. Вещество с катализатора экстрагировали метанолом

(5 x 2 мл) и отделяли фильтрованием через слой LiСhrоSоrb C18, 30-40μm.

Лабильный тритий удаляли, несколько раз растворяя вещество в метаноле (5 x 2 мл) и выпаривая последний.

Препаративную очистку меченого препарата проводили методом ВЭЖХ на колонке Zоrbах SB-AQ Cl 8, 4,6 х 150 мм с использованием 1% изо-пропанола в 50 мМ стандартном буфере (рН 2,8) +2 мМ PSNa; через 9 мин - промывка 1 мл метанола. Время удерживания сакситоксина - 3,19 мин. Повторную ВЭЖХ проводили в системе 15 мМ NH ₄ OAc (pH 5) + 1% изо-пропанол + 2 мM гексансульфоната.

Выход меченого препарата: 60-70%, молярная радиоактивность: 15-20 Ки/ммоль, радиохимическая чистота: 98-99%.

Пример 2 Получение меченного тритием сакситоксина при высокой температуре

Раствор 0,5 мг дигидрохлорида сакситоксина в 0,05 мл метанола добавляли к 100 мг 5% Pd/BaSO ₄ . Метанол удаляли выпариванием на роторном

испарителе и твердый остаток лиофилизировали. Катализатор с нанесенным на него веществом переносили в реакционную ампулу. Затем ампулу вакуумировали до достижения остаточного давления 0,1 Па, заполняли газообразным тритием до достижения давления 333 гПа и выдерживали при температуре 160°C, 5 мин. Избыток газообразного трития удаляли вакуумированием. Вещество с катализатора экстрагировали метанолом (5 x 2 мл) и отделяли фильтрованием через слой LiСhrоSоrb Cl 8, 30-40μm. Лабильный тритий удаляли, несколько раз растворяя вещество в метаноле (5 x 2 мл) и выпаривая последний. Выход меченого препарата: 6-9%, молярная радиоактивность: 25-31 Ки/ммоль, радиохимическая чистота: 98-99%.

Пример 3 Анализ связывания рецептора с использованием полученного [ ³ H]caкcитoкcинa

В анализе использовали препарат, содержащий [ ³ H]caкcитoкcин ( H STX), который имеет удельную активность 20 Ки/ммоль при концентрации 0,1 мКи/мл и радиохимическую степень чистоты более 97% по стандартному анализу ВЭЖХ, определенные в рамках программы NOAA Маriпе Вiоtохiпs.

В соответствии с протоколом анализа с рецептором PSP из кривой насыщения связывания было определено значение K _D , равное 2,0 нМ, что согласуется с литературными данными и результатами, полученными для предшествующих образцов [ЗH]caкcитoкcинa. Неспецифическое связывание было крайне низким (Фиг. 1).

В опыте на микропланшетах, проведенном в соответствии с протоколом исследований, утвержденным IАЕА/NОАА/FDА Тесhпоlоgу Тrапsfеr Рrоjесt, получили кривую конкурентного связывания, проводя подсчет с помощью сцинтилляционного счетчика Wаllас Мiсrоbеtа (Фиг. 2). Из полученных данных методами регрессионного анализа определен коэффициент Хилла, равный -0,9, а также величина IC ₅₀ 5,4 нМ. Для образца контроля качества QC (номинальное значение IC _5O 3,0 нМ), исследованного в тех же условиях, из аналогичной кривой определено значение IC _5O , равное 3,11 нМ. Результаты исследований убедительно показывают, что препарат, полученный в соответствии с настоящим изобретением, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к таким реагентам (коэффициент Хилла |0,8-l,2|; QC 3,0 ± 20%).