L'invention concerne l'utilisation de D-alkyl- glucopyranosides et esters de ceux-ci pour la préparation de prodrogues capables de traverser la barrière hémato¬ encéphalique, les prodrogues obtenues et des précurseurs de celles-ci.

Le système nerveux central (SNC) est protégé des variations de concentrations des différents nutriments présents dans le compartiment sanguin. Cette protection lui est conférée par une barrière qui le sépare du sang : la barrière hémato-encéphalique (BHE). Très sélective, elle lui assure toutefois un approvisionnement constant dans les différentes substances dont il a besoin pour son fonctionnement.

Cependant, cette barrière peut devenir un obstacle majeur quand un dysfonctionnement apparaît au sein du SNC, comme peuvent le provoquer certains virus, certaines bactéries, les tumeurs cancéreuses, les manifestations épileptiques et autres maladies neurodégénératives (maladie d'Alzhei er, de Parkinson, chorée de Huntington). En effet, le transport de médicaments au sein du SNC, au travers de la BHE, à un niveau de concentration où ils seraient efficaces, est difficile, voire même impossible. Ce transfert constitue souvent l'étape limitante dans le traitement des affections centrales. Le cas des maladies neurodégénératives, et, en particulier, les démences séniles de type Alzheimer, représentent un nouveau défi pour 1 ' industrie pharmaceutique car ce type de démence progresse avec 1 'accroissement du vieillissement de la population. Les dernières estimations pour les Etats-Unis donnent les chiffres de 4 millions de patients aujourd'hui, et en prévoient 23 millions dans le monde en l'an 2000 dont 5 à 8 millions pour les seuls Etats- Unis. L'enjeu économique est énorme : plus de 2 milliards de

dollars par an seront nécessaires pour le traitement de ces maladies.

Il existe donc un besoin pour un moyen qui permettrait d'améliorer le passage à travers la BHE de substances actives, qui ne passent normalement pas ou très peu à travers la BHE, afin qu'elles puissent agir plus efficacement sur le SNC.

La présente invention vise à fournir un tel moyen.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation, comme transporteurs de médicaments vers le système nerveux central (SNC), de -D-alkylglucopyranosides et esters de ceux-ci ayant la formule générale (I) :

dans laquelle R _x est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C ₂ à C ₁₈ , de préférence n-butyle ; R ₂ est un groupe -CO-R où R est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé, en C ₅ à C ₁₇ , ou un groupe -C0-(CH ₂ ) _n -C00H où n = 4 à 14 ; R ₃ et R ₄ sont chacun, indépendamment, H ou le reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' où R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C ₅ à C ₁₇ , avec la condition qu'un seul des groupes R ₃ et R ₄ soit un reste -CO-R' .

L'invention est basée sur la découverte qu'on peut améliorer le passage de médicaments ou de neurotransmetteurs à travers la BHE par fixation de ceux-ci sur des composés transporteurs liposolubles appropriés. Les produits résultants appelés "prodrogues" (couple transporteur/composé actif) sont capables de traverser la BHE du fait qu'ils sont plus liposolubles que le composé actif individuel.

Pour obtenir une liposolubilité adéquate, il convient, bien entendu, de choisir un transporteur adapté au composé actif à transporter.

Les composés de formule ( I ) définis ci-dessus se prêtent bien à la fixation de composés actifs contenant un groupe carboxylique libre qui ne diffusent pas, ou très peu, à travers la BHE. En effet, les groupes -OH disponibles sur les composés de formule (I ) sont estérifiables par de tels composés avec production d'esters dont certains sont capables de franchir la BHE en proportion accrue par rapport au composé actif de départ. Dans le cas où R ₂ est un groupe - C0-(CH ₂ ) _n -C00H, ils se prêtent également à la fixation de composés actifs contenant un groupe amino ou hydroxyle primaire libre. En effet, le groupe amino ou hydroxyle peut réagir avec le groupe carboxyle libre du groupe -C0-(CH ₂ ) _n - COOH avec production d' amides ou d'esters.

Les composés résultants qui sont capables de franchir la BHE sont ceux qui présentent un caractère liposoluble.

