本发明涉及融合蛋白，具体地，本发明涉及促 激素融合蛋白及其制 备方法和用途。 背景技术

促激素包括促甲状腺激素 ( thyroid stimulating hormone, TSH ) 、 促肾上腺皮盾激素和促性腺激素。 促性腺激素（ gonadotropins )是调节 脊推动物性腺发育， 促进性激素生成和分泌的糖蛋白激素， 如垂体前叶 分泌的促黄体生成激素 （luteotropic hormone , LH ) 和促卵泡激素 ( Follicle StimuLating Hormone, FSH ) ， 两者协同作用， 刺激卵巢或 睾丸中生殖细胞的发育及性激素的生成和分泌 ； 人胎盘分泌的绒毛膜促 性腺激素 ( HCG ) ， 可促进 « ^黄体分泌孕酮。

促性腺激素 ( LH, FSH, HCG )与促甲状腺激素共同组成糖蛋 白家族， 都由 α亚基和 β亚基所组成， α亚 jf目同， 而 β亚基具有激 素各自的特异性， 是激素生物活性和免疫活性的决定因素。

临床上， FSH用于在辅助生殖技术中， 如体外受精（IVF )、 配 子输卵管内移植（GIFT )及合子输卵管内移植（ZIFT ) 患者的超排 卵。 另外， 还用于女性无排卵患者： 包括对克罗米 无反应的多囊卵 巢综合征患者，以及脑下垂体性腺功能低下的 男性； LH通常用于 FSH 的辅助治疗； hCG主要用于促排卵， 促黄体发育。 在男性可促使睾丸 间质细胞分泌睾酮， 可用以检验睾丸间质细胞功能， 与促性素联合长 期应用， 有生精作用； TSH常和 I ¹³¹ 联合使用， 用于甲状腺癌患者术 后残留癌组织的抑制和消融。

通常， 为了获得治疗效果需要长期治疗， 每天肌肉注射或皮下注 射的给药方案经常伴有局部反应和不适。 因此开发长效促性腺激素和 促甲状腺激素， 减少给药频率具有实际临床应用价值。

例如， FSH 可以从脑垂体或绝经后妇女尿液中分离得到 （EP 322,438 )，也可以重组生产（ US 5,639,640、 US 5,156,957、 US 4,923,805、 US 4,840,896、 EP 211,894 )。 为了获得治疗效果， 刺激女性卵泡发生需 要连续 8-10天， 有时高达 21天， 而对于低促性腺激素的男性， 诱导精 子发生需要高达 18个月。近年材多篇专利 5L L章报道开发长效 FSH, 基本思路是通过增加 FSH的糖基化位点来达到提高半衰期的目的。 一 种是在 FSH分子内部增加糖基化 位点。 WO 01/58493公开了可以 在 FSH的 a亚羞 J£行的 77种突变和可以在 FSH的 b亚基进行的 51种 突变。 只是该专利没有公开通过定点突变而引入糖基 化位点的任何 FSHa或 b亚基的生产或测定情况。 US 7,740,862公开了在 FSH a-亚基 的 *<¾ ^酸 ¾ ^第 3和 4位之间插入 GNFT或 GNRT序列， 在大鼠体内 半衰期约为 17h，体外刺激重组表达 FSH受体的 CHO细胞产生环磷酸 腺苷（cAMP)的能力与天然 FSH相当。 另外一种是在序列末端添加额 外序列来增加糖基化修饰位点。 目前开发比较成功的是 2010年由德国 默克公司上市的 donva, 该类似物具有天然 FSH的生物活性， 但却具 有较长的循环半衰期， 在人体内的半衰期约 69h。 蛋白具体序列在专利 US 5,338,835和 US 5,585,345中公开， 是一种改造的 FSH b-亚基， 其 C-末端谷氨酸以 hCG 的^^末端肽 ( CTP )基团延长。 根据 Pieter Verbost 等人的实验结果： 该类似物在大鼠和狗体内的半衰期分别为 17.3, 46.9h, 比重组 FSH提高了 1.5-2倍。 Signe Perlman等人报道一 种改造的 FSH a-亚基，其 N-末端添加" ANITVNITV"氨基酸序列。该类 似物在大鼠体内半衰期为 22h， 比重组 FSH提高了 3-4倍。

IgG类免疫球蛋白为人体血液中最丰富的蛋白之 一， 半衰期达到 21 d,其稳定性是由于 IgG 的 Fc片段可与新生 Fc受体 (FcRn)结合，避 免 IgG 溶 中被降解（5-7 )。 因此， IgG的 Fc片段被用来与活 性蛋白连接构成融合蛋白， 以提高活性蛋白的体内半衰期， 达到长效的 目的。 根据铰链区的长短及 Fc片段 列的不同， 人 IgG分为 4 个亚型， 其中 IgG Fcy2具有较低的诱导细胞毒性作用， 而 IgG Fcyl最 强。 IgG融合蛋白的构建方式大多是将 IgG的 Fc(Hinge-CH2-CH3)片段 或 CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的 N端与活性蛋白的 C端相连， 以 避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造 成的影响。 此外， IgG的 融合蛋白可以通过 ProtdnA亲和层析得到高效便捷的纯化。 因此已有 多篇专利报道将 IgG Fc片段与其他蛋白融合可显著延长目的蛋白的� �� 衰期， 提高体内生物活性 （US 5,155,027， 5,428,130， 5,480,981 和 5,808,029 )

专利 US 20050,186,662公布了通过构建 FSH-Fc融合蛋白同二聚体、 异二聚体，在大鼠体内半衰期提高至 60h。 活性实验： 大鼠单次给药后， 72小时后测定卵巢重量， 结果显示 FSH-Fc融合蛋白相比重组 FSH卵 巢重量增加，从 14.3mg提高至 26.9mg， 阴性对照为 12.1mg。重组 FSH 半衰期很短， 通常需要每天给药， 如果按照该实验方案三天给药一次， FSH基本已经代谢完毕， 没有活性。 所以构建的 FSH-Fc融合蛋白在保 证半衰期的前提下， 活性还有待于提高。

因此， 临床上需要一种产品， 能够提供促性腺激素或促甲状腺激素 的全部治疗相关的效果， 可以比现有的促性腺激素或促甲状腺激素产品 更低频率给药， 并且和现有治疗达到的促性腺激素或促甲状腺 激素活性 相比， 可以提供更稳定的活性水平。 发明内容

本发明的发明人经过不懈地努力，令人惊奇地 发现将促性腺激素或 促甲状腺激素的 β亚基与抗体 Fc片段融合， 而 α亚 J 过 α亚基和 β 亚基的分子间作用力与 β亚基结合在一起， 由此得到的融合蛋白在保持 活性的基础上， 具有更长的半衰期， 由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及一种融合蛋白， 其含有促激素蛋白和抗体 Fc 片段， 所述促激素蛋白的 β亚基直接或者间接通过链接元件与 Fc片段 连接，促激素蛋白的 α亚 过 α亚基和 β亚基的分子间作用力与 β亚 基结合在一起， 所述促激素选自促黄体生成激素、 促卵泡激素、 绒毛膜 促性腺激素和促甲状腺激素， 优选促卵泡激素。

