Der medizinisch-biotechnologische Forschungs-und Anwendungsbereich des Tissage Engineering stellt eine in den letzten Jahren immer intensiver genutzte Möglichkeit dar, verletzte bzw. fehlende Gewebestrukturen bzw. Organe durch

biotechnologisch hergestellte Transplantate zu ersetzen. In diesem Zusammen- hang liegt ein Schwerpunkt auf der Herstellung und Transplantation sogenannter autologer Transplantate. Das Prinzip dieser Transplantationstechnik besteht darin, dass einem Patienten Zellen des gewünschten Typs (z. B. Keratinozyten) aus ei- nem intakten Gewebebereich (Spenderareal) entnommen, anschließend in vitro kultiviert ("expandiert") und eventuell auf einen Träger aufgebracht und schließ- lich in das Empfängerareal des Patienten transplantiert werden.

Prinzipiell sind jedoch autologe Transplantate aus einer Vielzahl von Zelltypen herstellbar, beispielsweise aus Haut-, Knochen-, Knorpel-und Bindegewebe, so- wie weiteren Gewebetypen.

Weiterhin existieren dermatologische Indikationsgebiete, die häufig die Trans- plantation von großflächigen Hautarealen erfordern. Hierbei sind als wichtigste Indikationen insbesondere Brandverletzungen, posttraumatische Wunddefekte, nävoide Hautveränderungen, Narben und Keloide, sowie die aufgrund der erhöh- ten Lebenserwartung der Bevölkerung zunehmend an Bedeutung gewinnenden chronischen Ulzera unterschiedlicher Genese zu nennen.

Die bisherigen Therapiemaßnahmen bei der Transplantation von Haut basieren im wesentlichen auf den im folgenden vorgestellten Transplantationsmaterialien bzw.

Verfahren.

Zur Therapie von Verbrennungen wurden von O'Connor und Mulliken (Lancet, 1981, Vol. 10, Seiten 75-78) kultivierte Keratinozyten als mehrschichtige Epi- dermis (sog. Cultured epidermal autografts = CEA) erstmals 1981 erfolgreich angewandt. Als epidermaler mehrschichtiger Hautersatz für Patienten mit lebens- bedrohlichen Verbrennungen ist seit 1987 Epicel der Fa. Genzyme in USA, Kanada, Deutschland, Frankreich und Japan arzneimittelrechtlich zugelassen. Die mögliche Verwendung einer präformierten mehrschichtigen Epidermis wird je- doch durch eine lange Kulturdauer von ca. 4-5 Wochen vor Transplantation ein-

geschränkt, wobei zugleich die zu erzielende mögliche maximale Deckungsfläche (2 cm2 Biopsie entsprechen ca. 30 cm2 Transplantatfläche) begrenzt ist. Die dün- nen und mechanisch empfindlichen Transplantate stellen hohe Anforderungen an den Operateur und erfordern einen gut vorbereiteten Wundgrund. Außerdem sind die Zellen bereits differenziert und daher nur noch eingeschränkt proliferationsfä- hig. Dies führt häufig zu mechanisch instabilen Regeneraten und der Notwendig- keit wiederholter Retransplantationen (Cooper, 1993). Die in diesem Verfahren auch verwendeten autologen Keratinozyten, die aus 50-100 Haarwurzeln (E- pigraft, Fa. BioCare GmbH, Leipzig) gewonnen werden können, sind erst nach 6 Wochen in Form von Zellpellets verfügbar, welche jedoch keine vollständige Wundabdeckung erreichen.

Weitere aus dem Stand der Technik bekannte Transplantate stellen sogenannte Keratinozyten-Fibrinmatrix-Konstrukte dar. Die Verwendung subkonfluent kulti- vierter Keratinozyten erfolgt durch die Kombination bzw. Mischung proliferativ aktiver Zellsuspension mit einer Fibrinsuspension. Das Zell-Fibringemisch wird im Wundbett vorübergehend fixiert, so dass die Keratinozyten im Wundbett migrieren, proliferieren, sich im dreidimensionalen Fibrinnetz ausrichten und un- ter Umbau der Fibrinmatrix eine mehrschichtige Epidermis in situ rekonstituieren können. Die erste klinische Anwendung autologer Keratinozyten als Zellsuspensi- on in Fibrin erfolgte 1988 durch Hunyadi et al. (J. Dermatol. Surg. 07lCO/., 1988, Vol. 14, Seiten 75-78). Bei 16 von 20 Patienten mit Ulcera bis 25 cm2 konnte eine vollständige Reepithelisierung nach nur 2 Wochen erreicht werden. Seit 1993 wird die Keratinozyten-Fibrin-Glue-Suspension (KFGS) in der Chirurgischen Universitätsklink Freiburg, Abteilung Plastische und Handchirurgie, vornehmlich bei großflächigen Brandverletzungen (s. auch Stark et al., Eur. J. Plast. Surg., 1995, Vol. 18, Seiten 267-271) angewandt. Im Mausmodell zeigten KFGS- Transplantate im Vergleich zu präformierten mehrschichtigen Transplantaten (CEA, s. o. ) postoperativ eine höhere mittlere Epidermisdicke und eine intakte Basalmembran mit Expression von Kollagen Typ VII, welches in der CEA- Gruppe fehlte (Horch et al., Cell Tmnsplant 1998, Vol. 7, Seiten 309-317). Au-