Des exemples non limitatifs de composés hydrosolubles contenant un groupe carboxyle libre, ayant un intérêt pharmacologique en tant que médicaments ou en tant que neurotransmetteurs mais dont l'utilisation pour traiter des désordres ou maladies du SNC n'a pas donné jusqu'à ce jour les résultats escomptés en raison de leur trop faible transfert à travers la BHE, sont les acides aminés par exemple l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) et ses dérivés, la glycine, la DOPA et autres, des peptides courts (de 2 à 4 acides aminés, par exemple) et certains composés à action anti-inflammatoire qui comprennent un groupe carboxyle comme le Diclofenac®.

Selon le composé de formule (I) particulier utilisé, on peut faire réagir 2 ou 3 molécules de composé carboxylique par molécule de composé de formule ( I ) , selon que ce dernier comprend 2 ou 3 groupes -OH libres. Des exemples non limitatifs de composés actifs hydrosolubles contenant un groupe amino ou hydroxyle réactif

libre sont la dopamine, la sérotonine, etc.... On peut faire réagir une molécule de composé aminé ou hydroxyle par molécule de composé de formule (I) comprenant un groupe R ₂ à groupe carboxyle libre. Les composés de formule (I) utiles aux fins de l'invention sont ceux qui ont un caractère lipophile. La lipophilie d'un composé donné peut être déterminée à partir de son coefficient de partage P dans un mélange eau-toluène (1 : 1, en volume) : P = C _tol /C _eau où C _tol est la concentration du composé dans la phase "toluène", et

C _eau est la concentration du composé dans la phase aqueuse et est exprimée ci-après par la valeur Log P : Log P = Log C _tol - Log C _eau .

La concentration du composé dans chacune des phases peut être mesurée par dosage colorimétrique à 1'anthrone (λ _max =625 n ).

Compte tenu de la sensibilité des méthodes de mesure, les valeurs de Log P mesurées peuvent varier de -3 pour des composés fortement hydrosolubles, tels que le glucose, à +3 pour les molécules fortement liposolubles, comme le benzène ou 1'octanol.

Dans le cas d'un composé de formule (I), il faut qu'il présente une valeur de Log P d'au moins 0,50, de préférence d'au moins 1,4, de façon que sa lipophilie puisse contrebalancer 1'hydrophilie attachée au composé actif avec lequel il sera mis à réagir.

L'invention concerne également les composés, appelés ci-après prodrogues, obtenus comme résultat de la réaction des groupes -OH libres ou du groupe -C00H libre des composés de formule (I) par un composé réactif avec ledit groupe -

COOH ou lesdits groupes -OH.

Plus particulièrement, l'invention concerne les prodrogues répondant à la formule générale (II) :

où R _x est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C ₂ à C ₁₈ , de préférence n-butyle ; A est H, -CO-R" où R" est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C _τ à C ₁₇ , ou le reste -CO-X d'un composé actif HOOC-X comportant un groupe carboxyle réactif; B est un reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' où R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C ₅ à C ₁₇ , ou bien un groupe -C0- (CH ₂ ) _n -C00-W où n = 4 à 14 et est le reste d'un composé actif comportant un groupe amino primaire ou hydroxyle primaire ; D et E sont chacun, indépendamment, H ou un reste -CO-X ou -CO-R' ; avec les conditions que (i) lorsque B est -CO-R', au moins deux des groupes A, D et E sont -CO-X, et (ii) lorsque B est -CO-(CH ₂ ) _n -C00-W, A, D et E sont H, -CO-R' ou -CO-R" .

L'invention concerne aussi des précurseurs de prodrogues de la formule II, qui répondent à la formule générale III :

O

où R _x est tel que défini ci-dessus, le groupement -CO-X' est le reste d'un acide aminé ou d'un peptide dont le ou les groupes amino sont protégés, -CO-Z est un groupement -CO-X' ou un groupement -CO-R' tel que défini ci-dessus, au moins un des groupes -CO-Z étant -CO-X'.

De préférence le groupe amino de 1'acide aminé est protégé par un groupe t-butyloxy-carbamate (en abrégé t- Boc).