任选地， 所述融合蛋白还含有其它活性蛋白或者可用以 帮助蛋白纯 化的标记， 例如 FLAG标记、 组氨酸标记、 GST标记、 麦芽糖结合蛋 白标记等。

在本发明中， 所述其它活性蛋白或者可用以帮助蛋白纯化的 标记连 接在所述融合蛋白的 N端或 C端。

在本发明的实施方案中， 所述融合蛋白由促激素蛋白和抗体 Fc片 段融合而成。

在本发明的实施方案中， 所述促激素为促卵泡激素 ( FSH ) 。

在本发明的实施方案中， 所述 FSH为人 FSH。

在本发明的实施方案中 所迷 FSHa亚基的氨基酸序列如、 ID NO: 1所示。

在本发明的实施方案中 所迷 FSHP亚基的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。

在本发明的实施方案中 所迷抗体 Fc片段的 列如 SEQ ID NO: 7所示。

在本发明实施方案中， 所述 β亚基直接与 Fc片段连接。

在本发明实施方案中， 所述 β亚基直接或通过至少一个接头（或称 为链接元件）与 Fc片段连接。 所述接头是任选的接头， 可插入到生物活 性分子和免疫球蛋白恒定区部分中间， 其序列设计方法为本领域所公 知， 。 接头可连接到 Fc片段的 N末端， 或 Fc片段的 C末端。 接头可连接到 FSHP亚基的 N末端， 或 FSHP亚基的 C末端。 本发明第二方面涉及异二聚体蛋白，其由本发 明第一方面任一项的 融合蛋白和抗体 Fc片段复合而成，所述抗体 Fc片段与融合蛋白中的抗 体 Fc片段通过化学締^ f 用连接。

在本发明的实施方案中， 所述异二聚体蛋白包括三条肽链， 其符合 以下方程：

aXXX@pXXX-L-Fc:Fc,

其中 XXXA指 FSH、 LH、 HCG或 TSH; a是指 a亚基； @代表了 a 亚基和 β亚基两奈链之间的关系， 为分子间作用力； β指的是 β亚基； L 代表了 β亚基和 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过链接元件 连接； Fc指的^ JL疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是融合蛋白 βΧΧΧ-L-Fc和 Fc两奈链之间的化学締合作用。

在本发明的实施方案中， 所述异二聚体蛋白符合以下方程：

Ta-aXXX@pXXX-L-Fc:Fc 或 Ta-Fc:Fc-L-pXXX @aXXX, 优选 Ta-aXXX@pXXX-L-Fc:Fc,

其中 XXXA指 FSH、 LH、 HCG或 TSH; a是指 a亚基； @代表了 a 亚基和 β亚基两奈链之间的关系， 为分子间作用力； β指的是 β亚基； L 代表了 β亚基和 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过链接元件 连接； Fc指的^ JL疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是融合蛋白 βΧΧΧ-L-Fc和 Fc两奈链之间的化学締合作用； Ta是其它活性蛋白或者可 用以帮助异二聚体蛋白纯化的标记，例如 FLAG标记、组氨酸标记、 GST 标记、 麦芽糖结合蛋白标记。

在本发明的实施方案中， 所述异二聚体蛋白为 FSH异二聚体蛋白， 其特征符合以下方程：

aFSH@pFSH-L-Fc:Fc

其中 aFSH指的是 FSH的 a亚基； @代表了 FSH a亚基和 β亚基 两条链之间的关系， 为分子间作用力； PFSH指的是 FSH的 β亚基； L 代表了 FSH P亚基和 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过链 接元件连接； Fc指的^ JL疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是融合 蛋白 PFSH-L-Fc和 Fc两 ^之间的化学締^ f 用。

在本发明的实施方案中， FSH异二聚体蛋白如图 la所示。 本发明第三方面涉及同二聚体蛋白，其由两个 本发明第一方面任一 项的融合蛋白复合而成， 两个融合蛋白的 Fc片段之间通过化学締 用连接。

在本发明的实施方案中， 所述同二聚体蛋白符合以下方程：

aXXX@pXXX-L-Fc: aXXX@pXXX-L-Fc,

其中 XXX是指 FSH、 LH、 HCG或 TSH; a是指 a亚基； @代表 了 a亚基和 β亚基两奈链之间的关系， 为分子间作用力； β指的是 β亚 基； L代表了 β亚基和 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过 链接元件连接； Fc指的 疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是两 条融合蛋白 aXXX@pXXX-L-Fc之间的化学締 ^f 用。

在本发明的实施方案中， 所述同二聚体蛋白符合以下方程：

Ta-aXXX@pXXX-L-Fc: Ta-aXXX@pXXX-L-Fc ,

其中 XXX是指 FSH、 LH, HCG或 TSH; a是指 a亚基； @ ί^ 了 a亚基和 β亚基两奈链之间的关系， 为分子间作用力； β指的是 β亚 基； L代表 β亚 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过链 接元件连接； Fc指的^ JL疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是两条 融合蛋白 aXXX@pXXX-L-Fc之间的化学締 用； Ta是其它活性蛋 白或者可用以帮助异二聚体蛋白纯化的标记， 例如 FLAG标记、组氨酸 标记、 GST标记、 麦芽糖结合蛋白标记。

在本发明的实施方案中， 所述同二聚体蛋白为 FSH同二聚体蛋白， 其特征符合以下方程：

aFSH@pFSH-L-Fc: aFSH@pFSH-L-Fc

其中 aFSH指的是 FSH的 a亚基； @代表了 FSH a亚基和 β亚基 两条链之间的关系， 为分子间作用力； PFSH指的是 FSH的 β亚基； L 代表了 FSH P亚基和 Fc之间的连接方式， 为直接连接或者间接通过链 接元件连接； Fc指的^ JL疫球蛋白的 Fc片段； 冒号（： ）指的是两条 融合蛋白 aFSH@pFSH-L-Fc之间的化学締 ^f 用。

在本发明的实施方案中， FSH异二聚体蛋白如图 lb所示。 本发明第四方面涉及混合物， 其含有本发明第二方面任一项的异二 聚体蛋白和本发明第三方面任一项的同二聚体 蛋白。 本发明第五方面涉及组合物， 其含有本发明第一方面任一项的融合 蛋白、 本发明第二或第三方面任一项的蛋白、 或者本发明第四方面的混 合物， 以及任选的药学上可接受的载体或辅料。

在本发明的实施方案中， 所述组合物为药物组合物。 本发明第六方面涉及重组表达载体，其含有编 码促激素蛋白 α亚基 的核苷酸序列、 编码促激素蛋白的 β亚基与抗体 Fc片段的融合蛋白的 核苷^ ^列， 以及编码抗体 Fc片段的核苷 列， ^^白之间各自独 立表达， 其中所述促激素选自促黄体生成激素、 促卵泡激素、 绒毛膜促 性腺激素和促甲状腺激素。

在本发明的实施方案中， 所述促激素为 FSH。

在本发明的实施方案中， 编码促激素蛋白 α亚基的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

在本发明的实施方案中， 编码促激素蛋白的 β亚基和抗体 Fc片段 融合蛋白的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。

在本发明的实施方案中，编码抗体 Fc片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 6所示。 本发明第七方面涉及重组细胞，其含有本发明 第六方面任一项的重 组表达载体。