ßerdem waren bei Verbrennungspatienten, wenn CEA zur Anwendung kam, im Vergleich zur KFGS-Transplantation häufigere Retransplantationen notwendig (Stark et al., Eur. J. Plast. Surg, 1995, Vol. 18, Seiten 267-271).

Desweiteren wurden zur Transplantation dermo-epidermale Allotransplantate verwendet, d. h. Transplantate, bei denen allogene Spenderzellen in einer al- loplastischen oder xenogenen Stützmatrix verwendet werden. In der EU ist seit 1994 als dermales Allotransplantat bislang AlloDermX der Fa. LifeCell Corpora- tion zugelassen, welches aus de-epidermisierter und dezellularisierter Spenderhaut Verstorbener besteht (Wainwright et al., J. Burn Care Rehabil., 1996, Vol. 17, Seiten 124-136). Weiterhin ist das Produkt TransCyteE) erhältlich, welches aus Vorhautfibroblasten in einem nicht resorbierbaren 3D-Nylongitter besteht und der temporären Defektdeckung dient, sowie Dermagraftg, bei welchem statt Nylon ein resorbierbares Vicrylgitter verwendet wird. Als erstes und bislang einziges zweischichtiges Komposithaut-Transplantat ist Apligraf0 (Graftskin) der Fa. Or- ganogenesis/Novartis Pharma AG seit Mai 1998 in USA, Canada und in der Schweiz zugelassen. Hierbei werden in vitro Vorhautfibroblasten in Suspension mit bovinem Typ I Kollagen polymerisiert. Anschliessend werden auf die kontra- hierte Kollagenmatrix allogene Keratinozyten (aus Vorhäuten Neugeborener) aus- gesät, die schliesslich durch entsprechende Kulturbedingungen bereits in vitro eine vollständig differenzierte und verhornende Epidermisoberfläche bilden (Muhart et al., Lancet, 1997, Vol. 350, Seite 1142).

Allerdings ergeben sich trotz der mit den oben dargestellten Verfahren erzielten Erfolge eine Reihe von bislang ungelösten Schwierigkeiten bzw. Nachteilen. Prä- formierte mehrschichtige epidermale Transplantate sind, da sie bereits differen- ziert sind, nur noch eingeschränkt proliferationsfähig und mechanisch instabil (s. z. B. CEA).

Allotransplantate (aus homologen Spenderzellen) weisen zum einen das Problem eines gewissen Infektionsrisikos auf. Weiterhin wird üblicherweise bei der Kulti-

vierung der zu transplantierender Zellen fetales Kälberserum (FCS) sowie als Matrix bovines Kollagen verwendet, wobei ein gewisses Infektionsrisiko mit BSE nach dem derzeitigen Stand der Wissenschaft nicht völlig ausgeschlossen werden kann. Die im Stand der Technik üblichen Dermisäquivalente weisen weiterhin eine präformierte Kollagenstruktur auf, die sich dem Wundareal häufig nicht op- timal mechanisch und physiologisch anpassen kann, so daß kosmetisch unbefrie- digende Transplantationsergebnisse erhalten werden oder sogar eine Abstoßung des Transplantates stattfindet. Außerdem ergibt sich aufgrund der Dicke der extra- zellulären Matrix, insbesondere bei alloplastischen Materialien (z. B. bei 3 D- Silikon-,-Nylon-,-Vicrylgittern), aber auch bei Kollagen-Gittern, eine Beein- trächtigung der Diffusionsstrecke von Nährlösungen bzw. Nährstoffen und damit der initialen Versorgung der Keratinozyten nach der Transplantation mit dem Ri- siko von Nekrosen. Dies ist vor allem auf eine mangelhafte bzw. gestörte dermo- epidermale Interaktion zurückzuführen, die die Neubildung bzw. Proliferation verschiedener Zelltypen (Fibroblasten und Keratinozyten) erfordert. Letztendlich führen diese Probleme zu einer verminderten mechanischen Stabilität des präfor- mierten Transplantates und damit zu einem höheren Risiko einer mißlungenen Transplantation.