Les composés de formule (I) peuvent être préparés par estérification enzymatique de 1'α-D-alkylglucopyranoside approprié par un acide gras en C ₆ -C ₁₈ ou par un diacide dicarboxylique en C ₆ -C ₁₆ dans un solvant non polaire, tel que l'hexane, au reflux et en présence d'une lipase. Des exemples non limitatifs de lipases utilisables sont la lipase de Mucor miehei adsorbée sur une résine anionique, telle que le produit Lipozy e® ou la lipase de Candida antartica. telle que le produit Novozym®, toutes deux vendues par la Société NOVO INDUSTRI (Danemark) . Cette estérification produit principalement le monoester en position 6 avec un peu de diester en position 2, 6. Le 6- monoester peut être ensuite estérifié dans des conditions similaires pour donner le 2,6-diester. Les α-D- alkylglucopyranosides de départ sont des composés disponibles dans le commerce ou pouvant être obtenus par résolution enzymatique d'un mélange commercial de a- et β-

D-alkylglucopyranosides à l'aide d'une β-glucosidase.

Des acides gras utilisables sont, par exemple, l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide linoléique, l'acide oléique, etc.. Des diacides dicarboxyliques utilisables ont la formule H00C-(CH ₂ ) _n -C00H où n = 4 à 14. L'acide adipique et l'acide hexadécanedioïque sont des diacides préférés.

Certains des composés de formule (II), peuvent être préparés par couplage (estérification) d'un composé à groupe carboxylique libre avec les groupes -OH libres d'un composé de formule ( I ) . Si le composé à groupe carboxylique libre comporte un autre groupe fonctionnel susceptible de réaction pendant la synthèse, comme c'est le cas par exemple des acides aminés qui comportent un groupe -NH ₂ réactif, il convient de protéger cet autre groupe fonctionnel avant d'effectuer la réaction. Dans le cas d'un groupe -NH ₂ d'un acide aminé, on peut, par exemple, le protéger, au moyen du 2-(tert-butyloxycarbonyl-oxyimino)-2-phényl-acétonitrile(e n abrégé BOC-ON), comme décrit par exemple par Itoh, M.; Hagi ara, D et Kamiya, J. (1975), Tetrahedron Letters, 4393- 4394. Des acides aminés protégés sont, cependant, disponibles dans le commerce.

Le couplage du composé carboxyle éventuellement protégé avec le composé de formule (I) peut être effectué, par exemple, comme décrit par Hassner, A. et Alexanian, V. (1978) Tetrahedron Letters, 4475-4478,. ^' au moyen de N,N- dicyclohexylcarbodiimide en présence de N,N- diméthylaminopyridine dans CH ₂ C1 ₂ .

Selon le composé de formule (I) utilisé (diester ou monoester) , on peut coupler 2 ou 3 molécules de composé carboxyle par molécule de composé de formule ( I ) .

Après le couplage, on réalise, s'il y a lieu, la déprotection des groupes protégés, par exemple par hydrolyse à l'aide d'acide trifluoroacétique à 50% en volume dans CH ₂ C1 ₂ à 0°C pendant 30 mn, comme l'enseignent Lundt, B.F. ; Johansen, N.L. ; Volund, A. et Markussen, J. (1978), International Journal of peptide and protein Research 12,

258-268. Dans ce cas les composés de formule (II) sont obtenus sous forme salifiée (trifluoroacétate).

Dans le cas où on prépare des composés de formule II par réaction d'un composé de formule (I) où R ₂ est un groupe -CO-(CH ₂ ) _n -COOH avec un composé à groupe amino ou hydroxyle réactif', une opération de protection n'est pas nécessaire.

L'aptitude des composés de formule (II) et de leurs sels à franchir la BHE a été démontrée au moyen d'essais in vitro et in. vivo chez la souris. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés dans le but d'illustrer l'invention.

Exemple 1 : Préparation du α-D-butylglucopyranoside (composé 1)

277 ml d'une solution aqueuse contenant 50 g d'un mélange des anomères α et β du D-butylglucopyranoside

(disponible auprès de la Société CERESTAR HOLDING) comprenant 60% de 1'anomère α et 10 mM de tampon acétate de sodium (pH 5) ont été mis à incuber avec 27 g de poudre d'amande [contenant de l'enzyme β-D-glucosidase (EC : 3.2.1.2.1)] pendant 18h à 50°C. Au bout de ce temps

1'anomère β avait complètement disparu comme montré par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le mélange résultant a été filtré, puis concentré jusqu'à siccité. De 1'α-D-butylglucopyranoside (composé 1 ) (25 g, rendement 83%) a été extrait du résidu par du CH ₂ C1 ₂ chaud et utilisé sans autre purification pour la suite de la synthèse. Le composé 1 présente une valeur de Log P égale à

0,56.