在本发明中， 所述细胞为真核表达细胞， 例如为酵母细胞、 哺乳动 物细胞。 在本发明的的实施方案中， 所述细胞为哺乳动物细胞（例如 HEK293细胞、 CHO细胞） 。 本发明还涉及本发明第四方面任一项的混合物 的制备方法， 其包括 利用本发明第六方面任一项的重组表达载体或 本发明第七方面任一项 的重组细胞表达蛋白的步骤。 本发明还涉及本发明第二方面任一项的异二聚 体的制备方法，其包 括将本发明第四方面任一项的混合物进行分离 纯化、 以得到本发明第二 方面任一项的异二聚体的步骤。

在本发明的实施方案中， 所述分离纯化方法为 FcRn亲和纯化， 然 后经高分辨率的强阴离子亲和层析纯化， 获得纯度较高的异二聚体蛋 白。 本发明还涉及本发明第一方面任一项的融合蛋 白、第二或第三方面 任一项的蛋白、第四方面任一项的混合物或第 五方面任一项的组合物用 于制备半衰期延长的促激素药物制剂的用途， 其中所述促激素选自促黄 体生成激素、 促卵泡激素、 绒毛膜促性腺激素和促甲状腺激素。

在本发明的实施方案中， 所述促激素为 FSH。 本发明还涉及本发明第一方面任一项的融合蛋 白、第二或第三方面 任一项的蛋白、第四方面任一项的混合物或第 五方面任一项的组合物用 于制备预防或治疗各种促激素适应症的药物的 用途。

本发明还涉及预防或治疗各种促激素适应症的 方法， 所述方法包括 给有需要的哺乳动物以有效量的第一方面任一 项的融合蛋白、第二或第 三方面任一项的蛋白、第四方面任一项的混合 物或第五方面任一项的组 合物的步骤。

在本发明中， 所述各种促激素适应症为本领域所公知。 其中 FSH 可用于给患有这些异常的对象提供有益效果（ 例如： 增强生育力）， 治 愈 FSH异常或生殖障碍， 可以用于刺激卵泡生成， 例如可与排卵诱导 或辅助生殖技术 ( ART )联用， 也可以用于诱发排卵（ OI )时单卵泡的 生成， 或者宫腔内人工授精（IUI ) 时少量卵泡生成， 用于体内授精， 也可以用于控制性超排卵 （COH ) 。

HCG可用于不孕症、 黄体功能不足、 功能性子宫出血、 隐睾症、 男性性腺功能减退症、 先兆流产或习惯性流产等。

LH可用于促排卵， 促黄体发育。 在男性可促使睾丸间质细胞分泌 睾酮， 可用以检验睾丸间质细胞功能， 长期应用有生精作用。

TSH可用于甲状腺癌患者术后残留癌组织的抑制 和消融。

在本发明中， 所述哺乳动物例如为人、 猴、 小鼠、 大鼠、 羊、 猪、 马等。 在本发明中， 所述抗体的 Fc片段是指是人免疫球蛋白链恒定区， 特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中 的一部分。 例如， 免疫球 蛋白 Fc区可包括重链 CH1、 CH2、 CH3、 CH4中的两个或更多结构域， 以及任选的与免疫球蛋白铰链区。 根据重链恒定区的 基酸序列， 免疫 球蛋白可以分为不同的种类， 主要有 5类免疫球蛋白： IgA， IgD, IgE, IgG和 IgM， 其中一些还可进一步分成亚类（同种型）， 如 IgG-l， IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1和 IgA-2。 从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择 特定的免疫球蛋白 Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。

在本发明的具体实施方案中， 所述抗体的 Fc片段是指人免疫球蛋 白的 Fc片段， 包括至少一个免疫球蛋白绞链区， 一个 CH2结构域和一 个 CH3结构域， 具体为人 IgGl Fc。

在本发明中，所述 α亚基和 β亚基两奈链之间的分子间作用力例如 是指离子相互作用、 疏水相互作用、 亲水相互作用、 范德华相互作用和 氢键。

在本发明中， 所述化学締合作用即 (：)为共价键或非共价键， 例如至 少一个非肽键。 在某些实施方案中， 化学締合作用是共价键， 例如二硫 键。 在其他实施方案中， 化学締合作用是非共价键， 例如离子相互作用、 疏水相互作用、 亲水相互作用、 范德华相互作用和氢键。 在本发明的具 体实施方案中， 所述化学締合作用是指两个 Fc片段之间的相互作用。

在本发明中， 所述 β亚基通过至少一个接头（或称为链接元件）� �� Fc片段连接。 所述接头是任选的接头， 可插入到生物活性分子和免疫球 蛋白恒定区部分中间， 其序列设计方法为 ^域所^, 。 接头可连接 到 Fc片段的 N末端，或 Fc片段的 C末端。接头可连接到 FSHP亚基的 N末端， 或 FSHP亚基的 C末端。

在雌性哺乳动物中 FSH主要的生理作用是刺激卵泡发育和排卵， 本发明所述的 FSH优选为人 FSH, 根据人与其他动物如鼠、 猪、 羊等 FSH序列的保守情况比较（见图 2 )， FSH在其他动物内也保持了非常 高的同源性， 因此所述 FSH也可以其他动物的 FSH如鼠、 猪、 羊等。 激素 LH, HCG,TSH的保守情况与 FSH类似。

在本发明中，复^^白中名^ "白的 基酸序列或其 DNA编码序列中 可制造各种变化， 而又不明显丧失本发明复合蛋白的活性、 功能或效用。 由这种变化产生的衍生物、 类似物或突变体及这种衍生物的应用都在本 发明的范围内。

本发明涉及的促激素融合蛋白可以用标准的实 验手段从宿主细胞 中纯化。 例如， FSH-Fc融合蛋白包含了 Fc， 蛋白则可以用蛋白 A来纯 化。 纯化方法包括但不限于色讲技术如体积排阻、 离子交换、 亲和色讲 法 51¾滤法。本发明涉及的融合蛋白的分离纯化� �法也包括上述各种方 法的适当组合。

所述的促激素融合蛋白包括 Fc， 优选人免疫球蛋白 Fc。 在一般情 况下，人免疫球蛋白 Fc区域的 CH3区域多肽来源于野生型的人免疫球 蛋白 Fc区域。野生型的人免疫球蛋白 Fc指发生在 中的 列， 当然 Fc序列在个体中会有一些细微的差异。 本发明中人免疫球蛋白 Fc 也包括对于野生型人免疫球蛋白 Fc序列的氨基酸个别的改变， 比如， Fc 区域局部某些氨基酸的改变， 如包括某些在糖基化位点突变的氨基 酸，或者其他无义的突变；也包括根据"把手-� ��洞"模型突变的个别氨基 酸的改变。

本发明涉及的哺乳动物宿主细胞包括但不限于 CHO, 293, 骨髄瘤 细胞。 宿主细胞也可以是酵母或者原核细胞如 /。

本发明的具体实施方式中构建了 FSH-Fc融合蛋白，其中的 FSH可 以由 LH, TSH， HCG等促激素来取代， FSH同促黄体激素 (LH)、 促甲 状腺激素 (TSH), 胎盘分泌的促绒毛膜激素 (HCG)共同组成糖蛋白 家族。 都由 α亚基和 β亚基所组成， α亚 jf目同， 而 β亚基具有激素各 自的特异性，这些 β亚基与 FSH的 β亚基也具有非常高的同源性（图 3 )， 且配体的 α亚基和 β亚基与受体的接触界面类似（图 3灰色区域）， 都 位于 α亚基和 β亚基的 C端。