Demzufolge ist es bisher nicht gelungen, ein Hauttransplantat zu entwickeln, das mechanische Festigkeit mit einer optimalen physiologischen und mechanischen Anpassung an das Wundareal bei gleichzeitig geringem Infektionsrisiko verbindet und das in akuten Fällen innerhalb kurzer Zeiträume zur Verfügung steht. Ferner existiert im Stand der Technik bis jetzt kein Transplantat, das auch in der Lage ist, bei profunden Verletzungen auch tiefere Wunden mit Granulationsgewebe auszu- füllen, was dazu führt, daß bei tieferen Wunden zunächst die"natürliche"Aus- füllung der Wunde mit körpereigenem Granulationsgewebe abgewartet werden muß, bevor z. B. eine Keratinozytensuspension zur Abdeckung des Oberflächen- areals aufgebracht werden kann. Weiterhin enthalten die bisher verwendeten Transplantate des Standes der Technik Kollagen, was dazu führt, daß die Synthese

von Kollagen und physiologischem Granulationsgewebe in der Wunde gehemmt bzw. erschwert wird.

Folglich bestand eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines Transplantatsystems, das ein geringes Infektionsrisiko für den Patienten darstellt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Transplantat- system bereitzustellen, das eine optimale physiologische und mechanische Anpas- sung des Transplantates an das Wundareal erlaubt, wobei neben oberflächlichen Wunden insbesondere erstmals die Behandlung von profunden Wunden unter Verwendung von fibrin-bzw. fibrinogenhaltigen Suspensionen autologer Zellen (Fibroblasten und Keratinozyten) ermöglicht werden sollte. Schließlich bestand eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von kolla- genfreien Zellsuspensionen (Keratinozyten und Fibroblasten) zur Verwendung als autologe Transplantate.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Zwei-Komponenten Zusam- mensetzung zur Behandlung von Hautdefekten, Ulzera, und Wunden umfassend die folgenden Bestandteile : a) Eine Fibroblastensuspension enthaltend Fibrin bzw. Fibrinogen als Matrix (Komponente a) ; und b) eine Keratinozytensuspension enthaltend Fibrin bzw. Fibrinogen als Matrix (Komponente b).

Die Zwei-Komponenten Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist insbesondere dadurch charakterisiert, dass kein präformiertes Transplantat ver- wendet wird, wie z. B. bei der CEA-Transplantation, sondern dass ein System be- stehend aus den zwei Suspensionen (Komponenten) a) und b) zur Wundheilung eingesetzt wird. Dies hat gegenüber den vorgeformten Transplantaten auf der Ba- sis von konfluent kultivierten Zellen entscheidende Vorteile. So bewirkt die erfin- dungsgemäß verwendete Zusammensetzung aus Fibroblasten und Keratinozyten,

dass in situ eine verbesserte dermo-epidermale Interaktion auftritt. Für die mecha- nische Stabilität einer dermo-epidermalen Junktionszone ist die Ausbildung einer kontinuierlichen, nicht fragmentierten Lamina densa sowie die Bildung von Ve- rankerungsfilamenten ("anchoring fibrils") von besonderer Bedeutung. Durch die mit der erfindungsgemäßen Zwei-Komponenten Zusammensetzung erreichte Koinkubation von Keratinozyten mit Fibroblasten in situ wird die Entwicklung nativer extrazellulärer Matrixstrukturen ermöglicht. Das Prinzip der Synthese ei- ner dermo-epidermalen Junktionszone im Sinne eines physiologischen Basal- membran-Äquivalents durch die Zellen selbst wird daher durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung realisiert. Desweiteren bietet die erfin- dungsgemäße Zwei-Komponenten Zusammensetzung den Vorteil, daß die bei präformierten Transplantaten des Standes der Technik auftretenden mechanischen Probleme bei der Transplantation, wie z. B. Zerreißen oder Verkleben des Trans- plantates, nicht auftreten können. Die für die Zellen gemäß (a) und (b) verwende- ten Suspensionskulturen werden vorzugsweise unter Reinraumbedingungen nach GMP-Standards hergestellt. Für den gesamte Herstellungsprozeß der erfindungs- gemäßen Zusammensetzung sind Bedingungen der Reinheitsklasse A gemäß GMP-Standard bevorzugt, d. h., es dürfen nicht mehr als 3500 Partikel, die min- destens 0,5 pm groß sind und 0 Partikel, die mindestens 5 um groß sind, pro Ku- bikmeter Luft vorhanden sein (bezügl. der Anforderungen an bestimmte Rein- heitsklassen siehe"EG-Leitfaden einer guten Herstellungspraxis für Arzneimittel- mit Betriebsverordnung für pharmazeutische Unternehmer" (1998), 5. Auflage, Hrsg. : G. Auterhoff ; Editio Cantor Verlag, Aulendorf). Die weiteren Verfahrens- schritte zur Herstellung von Suspensionskulturen sind dem Fachmann bekannt.