Exemple 2 : Préparation de dérivés acylés du composé 1 (a) 1,7 g (8, 5 mmole) d'acide laurique et 1 g (4,23 mmol) du composé 1, préparé dans l'exemple 1 ont été ajoutés à de l'hexane bouillant dans un appareil Dean-Stark. On a ajouté 0,15 g de Lipozyme® (commercialisé par la Société NOVO INDUSTRI) et la suspension résultante a été agitée à 70 ^C C pendant 3 jours, temps après lequel la formation de diester a été détectée. On a filtré le mélange réactionnel et évaporé le solvant sous pression réduite. Une flash-

chromatographie sur colonne de silice (94 : 6 CH ₂ Cl ₂ -Me0H) du résidu obtenu (2,60 g) a donné le dérivé 6-0-lauroylé (composé 2 ) (1,4 g, rendement 80%). Le composé (2) avait un point de fusion de 25°C ; un pouvoir rotatoire [α] : + 29° (c 1,3, CHC1 ₃ ), un Log P égal à 0,87, et l'analyse IR a montré des raies à 3490 (OH), 2980 (CH) et 1730 (C = 0) cm ^-1 . Analyse calculée pour C ₂₂ H ₄₂ 0 ₇ : C, 63,10, H, 10,04. Trouvé : C, 62,72; H, 10,04.

(b) En utilisant le mode opératoire de la partie (a) ci-dessus si ce n'est qu'on a remplacé l'acide laurique par l'acide adéquat, on a préparé les dérivés 6-0-palmitoylé (composé 3_), 6-0-stéaroylé (composé 4) et 6-0-oléoylé (composé 5.). Le composé 4 a un Log P de 0,93. Le tableau 1 ci-après résume certaines données concernant les composés 3_, 4 et ϋ obtenus.

TABLEAU 1

σ m

30

5

33 rn

* C 1,3, CHC1,

(c) A un mélange fondu de 1 g (4,23 mmoles ) de composé 1 et de 2,41 g d'acide stéarique (8,46 mmoles) à 75°C, on a ajouté 0,15 g de Lipozyme®. Après 72h de réaction, une analyse par spectroscopie RMN C ¹³ a montré que le produit obtenu était un mélange de composé 4, du dérivé 2,6-0- distéaroylé (composé 6.) et du dérivé 3-0-stéaroylé (composé 2).

(d) Préparation du 2 , 6-di-O-stéaroyl-α-D- butylglucopyranoside (composé £) La synthèse du composé 6. à partir du composé 4 et de 1 équivalent d'acide stéarique a été réalisée selon le mode opératoire général de la partie (a) de l'exemple 2 ci- dessus. Le produit brut résultant a été soumis à une flash- chromatographie sur colonne de silice (98 : 2 CH ₂ Cl ₂ -Me0H) et on a obtenu le composé .6 avec un rendement global de 96%. Ce composé £ avait les propriétés suivantes : Pf 42°C ; Log P = 1,76 ; [α] : + 34° (c 1,3, CHC1 ₃₎ ; γ 3480 (OH), 2970 (CH) et 1730 (C ≈ 0) cm ^-1 . Analyse calculée pour C ₄₆ H ₈₈ 0 ₈ : C, 71,82 ; H, 11,53. Trouvé : C, 71,74 ; H, 11,52. II est à noter qu'en l'absence d'enzyme, il ne se forme pas d'esters.

(e) Préparation du 2-0-lauroyl-6-0-stéaroyl- -D- butylglucopyranoside (composé £)

On a fait réagir du composé 4 (lg, 1,99 mmole) et de l'acide laurique (0,4 g, 1,99 mmole), comme décrit en (a) ci-dessus pour la préparation du composé 6 . On a obtenu, après purification par flash-chromatographie comme décrit en (d), 1,30 g de composé . (rendement global 96%). Le composé S avait les propriétés suivantes : Pf 39°C ; [α] : + 58° (c l, 16, CHC1 ₃ ). Analyse élémentaire calculée pour C ₃₄ H ₆₄ 0 ₈ : C, 67,96 ; H, 10,73. Trouvé C, 67,92 ; H, 11,10.