根据本发明设计的出发点，将 α亚基游离出来通过与 β亚基自身分 子间作用力的连接， 克服了将 α亚基与 β亚基用链接元件（linker )相 连所导致的亲和力丟失的问题。

本发明一相关方面， 采用的促激素融合蛋白例如 FSH-Fc融合蛋白 的药物组合物用于治疗疾病、 障碍或病症的药物。 在另一方面， 本发明 的多肽或药物组合物用于哺乳动物特别是人的 治疗方法中， 所述方法包 括把这些多肽或药物组合物给予有需要的哺乳 动物。

对于本领域技术人员显而易见的是， 有效量的本发明的多肽、 药剂 或组合物取决于疾病类型、 剂量、 给药进度、 是单独给予所述多肽、 制 剂或组合物还是与其他治疗药物联用、组合物 的血清半衰期以及病人的 一般状况。 一般的， 有效量得本发明的制剂或者组合物能够保证治 疗效 果。

根据本发明的促激素融合蛋白可以是药物组合 物， 该药物组合物可 以包含药学上可接受的赋形剂、 载体、 緩冲质、 稳定剂或本领域技术人 员 的其他材料。此类材料应当是非毒性的并且不 应干扰活性成分的 功效。此类材料可以包括，例如任何一种和所 有溶剂、分散介盾、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂以及生理学相容的物质等 。 药学上可接受的载体可以是例如水、 盐水、 磷酸盐緩冲盐水、 葡萄糖、 甘油、 乙醇等， 以及其组合。 在许多情况下， 所述药物组合物中可以包 括等渗剂，例如糖， 多元醇如甘露醇、 山梨糖醇，或氯化钠将是优选的。 药学上可接受的物质的还可以是湿润剂或少量 辅助物质例如湿润剂或 乳化剂、 防腐剂或緩冲质， 其增强抗体的保存期或效用。 载体或其他材 料的精确性质将取决于施用途径， 所述施用途径可以是口服、 局部、 通 过^^或通过注射， 例如静脉内。 在一个优选实施方案中， 所述药物组 合物通过静脉内输注或注射进行施用。 在另一优选实施方案中， 所述药 物组合物通过肌内或皮下注射进行施用。

用于口 用的药物组合物可以是片剂、 胶囊、 粉剂或液体形式， 例如含有惰性稀幹剂或可同化的可食用载体。 片剂可以包含固体载体例 如明胶或佐剂。 液体药物组合物一般包含液体载体例如水、 石油、 动物 或植物油、 矿物油或合成油。 可以包括生理盐水溶液、 葡萄糖或其他糖 类溶液或者二醇例如乙二醇、 丙二醇或聚乙二醇。 特异性结合成员 （需 要时， 以及其他成分）还可包封在硬或软壳明 囊内， 压缩成片剂， 或直接掺入受试者饮食中。 对于口服治疗施用， 活性成分可以与赋形剂 相 ， 并以可吸收的片剂、 颊含片剂、 锭剂、 胶囊、 酏剂、 悬浮液、 糖浆剂、 糯米纸囊剂等的形式进行使用。 为了通过除脉胃外施用以外的 其他方式施用本发明的化合物，可能必需用防 止其失活的材料包被所述 化合物或将所述化合物与所述材料共施用。

对于静脉内注射， 或在痛苦部位注射， 活性成分将是肠胃外可接受 的水溶液的形式， 其是无热原的并且具有合适的 pK：、 等渗性和稳定性。 本领域相关技术人员将能够容易地例如使用等 渗媒介物例如氯化钠注 射液、 林格注射液、 乳酸盐林格注射液来制备合适的溶液。 需要时， 可 以包括防腐剂、 稳定剂、 緩冲质、 抗氧化剂和 /或其他添加剂。

本发明的药物组合物可以以液体、 半固体或固体形式进行配制， 例如液体溶液（例如， 可注射的和可输注的溶液）、 分散系或悬浮液、 片剂、 丸剂、 粉剂、 脂质体和栓剂。 优选的形式取决于所希望的施用 形式、 治疗应用、 所述分子的物理化学特性和递送途径。 制剂可以包 含赋形剂、 或赋形剂的组合， 例如： 糖、 氨基酸和表面活性剂。 液体 制剂可以包含广泛范围的抗体浓度和 ρΗ。 固体制剂可以通过例如冻 干、 喷雾干燥、 或经超临界流体技术进行干燥来生产。

通常， 药物组合物在制造和贮存条件下必须是无菌的 和稳定的。 所述药物组合物可以配制为溶液、 微乳液、 分散系、 脂质体或适合于 高药物浓度的其他有序结构。 无菌可注射溶液可以通过下列方式制备： 在需要时将在合适溶剂中的所需量的本发明的 抗体或其抗原结合片 段、 组合物或分离的核酸分子与上文所列的一种成 分或成分组合相掺 合， ^过滤灭菌。 一般地， 系通过将活性化合物整合入无菌媒 介物中进行制备， 所述无菌媒介物包含 介盾和来自上文列举 的那些中的所需的其他成分。 在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂 的情况下， 优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥， 这种干燥方式从 其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何 另外所需成分的粉末。 溶液的合适流动性可以通过下列方式来维持： 例如， 通过使用包衣例 如卵磷脂， 在分散系的情况下通过维持所需颗粒大小， 和通过使用表 面活性剂。 通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬 脂酸盐和明 胶可以导致可注射组合物的吸 长。 在某些实施方案中， 本发明所述的药物组合物可以用保护活性成 分不被快速幹放的载体进行制备， 例如受控幹放制剂， 包括植入物、 透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。 可以使用生物可降解的、 生物相容 的聚合物， 例如乙烯乙酸乙烯酯、 聚酐类、 聚乙醇酸、 胶原、 聚原酸 酯和聚乳酸。 用于制备此类制剂的许多方法是被授予专利权 的， 或者 一般是本领域技术人员已知的。 参见， 例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ( J. R. Robinson, ed.， Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 ) 。

本发明的药物组合物可以单独地或与其他治疗 相组合地同时或顺 次施用， 这取决于被治疗的病状。

该药物组合物可以和其他治疗药物联合使用。 这些药物可以混合到 该药物组合物中作为其一部分， 也可以与多肽分开， 同时给药， 或者根 据其它可接受的治疗方案使用。 另外， 该多肽、 制剂或药物组合物可以 作为其它药物的辅助使用。