Die Bestandteile des Zwei-Komponenten Systems bestehend aus (a) und (b) um- fassen neben den suspendierten Fibroblasten bzw. Keratinozyten in einer bevor- zugten Ausführungsform jeweils Thrombin und Calciumchlorid, das durch vor- zugsweise simultane Zugabe von Fibrinogen beim Auftragen in die Wunde (z. B. mittels einer Zwillingsspritze) zu Fibrin reagiert und die Auspolymerisation der Matrix in der Wunde bewirkt. Dabei kann in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Zelllösung von Anfang an als Mischung mit

Fibrinogenlösung vorliegen und bei der Applikation in das Empfängerareal durch Thrombin/Calciumchloridzugabe aktiviert werden. In einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform findet die Mischung der Fibrinogenlösung zu der Zellsus- pension (die in diesem Fall bereits Thrombin und Calciumchlorid enthält) erst beim Aufbringen auf das Wundareal mittels Zwillingsspritze statt. Demzufolge umfasst die vorliegende Erfindung auch Zwei-Komponentenzusammensetzungen die die erfindungsgemäße Zusammensetzung erst unmittelbar vor dem Einbringen in das Empfängerareal aufweisen, d. h. es sind auch solche Zusammensetzungen umfasst, bei denen die Fibrinmatrix und die Keratinozyten bzw. Fibroblasten- suspensionen erst unmittelbar vor bzw. bei der Anwendung vereinigt werden.

Vorteilhafte Thrombinkonzentrationen liegen im Bereich von 50 bis 1000 i. E. <BR> <BR> <P>Thrombin/ml, bevorzugt ist eine Konzentration von 200 bis 800 i. E. /ml Lösung, besonders bevorzugt sind 500 i. E. Thrombin/ml. Vorteilhafte Calciumchloridkon- zentrationen liegen im Bereich von 0.1 bis 50 mg/ml, bevorzugt ist 1 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt 5,88 mg/ml Calciumchlorid (alle Angaben stellen Endkonzentrationen dar). Eine ausführliche Darstellung von Fibrinklebern als biologische Zwei-Komponenten Systeme sowie deren Anwendung und Handha- bung findet sich in EP 0 373 044, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug ge- nommen wird. Die verwendeten Kulturmedien sind auf den klinischen Einsatz am Menschen ausgerichtet.

Eine vorteilhafte Zelldichte der erfindungsgemäßen Zwei- Komponentenzusammensetzung beträgt sowohl für Bestandteil (a) als auch für Bestandteil (b) zwischen 0,5 bis 20 Millionen Zellen/ml Suspension, bevorzugt ist 1 bis 10 Millionen Zellen/ml, besonders bevorzugt 3 bis 6 Millionen Zellen/ml Suspension. Ein vorteilhaftes Zellmengenverhältnis der Bestandteile (a) zu (b) beträgt bei oberflächlichen Wunden 0,1 : 1 (a : b) bis 10 : 1 (a : b). Bevorzugt ist ein Zellmengenverhältnis von 0,5 : 1 bis 5 : 1 (a : b), besonders bevorzugt ist ein Verhält- nis von 1 : 1. Bei tieferen Wunden ist ein Zellmengenverhältnis bevorzugt, daß

einen Überschuß an Fibroblasten enthält, so daß ein besseres Auffüllen der pro- funden Wunde mit Granulationsmaterial ermöglicht wird. Der genaue jeweilige Ansatz der Suspensionskulturen hängt vom Einssatzzweck ab und liegt im Rah- men der Kenntnisse des Fachmanns auf dem Gebiet der Zellkultur (s. z. B. Hunya- di et al., J. Dermatol. Surg. Ofacol., 1988, Vol. 14, Seiten 75-78 ; O'Connor und Mulliken, Lancet, 1981, Vol. 10, Seiten 75-78).

Die sowohl in Komponente (a) als auch (b) enthaltene Fibrinmatrix besteht in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aus einem han- delsüblichen und arzneimittelrechtlich zugelassenen Fibrinkleber, wie z. B."Tis- sucol Duo S Immuno"der Firma Baxter. Im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten (präformierten) Transplantaten auf Kollagenbasis wirkt die erfindungsgemäße Fibrinmatrix der Zwei-Komponmentenzusammensetzung för- dernd auf die Migration, Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten, Fibroblasten und Endothelzellen (Clark et al., J. Invest. Dermatol. (1982), Vol.

79, Seiten 264-269 ; Tuan et al., Exp. Cell. Res. (1996), Vol. 223, Seiten 127- 134 ; Ongenae et al., Dermatol. Surg. (2000), Vol. 26, Seiten 447-451). Eine mögliche Erklärung für die o. g. Vorteile der erfindungsgemäßen Fibrinmatrix ist die Tatsache, daß die Anwesenheit von präformiertem Kollagen die Ausbildung weiterer dermaler Strukturen über einen Feed-Back Mechanismus hemmt (in der Art einer Produkthemmung), d. h. die Zellen erhalten bei Vorhandensein von Kollagen das Signal, die Proliferation herunterzuregulieren oder ganz einzustel- len. Desweiteren wurde gezeigt, dass Fibroblasten in 3D-Kollagengelen apopto- tisch werden (Fluck et al., J. Invest. Dermatol., 1998, Vol. 110, Seiten 153-157).

Derartige Effekte sind jedoch für ein frisch eingebrachtes Transplantat von gro- ßem Nachteil, da eine Zellmigration und Proliferation unbedingt erforderlich ist, um ein Verwachsen und Integrieren des Transplantates in die Wunde zu ermögli- chen und eine intakte dermo-epidermale Junktionszone auszubilden, die für ein stabiles physiologisches Transplantat erforderlich ist. Die erfindungsgemäße Zwei-Komponenten Zusammensetzung beseitigt dieses Problem und induziert physiologisches Granulationsgewebe, was zu einem physiologisch angepassten

Matrixumbau durch die beteiligten Zelltypen selbst führt und somit eine verbes- serte Textur des Unterhautgewebes sowie der dermo-epidermalen Junktionszone bewirkt. Da zur Wundheilung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zu- sammensetzung lediglich jeweils ein dünner Film der Komponenten (a) und (b) aufgetragen werden muß-in einer bevorzugten Ausführungsform findet flächen- deckende Benetzung des Wundareals statt-, verringert sich gegenüber Trans- plantaten des Standes der Technik die Diffusionsstrecke für Nährstoffe, angioge- netische Faktoren und andere regulatorisch aktive Substanzen. Demzufolge stellt die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Zwei-Komponentensystem bereit, das die Transplantatqualität, dessen Lebensdauer und die physiologische Integra- tion des transplantierten Gewebes gegenüber dem Stand der Technik deutlich ver- besser.

Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren in einer bevorzugten Ausfüh- rungsform eine Zwei-Komponenten Zusammensetzung gemäß dem obigen An- spruch, bei der die Fibroblasten-und/oder die Keratinozytensuspension aus auto- logen Spenderzellen des zu behandelnden Patienten gewonnen wurden. Zu diesem Zweck wird dem Patienten zunächst ein ca. 1 bis 2 cm2 großes Vollhautbiopsat entnommen, das anschließend in einer vorteilhaften Ausführungsform 2 bis 28 Tage in Kultur genommen wird, wobei 4 bis 21 Tage bevorzugt und 14 bis 18 Tage besonders bevorzugt ist. Mit 1 ml autologer thrombinhaltiger Keratinozyten- (b) bzw. Fibroblastenlösung (a), die in einer besonders bevorzugten Ausführungs- form 500 i. E. humanes Thrombin enthalten, oder, in einer bevorzugten Ausfüh- rungsform, in Fibrinogenlösung vorliegen und beim Einbringen in das Empfän- gerareal mit Thrombin/Calciumchloridlösung gemischt werden.

Die Komponenten (a) und (b), die in einer besonders bevorzugten Ausführungs- form der vorliegenden Erfindung 3 bis 6 x 106 Zellen umfassen, lassen bei ober- flächlichen Defekten die Transplantation von ca. 100 cm2 Wundfläche zu. Sind tiefere Wunden zu transplantieren, so ist ein größeres Mengenverhältnis von

Fibroblasten zu Keratinozyten vorteilhaft, wobei das genaue Verhältnis von der Tiefe der Wunde abhängt und im Einzelfall vom Transplanteur festgelegt werden muß.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ferner eine Zusammensetzung, bei der die verwendeten Fibroblasten-und Keratinozy- tensuspensionen im wesentlichen kollagenfrei sind. Dabei bedeutet"im wesentli- chen kollagenfrei", dass kein Kollagen zugesetzt wird und bereits vorhandenes Kollagen durch Behandlung mit Kollagenase entfernt wird. In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Kollagengehalt der ver- wendeten Zellsuspensionen des Zwei-Komponentensystems (a und b) auf 40 bis 60% der ursprünglich in der Suspensionskultur vorhandenen Ausgangsmenge reduziert, in einer bevorzugten Ausführungsform wird der Kollagengehalt auf 20 bis 40% der Ausgangsmenge reduziert ; besonders bevorzugt ist eine Reduktion des Kollagengehaltes auf unter 20% der Ausgangsmenge. Allgemein gilt, daß ein besonders niedriger Kollagengehalt (unter 20% der Ausgangsmenge) sich beson- ders vorteilhaft auf die physiologische Integration des Transplantates auswirkt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, bei der die verwendeten Fibroblasten-und/oder Kerati- nozytensuspensionen subkonfluent in Suspensionskultur vorliegen. Die verwen- deten Suspensionskulturen enthalten-im Gegensatz zu Transplantaten des Stan- des der Technik, die auf konfluenten, präformierten Kulturen basieren-Zellen, die nicht kontaktinhibiert sind und die somit ein erhöhtes Migrations-und Prolife- rationspotential besitzen. Demzufolge stellen subkonfluent wachsende Fibroblasten bzw. Keratinozyten eine an das erfindungsgemäße Zwei- Komponenten Zusammensetzung angepasste Form der Kultur dar, die im Gegen- satz zu präformierten Transplantaten eine biochemische und morphologische An- passung des Transplantats an die Wunde ermöglicht, da die darin enthaltenen Zellen noch nicht vollständig ausdifferenziert sind. Demgemäss dient in einer be-

vorzugten Ausführungsform Komponente a der erfindungsgemäßen Zusammen- setzung zum flexiblen"aufgranulieren"profunder Wunden und Komponente b zum Abschluss bzw. zur Epithelbildung auf der Wundoberfläche.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfin- dung eine Zusammensetzung, bei der die Fibroblasten-und/oder die Keratinozy- tensuspension einen Fibrinkleber als Matrix enthält. In einer vorteilhaften Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung werden handelsübliche Fibrinkleber ver- wendet, die arzneimittelrechtlich zugelassen sind, wie z. B. das Produkt"Tissucol Duo S Immuno"der Firma Baxter.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden kryo- konservierte Zellen eingesetzt. Die Kryokonservierung dient dem Aufbewahren gewonnener Spenderzellen bzw. Zellen aus dem Spenderareal des Patienten, die nicht unmittelbar, sondern zu einem späteren Zeitpunkt transplantiert werden sol- len. Die Kryokonservierung kann durchgeführt werden vor oder bei Erreichen der Subkonfluenz der jeweiligen Zellsuspension der Komponente (a) bzw. (b).

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die ein von bovinem Serum freies Medium umfasst. Die Verwendung von Medien ohne bovi- nes Serum stellt insoweit einen Vorteil dar, als das Infektionsrisiko, beispielswei- se mit BSE bzw. der neuen Form der Creutzfeld-Jacob Krankheit, das nach der- zeitigem Stand der Forschung nicht auszuschließen ist, minimiert wird. Verwen- dung finden stattdessen, wie bereits oben ausgeführt, bereits seit langer Zeit auf <BR> <BR> dem Markt etablierte Fibrinkleber bzw. -matrices. Des weiteren ist der bevorzugte Fibrinkleber frei von bovinem Kollagen.

Ferner können die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eingesetzten Fibroblasten-und Keratinozytensuspensionen gentechnisch modifizierte Zellen umfassen. Vorteilhaft sind in diesem Zusammenhang Zellen, in die mittels dem Fachmann bekannter Verfahren Gene bzw. Vektoren eingeschleust werden, die beispielsweise für chemotaktische und angiogenetische Faktoren, Hormone, Pep- tide oder Strukturproteine kodieren und somit den transplantierten Zellen wün- schenswerte Eigenschaften verleihen können.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausfüh- rungsform die Verwendung einer Zusammensetzung der hier in Rede stehenden Art zur Behandlung von chronischen Ulzera unterschiedlicher Genese, sowie zur Behandlung von Verbrennungswunden, posttraumatischen und postoperativen Wunddefekten nach Exzision, Dermabrasion und Laserablation, sowie von nävoi- den Hautveränderungen und Narben nach Dermabrasion.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in der Art, dass die Fibroblastensuspension (Komponente a) vor der Keratinozytensuspension (Komponente b) in die Wunde gebracht wird. In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Kompo- nente b wenige Sekunden bis Minuten nach der Komponente a) in die Wunde ge- bracht, in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt dieser Zeitraum Minuten bis mehrere Stunden, besonders bevorzugt sind Zeiträume von mehrere Tagen. Für beide Komponenten a und b gilt, dass die Suspensionen, die zunächst Fibrinogen und die jeweiligen Zellen umfassen, unmittelbar bei der Applikation in die Wunde in einer bevorzugten Ausführungsform mit der Thrombin und Calci- umchlorid enthaltenden Lösung gemischt werden, so dass die Polymerisation der Fibrinmatrix in situ stattfinden kann. In einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung liegen die Zellen (Komponenten a und b) in Thrombin/Calciumchloridlösung vor und werden bei oder unmittelbar vor der Applikation in der Wunde erst zur endgültigen Zwei-Komponenten Zusammen- setzung mit Fibrinogenlösung gemischt (mittels einer Zwillingsspritze).

Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer erfindungs- gemäßen Zusammensetzung, wobei die Fibroblastensuspension gemäß a) und/oder die Keratinozytensuspension gemäß b) vor der Verwendung mit einer Thrombinlösung gemischt werden. Für dieses Verfahren sind die für den oben genannten Verwendungsanspruch aufgeführten Zeitabstände bezüglich der Zuga- be der Komponente (a) bzw. (b) bevorzugt.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, wobei eine Thrombin enthaltende Fibroblastensuspension gemäß (a) und/oder eine Thrombin enthaltende Keratinozytensuspension gemäß (b) vor der Verwendung mit einer Fibrinogenlösung gemischt werden. Auch für dieses Verfahren sind die für den oben genannten Verwendungsanspruch aufge- führten Zeitabstände bezüglich der Zugabe der Komponente (a) bzw. (b) bevor- zugt.

Ferner können im Rahmen dieses Herstellungsverfahrens die Fibroblastensuspen- sion und/oder die Keratinozytensuspension vor der Herstellung der Komponenten (a) und (b) mit Kollagenase behandelt werden. Dies bedeutet, dass in den Zellsus- pensionen bzw. -kulturen vorhandenes Kollagen durch Behandlung mit Kollage- nase entfernt wird. In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Er- findung wird der Kollagengehalt der verwendeten Zellsuspensionen des Zwei- Komponentensystems (a und b) auf 40 bis 60% der ursprünglich in der Suspensi- onskultur vorhandenen Ausgangsmenge reduziert, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird der Kollagengehalt auf 20 bis 40% der Ausgangsmenge reduziert ; besonders bevorzugt ist eine Reduktion des Kollagengehaltes auf unter 20% der Ausgangsmenge. Allgemein gilt, wie bereits oben erwähnt, daß sich ein besonders niedriger Kollagengehalt (unter 20% der Ausgangsmenge) vorteilhaft auf die physiologische Integration des Transplantates in die zu therapierende Wunde bzw. Läsion auswirkt.

Ferner ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Kultivierung Fibroblastensuspension gemäß (a) und/oder der Keratinozytensuspension gemäß (b) unter Hypoxie möglich. Hartmann et al. fanden bereits 1997 bzw. 1999, dass unter Hypoxie kultivierte Zellen (hier : Endothelzellen bzw. Tumorzellen) eine Hochregulierung des Angiogeninspiegels aufwiesen (Hartmann et al., J. Invest.

Dermatol. 1997, Vol. 109, Seite 438 ; Hartmann et al., Cancer Res., 1999, Vol. 59, Seiten 1578-1583). Im Falle der Tumorzellen wird so sichergestellt, dass die für die Versorgung und das Wachstum des Tumors unabdingbare verstärkte Angio- genese induziert wird. Diesen Effekt nutzt die vorliegende Erfindung, da das Schicksal des transplantierten Gewebes in besonderem Maße von einer schnellen Vaskularisierung des Wundareals abhängt. Somit führt die temporäre Hypoxie einer oder beider zu transplantierender Komponenten des Zwei-Komponenten Systems dazu, dass diese Zellen verstärkt angiogenetische Faktoren sezernieren und damit eine Vaskularisierung des Wundareals fördern. Die durch die Hypoxie initiierte Vaskularisierung stellt somit eine Anpassung des Gewebes bzw. der Zellen an eventuell auftretende Sauerstoffmangelzustände dar.

Ferner können der Fibroblastensuspension (Komponente a) und/oder der Kerati- nozytensuspension (Komponente b) angiogenetische Faktoren zugesetzt werden.

Auch diese bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert auf dem Gedanken, dass eine möglichst schnelle Vaskularisierung des transplantierten Areals wünschenswert und vorteilhaft ist. Als angiogenetische Faktoren kommen z. B. VEGF, Angiogenin und verwandte Peptidfaktoren in Frage. Die erforderliche Dosierung und Applikation dieser Faktoren kann vom Fachmann routinemäßig auf die jeweilige Anwendung abgestimmt werden.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Zelltransplantat, erhältlich durch ein Verfahren wie vorstehend beschrieben.

Gemäß den voranstehend gemachten Ausführungen ist es im Rahmen der vorlie- genden Erfindung gelungen, eine Zwei-Komponenten Zusammensetzung zur Be- handlung von Hautdefekten, Ulzera und Wunden bereitzustellen, die-im Gegen- satz zu den präformierten Systemen des Standes der Technik-eine Transplantati- on von Fibroblasten und Keratinozyten erlaubt, die eine in situ Anpassung der subkonfluenten Zellen an das umgebende Wundgewebe erlaubt und sowohl die beschleunigte Bildung von Granulationsgewebe in der Wunde, als auch eine ra- sche Epithelbildung induziert. Somit können mit den vorliegenden Zusarnmenset- zungen bzw. Verfahren zu deren Herstellung erstmals auch profunde Wunden transplantiert werden, ohne dass auf die körpereigene Granulation der Wunde ge- wartet werden muß. Die weiteren Nachteile der herkömmlichen Transplantate wie mechanische Instabilität und Infektionsgefahr werden ebenfalls beseitigt bzw. vermindert.

Die vorliegende Erfindung soll abschließend in Form eines Beispiels erläutert werden.