(f) Préparation du 2 , 6-di-O-lauroyl-α-D- butylglucopyranoside (composé 9 _. )

On a préparé le composé 9_ en suivant le mode opératoire utilisé en (d) ci-dessus si ce n'est qu'on a remplacé l'acide stéarique par de l'acide laurique.

Le point de fusion de ce composé est inférieur à la

température ambiante et n'a pas été mesuré. Spectrométrie de masse : M ⁺ + 17 : 618 ; M+ 601. Le composé £ a un Log P égal à 1,41.

Les composés 2 à &, £ et £ sont des composés répondant à la formule générale ( I ) . Exemple '3 :

On a préparé des composés (prodrogues) de la formule II à partir des composés 2 , 4 , 6 _. , et et de l'acide 4-amino- butyrique ou acide 4-amino-butanoïque (en abrégé GABA) après protection du groupe amino réactif de ce dernier. Des formes protégées du GABA sont disponibles dans le commerce, en particulier sous l'appellation t-boc-GABA. Le GABA est un acide aminé que l'on a choisi comme médicament-modèle car, outre le fait que le GABA ne peut pas franchir la BHE dans des conditions normales, il est connu que son métabolisme est altéré lors de maladies telles que les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, d'Huntington et l'épilepsie. Les composés de formule II obtenus (prodrogues de GABA) ont été évalués, en ce qui concerne leur aptitude à franchir la BHE sur un modèle in vitro de BHE. On a également évalué leurs propriétés biologiques in vivo sur la souris par un test de sélection de médicaments anticonvulsivants.

A) Préparation du 6-0-lauroyl 2.3 _r 4-tri-0(N-tBoc 4- aminobutanoyl ) -D-butylglucopyranoside (composé 12) 1,31 g (5,5 mmoles) de composé 2 , 3,75 g (18,14 mmoles) de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC),.0,22 g (1,8 mmole) de N,N-diméthyl-amino-4-pyridine (DMAP) et 3,7 g (18,15 mmoles) de tBoc-GABA de formule (CH ₃ ) ₃ C0C0NH(CH ₂ ) ₃ C00H (vendu, par exemple, par la Société ALDRICH CHEMICALS) sont dissous, sous agitation magnétique, dans 30 ml de dichlorométhane, à température ambiante, sous atmosphère d'azote. Un précipité apparaît quelques minutes après 1 ' addition des réactifs (correspondant à la N,N' -dicyclohexylurée (DCU)), et le milieu réactionnel est agité pendant 2 heures supplémentaires. Le précipité est alors éliminé par filtration, et le filtrat lavé successivement avec des solutions aqueuses d'HCl 0,1 N, de NaHC0 ₃ à 5% et de NaCl

saturé. La phase organique, séchée sur sulfate de sodium est évaporée à sec. L'huile jaune résiduelle est purifiée par flash chromatographie sur gel de silice pour conduire à 2,95 g (3 mmoles) de produit final, avec un rendement global de 70% après purification.

Le composé 12 a les propriétés suivantes :

- Pouvoir rotatoire [ ] ₂₀ +58° (C 0,4,CH ₃ 0H)

- Point de fusion : 89°C

- Analyse infra-rouge (NaCl) : v-N-H amide : 3454 cm ^-1 v-CH, CH ₂ ,CH ₃ : 2979,2960 cm' ¹ v-(CH ₃ ) ₃ C (déformation C-H) : 1393/1363 (rapport 1/2) cm ^'1 v-C=0 ester : 1745 cm ^"1 v-C=0 carbamate : 1654 cm" ¹ v-(CH ₃ ) ₃ C (squelette tBoc) : 1250 cm ^"1 Analyse élémentaire pour C ₅₃ H ₉₅ N ₃ 0 ₁₆ : Cale. : C : 60,43 H : 9,03 N : 4,31 Trouvée : C : 60,35 H : 8,53 N : 4,20 B) Préparation du 6-0-lauroyl 2 , 3.4-tri-0-(4-ammonium- butanoyl ) α-D-butylglucopyranoside-tris-trifluoroacétate (composé 221

0,2 g (2,06 x 10 ^"4 mole) de composé 12 est dissous sous agitation, à 0°C, dans 1,5 ml de CH ₂ C1 ₂ , et sous atmosphère d'azote, 1,5 ml d'acide trifluoroacétique sont alors additionnés et 30 min après, le milieu réactionnel est amené à sec par distillation sous pression réduite. L'huile résiduelle est purifiée par chromatographie sur couche mince (CCM) préparative sur silice greffée RP-18. La bande correspondant au produit, est grattée, lavée par du méthanol et concentrée. Cette phase méthanolique, diluée 30 fois dans de l'eau, est lyophilisée pour conduire à 0,205 g de produit final avec un rendement quantitatif.