本发明涉及的治疗领域与促激素的治疗作用有 关。本发明的融合蛋 白、异二聚体蛋白或包含上述蛋白的药物组合 物可用于治疗相应的促激 素的适应症。 例如包括， 通过药物组合物治疗降低任意对治疗有反应的 生殖障碍或疾病状态的严重性；预防与这些障 碍或疾病状态相关的一种 或多种症状； 减少 FSH异常的疾病过程的治疗时间； 给患有这些异常 的对象提供有益效果（例如： 增强生育力） ， 治愈 FSH异常或生殖障 碍，可以用于刺激卵泡生成，例如可与排卵诱 导或辅助生殖技术（ART ) 联用， 也可以用于诱发排卵（OI )时单卵泡的生成， 或者宫腔内人工授 精（IUI ) 时少量卵泡生成， 用于体内授精， 也可以用于控制性超排卵 ( COH ) 。 本发明提供了一个在不丟失 FSH的体内活性的^ U增强 FSH的体内半衰期的 FSH-Fc片段的融合的方法。 具体方式是将 FSH 的 β亚基融合于 Fc片段上， 并利用 FSH α亚基与 β亚基的自身亲和力 的特性， 单独表达 FSH a亚基。 本发明将提供 FSH的部分或全部治疗 相关的效果， 可以比现有的 FSH产品更低频率给药， 并且和现有治疗 达到的 FSH活性相比， 可以提供更稳定的活性水平。 本发明涉及的治疗领域还包括， 用于不孕症、 黄体功能不足、 功能 性子宫出血、 隐睾症、 男性性腺功能减退症、 先兆流产或习惯性流产 等。可用于促排卵，促黄体发育。在男性可促 使睾丸间质细胞分泌睾酮， 可用以检验睾丸间质细胞功能， 长期应用有生精作用。 本发明涉及的治 疗领域还包括， 用于甲状腺癌患者术后残留癌组织的抑制和消 融。 发明的有益效果

与专利 US20050186662相比，本发明将促性腺激素或促甲� �腺激素 的 α亚基游离出来， 通过自身的分子间作用力结合在 β亚基上，使促性 能够正常与其相应的受体结合，在增强促性腺 激 素或促甲状腺激素的体内半衰期的同时， 最大程度地保留了激素的体内 活性。 附图说明

图 1为 FSH-Fc融合蛋白异二聚体及同二聚体示意图。

图 2 不同物种的 FSHa (图 A )和 FSHp (图 B)的多重序列比较。序 列来源于 NCBI GenBanko人（ human,V00518,NM000510,NM000894 )， 牛 （ cattle,X00050,M14853,M10077 ) ， 羊 （ sheep, X16977,X15493,X52488 ) ， 猪（ pig, D00768, AF134151, D00579 ) ， 大 鼠 （rat, V01252, M36804, D00576) ， 小 鼠 （ mouse, J00643,NM00804,AF33067 ) 。

图 3人 FSH, CG, LH和 TSH β链序列多重比较。 其中 FSHp的氨 基酸埋藏与受体-配体结合区域高亮为灰色。

图 4 为 FSH-Fc同二聚体重组质粒。

图 5为 FSH-Fc/Fc异二聚体重组质粒。

图 6 为 FSH-Fc 同二聚体、 FSH-Fc/Fc 异二聚体经一步纯化后 SDS-PAGE图讲。 A: FSH-Fc同二聚体 SDS-PAGE图讲； B: FSH-Fc/Fc 异二聚体 SDS-PAGE图讲。

图 7为 FSH-Fc/Fc异二聚体混合物皮下单次给药 3(^g/kg SD大鼠 血清中 FSH-Fc/Fc浓度 -时间曲线图。

图 8 为 FSH-Fc/Fc单克隆筛选还原 SDS-PAGE图讲。

图 9 为 FSH-Fc/Fc异二聚体经精细提纯后 SDS-PAGE图讲。

图 10 为 FSH-Fc/Fc异二聚体与对照品 Gonal-F量效关系曲线的比 较—— ^外刺激外源性 FSHR介导产生的 cAMP水平。

图 11为 FSH-Fc/Fc异二聚体皮下单次给药 38 g/kg SD大鼠血清中

FSH-Fc/Fc浓度-时间曲线，和对照品 Gonal-F皮下单次给药 3.8 g/kg SD 大鼠血清中 FSH浓度-时间曲线的比较

图 12 为 FSH-Fc/Fc异二聚体 ( A )皮下单次给药 3.8， 38 g/kg和 ( B )静 次给药 ^g/ g后食蟹猴血清中 FSH-Fc/Fc浓度-时间曲线 图。 每条曲线表示一只猴。

图 13为 FSH-Fc/Fc异二聚体单次皮下给药， 对照品 Gonal-F每天 给药两次 21日龄 SD雌性大鼠的卵巢重量 -给药剂量曲线图。 给药后 72 小时卵巢称重。

图 14 ( A ) FSH-Fc/Fc异二聚体单次皮下给药， 对照品 Gonal-F每 天给药两次（Nx )和单次给药 （lx ) 26 日龄 SD雌性大鼠的卵母细胞 数目柱状图， 给药剂量 3pmol; ( B ) FSH-Fc/Fc异二聚体单次皮下给 药 26日龄 SD雌性大鼠的卵母细胞数目 -给药剂量柱状图。给药 72小时 后注射 hCG， 24小时卵泡计数。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通 过市购获得的常规产品。 实施例 1 FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体的质 建 1. FSH-Fc同二聚体的质粒构建 商业化哺乳动物细胞表达载体 _P cDNA4/myc-HisA的改造。 商业 化载体 pcDNA4/myc-fflsA ( Invitrogen, V863-20 )含有两个 Pvu II酶 切位点，分别在大约 1411, 3160bp的位置。对质粒定点突变，将 3106bp 位置的碱基 C突变为 G， 去除在该位置的 v« II酶切位点， 只保留在 大约 1411bp处的一个酶切位点， 新的载体命名为 pcDNA4m。

根据基因库中搜索到的人 FSHa亚基基因序列 （Gene bank No. NP_000726.1 ), 基因两端添加相应的 III， EcoR 1酶切位点, 人 工合成方法获得人 FSHa蛋白基因，合成好的 FSHa基因经 Takara公 司的 Hind III与 EcoR I欢酶切亚克隆到改造的载体 pcDNA4m中， 测 序验 建盾粒的准确性， 获得重组盾粒 DNA即： pcDNA4m-FSHa。

人的 FSHa序列见 SEQ ID ΝΟ:1，信号肽序列见（ SEQ ID NO:2 )， 编码 FSHa序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO:3。

根据基因库中搜索到的人 FSHP亚基基因序列 （Gene bank No. NP_000501.1 )， 人 IgGl的 Fc片段（ hing-CH2-CH3 )基因序列， 人工 合成方法获得人的 FSHP-Fc融合蛋白基因， 合成的基因序列两端添加 相 的 Hind m, EcoR I酶切位点， 合成好的 FSHp-Fc基因经 Takara 公司的 Hind III与 EcoR I双酶切亚克隆到改造的载体 pcDNA4m, 测 序验证构建质粒的准确性， 获得重组质粒 DNA 即： pcDNA4m-FSHp-Fc„

人的 FSHP-Fc融合蛋白序列见 SEQ ID NO:4，信号 J ^列见 SEQ ID NO:5, 编码 FSHP序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO:6。 人 IgGl的 Fc片段的 J^^ψ列见SEQ ID NO: 7, 核苷^ ψ列见 SEQ ID NO: 8。

取上^ j¾ ^功的单基因表达载体 pcDNA4m-FSHa用 Takara 公司的 Bgl II， Pvu II双酶切。 酶切产物通过 0.8%的琼脂糖电泳分离 纯化， 并回收约 1.6kb 大小含有 FSHa 基因的 DNA 片段； pcDNA4m-FSHp-Fc经 Bgl II， Nru I双酶切 回收约 6kb 大小含有 FSHP-Fc基因的 DNA片段。 ^将 ^处理过的 DNA片段进行连接， ^ FSHa和 FSHP-Fc外源基因表达原件于一个表达载体上， 获得重 组质粒 pcDNA4m-FSH -Fc,即 FSH-Fc同二聚体重组质粒（见附图 4 )。 2. FSH-Fc/Fc异二聚体的质粒构建

以 pcDNA4m-FSHp-Fc为模板， 设计引物进行 PCR扩增获得 Fc 基因 ， 通过 PCR 引 物在基因 N 端添加 IgGl 信号肽 ( 5'METDTLILWRLLLWVPGSTLGSA3' )， 在基因两端分别添加酶 切位点 Hind III, EcoR I, PCR产物经双酶切亚克隆到改造的载体 pcDNA4m中， 获得重 BL¾粒 pcDNA4m-Fc。 用 Takara公司的 Vr" I， Pvu II对重组质粒进行欢酶切， 酶切产物通过 0.8%的琼脂糖电泳分离 纯化， 回收约 1.8kb大小含有 Fc的 DNA片段。 通过平末端连接， 将 其连入经 Nru I 单酶切， 并经过 CIAP 去磷酸化处理的 pcDNA4m-FSH-Fc质粒中， 获得重组质粒 pcDNA4m-FSH mono, 即 FSH-Fc/Fc异二聚体重 BUt粒。 质粒图 附图 5所示， 基因 FSHa, FSHP-Fc, Fc以摩尔比 1:1:1的方式构建至同一个质粒， 最终表达的蛋 白 FSH-Fc, Fc以三种方式存在： FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚 体和 Fc同二聚体， 理论上三者之间的摩尔比为 1:2:1。

采用 Qiagen的中提试剂盒， 按照说明书操作， 获得去除内毒素 的重组质粒 pcDNA4m-FSH -Fc, pcDNA4m-FSH mono。 实施例 2 FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白表达 纯 化

1. FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白瞬时表达

转染前两天， 准备 500mL 经悬浮驯化的 HEK293 ( ATCC , CRL-1573 ^TM )细胞用于瞬时转染， 接种密¾^ 0.8xl06cdls/mL。 两天 后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为 3.5~4xl06cells/mL, 取细胞 悬液 lOOOrpm离心 5min，弃上清液。用 lOOmL的新鲜的 Freestyle293 培养基重新悬浮细胞，再次 lOOOrpm离心 5min，弃上清液。用 500mL Freestyle293培养基重新悬浮 293细胞。 分别用 2.5mL Freestyle293培 养基稀释 250 g pcDNA4m-FSH -Fc, pcDNA4m-FSH mono盾粒， 5mL Freestyle293培养基稀释 1.5mLPEI ( Polyethylenimine, 聚乙蟑亚胺）， 分别将 2.5mL质粒和 2.5mL的 PEI混匀， 室温 5分钟。 将盾粒 /PEI 混合物分别加入 250mL细胞悬液中，放置在 37。C， 10% C02 , 90rpm 中培养； 同时补加 5(^g/L IGF-l (胰岛素 1号增长因子）。 四小时后分 别补加 250mL EX293培养基， 2mM Glutamine (谷氨 S fe )和 50 g/L IGF-l,135rpm培养。 二十四小时后加 3.8mM VPA (丙戊酸钠， 培养 5-6天收集 500mLSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体上清液准备纯 化。

2. FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白纯化

首先，鼠源 FcRn (新生儿 Fc受体）蛋白（ Uniprot编号： Q61559 ) 交联至 NHS-activated agrose resin ( Thermo )， 细胞液经离心，取上清 0.22μιη过滤后上载到 FcRn柱子上， 然后用 20mM PB, 50mMNaCl, pH6.2漂^， ： gj^用 20mM PB, 50mMNaCl, pH7.4洗脱目的蛋白。 经一步纯化后， SDS-PAGE结果图 6所示。 Fc融^^白是通过 Fc之 间二硫键结合的， 在非还原胶即不加入 DTT (巯基乙二醇）强还原剂 的情况下， Fc的链接二硫键没有被破坏， 融合蛋白以二聚体的形式存 在。 而 FSH的两个亚基 α、 β是以非共价键的方式结合， 在非还原胶 样品不经过煮沸的情况下， 非共价键没有遭到破坏； 在非还原胶煮沸 的情况下， 两个亚基之间的非共价键断裂。 所以电泳分别采取还原、 非还原样品煮沸及不煮沸的方式进行检测。 经一步纯化后， FSH-Fc同 二聚体蛋白纯度达 90%以上； FSH-Fc/Fc异二聚体重组质粒， 蛋白表 达后以混合物的形式存在： FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体和 Fc同二聚体， 摩尔比大致为 1:2:1, 与理论推测相符合（见附图 6 )。 实施例 3 FSH-Fc同二聚体， FSH-Fc/Fc异二聚体齡物大鼠体 内初步药效学研究

对实施例 2分离制备获得的具有一定纯度的 FSH-Fc同二聚体， FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白进行了初步的体内药效学 研究，评价模型是大 鼠卵巢重量增加法。使用 FSH或具有 FSH活性的分子，皮下给药未成 熟的 21日龄雌性大鼠， 触发卵巢卵泡生长和卵细胞产生。 这种生长通 过测量末期卵巢重量很容易探测。 该方法作为给临床产品标定 FSH活 性已经使用了数十年， 它能衡量 FSH的相关生理学作用， 与临床产品 的表现有明确的 f目关， 14。

取^ ¾合格， 出生 21天左右的 Sprague-Dawley雌鼠， 按照中国 药典 2010版第 II部附录 121 的实验方案进行 FSH-Fc 同二聚体， FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白动物体内研究。样品给药 剂量分高、 中、低三 组（依次为 2.5、 1.25, 0.5U ), 对照品 Gonal-F (购自雪兰诺）（比活 预估 10， 000U/mg )每日给药一次，样品 FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc 异二聚体蛋白（比活预估 1， 000U/mg )只给药一次， 72小时后进行卵 巢称重， 运用 《中检所药典生物检定统计 BS2000程序 3.3法》计算， 结果显示 Gonal-F比活为 11, 000 IU/mg, 样品 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋 白比活为 1， 300IU/mg， 样品 FSH-Fc同二聚体蛋白比活 1, 00IU/mg _e 结果表明： 相对于 Gonal-F连续三天每日给药一次， FSH-Fc/Fc异二 聚体蛋白在只给药一次的情况下， 仍然具有一定的 FSH活性。 根据 Gonal-F 的产品说明书， 临床推荐给药剂量为 75IU, 即可以推算 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白的临^ ^药剂量约为 17微克， 在合理给药剂 量范围内。 实施例 4 FSH-Fc/Fc异二聚体混合物大鼠体内初步药代动力 学研 究

将具有一定 FSH活性的 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白 （样品制备详 情见实施例 2 )进行大鼠体内药代动力学研究。 具体方案如下： 6周左 右的 Sprague-Dawley雌鼠，接受静脉注射 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白（样 品制备详情见实施例 2 )， 注射剂量 3(^g/kg。 采用眼眶采血的方式，给 药 0,1,2,4, 12,24,48, 72, 96, 144, 192小时采血， 每次采血体积 ΙΟΟμΙ, 离心后取血清冻存于 -80°C待 ELISA分析。 使用抗 FSH 包被抗体 ( Fitzgerald Industries,货号 10-F20A ) ^偶联辣根过氧化物酶的抗 -Fc 检测抗体（ Lakepharma, 货号 203150 )进行夹心 ELISA检测， 结果 显示在图 7 中。 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白的半衰期为 30-40 小时， Gonal-F静 Ji^药在大鼠体内半衰期约 5h， 示 FSH-Fc/Fc异二聚 体具有比 Gonal-F更长的半衰期， 半衰期约是 Gonal-F的 6-8倍。 实施例 5 FSH-Fc/Fc异二聚体高表 ¾ 定细 的获得

才艮据前期实验结果， FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白具有一定的 FSH活 性， 同时在大鼠体内的半衰期约 30-40h， 是对照品 Gnoal-F的 3倍多， 具有艮好的临床应用前景， 因此试图获得 FSH-Fc/Fc异二聚 定细 胞林， 为后期工艺开发及产业化做准备。 稳定细胞林获得的具体方案： 将对数生长期的 HEK293 ( ATCC, CRL-1573™)细胞以 lxl05cdl/ 孔浓度接种于 24 用完全培养基 (含 10%胎牛血清的 DMEM培 养基） 培养 24 h , 第二天使细胞汇合度达到 75% ~ 85%。 使用 Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen, P/N52887)转染重组质粒 pcDNA4m-FSH mono„转染 5 h后换液，每孔加入 400μ£完全培养基， 24小时后将细胞以 1: 5比例传代到含有 10mL新鲜完全培养基的细胞 培养 JUL中培养， 24小时后更换筛选培养基（含 20(^g/mL zeocin的完 全培养基)， 每隔 3-4天更换一次筛选培养基。 4-6周以后^^单克隆 传代到 24 约 4-5天至汇合度达到 80%-100%时进行单克隆筛选。 单克隆筛选策略： 第一轮检测用 Fc ELISA试剂盒检测， 共筛选了 309 个克隆。 根据 ELISA结果， 结合菌落大小情况， 选取 102个 Fc表达 水平相对较高的克隆， 传代培养至 6 ， 使用 FSH ELISA试剂盒 ( DRG, E1A-1288 )检测 FSH表达量， 筛选阳性克隆。 选取 FSH表 达水平相对较高的克隆进行非还原 SDS-PAGE电泳。

前面已提到过， 基因 FSHa, FSHP-Fc, Fc以摩尔比 1:1:1的方式构 建至质粒 pcDNA4m-FSH-Fc mono, 最终表达的蛋白 FSH-Fc, Fc以三 种方式存在： FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体和 Fc同二聚体， 一般情况下三者之间的摩尔比为 1:2:1。 我们最终的目的产物是 FSH-Fc/Fc, 蛋白具有 FSH活性且半筛期在大鼠体内是 FSH的 3-4倍， 另外， 考虑到后续的蛋白纯化工艺， FSH-Fc/Fc异二聚体和 Fc同二聚 体蛋白的分离， 比其与 FSH-Fc同二聚体的蛋白分离要容易的多。 所以 我们的蛋白电泳筛选标准是 FSH-Fc/Fc 异二聚体蛋白占主要部分， FSH-Fc同二聚体含量较低。 最终筛选到的部分非还原 SDS-PAGE电泳 图讲如附图 8所示， 根据电泳情况最终选取第 2、 3、 6和 9泳道的克隆 进行后续细胞培养及纯化工艺的开发。其中值 得一提的是第 6泳道的克 隆， 表达产物基本是以 FSH-Fc/Fc异二聚体的形式存在， FSH-Fc同二 聚体蛋白含量很低， ^续的蛋白纯化工艺开发变得简单。 将第 2、 3、 6和 9泳道的克隆进行细胞林的保存： 从 6孔板中 克隆扩大培养至 125ml摇瓶中， 细胞密度在 2~3 X 10 ⁶ cdls/ml， 细胞活性率 > 90%时， 离 心向细胞沉淀中加入完全培养基以及 7.5% DMSO (二甲 J >砜)， 轻轻 吹打混匀，使细胞密度达 1 10 ⁷ cells/mlo 1ml/管分装细胞悬液于冻存管 内。 实施例 6 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白表 纯化

稳定细胞株扩大培养到 T75细胞培养瓶，待细胞汇合度长到 90%左右 转移到摇瓶中用 CD Opti CHO培养基（Invitrogen, 货号 81-011 ) 悬浮 培养， 驯化培养 3周以后细胞林生长正常即驯化完全。 将驯化完全后的 细胞^ 大培养至 1L, 收获培养液上清。 因为 FSHa, FSHp-Fc, Fc共同 表达， 最终获得的收集液包含： FSH-Fc同二聚体、 FSH-Fc/Fc异二聚体 和 Fc同二聚体混合物。

按照实施例 2中所述使用 FcRn亲和层析进行初步纯化。 洗脱后通 过 Source Q( GE healthcare,货号 17-0947-20 )去除残留的少量 FSH-Fc 同二聚体和所有 Fc同二聚体。 Source Q层析柱首先用再生溶液（ 10mM Tris, lMNaCl, pH 8.0 )和平衡溶液（ lOmM Tris, 50mMNaCl， pH 8.0 ) 处理， FcRn洗脱后样品调 pH至 8.0后直接上柱， 经平衡溶液再平衡 去除残留的 Fc同二聚体， 用洗脱溶液 ( 10mM Tris, 200mMNaCl, pH 8.0 )洗脱 FSH-Fc/Fc异二聚体， 最后用再生溶液清洗柱子， 去除残留 的 FSH-Fc同二聚体。 经 FcRn亲和层析和 Source Q离子交换层析后， FSH-Fc/Fc异二聚体纯度很高， SDS-PAGE图讲如图 9所示。 实施例 7 FSH-Fc/Fc异二聚体的体外功能

对实施例 6分离制备获得的纯度较高的 FSH-Fc/Fc异二聚体进行了 体外生物活性测定， 测定了其刺激重组表达人 FSH受体的 CHO细胞 产生环磷酸腺苷 ( cAMP )的能力。 CHO-FSH受体 ( CHO-FSHR )细 胞保持在 FSHR生长培养基中 （ 养基 ( DMEM ) +10%胎牛血 清）。 CHO-FSHR细胞以 2xl0 ⁴ 细胞 /孔接种于 96孔板， 100μΙ孔， 在 检测前于 37°C孵育 24小时， 至少 70%汇合度时用于活性测定。 样品 和对照品 Gonal F从 67.5nM开始以 1: 3比例进行梯度稀释， 所有稀 释都在检测培养基 (基本培养基 ( DMEM ) +10%胎牛血清 +0.1mM IBMX ( Sigma,15879-100mg ) ) 中进行。 ^ r测 中去除生长培养基， 加入 25 L检测培养基， 回收培养 并在 37。C孵育 15分钟。 孔中加入 25μΙ^Ι ϋ!，】样品， 混合， 回收培养 并在 37。C孵育 1小时， 孵育 1小 时后，从孔中去除样品和培养基。然后每孔加 入 25μΙ,标准裂解緩冲液， 培 ^加盖摇荡 5 。 5分钟裂解孵育后， 将 25 L细胞裂解物转移 到 cAMP培养 中， 室温培养 30分钟。 每孔加入 25 L cAMP-碱性磚 酸酶组合物， 然后每孔加入 25μΙ,抗 cAMP抗体， 培: 加盖室温摇 荡 30分钟。 培养 JUL然后用 350 μΐν孔清洗緩冲液清洗 6次。 然后每孔 加入 ΙΟΟμΙ^底物增强剂， 培养 加盖 25°C暗处孵育 30分钟。 然后培 ^每孔 1秒读数， 低 cAMP浓度者显示高信号， 高 cAMP浓度者显 示低信号。 样品 FSH-Fc/Fc异二聚体和对照品 Gonal F的量效关系曲 线图如图 10所示， 计算半数有效浓度（EC50 )。 结果显示： Gonal F 的 EC50为 0.1037nmol/L， FSH-Fc/Fc的 EC50为 0.2039nmol/L，表明 FSH-Fc/Fc的体外生物活性约是 Gonal-F的 50%。 实施例 8 FSH-Fc/Fc异二聚体在大鼠体内的药代动力学研究 对实施例 6分离制备获得的纯度较高的 FSH-Fc/Fc异二聚体进行 了大鼠体内药代动力学研究。 具体方案如下： 6 周左右的 Sprague-Dawley雌鼠， 接受皮下给药。 给药剂量： FSH-Fc/Fc异二聚 体蛋白 38 g/kg; 对照品 Gonal-F 3.8 g/kg (相当于 50IU/kg )。 采用眼 眶采血的方式， 给药 0, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192小时采血， 每 次;^体积 ΙΟΟμΙ, 离心后 清冻存于 -80。C待 ELISA分析。使用抗 FSH包被抗体 ( Fitzgerald Industries,货号 10-F20A )和偶联辣根过氧 化物酶的抗 -Fc检测抗体（ Lakepharma,货号 203150 )进行夹心 ELISA 检测， 结果显示在图 11中。 与对照品 Gonal-F相比， FSH-Fc/Fc异二 聚体蛋白达峰 ，半衰期长。 FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白在大鼠体内半衰 期约 84小时， Tmax约 48h; Gonal-F半衰期约 7h左右， Tmax约 5h。 结^^明 FSH-Fc/Fc异二聚体在大鼠体内的半衰期约是 Gonal-F的 10 倍多。结合实施例 4 FSH-Fc/Fc异二聚体混合物的初步药代动力学测定 结果（ FSH-Fc/Fc异二聚体在大鼠体内的半衰期约是 Gonal-F的 6-8 倍）， 示 FSH-Fc/Fc异二聚体经分离提纯后，在大鼠体内的 半衰期 显著提高。 实施例 9 FSH-Fc/Fc异二聚体在食蟹猴体内的药代动力学研 究 对实施例 6分离制备获得的纯度较高的 FSH-Fc/Fc异二聚体进行 了食蟹猴体内药代动力学研究。具体方案如下 ： 3-4周岁的雌性食蟹猴， 接受皮下和静脉注射两种给药方式。皮下给药 剂量： FSH-Fc/Fc异二聚 体蛋白 3.8 g/kg和 38 g/kg， 静脉注射给药剂量： 38 g/kg; 采用眼眶 的方式， 皮下给药 0, 2, 8, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 168, 216, 264, 336, 408, 504, 600, 672小时采血，每次采血体积 ΙΟΟμΙ, 离心后取 j 清 冻存于 -80。C待 ELISA分析； 静 药 0.25, 1, 4, 8, 24, 48, 96, 120, 168, 216, 264, 336, 408, 504, 600, 672 小时采血， 按照上述方式处理用于 ELISA分析。 使用抗 FSH 包被抗体（Fitzgerald Industries, 货号 10-F20A )和偶联辣根过氧化物酶的抗 -Fc检测抗体 ( Lakepharma, 货 号 203150 )进行夹心 ELISA检测，结果显示在图 12中。使用 WinNonlin (V6.2),采用非房室模型（NCA )计算主 谢动力学 ，结^^明： FSH-Fc/Fc异二聚体蛋白皮下注射给药，在食蟹猴 的半衰期超过 200h; 药物吸收较充分，皮下注射 38 g/kg时， 平均绝对生物利用度（皮下给 药 0-672h的药时曲线下面积 /静 药 0-672h的药时曲线下面积％) 接近 100%; 由于药物吸收较快、 较充分， 药后 28天内， 血浆药物浓 度未见突然下降， 提示单次皮下注射给药后 28天内， 没有抗药抗体产 生； 皮下注射给药 （ 3.8-38 g/kg ) 时， 血浆药物暴露量与给药剂量正 相关， 羞^ ¹ 合线性动力学特征。 实施例 10 FSH-Fc/Fc异二聚体体内药效学研究：大鼠卵巢称 重实 验

对实施例 6分离制备获得的纯度较高的 FSH-Fc/Fc异二聚体进行 了大鼠卵巢称重实验研究。 取健康合格， 出生 21 天左右的 Sprague-Dawley雌鼠。 样品和对照品 Gonal-F给药剂量依次为 0， 3， 6, 12pmol ( Gonal-F相当于 0, 1.25, 2.5, 5IU ); 样品只皮下给药一次， 对照品 Gonal-F每日给药两次。 72小时后进行卵巢称重， 结果如图 13 所示。 与对照品 Gonal-F相比，在 0-6pmol剂量范围内（Gonal-F相当 于 0-2.5IU ), 同摩尔数的样品和对照品 Gonal-F引起的卵巢重量增加 相当； FSH-Fc/Fc异二聚体给药剂量与引起的卵巢重量增 加呈正相关。。 实施例 11 FSH-Fc/Fc异二聚体体内药效学研究： 大鼠排卵实验 对实施例 6分离制备获得的纯度较高的 FSH-Fc/Fc异二聚体进行了 大鼠排卵实验研究， 探讨了 FSH-Fc/Fc异二聚体不同剂量与排卵效果的 关系， 以及与对照品 Gonal-F在同摩尔数给药剂量的情况下排卵效果� � 了比较。 具体方案： 取健康合格， 出生 26-28天左右的 Sprague-Dawley 雌鼠。 样品给药剂量依次为 3， 6, 12, 24pmol, 只皮下给药一次； 对照 品 Gonal-F给药剂量 3pmol (相当于 1.25IU )， 每日给药两次（Nx )或只 给药一次（lx ) 。 72小时后给药 13.3IU hCG ( human chorionic gonadotropin ) ， hCG给药 24小时后处死大鼠， 卵母细胞计数， 结果汇 总如图 14所示。 与对照品 Gonal-F相比， 剂量为 3pmol时， FSH-Fc/Fc异 二聚体给药一次比 Gonal-F每日给药二次刺激产生的卵母细胞数还� � 多； FSH-Fc/Fc异二聚体刺激产生的卵母细胞数呈现一 定的剂量依赖性， 在 6pmol范围内， FSH-Fc/Fc异二聚体给药剂量与卵母细胞数呈正相 关， 6pmol时卵细胞数达到平台期， 随着剂量增加， 卵细胞数开始减少。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的 描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。