Beispiel : Eine dem Patienten entnommene Hautbiopsie wird nach Desinfektion in eine ste- rile Umgebung gebracht, in der die Bedingungen nach Reinheitsklasse A gemäß GMP-Richtlinien herrschen. Dies geschieht beispielsweise durch Übertragung der Probe in einen Arbeitsisolator mittels eines Transferisolators, wobei jeweils nahe- zu vollständige Keimfreiheit herrscht.

Zur Herstellung der Zellsuspensionen bzw.-kulturen für die Komponenten a und b werden folgende Schritte, vorzugsweise unter den in Klammern angegebenen Reinheitsbedingungen gemäß GMP-Standard, durchgeführt : - Präparation der Hautbiopsie, mechanische Entfernung von Dermisresten (A)

Spülung mit 70%-igem Ethanol und dann mit PBS-Puffer (A) Enzymatischer Verdau zur Ablösung der Epidermis von der Dermis (mindestens 2,4 U/ml Dispase, entweder 4 Stunden bei 37°C oder über Nacht bei 4°C) (D) Trennung der Epidermis von der Dermis durch"Abziehen" (A) Zerkleinerung der Epidermis in einer PBS-Pufferlösung mittels sterilen Instrumente, beispielsweise Scheren oder Pinzetten (A) Enzymatische Dissoziation einzelner Zellen durch Trypsinierung (0,5%-ige Trypsinlösung ; 30 Minuten bei 37°C) (A oder D) Stoppen der Trypsinierung, beispielsweise durch Zugabe von Serum (A) Zentrifugation (zwischen 1500 und 4000 upm ; bei Raumtemperatur ; etwa 5 bis 10 Minuten) (D) Absaugen des Überstandes und Resuspension der Zellen in einem geeigneten Keratinozyten-bzw. Fibroblastennährmedium (z. B. in MEM-oder RPMI- Medium) (A) Aussäen der Zellen in Kulturflaschen (5000-50000 Zellen/cm2) (A) Kultivierung der Zellen bis zur Subkonfluenz (37°C, 5% C02, Mediumwechsel nach Bedarf, in der Regel jeden zweiten oder dritten Tag) (D) Die Herstellung einer autologen Keratinozyten- (b) bzw. Fibroblastensuspension (a) der Zwei-Komponenten Zusammensetzung geschieht dann folgendermaßen : Enzymatische Dissoziation einzelner Zellen durch Trypsinierung (0,5%-ige Trypsinlösung ; 30 Minuten bei 37°C) (A oder D) Stoppen der Trypsinierung, beispielsweise durch Zugabe von Serum (A) Zentrifugation (zwischen 1500 und 4000 upm ; bei Raumtemperatur ; etwa 5 bis 10 Minuten) (D) Resuspension der Zellen und Aufnahme der Zellen in Thrombin/Calciumchlorid- oder Fibrinogenlösung (4 Mio Zellen/0,5 ml (A)).

Nicht in Thrombinlösung aufgenommene Zellen werden entweder sofort oder nach erneuter Weiterkultivierung bis zur Subkonfluenz kryokonserviert.

Vor der Auftragung der Zwei-Komponenten Zusammensetzung wird das Wund- areal gereinigt und vorbereitet, z. B. durch Dermabrasion. Auf die entsprechenden Stellen wird zunächst die Suspension der autologen kultivierten Fibroblasten in Thrombin/Calciumchloridlösung aufgetragen (Komponente a), wobei die Ver- wendung einer Zwillingsspritze vorteilhaft ist, bei der eine Kammer die zu trans- plantierenden Fibroblasten in Thrombin/Calciumchloridlösung enthält und die andere Kammer Fibrinogenlösung, so dass eine Mischung der Zellen in Throm- bin/Calciumchloridlösung mit Fibrinogen in situ stattfindet. Hierbei ist zu beach- ten, dass die Bildungsgeschwindigkeit des Fibrins aus Fibrinogen und damit die Gerinnung über die Thrombinkonzentration steuerbar ist und somit vom Fach- mann die gewünschte Gerinnungszeit eingestellt werden kann.

Anschließend wird entweder direkt nach dem Auftragen der Komponente (a), bzw. einige Stunden oder Tage später (bezügl. der bevorzugten Zeiträumen s. o., Beschreibung) die Lösung (b), also Keratinozyten in Throm- bin/Calciumchloridlösung aufgetragen, wobei sich ebenfalls in der zweiten Kam- mer einer Zwillingsspritze Fibrinogenlösung befindet und eine Mischung der Fibrinogenlösung mit den Zellen in Thrombin/Calciumchloridlösung unmittelbar vor oder bei der Applikation in das Empfängerareal stattfindet.

Nun befindet sich die vollständige Zwei-Komponenten Zusammensetzung im Empfängerareal, so dass eine physiologisch und morphologisch angepasste Rege- neration des betroffenen Bereiches stattfinden kann.