Le composé 22 a les propriétés suivantes :

- Pouvoir rotatoire : [α] ₂₀ + 52°(C 0,434,CH ₃ OH) - Point de fusion : hygroscopique.

- Analyse infra-rouge (KBr) : v-NH ₃ ^* : 3250 cm ^"1

v-CH,CH ₂ 2924 cm" ¹ v-C=0 ester 1739 cm ^"1 v-COO" 1677 cm' ¹ v-CF 1197,1135 cm" ¹ Analyse élémentaire pour C ₄₀ H ₆₆ F _g N ₃ O ₁₆ : Cale. ^• : C : 47,29 H : 6,50 N : 4,13 Trouvée : C : 46,93 H : 6,83 N : 4,09

En suivant les modes opératoires généraux décrits dans les parties A) et B) ci-dessus, si ce n'est qu'on est parti d'un composé de formule I différent, on a préparé une série de précurseurs de prodrogues et une série des prodrogues correspondantes comme récapitulé dans le tableau II suivant:

TABLEAU II

Les précurseurs de prodrogues répondaient à la formule générale III où R _{l r} Z, X' et Y avaient les significations suivantes :

Les prodrogues répondaient à la formule II où R _{l r} D, A, E et B avaient les significations suivantes :

Les précurseurs de prodrogues avaient les propriétés suivantes :

o

30 m CSΛ

3>

3D m en - Analyse infra-rouge (KBr) : voir les données du composé 12

La prodrogue 24 avait les propriétés suivantes :

- Pouvoir rotatoire [α] ₂₀ +38°C (c 0,47, CH ₃ 0H) Analyse élémentaire pour C ₄₆ H ₇₈ F ₉ N ₃ 0 ₁₆ ,H ₂ 0 :

Cale. : C : 49,42 H : 7,16 N : 3,76 Trouvée : C : 49,33 H : 7,48 N : 3,70.

La prodrogue 26 avait les propriétés suivantes :

- Pouvoir rotatoire [α] ₂₀ +32° (c 3,33, CH ₃ 0H) Analyse élémentaire pour C ₅₈ H ₁₀₄ F ₆ N ₂ O ₁₄ , 2H ₂ 0

Cale. : C : 58,09 H : 9,01 N : 2,33 Trouvée : C : 58,11 H : 8,66 N : 2,17.

Le prodrogue 2£ avait les propriétés suivantes :

- pouvoir rotatoire [α] ₂₀ +55° (c 0,67, CH ₃ 0H) Analyse élémentaire pour C ₄₆ H ₈₀ F ₅ N ₂ 0 ₁₄ ,H ₂ 0

Cale. : C : 54,33 H : 8,07 N : 2,76 Trouvée : C : 54,27 H : 8,03 N : 2,89

Toutes les prodrogues ont été obtenues sous forme d'une poudre ou d'une huile blanche avec un rendement global de synthèse de l'ordre de 60%.

L'aptitude des prodrogues de l'invention à franchir la BHE plus aisément que le GABA lui-même a été démontrée d'abord par un test in vitro _r puis par un test in. vivo chez la souris. Tests in vitro :

Dans ces tests, on a utilisé un modèle in vitro de BHE développé à 1 ' Institut Pasteur de Lille et décrit par Marie-

_*

Pierre Dehouck et coll. dans Journal of. Neurochemistry, 58, 1790-1797 (1992) auquel on pourra se reporter pour plus de détails.

En bref, le test consiste à placer une solution de Ringer-HEPES (NaCl, 150 mM ; KC1, 5,2 mM ; CaCl ₂ , 2,2 mM ; MgCl ₂ 6H ₂ 0, 0,2 mM ; NaHC0 ₃ , 6 mM ; HEPES [N-( 2-hydroxyéthyl )- pipérazine-N ¹ -(acide 2-éthanesulfonique)] , 5 mM ; glucose 2,8 mM) dans le compartiment inférieur d'une boîte à 6 puits (2ml par puits). Un filtre imprégné de collagène et recouvert d'une monocouche de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de boeuf produites comme décrit par Dehouck et coll., supra _r est transféré dans le premier

puits. 2 ml de la solution de Ringer-HEPES contenant la molécule à tester sont déposés dans le compartiment supérieur du filtre, à la concentration de 150 μM. Au temps 10, 20, 40, 60, 90 et 120 min après addition de la molécule, les filtres sont transférés dans un autre puits afin de réduire au maximum le retour de la molécule du compartiment inférieur vers le compartiment supérieur.

Les expériences sont réalisées sur trois séries de puits, avec des filtres couverts de cellules endotheliales de capillaires cérébraux ou de collagène seul comme témoin. La quantité de substance est déterminée dans les différents compartiments inférieurs en comptant la radioactivité ou en dosant la molécule froide par CLHP.

Lors de chaque expérience, 3 filtres, pris au hasard dans la série, sont utilisés afin de déterminer la perméabilité au saccharose et à 1'inuline (ces substances ne diffusent pas dans des conditions physiologiques), dans le but de vérifier 1'intégrité de la monocouche de cellules endotheliales. Afin de déterminer le coefficient de perméabilité endothéliale (Pe) des prodrogues, la clairance, exprimée en μl, de chaque substance est déterminée suivant la formule développée suivante :

Clairance (μl) = Q/S où Q est la quantité de substance dans le compartiment inférieur où S est la concentration de substance dans le compartiment supérieur.

Pendant 60 min, la clairance augmente linéairement avec le temps. Sur le graphe clairance = f(t), la mesure de la pente correspond à la valeur du "PSt" où PS correspond au produit de la perméabilité par la surface de la monocouche de cellules endotheliales, exprimé en μl/min. Pour les filtres témoins, "PSf" est calculé de la même façon. La perméabilité de la monocouche de cellules endotheliales seule (PSe) est donnée par la relation suivante :

1/PSe = 1/PSt - 1/PSf

Le coefficient de perméabilité endothéliale "Pe" est calculé en divisant PSe par la surface de la monocouche de cellules endotheliales (4,2 cm ² ). Le coefficient "Pe" s'exprime en cm/min.

Le GABA a servi dans cette étude. Il est connu pour ne pas diffuser de façon significative au travers de la BHE. L'évaluation du transfert du GABA sur ce modèle in vitro de BHE a constitué la première étape.

La méthode de dosage du GABA fait appel à un comptage radioactif, ce qui implique l'utilisation de GABA marqué au ¹⁴ C.

Dans le Tableau ci-dessous, les valeurs de perméabilité du GABA obtenues dans une série d'essais sont présentées.

*Les valeurs entre parenthèses correspondent aux coefficients de régression linéaire des droites dont les coefficients PSt et PSf sont les pentes.

La valeur du Pe du GABA obtenu confirme que le GABA ne passe que très faiblement au travers de ce modèle de BHE.

Pour pouvoir comparer les différentes valeurs de Pe obtenues au cours de toutes les expériences, on a divisé la valeur de Pe d'une prodrogue par celle du GABA obtenue dans la même série d'expériences. Ceci a abouti à 1'expression d'un coefficient "C", défini comme suit :

C = Pe prodrogue ,/'P ^x e GABA

Etude du transfert des prodrogues 22. 24. 26 et 29 sur le modèle in vitro de BHE.

Afin de pouvoir mesurer par comptage radioactif le Pe de chacune des prodrogues précitées, on a préparé des

prodrogues 22, 24, 2è et 29 marquées au ¹⁴ C en effectuant leur synthèse comme décrit plus haut si ce n'est qu'on est parti de GABA radioactif marqué au ¹ C. Le Pe a été déterminé par comptage radioactif comme le GABA. Le Tableau ci-dessous présente l'ensemble des valeurs des différents coefficients de perméabilité ainsi que les valeurs du coefficient C pour les prodrogues de la famille des esters liposolubles par un comptage radioactif.

*C = Pe/Pe _GABA

Ces résultats montrent que les 4 prodrogues testées diffusent mieux que le GABA au travers de ce modèle in vitro de BHE, en particulier les prodrogues 22, 2ϋ et 22.. Il est intéressant de noter que le composé 22 possède un coefficient C identique à celui du glucose, molécule elle- même connue pour être bien transférée au travers de ce modèle et à travers la BHE par un mécanisme de transport actif. Tests in vivo

L'activité inhibitrice du GABA et des prodrogues de 1'invention sur le SNC a été évaluée par un test de sélection de médicaments anticonvulsivants. Ce test consiste à rechercher, pour une substance donnée, la protection qu'elle confère à des souris vis-à-vis d'une crise épileptiforme induite par la picrotoxine.

La crise induite est caractérisée par 1 'apparition chronologique des phénomènes suivants :

* tremblements, * catatonus : raidissement de la queue,

* crise clonique : secousses musculaires associées à des mouvements myocloniques,

* crise tonique : flexion/extension des pattes postérieures, * décès.

La protection de la crise épileptiforme, conférée par une prodrogue, sera évaluée par le pourcentage de survie. Picrotoxine

L'agent convulsif (la picrotoxine) a été injecté par

voie i.p. chez la souris, à raison de 7,5 mg/kg, correspondant à la DL ₅₀ (Merck index, Xlème Edition, 1989). Dans les conditions expérimentales utilisées au cours de cette étude, 17% et non 50% des souris ont survécu à l'injection de picrotoxine. Une dose plus importante de picrotoxine n'aurait pas permis de constater une éventuelle protection par les prodrogues, alors qu'à une dose plus faible (5mg/kg) 80% des animaux ont survécu. De ce fait, l'utilisation de cette dose de convulsivant n'aurait pas permis d'observer une différence entre le GABA et les prodrogues.

Dans ces conditions, le décès apparaît 24,2 ± 1,9 min (n = 42) après l'injection de picrotoxine (temps de référence). Les prodrogues et le GABA sont injectés par voie i.p. 15 min avant l'injection de picrotoxine. GABA

Les résultats obtenus après injection de doses croissantes de GABA, sont consignés dans le Tableau ci- après:

rn» rn σ rn

3θ m

3> m t

nimaux n d'apparition du décès exprimé en minutes écarts à la moyenne

Le GABA ne confère aucune protection vis-à-vis du décès pour des doses comprises entre 50 et 200 mg/kg. Le pourcentage de survie est de 0% et, bien qu'inférieur au résultat obtenu en l'absence de GABA, il n'est pas significativement différent. Prodroσues 26 et 29 :

Ces prodrogues incluent au sein de leur structure 2 molécules de GABA. Dans le but d'avoir un élément de comparaison entre les différentes prodrogues, la dose administrée a été ramenée à une dose en μmol/kg de GABA injecté. Les valeurs des pourcentages de survie et des TMAD obtenus pour les prodrogues de la famille des esters liposolubles, en fonction de la dose injectée, sont présentées dans le Tableau ci-après.

rn

m

o m

m 30 CD r en

n : Nombre d'animaux

TMAD : Temps moyen d'apparition du décès exprimé en minutes

SEM : Somme des écarts à la moyenne

On voit d'après les résultats ci-dessus que les prodrogues 2£ et 22. permettent de doubler le pourcentage de survie par rapport à la picrotoxine (33%) aux doses de 200 et 100 mg/kg respectivement. Le fait de doubler ces doses ne permet pas toutefois de constater une amélioration : un plateau d'activité semble donc atteint.

Il est intéressant de noter qu'à aucune dose il n'a été rapporté de toxicité aiguë provoquant le décès avant l'injection de picrotoxine. Ces résultats montrent que les prodrogues de 1'invention sont des agents thérapeutiques potentiellement utiles pour traiter les dysfonctionnements et maladies du SNC, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, l'épilepsie, etc..., ainsi que les phénomènes d'anxiété et de stress.

Les prodrogues de 1'invention peuvent être administrées par voie intrapéritonéale sous forme de suspension aqueuses, par exemple à des doses de 10 à 100 μmole/kg de poids du corps. Pour la prodrogue 23. cela correspond à environ 5 à 50 mg/kg de poids du corps.

Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et que l'on pourrait les modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention.