ULTRAMIKROEMULSIONEN AUS

SPONTAN DISPERGIERBAREN KONZENTRA TEN

MIT ANTITUMORAL UND ANTIVIRAL WIRKSAMEN

ESTERN VON BACCATIN-Ill-VERBINDUNGEN

EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Ultramikroemuisionen aus spontan disper- gierbaren Konzentraten mit Estern von Baccatin-Iil, 10-Deacetylbaccati n-lll und 14-OH-10-Deacetylbaccatin-ill, diese Taxanester selber, Verfahren für ihre Herstellung und ihre Aufarbeitung zu spontan dispergierbaren Konzen-traten, deren Verwendung zur Erzeugung von gut verträglichen Heilmitteln mit antitumoraler und/oder antiviraler, bzw. viruzider Wirksamkeit, zur Bekämp¬ fung von Ekzemen und Schuppenflechte, sowie zur Tumorprophylaxe und Tumortherapie, wie auch zur gesteigerten Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren.

Die erfindungsgemässen Ester von Baccatin-III, 1 0-Deacetylbaccati n-Ill und 14-OH-10-Deacetylbaccatin-lil haben eine sehr gute antitumorale und anti- virale, bzw. viruzide Wirkung, und sie eignen sich auch zur Behandlung von Ekzemen und Psoriasis. Die therapeutischen Eigenschaften dieser Ester tre¬ ten aber erst dann massgeblich verstärkt auf, wenn sie in spontan disper- gie rbare Konzentrate eingearbeitet und darauf mit destilliertem Wasser oder 5%-GlucoseIösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) ver¬ dünnt worden sind, wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemul¬ sionen ergeben, mit sich ausbildenden Mizellen von einem hyd rodynami¬ schen Radius von 2.2 bis 3.0 nm.

BESCHREIBUNG der ERFINDUNG

Die erfindungsgemässen Ester von Baccatin-III, 10-Deacetylbaccatin-lll und

14-Hydroxy-10-deacetylbaccatin-lll haben die allgemeinen Formeln (I) bis (IM):

(I) = BACCATIN III; R ¹ = R ³ = H, R ² = COCH3, R ⁴ = H

(II) 10-DEACETYLBACCATIN-lll; R ¹ = R ² = R ³

(III) = 14-HYDROXY-10-DEACETYLBACCATIN-III; R = R H,

R = OH

.1-4 wobei R für Wasserstoff, Acetyl oder eine C ₆ -32-Alkylcarboxyl-, eine Cβ-3 ₂ -

Alkenylcarboxyl-, eine Cβ-s _∑ -Alkapolyencarboxyl- oder eine Retmoylcarboxyl- gruppe stehen.

Besonders bedeutungsvoll sind die Verbindungen der Formel (I), worin R

3 und R für eine C _{12 22} -Alkylcarboxyt-, eine Cii. ₂₂ -Alkenylcarbc.xyl- oder eine

Cιι. ₂₂ -Alkapolyencarboxylgruppe stehen.

Beispiele von Verbindungen nach Formel (I) sind u.a.:

7,13-Dιundecenoylbaccatιn-lll

7,13-Dιlauroylbaccatin-lll

7,13-Dιpalmιtoyl baccatin-III

7, 13 -Di stearoyl baccatin-III

7,13-Baccatιn-lll-dι-olsaureester

7,13-Baccatιn-lll-dι-lιnolsaureester

7,13-Baccatιn-lll-dι-lιnolensaureester

7,13-Baccatin-lll-dt-arachιdat

7,13-Baccatιn-lll-dι-behenat

7 -La uroyl baccatin-III

7 -Palmitoyl baccatin-III all trans-Retinoylbaccatin-lll

Beispiele von Verbindungen nach den Formeln (II) und (III) sind u.a.: 10-Deacety I-7, 10-dilauroyl baccatin-III 10-Deacety 1-14ß-hydroxybaccatin-7,10,14-tri laurat 1 O-Deacety 1-14 ß-hydroxybaccat in-7,10-dilau rat 10-Deacetyl-14ß-hydroxybaccatin-10,14-dilaurat

Das Fettschwanzprinzip und die Bildung von Ultramikroemulsionen bei TAXAN-Estern

In neuerer Zeit sind mehrere Diterpene mit dem ungewöhnlichen Taxangerust aus Vertretern der Genera Taxus. Cephalotaxus und Austrotaxus isoliert wor¬ den; siehe z.B. S. Blechert und D. Guenard in "The Alkaloids" (Ed. A. Brossi), Vol. 3j[, S. 195-238, Academic Press, N.Y., 1990, sowie M. Suffness und G.A. Cordell, ibid., Vol.25, 1985.

Wegen ihrer teilweise ausgezeichneten cancerostatischen Wirkungen haben Taxan-Derivate grosse Aufmerksamkeit erregt. Gegenstand dieser Patent¬ schrift sind Ergebnisse aus Untersuchungen zu den Taxan-Derivaten Bacca¬ tin-III, sowie seinen hydroxylierten Modifikationen 10-Deacetylbaccatin-lll (10-DAB) und 10-Deacetyl-14ß-hydroxybaccatin-lll (14-OH-10-DAB).

BACCATIN III (IV)

10-DEACETYLBACCATIN-lll (V)

14-OH-10-DEACETYLBACCATIN-III (VI)

Baccatin-III ist erstmals aus dem Kernholz der Eibe (Taxus baccata. L.) iso¬ liert, charakterisiert und strukturell aufgeklart worden: W.R. Chan, T.G. Halsall, G.M. Hornby, A.W. Oxford, W. Säbel, K. Bjόmer, G. Ferguson, J. Monteath Robertson, J.Chem.Soc, Chem.Comm. 1966.923; D.P. Della Casa de Marcano, T.G. Halsall, G.M. Hornby, ibid. 1970. 216 und 1975. 365. In bioge¬ netischer Hinsicht ist Baccatin-III in der Pflanze der direkte und spezifische Vorläufer von TAXOL [P.E. Fleming, A.R. Knaggs, X.-G. He, U. Mocek, H.G. Floss, J.Amer.Chem.Soc.1994. 116, 4137].

Taxol (Paclitaxel) gilt in der therapeutischen Anwendung als potentes Cyto- staticum [vgl. Antitumor Compounds of Natural Origin: Chemistry and Bio- chemistry, Vol. II; Ed. Adorjan Aszalos, NCI, CRC Press, Boca Raton, 1980, pp. 170, 175] und als Antitumormittel; es wird gegenüber Baccatin-III als deutlich wirksamer eingestuft. Ob dies auf die Veresterung der Hydroxyl¬ gruppe an C(13) durch die substituierte Zimtsäure oder aber auf andere Fak¬ toren zurückgeführt werden kann, ist bis heute offen geblieben. Wegen seiner relativ ausgeprägten Polarität, seinem hohen Schmelzpunkt und seiner sehr geringen Loslichkeit in Wasser bereitet Baccatin-III erhebliche Schwierig¬ keiten bei seiner Formulierung zu einem pharmazeutischen Präparat für die intravenöse Anwendung, was aber auch für Taxol-W.S. zutrifft. Vgl. dazu Blechert und Guenard, I.e., S. 232. Baccatin-III, wie neuerdings auch 10-De- acetylbaccatin-lll wurden aber als Ausgangsmaterial zu zahlreichen Partial- synthesen eingesetzt. Siehe auch: Kyriacos Costa Nicolaou et al.: "Chemie und Biologie von Taxol", Angew.Chem. 1994, 106, 38-69 und 1672-1675, sowie Lutz Heide: "Pharmazeutische Biologie im Blickpunkt", Pharmazie in unserer Zeit / 23. Jahrg. 1994 / Nr. 2 (pp. 100-104).

10-Deacetylbaccatin-lll (Formel V) wurde aus Nadeln von Taxus baccata ge¬ wonnen (Isolierung und Strukturbestimmung: G. Chauviere, D. Guenard, F.

Picod, V. Senilh, P. Potier, C.R. Seance, Acad.Sci.Ser. 2, 1981, 293, 561) und für 10-Deacetyl-14-ß-hydroxybaccatin III (Formel VI) wurde deren Vorkommen in Taxus wallichiana. Zucc, genutzt. Vgl. u.a. EPA 93102633.0/0 559 019 vom 08.09.93 (Indena S.p.A., Milano), sowie: E. Bombardelli und B. Gabetta, J.Chem.S., Perkin Trans. I (1992) (21), 2925-29; (1993) (14), 1563-6.

Dass die Aufbereitung von Taxol und Taxol-Analogen zu erfindungsgemäs¬ sen, spontan dispergierbaren Konzentraten und die Herstellung daraus von wässerigen Ultramikroemulsionen entscheidende Verbesserungen in der Bio- verfugbarkeit und demnach der Bioreaktivität und relativen Toxizitat bringen, wurde in der Prioritats-Patentschrift CH 282/95-1 vom 4. Dezember 1995 auf¬ gezeigt. Wir haben nun gefunden, dass die Anwendung des oben erwähnten Fettschwanzprinzips, d.h. die Veresterung von Baccatin-III, von 10-Deacetyl- baccatin III, sowie von 14-HO-10-Deacetylbaccatin-Ill mit langkettigen Fett¬ sauren, und die anschliessende Einbringung in erfindungsgemasse Konzen¬ trate ebenfalls eine bedeutende Verbesserung ihrer Kinetik und somit ihrer pharmakologischen Wirksamkeit auslost. Da diese drei Verbindungen aus den Nadeln der Eibe (Taxus baccata, L., und Taxus brevifolia, Nutt.) gewonnen werden können und überdies die Totalsynthese sehr aufwendig ist, bietet sich die Nutzung einer biologisch rascher erneuerbaren Grundlage als Vorteil an; die Fallung von Taxus-Baumen zur Gewinnung von TAXOL lasst sich dem¬ nach vermeiden. Die Grundsubstanzen, extrahiert aus Himalayaπ Yew, wur¬ den von DABUR India Ltd., 22, Site IV, Sahibabad (U.P.), India, bezogen.

Baccatin-III [laut Formel (IV)] enthält drei, strukturell sehr unterschiedlich reaktive Hydroxylgruppen. In Übereinstimmung mit Literaturangaben haben wir festgestellt, dass die Hydroxylgruppe an C(7) wesentlich rascher ange¬ griffen wird als jene an C(13), was erstaunt, da die OH-Gruppe an C(13) allylischer Natur ist; für dieses Verhalten werden sterische Grunde und eine intramolekulare Wasserstoffbrucke verantwortlich gemacht. Die OH-Gruppe an C(1) wird wegen ihrer tertiären Natur und gleichzeitigen Neopentylstel- lung unter keinen bekannten Bedingungen verestert. Bei den hydroxylierten Baccatinen sind die Verhältnisse wieder anders: OH-C(10) reagiert schneller als die OH-C(7); die OH-C(14) wiederum langsamer als die an C(10). Somit ist es möglich, bei Veresterungen Bindungen an verschiedenen Stellen vorzu¬ nehmen.

Will man an Baccatin-III beide Hydroxylgruppen an C(7) und C(13) verestern, so sind Bedingungen zu wählen, bei denen gleichzeitig auch die Oxetan- funktion C(4)-C(5)-C(20) angegriffen werden konnte. Um dies zu vermeiden,

haben wir zwar die gegenüber den Anhydriden reaktiveren Säurechloride verwendet, diese jedoch durch Zusatz von geeigneten Basen von einem mög¬ lichen Angriff auf die Oxetanfunktion abgehalten und dazu fallweise auch die ent-stehenden Chlorid-Ionen mit Silbercyanid abgefangen. Auf diese Weise kann auch die Reaktionstemperatur zur vollständigen Reaktion allmählich gesteigert werden, sodass sich bei geeigneter Aufarbeitung Ausbeuten an Reinprodukten von bis zu 70% erreichen lassen.

Die erzeugten Ester sind praktisch farblos und im UV nur undeutlich fluores¬ zierend. Die Veresterungs-Reaktion lasst sich aber mit DC auf Kieselgelfolien durch Besprühen mit einem Cersulfat/Phosphormolybdansäure/Schwefelsau- re-Reagens und anschliessendem Heizen über dem Spiegelbrenner bequem verfolgen: der gesuchte Ester erscheint als dunkelsepiafarbiger Fleck. 10- Deacetylbaccatin-Ill (10-DAB) enthalt vier und 14-HO-10-Deacetylbaccatιn-lll (14-HO-10-DAB) enthalt fünf, strukturell sehr unterschiedlich reaktive Hy¬ droxylgruppen; über deren gefundene Reaktivität siehe die entsprechenden Veresterungsansatze.

Die hergestellten Ester lassen sich sehr gut in erfindungsgemasse, spontan dispergierbare Konzentrate einbringen, welche unter Zusatz von destilliertem Wasser, 5%-Glucoselosung oder physiologischer Kochsalzlosung stabile Ol- in-Wasser-Mikroemulsionen ergeben, mit globularen Mizellen im untersten nm-Bereich.

1.0 HERSTELLUNG von Estern der Verbindungen (I) bis (III)

1.1 Herstellung von 7-Baccatιn-lll-all trans-retinat.

Zu 720 mg all-trans Retinsaure in 25 ml Ether oder t.Butylmethylether (TBME) werden unter Argon 360 mg N,N'-Dιcyclohexylcarbodιιmιd (DCC) bei 0°C zu¬ gefugt. Nach einstundigem Ruhren bei 0°C tropft man 450 mg Baccatin-III in 10 ml Ether zu. Die Losung wird anschhessend bei Raumtemperatur noch 2 h gerührt. Vor dem Abdestillieren des Losungsmittels wird filtriert. Der Ruck¬ stand wird an Kieselgel mit Cyclohexan/Essigester (95:5) als Eluiermittel chromatographisch gereinigt. Man erhalt das 7-Baccatιn-lll-all trans-retinat; Rf-Wert in Hexan/Essigester 90:10 von 0.91; UV λ ax 398,0 nm

1.2 Herstellung von 7,13-Baccatιn-lll-dιundecenoat.

Zu einer Losung von 550 mg Baccatin-III, 20 mg 4-Dιmethylaminopyrιdιn (DMAP) und 20 mg N,N-Dιmethylformamιd (DMF) in 25 ml Dichlormethan wer¬ den bei Raumtemperatur 600 mg (Uberschuss) 10-Undecenoylchlorιd in 40 ml Dichlormethan zugetropft. Nach 2 h Ruhren wird das Losungsmittel abdestil-

liert und der Rückstand an Kieselgel mit Cyclohexan/Essigester (90:10) als Eluiermittel chromatographisch gereinigt. Man erhält das

7,13-Baccatin lll-diundecenoat mit einem Rf-Wert in Hexan/Essigester

90:10 von 0.85, Esterbindung bei 1710 cm-1 v(C = 0) Ester

1.3 Herstellung von 7-Lauroylbaccatin-IH.

In einem gut getrockneten Dreihalskolben mit N ₂ -Einleitrohr, Magnetruhrer, Ruckflusskühler und Tropftrichter werden 250 mg Baccatin-III unter ^-At¬ mosphäre in 0.5 ml abs. Pyridin gelost, dann mit einigen Kristallchen von 4- Dimethylaminopyridin versetzt und unter Zugabe von 150 mg feinst ge¬ pulvertem, trockenem AgCN mit 5 ml 1 ,2-Dichlorethan verdünnt. Nach Kuhlen im Eisbad auf 0°C werden 0,2 ml Lauroylchlorid mit Hilfe einer Spritze tröpfchenweise zugegeben. Hierauf wird das Kühlbad entfernt und die Mischung während 18 h im Oelbad auf ca.45°C erwärmt.

Zur Aufarbeitung versetzt man die Suspension mit etwas Celite®, verdünnt mit Ether und filtriert die Suspension. Das Filtrat wird im Scheidetrichter mit verdünnter Schwefelsaure, dann mit Wasser und Sole gewaschen. Das nach üblicher Aufarbeitung erhaltene Produkt, nämlich 500 mg eines blassgelben, honigartigen Oeles, wird zur Reinigung an einer Kieselgelsaule (Kieselgel Merck 0,015 - 0,04mm, Säule 2,3 x 20 cm) mit dem Laufmittelgemisch Essig- saureethylester/Toluol/Aceton 11:9:1) chromatographiert. Das gesuchte Lau¬ rat erscheint ziemlich rasch in einer eng begrenzten Zone. Nach Kristal¬ lisation aus Diisopropylether bei - 14°C wurden farblose Nadelchen von Smp. 87-88,5-0 erhalten; Ausbeute 65-70%.

HPLC fast einheitlicher peak mit t 3,6 und λ _max 242 nm an Spherisorb

S-5 CN, 4.6x250 mm, flow 0.8 ml/min. Laufmittel 1% B in A (A = Hexan mit

0.1% Ethyldiisopropyla in; B = CH ₂ CI ₂ mit 5% Methanol).

UV (CH ₂ CI ₂ ): λ _max 235 nm (ε 11"100), 277 (1500), 285 (1300).

LOJD. - 60.9° (CHCIj, c = 0.041%; zum Vergleich Baccatin-III = - 85.5°)

IR (CHCl ₃ ; cm ^'1 , Auswahl von Banden): 3620 und 3570s (OH): 3020,

2925, 2855m-s (Methylen- und Methylgruppen), 1733 ss, breit [Carbonyl- gruppen]

CI-MS (NH ₃ ): m/z 786,4 (100%, [M + NH ₃ ] ⁺ )

Η-NMR (CDCI ₃ , 600 MHz, δ in ppm, Interpretationshilfen ¹ H, ¹ H-DFQ-CO-

SY, ¹³ C, ¹ H-HMBC, ¹³ C, ¹ H-HSQC, DEPT-Techniken):

H-2: 5.62 (d J = 6.9); H-3: 3.99 (d J = 6.9); H-5: 4.96 (d J = 9.0); H-6: 1.55 und 2.6 (je m); H-7: 5.6 (dd); H-10: 6.28 (s); H-13: 4.84 (t, J = 7.8); H-14: 2.3 und 2.6 (je m); CHj (16): 1,13* (s); CHj (17): 1.07* (s); CHj (18): 2,10 (s); CH ₃ (19): 1,79 (s) CH ₂ -20: 4,43 (AB-System); CH3CO-4: 2,28 (s).

¹³ C-NMR (Auswahl von Signalen): C-4: 80,6; C-5: 84,0; C-7: 71,3; C-10:

75,8; C-11: 131,5; C-12: 144,8; C-13: 67,7; ArylCO: 166,9; LauroylCO-7: 173,0; CH3CO-4: 170,5; CH3CO-IO: 168,8; CO-9: 202,4.

Auf vergleichbare Weise werden auch andere Fettsaureester von BACCATIN-III [laut Formel (IV)], von 10-DEACETYLBACCATIN-lll [laut Formel (V)], und von 14-OH-10-DEACETYL-BACCATIN-III [laut Formel VI) hergestellt.

1.4 Herstellung von 7-Palmitoylbaccatin-lll.

Die Umsetzung von Baccatin-III mit Palmitoylchloπd erfolgte wie oben unter 1.3, jedoch unter Verlängerung der Reaktionszeit auf das Doppelte; die Reini¬ gung wurde analog vorgenommen. Nach Umkristallisation aus Dnsopropyl- ether/Pentan erhalt man seidige Nadeln mit Doppelsmp. 77-80/90-92°C. UV (CH ₂ CI ₂ ): λ _max 237 nm (L 19'800)

Circulardichroismus (CH ₂ CI _2l RT): 230,8 (Δr.27,0), 258,6 (0), 300,2 (-12,4). iR. (CH ₂ CI ₂ : 3628w und 3570w (OH); 3049m, 2926s, 2852m (Methyl- und Methylengruppen), 1736 ss, und 1725ss [Carbonyle]

¹ H-NMR (CDCI ₃ , ARX 300) : H-2: 5.63 (d J = 6.7); H-3: 4.00 (d J = 6.9); H-5:

4.97 (dd); H-6: 1.57 und 2.6 (je m); H-7: 5.61 (dd, teilweise verdeckt); H-10: 6.29s; H-13: 4.89 (t J = 7.8); H-14: 2.2 und 2.3 (je m); CH ₃ (16): 1,14* (s), CH ₃ (17). 1.12* (s); CH ₃ (18): 2,11 (d, J = 1,0); CH ₃ (19): 1,80 (s); CH ₂ -20: 4,23 (AB- System); CH3CO-4: 2,28 (s).

¹³ C-NMR C-5. 84,1; C-7: 71,3; C-11: 131,6; C-12: 144,7; C-13: 67,9; C-14:

38,6; ArylCO: 167,0; LauroylCO-7: 173,1; CH3CO-4: 170,6; CH3CO-IO: 168,8; CO-9: 202,4.

1.5 Herstellung von 10-Deacetyl-7,10-dilauroylbaccatin-lll.

500 mg 10-Deacetylbaccatιn-lll wurden wie im Beispiel 1.3 mit Lauroylchloπd umgesetzt und das erhaltene Rohprodukt durch Saulenchromatographie ge¬ reinigt. Durch Kristallisation aus Dnsopropylether bei -14°C wurden 660 mg als feines, weisses Pulver, Smp. 106,5-108°C gewonnen. UV (CH ₂ CI ₂ )' λ _max 243,5 nm (t 15 ^* 400)

JR. (CH ₂ CI ₂ : 3677w und 3608w (OH); 3006m, 2925s, 2352m (Methyl- und Methylengruppen), 1713 s, breit [Carbonyle]

CI-MS (NH ₃ ): m/z 926,5 (47%, [M + NH ₃ ] ); 909,5 (15% [M ]; 804,5 (30%,

[M + NH ₃ ] ⁺ -H ₂ 0; 709,3 (100% [M ⁺ -Laurinsaure], etc.

¹ H-NMR (CDCI ₃ , 300 MHz) : H-2: 5.62 (d J = 7.11); H-3: 3.89 (d J = 7.1); H-5:

4.99 (d mit Feinaufspaltung, J=7,6); H-6: 1.7 und 2.5 (je m); H-7: 4.48 (dd, J = 10,9/6,9); H-10: 6.32 (s); H-13: 4.89 (t,J = 7.5); H-14: 2.3 und ?, verdeckt (je m); CH ₃ (16,17): 1,11 (s); CH ₃ (18): 2.05 (d, J = 1.0); CH ₃ (19): 1,67 (s); CH ₂ -20: 4,23 (AB-System).

¹³ C-NMR (CDCI ₃ ): C-1: 79,1; C-4: 80,8; C-7: 72,3; C-10: 76,4; C-11: 131,9; C-

12: 146,3; C-13: 67,9; C-14: 38,6; ArylCO: 167,0; CH3CO-4: 170,7; LaurylCO-7.

174,1; LaurylCO-10: 179,0.

1.6 Veresterung von 10-Deacetyl-14ß-hydroxybaccatin-lll mit Lauroylchlorid. 738 mg der Formel (VI) wurden mit 1,3 ml Lauroylchlorid wie oben ange¬ geben umgesetzt. Die Säulenchromatographie an Kieselgel brachte 3 Hauptfrak-tionen mit Rf 0,90; 0,53; 0,30. (Laufmittel auf Kieselgelfolien Merck mit Essig-saureethylester/Toluol/Aceton 11:9:1). Die unpolare Verbindung erwies sich als 10-Deacetyl-14ß-hydroxybaccatιn-7,10,14-trιlaurat, die polare als 10-Dea-cetyl-14ß-hydroxybaccatιn-lll-7,10-dilaurat; die mittelpolare Verbindung Hess sich nach Spektrenvergleich als das 10-Deacetyl-14ß- hydroxy-10,14-dilau rat bestimmen.

Eigenschaften von 14-OH-10-DAB-trilaurat:

Ausbeute 0,1 g, farblose Kristalle aus Methanol/Spur Diisopropylether bei

-12°C; Smp. 87-92°C.

UV (CH ₂ CI ₂ ): λ _max 234 nm (ε 18 00)

Circulardichroismus (CH _? CI _? . RT) : 229,4 (Δε 19,2), 257,6 (0), 299,6 (-7,9) l_R 3575w OH); 2043w-m, 2853s (Methylen- und Methylgruppen), 1733 ss, breit [Carbonyle]

CI-MS (mit NH ₃ ) : m/z 1124,5 (60%, [M + NH ₃ ] ^* ); 1107,5 (23%, [M ^* ]; 1089,5

(M*-18]); 924,5 (100%, [M + NH ₃ ]+-Laurιnsaure]); 907,4 (66% [M ^* ]-Laurιnsaure). H-NMR (CDCI ₃ , 600 MHz) : H-2: 5.75 (d J = 7,3); H-3: 3.95 (d J = 7,1), H-5:

4.90 (dd); H-6: 1.6 und 2.5 (je m); H-7: 5.56 (dd); H-10: 6.29 (s); H-13: 4.62 (s breit), 2,1 und 2,3 (je m); CH ₃ (16): 0,98*; CH ₃ (17): 1,12*; CH ₃ (18): 2,08; CH ₃ (19): 1,75 (s); CH ₂ -20: 4,18 (AB-System); CH3CO-4: 2,31 (s).

¹³ C-NMR (CDCI ₃ ): C-4: 80,5; C-5: 83,9; C-7: 71,1; C-10: 75,2; C-11: 133,1; C-

12: 141,1; C-13: 76,7; C-14: 75,2; ArylCO: 165,7; CH3CO-4: 170,8; CO-9: 201,8;

LaurylCO-7: 172,8; LaurylCO-10: 171,5; LauroylCO-14: 173,9.

Eigenschaften von 7,10-Dιlaurat:

Ausbeute 1,02 g; farbloses, sehr dickflüssiges OI, das langsam zu einer festen Masse erstarrt.

UV (CH ₂ CI ₂ ): λ _max 233 nm (F.13'200)

]_R 3600w und 3186w, breit (OH); 3043m, 2922ss (Methylen- und

Methylgruppen), 1733 ss und 1710s [Carbonyle]

¹ H-NMR (CDCI ₃ , 600 MHz) : H-2: 5.81 (d J=7,2); H-3: 3.95 (d J = 7,1); H-5:

4.96 (d verbreitert, J=8,3); H-6: 1.63 und 2.41 (je m); H-7: 5.58 (dd); H-10. 6.32

(s); H-13: 4.79 (d mit Feinaufspaltung, J=6,3); H-14: 4,04 (d, J = 6,4); CH ₃ (16):

1,18* (s); CH ₃ (17): 1,07* (s); CH ₃ (18): 2,10 (d, J = 1,1); CH ₃ (19): 1,81 (s); CH ₂ -

20: 4,25 (AB-System); CH3CO-4: 2,31 (s).

¹³ C-NMR (CDCI ₃ ): C-1: 76,6; C-2: 74,0: C-3 46,4; C-4: 80,7; C-5: 83,9; C-7

71,2; C-10: 75,3; C-11: 132,7; C-12: 146,9; C-13: 75,9; C-14: 74,0; C-15" 42,8 CH3 (16): 21,9*; CH3 (17): 26,1*; CH3 (18): 14,9: CH3 (19): 10,8; CH2-20: 76,2 ArylCO: 166,2; CH3CO-4: 170,5, LaurylCO-7: 173.2; LaurylCO-10: 173,2.

Eigenschaften von 10,14-Dιlaurat:

Ausbeute 60 mg; farblose Kristalle aus Dnsopropylether bei -14°C; Smp. 93-

103 ^β C.

UV (CH ₂ CI ₂ ): λ _max 234 nm ( 15'800).

2.0 Bedeutung der angemessenen Solubilisierung der Ester

Die Ester von ausgewählten Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis (III) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale und antivirale, bzw. viruzide Wirkung und eignen sich auch zur Behandlung von Ekzemen, Psonasis und von metabolischen Störungen, vornehmlich dann, wenn sie in erfindungsgemasse, spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet wor¬ den sind, welche mit destilliertem Wasser, 5%-ιger Glucoselosung oder Rin¬ gerlosung verdünnt, thermodynamisch stabile Oel-in-Wasser-ULTRAMIKRO- EMULSIONEN ergeben.

Derartige Ultramikroemulsionen weisen kugelförmige Mizellen mit einem hy¬ drodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm auf. [Messungen mit QLS = quasi- elastischer, dynamischer Lichtstreuung wurden durchgeführt an der E.T.H., Zürich, Institut für Polymere (Prof. Dr. Pier Luigi LUISI und Prof. Dr. Peter SCHURTENBERGER)]. Vgl "Mode-selective dynamic light scatteπng; theory versus expeπmental realization", Thomas Gisler, et al., Applied Optics/Vol. 34, No. 18/ 20 June 1995, pp. 3546-3553.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach auch spontan disper- gierbare Konzentrate mit antitumoral und/oder antiviral, bzw. viruzid wirk¬ samen Estern von ausgewählten Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis (III). Die erfindungsgemässen Ester mit Baccatin-Verbindungen der Formeln (I) bis (IM) sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindun¬ gen. Damit solche Verbindungen aber durch die Membranbarriere der Tumor-, bzw. Wirtzellen diffundieren und im Innern der Zelte wirksam werden können, müssen sie vorerst in geeigneter Weise im wässrigen Medium solubilisiert werden. Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultramikroemulsionen mithilfe von besonders ausgewählten Cotensiden oder Lösungsvermittlern einerseits und geeigneten Tensiden anderseits gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der neuen Ester zu erzielen.

Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten Ultramikro¬ emulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die aus¬ gewählten Tenside und Cotenside, als ausgewogenes System genommen, in der wässerigen Phase organisierte Aggregate, sog. Mizellen bilden. Diese besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynami¬ schen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Die Tenside und Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässerigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die Ester der Formeln (I) bis (III), gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase, d.h. im mizellaren Kern, liegen die Moleküle der erfindungsgetreuen Ester in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor.

Die Mizellen der Baccatinester-haltigen inneren Phase der erfindungs¬ gemässen Ultramikroemulsionen sind demnach an ihrer Oberfläche, d.h. an ihrer Grenzschicht mit einem Tensidmantel geschützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Tumor- oder Wirtzeile, bzw. durch die Proteinhülle von Viren zu diffundieren. Die Diffusion durch die äussere Membran solcher Zellen erfolgt ausschliesslich aufgrund ther¬ mischer Molekularbewegungen.

Die Richtung, die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlägt, wird vom Konzentrationsunterschied bestimmt, welcher an der Plasmamembran zwi¬ schen ausserhalb und innerhalb der Tumor- oder Wirtzelle besteht. Die Dif¬ fusion verläuft solange entlang dem Konzentrationsgefälle, bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellulären Zone und dem Inneren der einzelnen Ziel-

zelle wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. am Wirkstoffsystem ("multiple drug System") ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte ("slow release effects") auftreten können. Derartige Diffusionsvorgänge ver¬ laufen unabhängig von jeglicher Energiezufuhr. Sie haben keinen Bezug auf die zelluläre Stoffwechselenergie. Ihre Geschwindigkeit , bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Tumor- oder Wirtzelle wird be¬ stimmt :

1. vom Konzentrationsunterschied in den beiden Kompartimenten

2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmoleküls oder

Wirkstoff Systems

3. von der Viskosität der diffundierenden wässrigen Lösung (Emulsion)

4. von der Temperatur.

Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat eine globulare "Mizelle" mit einem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Vo¬ lumen von 4,189 cm3 und eine Phasenoberfläche von 12,564 cm ² . Demgegenüber weisen 1018 Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von nur 10-6 _cm (IQ nm), welche zusammen das gleiche Volumen von 4,189 cm ³ ausmachen, schon eine Gesamt-Phasenoberfläche von 1'256,4 π.2 auf.

MIZELLEN: VERHÄLTNIS VOLUMEN ZU GESAMTOBERFLÄCHE

Kugeivotumen = — π r3 Kugeloberflache = 4 π r2

Fazit: Durch die grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 1 bis 5 nm in Ultramikroemulsionen ausbil¬ den, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheolo- gische Verteilung (Spreitung oder "spreading") und somit die Bioverfüg¬ barkeit und Bioaktivität der Wirkstoffe, welche im Kern der Mizellen in mono¬ mer oder oligomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert. Das kann eine beträchtliche Ermässigung der kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte Nebenwirkungen vermeiden oder wenigstens ver¬ ringern helfen.

Die "Packungsdichte" eines spontan dispergierbaren, stabilen MARIGENOL®- Konzentrates nimmt in exponentieller Funktion mit der kleiner werdenden Teilchengrosse der Mizellen zu. Entscheidend sind die richtige Ausbildung der inneren Phase, ihr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswahl der je dazu passenden Tenside.

3.0 MARIGENOL®-KONZENTRATE

Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten: 0,1 bis 10 Gewichts-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (III), bzw. Kom¬ binationen solcher Ester, sowie

0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe wie nachstehend umschrieben,

1 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches,

5 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemi- sches, bis zu 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins, bis zu 10 Gewichts-% eines Stabilisators, eines Radikalfängers oder eines

Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

Unter pharmazeutischen Wirkstoffen sind im vorliegenden Falle alle üblicher¬ weise in der Humanmedizin verwendbaren Wirkstoffe zu verstehen. Hiezu zäh¬ len z.B. : Beta-Blocker

Pindolol [1-(4-lndolyloxy)-3-isopropylamino-2-propanol] Propanolol [1-lsopropylamino-3-(1-naphthyloxy)-2-propanol] Oxprenolol [1-(o-Allyloxyphenoxy)-3-isopropylamino-2-propanol] Metoprolol [Di-{(+-)-1-(isopropylamino)-3-[p-{2-methoxyäthyl)- phenoxy-2-propanol]-L ( + ) tartrat}]

Labetalol [5-[1-Hydroxy-2{(1-methyl-3-phenylpropyl-aminoäthyl> salicylamid] Diuretica

Acetazolamid [5-Acetamido-1,3,4-thiadiazol-2-sulfonamid] Hydrochlorothiazid [6-Chlor-3,4-dihydro-2H-1 ,2,4-benzothiadiazin-7- sulfonamid-1 ,1-dioxid] Chlortalidon [1-Oxo-3-(3-sulfamyl-4-chlorphenyl)-3-hydroxy- isoindolin] Metolazon [7-Chlor-1 ,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-4-oxo-3-o-tolyl-6- chinazolinsulfonamid] Schwache Beruhigungsmittel

Diazepam [7-Chlor-1,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1 ,4- benzodiazepin-2-on] Medazepan [7-Chlor-2,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzo- diazepin-2-on]

Starke Beruhigungsmittel

Sulpind [N-(1-Athyl-2-pyrrolιdιnyl-methyl)-2-methoxy-5-sulfamoyl- benzamid] Muskelentspannende Mittel

Baclofen [ß-(Amιnoaethyl)-p-chlorhydrozιmtsaure] Antibiotica

Sulfamethoxazol [5-Methyl-3-sulfanιlamιdo-ιsoxazol]

Trimethopπm [2,4-Dιamιno-5-(3,4,5-trιmethoxybenzyl)-pyrιmιdιn]

Chloramphenicol [D (-)-threo-2-dιchlor-acetamιdo-1 -(4-nιtrophenyl)-

1 ,3-propandιol]

Cefaclor [3-Chloro-7-D(2-phenyl-glycιnamιdo)-cephalosporansäure- monohydrat]

Cefradin [7-{D-2-Amιno-2-(1 ,4-cyclohexadιen-1-yl)-acetamιdo}-3-me- thyl-cephalospo ransaure]

Bacampicillin [1-Athoxycarbonyloxy-aethyl-6-(D-α-amιnophenyl- acetat-amιdo)-penιcιllιnat]

Minocychn [7-Dιathylamιno-6-desoxy-6-desmethyltetracyclιn]

Sulfadoxin [N'-(5,6-Dιmethoxy-4-pyrιmιdιnyl)-sulfanιlamιd]

Sulfamethoxazol [3-Methyl-3-sulfanιl-amιdo-ιsoxazol]

Sulfisoxazol [3,4-Dιmethyl-5-sulfanιl-amιdo-ιsoxazol]

Sulfadimethoxin [2,4-Dιmethoxy-6-sulfanιlamιdo-1 ,3,dιazin] Dermatologica

Chlorquinaldol [5,7-Dιchlor-8-hydroxy-chιnaldιn]

Crotamiton [N-Crotonyl-N-athyl-o-toluιdιn]

Diamthazol [6(-)2-Dιmethylamιno-ethoxy-(ß-dιaethylamιno-)-benzo- thiazol-dihydrochloπd]

Flumethason-pιvalat [6α,9-Dιfluor-11ß,17,21-trιhydroxy-16α-methyl- pregna-1 ,4-dιen-3,20,dιon-21-pιvalat]

Tretmoin [Vitamin-A-Saure] Corticosteroide

Cortison [17α-21 ,Dι hydroxy-pregn-4-en-3.il ,20-trιen-21-acetat]

Prednison [11 ß-17,21 -Trιhydroxy-pregna-1 ,4-dιen-3,20-dιon]

Dexamethason [9-Fluor-11 ß, 17,21 -dιhydroxy-16 -methyl-pregna-1 ,4- dιen-3,20-dιon]

Desoxycorton-acetat [21-Hydroxy-pregn-4-en-3,20-dιon-acetat] Endokrine Regulation

Melatonin [N-{2-(5-Methoxy-1H-ιndol-3yl)ethyl}acetamιd]; N-acetyl-5- ethoxytryptamin

Coronarmittel

Pentaerythrityltetranitrat (PETN)

Nitroglycerin (Glyceryltrinitrat)

Pindolol [1-(4-lndolyloxy-3-isopropylamino-2-propanol] Cytostatica

Mel halan [p-Di-(2-chlorethyl)-amino-L-phenylalaniπ]

Procarbazin [p-(N'-Methyl-hydrazinomethyl)-N-isopropyl-benzamid]

Dactinomycin [Actinomycin D]

Polyöstradiol phosphat

Cyclophosphamid [N,N-bis-(ß-Chloräthyl)-amino-1-oxa-3-aza-2- phosphocyclohexan-2-oxid] Entzündungshemmende Mittel

Mefenaminsäure [3-Xylyl-2-aminobenzoesäure]

Dexamethason [9-Fluor-11 ß, 17,21 -trihydroxy-16 -methyl-p reg na- 1,4-dien-3,20-dion]

Hydrocortison [17α-Hydroycorticosteron] Coronardilatoren

Nifedipin [1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(o-nitrophenyl)-pyridin-3,5- dicarbonsäure-dimethylester]

I s os orbid-d initrat [1 ,4;3,6-Dianhydrosorbit-2,5-dinitrat]

Nitroglycerin (Glyceryl-trinitrat)

Dipyramidol [2,6-Bis-(diäthanolamino)-4,8-dipiperidino (5,4- dipyrimidin)] Periphere Vasodilatoren

Cinepazid [4-(-3,4,5-Trimethoxy-cinnamoyl)-1-piperazin-essigsäure- pyrrolidid]

Cyclandelat [3,3,5-Trimethyl-cyclohexylmandelat]

Cinnazarin [1 -trans-Cinnamyl-4-diphenylmethyl-piperazin]

Pentoxyfyllin [3,7-Dimethyl-1-(5-oxo-hexyl)-xanthin] Antirythmica

Procainamid [4-Aminobenzoesäure-ß-diethylaminoethylamid]

Disopyramid [4-Diisopropylamino-2-phenyl-2-(2-pyridyl)-butyramid] Antigichtmittel

Allopurinol [1 H-Pyrazolo-(3,4-d)-pyrimidin-4-ol] Antiepileptica

Phenytoin {Diphenylhydantoin}; [5,5-Diphenyl-2,4-imidazolidin-dion]

Carbamazepin [5-Carbamoyl-5H-dibenz(b,f)azepin]

Antihistaminica

Chlorphenamin[{3-(p-Chlorphenyl)-3-(2-pyridyl)-propyldime thyl- amin]

Clemastin {Hydrogenfumarat}; [1-Methyl-2-{2-(α-methyl-p-chlor-di- phenylmethoxy) ethyl}pyrrolidin]

Mequitazin [10-(3-Chinuclidinylmethyl) phenothiazin]

Alimemazin [10-(3-Dimethylamino-2-methyl-propyl)-phenothiazin] Mittel gegen Übelkeit und Schwindel

Domperidon [5-Chlor-1-{1-(3-[2-oxo-1-benzimidazolinyl]-propyl)-4- piperidyl}2-benzimidazolinon]

Betahistin [2-{2-Methylaminoäthyl} pyridin]

Metoclopramid [4- Amino-5-chlor-N-(2-diethylaminoethyl)-2-me- thoxy-benzamid] Blutdrucksenkende Mittel

Reserpin [3,4,5-Trimethoxybenzoyl-methylreserpat]

Rescinnamin [3,4,5-Trimethoxy-methylreserpat]

Methyl dopa {L-α-Methyldopa}; [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methyl- aianin]

Clomidinhydrochlorid [2,6-Dichlor-N-2-imidazoidinyliden-benzamin hydrochlorid] Sympathomimetica

Isoproterenol [N-lsopropyl-nor-adrenalin]

Etilefrin [DL-1-{α-Äthylaminomethyl}-m-hydroxy-benzylalkohol]

Expectorantien

Carbocystein [(S-Carboxymethyl) cystein] Bromhexin[N-Cyclohexyl-N-methyl-(2-amino-3,5-dibrom-benzyl) amin HCL]

L-Ethylcystein

L-Methylcystein Orale Antidiabetica

Glibenclamid [N-4-2-(5-Chlor-2-methoxy-benzamido)-ethyl-phenyl- sulfonyl-N'-cyclohexyl-harnstoff]

Tolbutamid [N-(4-Tolylsulfonyl)-N'-n-butyl-harnstoff] Cardiovasculäre Mittel

Ubidecarenon

Aden os in [6-Amino-9-ß-D-ribo-furanosyl-9H-purin] Immunsuppressivum

Cyclosporin A

Antitumormittel

Taxol (Paclitaxel) Baccatin-III

10-Deacetyl baccatin-III 1 -OH-10-Deacetylbaccatin-lll Cyclosporin D-oxyd Antivirale Mittel (AIDS)

4-lsoleucin-Cyclosporin Cyclosporin G

3ß-Stigmast-5-en-3-laurat (ß-Sitosteryl-laurat) 3ß-Stigmast-5-en-3-palmitat (ß-Sitosteryl-pa Imitat) 3ß-Stigmast-5-en-3-stearat (ß-Sitosteryl-stearat) 3ß-Stigmast-5-en-3-arachidat (ß-Sitosteryl-arachidat) 3ß-Stigmast-5-en-3-behenat (ß-Sitosteryl-behenat) 3 -Stigmast-5-en-3-10-undecenoat ( ß-S i toste ryl-10-undecenoat) 3ß-Stigmast-5-en-3-oleat (ß-Sitosteryl-oleat)

3ß-Stigmast-5-en-3-all trans-retinat (ß-Sitosteryl-all-trans-retmat). (3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-valeriansaureester

[Ergosteryl-n-valerat, Provitamin D2-n-valerat] (3ß, 22 E )-Erg osta-5, 7, 22-trien-3-y 1-10-undecen säureester

[Ergosteryl-10-undecenoat, Provitamin D2-undecenoat] (3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-laurinsäureester

[Ergosteryl-Iaurat, Provitamin D2-'aurat] (3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-yl-all-trans-retinsäureester

[Ergosteryl-retinat, Provitamin D2-retinat] 9, 10-Sec oe rg o sta -5,7, 10,( 19 ),22-tetra-en-3-yl-valerian säureester

[Ergocalciferyl-n-valerat, Vitamin D2-n-valerat] 9, 10-Secoergosta -5,7, 10,(19 ),22-tetra-en-3-y 1-10-undecen säureester

[Ergocalciferyl-10-undecenoat, Vitamin D2-undecenoat] 9, 10-Secoergosta-5, 7, 10,(19 ),22-tetra-en-3-yl-laurin säureester

[Ergocalciferyl-Iaurat, Vitamin D ₂ -lauratJ 9,10-Secoergosta-5,7,10,(19),22-tetra-en-3-yl-all trans-retinsaureester

[Ergocalciferyl-retinat, Vitamin D2-retinat] 9,1 O-Secoc hole s ta -5,7, 10,(19), -trien-3-yl-vale rian säureester

[Cholecalciferyl-n-valerat, Vitamin D3-n-valerat] 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),-trien-3-yl-10-undecensaureest er

[Cholecalciferyl-undecenoat, Vitamin D3-undecenoat]

9,10-Secocholesta-5,7,10,( 9),-trιen-3-yl-laurinsaureester

[Cholecalciferyl-Iaurat, Vitamin D3-Iaurat] 9,10-Secocholesta-5,7,10,(19),-trien-3-yl-all trans-retinsaureester

[Cholecalciferyi-retinat, Vitamin D3-retinat] Morin-Tri-Undecenoat Morin-Tri-Laurat Quercetin-Penta-Undecenoat Quercetin-Penta-Laurat

Die erfindungsgemass einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhaltnis (d.h. eine "hydro- philic-lipophilic balance") zwischen 2 und 18; vorzugsweise liegt es für Ge¬ mische zwischen 2 und 6 einerseits und 10 und 15 anderseits. HLB-Werte ge¬ ben Auskunft über die hydrophilen und lipophilen Eigenschaften eines Emul- gators. Vgl. dazu "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Deve¬ lopments" von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technolo¬ gy 5 (1), 81-96 (1984).

In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsaureestertenside, wie z.B.: das Tristyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaureester TEA-Salz, mit

Formel:

(Soprophor® FL, RHÖNE-POULENC); Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit den Formeln:

O

OCH,

Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenolpolyglycolether-

Phosphat-Tensid

Tensid

(Tensid 508, CIBA-GEIGY); Tmovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-ethoxy-phosphorsaure- ester

Buty , bzw.

(Zerostat ® AN , CIBA-GEIGY) und anderseits Betainverbindungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B.:

worin Me[ ⁺ ] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und R _x für d. ₃₂ -Alkyl oder C ₂ . ₃₂ -Alkenylgruppen stehen.

Verwendung finden auch sog. "multi-functional glucose derivatives", wie z.B.

Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat) und Glucamate® SSE-20 (PEG-20

Methyl-Glucose-Sesquistearat, in der CTFA Classification) von Amerchol, Edison, N.J., U.S.A. Gute Ergebnisse sind fallweise auch zu erzielen unter Mitverwendung von nicht-ionogenen Verbindungen aus der "TWEEN®"-Reιhe (Atlas Chem. Ind., Inc.; bzw. ICI Specialty Chemicals), sog. Polyoxyethylen- Sorbitan-Estern oder "Polysorbate" 20 bis 85-Verbιndungen in der CTFA Clas¬ sification [Fluka 93'773 bis 93*783].

Als Hydrotrop, bzw. als Co-Emulgator dienende, pharmavertragliche Losungs¬ mittel lassen sich einsetzen, z.B.:

Ester eines ahphatischen Alkohols (C ₃ . ₁₈ ) mit einer ahphatischen Carbon¬ saure (C _{10 22} ), wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropyl- myristat, Isopropylpatmitat und Laurylmyristat, Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C _{12 32} ), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substi¬ tuiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen Mono-Ester aus Ethylenglykot oder Propylenglykol mit einer ahphatischen Carbonsaure (C _{6 22} ), wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Propylen¬ glykol monomyristat. Ester aus einem ahphatischen Alkohol (C _{12 22} ) mit Milchsäure, wie z B Myπ- styl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Tπester des Glyceπns mit einer ahphatischen Carbonsaure (C _{s 22} ), wie z.B Glyceryl-Caprylat, oder

Miglyol® 812 Neutralol (Oleum neutrale).

Ester aus einem Poly(2-7)ethylenglykolglyzerιnäther mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer ahphatischen Carbonsaure (C _{S 22} ), wie z.B ahphatische Alkohole (C _{12 22} ), somit u.a Dodecanol, Tetradecanol, Oleylal- kohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.

Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer ahphatischen Carbonsaure (C _{6 22} ), Monoether aus einem Polyethylen- glykol mit einem ahphatischen Alkohol (C _{12 18} ), wie z.B Polyoxyethylen (Cκ>)- octylether.

Heterocychsche Verbindungen, wie z.B 1-Methyl-2-Pyrrolιdon

CHAPS (FLUKA 26*680; Merck-Index 11 2034) 3-[(3-Cholamιdo-proρyl)-dιme- thylammonιo]-propansulfonat.

Biotenside Ester der allgemeinen Formel (VII) ⁵ — COO R _(VM) worin R ⁵ eine C _{2 31} -Alkyl-, eine C _{3 31} -Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und R ⁶ Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten

Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan disper¬ gierbaren Konzentrate mitteis Filtration, bzw. Chromatographie über neutra¬ lem Aluminiumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofu- ran, Ethylalkohol oder Methylenchlorid gereinigt.

Als Zusätze in die erfindungsgemässen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A-Säure, Retinol, To- copherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Flux enhan- cers") und Radikalfänger.

ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dis¬ pergierbaren KONZENTRATEN, welche Wirkstoffe der Formeln (I) bis (III) ent¬ halten und welche, wenn sie mit Wasser oder 5%-Glucoselösung oder physio¬ logischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt werden, thermodyna¬ misch stabile ULTRAMIKROEMULSIONEN mit einem hydrodynamischen Ra¬ dius von 2.2 bis 3.0 nm ergeben.

a) 0,1 bis 10 Gewichts-% einer oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis

(III),

0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe,

1 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Neutralöl, wie z.B. Migiyol® 812 (Dynamit Nobel oder Hüls),

0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (Rhόne-Poulenc), 5 bis 90 Gewichts-% Invadin JFC 800 % (CIBA-GEIGY) und/oder Polysorbate 20-85 (ICI SPECIALTY CHEMICALS),

0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,

0 bis 10 Gewichts-% eines Penetrationsverbesserers, eines Stabilisators und/oder Hilfsstoffe.

b) 0,5 bis 2 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe laut (I) bis (III), 0 bis 2 Gewichts-% CHAPS oder DMSO,

5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (VII)

R ⁵ COO R _(VII) worin R5 eine C _{2 31} -Alkyl-, eine C _{3 31} -Alkeπyl- oder eine Alkapolyengruppe und R6 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten, 30 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% und/oder Tween®-20 30 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL oder Diphasol® 3873.

c) 1 Gewιchts-% eines Wirkstoffes taut Formel (I), (II) oder (III),

7 Gewιchts-% Alkohol (C ₂ H ₅ OH), oder 2-Pentanol, und/oder DMSO,

20 Gewιchts-% Cιtronellyl-10-Undecenoat (Cn i-Citronellylester) oder Citro- nellyl-10-Laurat (C ₁₂ o-Cιtronellylester)

30 Gewιchts-% Invadin® JFC 800% und/oder TWEEN®-20,

42 Gewιchts-% Soprophor® FL.

N.B. INVADIN® JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein wasserfreies tert. Octyl- phenylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen. SOPROPHOR® FL (RHÖNE-POULENC) ist ein Tπstyrylphenolpolyoxyethylen- 18-phorsaureester, TEA-Salz-Tensid,

TWEEN®-20 (ICI Specialty Chemicals) ist eine nicht-ionogene Polyoxy- ethylen-Sorbitan-Ester-Verbindung. "Polysorbate"-20.

3 1 BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempraparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". a) Granulierung

Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g

Avicel® PH-101 80.3 g

Erfindungsgemasses MARIGENOL®-KONZENTRAT 139.4 g

Aerosil® 200 80.3 g

∑ 390.0 g

Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40°C

b) MSR- und RETARD-Ausrustung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk

c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets Kernmaterial 44 % Erfindungsgemasses KONZENTRAT 25 % MSR-Beschichtung 31 %

Σ 100 %

N.B MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemass a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern.

O 98/13359 -- 2 ,4. -- PCT/CH96/00329

4.0 BIOLOGISCHE PRÜFUNGEN

Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemass den Herstellungsbeispielen, sowie den Aufarbeitungs¬ beispielen für ihre Bildung a) bis c) wird anhand folgender Prufungsergeb- nisse bestätigt:

4.1 In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien

Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiterplat- ten und Verdunnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 1θ4/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie während des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden, mit 100 μl pro Reihe, die man im 1. Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch ein¬ gebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geo¬ metrische Verdunnungsreihe nVi.

Die Proben werden im Plaque Assay wahrend 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 3Vi% C0 ₂ inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1% Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Losung von 70% Methanol, 1% Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrosserung 300-fach. Man bestimmt die grosste zytotoxische Verdünnung. Die quantitative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessuπg am Spektrophoto- meter vornehmen.

4.2 Prüfung auf Zelltoxizität

4.21 Zelltoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE geprüft an Py6-Zellen (Polyoma-Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten)

MIKRO¬ EXPOSITION EXPOSITION EXPOSITION

GEPRÜFTES EMULSION 24 h, in 48 h. in 72 h. in ME 1:100 Verdünnung Verdünnung Verdünnung

KONZENTRAT wirksam bis wirksam bis wirksam bis

AKTIVSUB¬ zu 1: zu 1: zu 1. mit 1%-WIRK- STANZ A.S.

SUBSTANZ-GEHALT

TAXOL-W.S. ME 1:100 64*000 256*000 256*000 A.S. 6.4 Mio. 25.6 Mio. 25.6 Mio.

BACCATIN lll-W.S. ME 1:100 128*000 128*000 1 Mio. A.S. 12.8 Mio. 12.8 Mio. 100 Mio.

BACCATIN 111-7,13- ME 1:100 128*000 256*000 1 Mio. DIUNDECENOAT A.S. 12.8 Mio. 25.6 Mio. 100 Mio.

BACCATIN III- ME 1:100 128*000 128*000 256*000 7,13-DILAURAT A.S. 12.8 Mio. 12.8 Mio. 25.6 Mio.

BACCATIN lll-7-a.t.- ME 1:100 128*000 256*000 256*000 RETINAT A.S. 12.8 Mio. 25.6 Mio. 25.6 Mio.

Verdünnungen: Erste Zeile auf Mikroemulsion berechnet Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet

4.22 Zelltoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE (FORTSETZUNG) geprüft an Py6-Zellen (Polyoma-Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten)

MIKRO¬ EXPOSITION EXPOSITION .S.

GEPRÜFTES EMULSION 48 h, in 72/96 h. ANFANGS¬

ME 1:100, Verdünnung in Verdünn¬ KONZENTRATION

KONZENTRAT bzw. 1:1O_0 wirksam bis ung wirksam im KONZENTRAT zu 1: bis zu 1: in mMol mit 1%-W1RK- AKTIVSUB¬

STANZ * = 96 h

SUBSTANZ-GEHALT A.S. END-KONZENTRA-

TION in der M.E. in pMol

TAXOL-W.S. ME 1:100 256 ^* 000 256*000 0.0117

A.S. 25.6 Mio. 25.6 Mio. 45.7

BACCATIN lll-W.S. ME 1:100 80*000 160*000 0.0171

A.S. 8 Mio. 16 Mio. 106.9

10-DAB-BACCATIN-lll ME 1:1'000 640O00 1'280*000* 0.0190

W.S. A.S. 64 Mio. 128 Mio. 14.8

14-OH-10-DAB- ME 1:1*000 640*000 1*280*000* 0.0184

BACCATIN-Ill W.S. A.S. 64 Mio. 128 Mio. 14.4

BACCATIN-Ill- ME 1:1*000 160 ^* 000 640*000* 0.0130

MONOLAURAT A.S. 16 Mio. 64 Mio. 20.3

BACCATIN-Ill- ME 1:1*000 320 ^* 000 640*000* 0.0124

MONOPALMITAT A.S. 32 Mio. 64 Mio. 19.4

BACCATIN 111-7,13- ME 1:100 40*000 80*000 0.0105

DILAURAT A.S. 4 Mio. 8 Mio. 131.2

MIKRO¬ EXPOSITION EXPOSITION .S.

GEPRÜFTES EMULSION 48 h, in 96 h, in ANFANGS¬ ME 1:1*000 Verdünnung Verdünnung KONZENTRATION KONZENTRAT wirksam bis wirksam bis im KONZENTRAT

AKTIVSUB¬ zu 1: zu 1: in mMol mit 1%-WIRK- STANZ

A.S.

SUBSTANZ-GEHALT END-KONZENTRA- TION In der M.E. in pMol

10-DEACETYL- ME 1:1'000 32*000 32*000 0.0130

BACCATIN 111-7,10- A.S. 32 Mio. 32 Mio. 40.6

DILAURAT

14-OH-10-DEACETYL- ME 1:1*000 16*000 32*000 0.0092

BACCATIN 111-7,10,14- A.S. 16 Mio. 32 Mio. 28.8

TRILAURAT

Verdünnungen: Erste Zeile auf Mikroemulsion berechnet Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet Konzentrations-Angaben für das Konzentrat: in mMol (Anfangskonzentration, bzw. in pMol (höchste noch zelltoxische Verdünnung)

N.B.: Zusammensetzung der 1%-Konzentrate: 1 Gewιchts-% Wirksubstanz 12 Gewιchts-% Cn .-CITRONELLYL-ESTER 87 Gewichts-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL 1:1

5.0 Analytischer Nachweis

5.1 Identifikation von Baccatin Ill-Doppelester-Wirksubstanz Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerat P/ACE 2100 von Beckman Ins¬ truments, bzw. einem BioFocus Integrator von BIO-RAD Laboratories. Bedingungen: Puffer pH = 7.0 50 mM Na-phosphat

100 mM Borsäure 50 M SDS filtriert 0.2 μm Zu 20 ml Puffer werden 5 ml Methanol gegeben Kapillare: HP bubble cell 15 μm 0, 37 cm Injektion: 20 psi'sec. Run 15 kV, Messung bei 192 nm Druckinjektion 10 sec. Detektionsgrenze 0.5 ppm, sehr hohe Auflosung.

Der Peak erscheint für das Konzentrat nach 22 Minuten (Tensidwirkungl), für die reine TAXOL-Substanz, bzw. den Ester nach 44 Minuten.

Als Alternative kann auch eine sog. "fused silica capillary": FS 75 μm, 50 cm, eingesetzt werden.

Run 15 kV - 70 μA, Messung bei 195/220 nm Der klare Peak erscheint nach 57 Minutenl

5.2 Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wässrigen Mikroemul- sion/bzw. im gereinigten und hochzentrifugierten Überstand des Zellplasmas der Tumorzellen. Gleiche Methodik wie 5.1. Der charakteristische Peak erscheint nach ca.45-60 Minuten.

5 3 Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle

Am Lichtmikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lasst sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel Py6-Zellen = Polyoma- Virus transformierte 3T3-Mausfιbroblasten; dünn ausgesät, mittlere Verdünn¬ ung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet. Als Markiersubstanz kann dem Konzentrat eine kleine Menge Canthaxanthin beigegeben werden, das eine deutliche Fluoreszenz besitzt. Es eignen sich auch Phenosafranin, Tinopal® GS oder Uvitex® CF, bzw EBF (CIBA-GEIGY). Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die Baccatin HI-Ester als Wirksubstanz enthalten, erfolgt ebenfalls mittels mizellarer Kapillar-Zonen-Elektrophorese "MECC", (Beckman Instruments, P/ACE System 2100 oder dem BioFocus Integrator von Bio-Rad).

Vgl. im übrigen: KOJI Otsuka et al.. Separation of lipophile compounds by micellar electrokinetic chromatography with organic modifiers, Electropho- resis, 1994, f5, 1280-83 (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim).

Zusätzliche Kontrolle mittels Messung mit UV-MALDI-Ms-Spektroskopie, unter Verwendung von 2,6-Dιhydroxyacetophenon als Matrix.

6.0 Vergleichsprüfungen mit humanen Tumor-Zell-Linien

VITALITÄTSTEST / 1%-MARIGENOL-KONZENTRATE LEUKÄMIE K 562 I Kontrollen SO'037 cpm 1 x 10* Zellen pro Loch

Proliferationstest (Tritium: 1 μCi/well H ⁺ )

VITALITATSTEST I 1%-MARIGENOL-KONZENTRATE LEUKÄMIE DAUDI-LINIE / Kontrollen 23O90 cpm

Arbeiten durchgeführt von Dottoressa Anna Rita GUARINI, Universita degli Studi di Torino, Clinica medica, 21. - 24.8.1995.

7.0 Allgemeine Vertraglichkeit der MARIGENOL®Praparate

AUSWIRKUNG auf das BLUTBILD TOXIZITAT von MARIGENOLΦ-KONZENTRATEN an der BALB/c-Maus %-Anteιl der Blutkörperchen

Präparat L M N E B

G 17 10-7 70 ± 6 11 ± 3 1314 614 0 10-5 77 ± 6 6 ± 3 11 14 514 1 11 10-3 69 i 10 7 ± 5 2218 2 l 2 0

G 41 10-7 77 ± 6 6 ± 3 1315 313 0 10-5 78 ± 4 10 ± 2 1014 1 11 1 1 1 10-3 80 ± 6 8 ± 2 10 6 121 1 0

G 44 10-7 74117 10 ± 1 20 + 9 1 11 0 10-5 74 ± 6 914 1417 413 0 10-3 76 ± 5 614 1618 211 0

G 55 10-7 78 ± 4 1014 1014 211 0 10-5 69 ± 10 11 13 1814 1 11 0 10-3 77 ± 5 6 ± 4 14 ± 2 211 1 ± 1

KONTROLLEN 76 ± 5 812 1514 1 i 1 0 (Phys. Puffer)

G 17 2 %-Konzentrat mit C _{6 0} -ιso-CHOLESTERYL-ESTER

(Cholesteryl-iso-Vaterat)

G 41 2 %-Konzentrat mit Cn i-ERGOSTERYL-ESTER

(Er osteryl-10-Undecenoat)

G 44 2 %-Konzentrat mit Cι _{B 2} -CHOLECALCIFERYL-ESTER

(C. _{8 2} -D3 ; Vιtamιn-D3-Lιnolat)

G 55 2 %-Konzentrat mit C _{4 1} -CHOLECALCIFERYL-ESTER

(C _{4 1} -D3 ; Vιtamιn-D3-Crotonat)

Verdünnungen: 10-7 = o,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz 10-5 = 10 ppm Konzentrat, 0,200 ppm Wirksubstanz 10-3 = 1 ^* 000 ppm Konzentrat; 20,000 ppm Wirksubstanz (auf die wassπge Mikroemulsion berechnet)

Legende:

L = Lymphocyten

M = Monocyten (Makrophagen)

N = Neutrophile Granulocyten

E = Eosinophile Granulocyten

B = Basophile Granulocyten

Durchführung der Proben: Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta Stefania VAI, Uni- versitä di Torino, Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, Ospedale San Luigi Gonzaga, 1-10 ^* 043 ORBASSANO (TO), August/September 1993.

Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mausen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Wahrend 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puf¬ fer für die Kontrollen. Färbung mit May Grunwald-Giemsa.

Zeit der Behandlung: 28 Tg.

Blutanalyse: nach der letzten Injektion

Anzahl Tiere: 13 Gruppen zu 5 je Tieren

RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.

7.1 UNTERSUCHUNG DES BLUTBILDES

Auswirkung der MARIGENOL®-KONZENTRATE auf normale humane Lymphomonocyten

Zellen: normale humane phagozytische weisse Blutzellen

(Macrophagen); 2 x 10 ⁵ Zellen pro well

Stimulation der Kontrollen: 1 % PHA (Phytohemagglutinin)

PRÄPARAT VERDÜNNUNG TEST 1 TEST 2 TEST 3 cpm cpm cpm

KONTROLLEN 2682 3386 3386

PHA 1% (stimuliert) 80*981 61*966 61 ^* 966

KONZEN¬ 10-1 1076 3826 3936

TRATE als 10-2 1396 3726 3845 wassrige

10-3 1431 2141 2939

MIKROEMUL-

SIONEN 1386 3221 2752

10-4

1656 2888 3093

10-5 2536 2105 3046

10-6

Test 1 : 2 %-Konzentrat enthaltend C _12:0 -Cholesteryl Ester

Test 2 : 2 %-Konzentrate enthaltend C _16: o-Ergosteryl Ester

Test 3 : 2 %-Konzentrate enthaltend C _5:0 -Cholecalciferyl Ester

(Vitamin D3-iso-Valerat)

Tests durchgeführt von Dottoressa Anna GUARINI, Universitä di Torino, Clini- ca medica, l-10'126 TORINO, 21. bis 24. März 1994.

7.2 VERGLEICHSPRÜFUNGEN bei verschiedener Aufarbeitung

A TAXOL-W.S., als spontan dispergierbares MARIGENOL®-Konzentrat formuliert, das eine wassrige U/fra/n/iVroemulsion bildet B TAXOL-W.S., als herkömmliches Konzentrat formuliert, das nur eine wasserige Makroemulsion bildet C BACCATIN-III-W.S., als spontan dispergierbares MARIGENOL®-

Konzentrat formuliert, das eine wassrige l>/tram/frroemulsion bildet D BACCATIN-III-W.S., als herkömmliches Konzentrat formuliert, das nur eine wasserige ftfaftroemulsion bildet

MIKRO-/ EXPOSITION EXPOSITION

GEPRÜFTES MAKRO¬ 24 h, in 48 h, in

EMULSION Verdünnung Verdünnung

KONZENTRAT 1:100 wirksam bis wirksam bis zu 1: zu 1: mit 1%-WIRK- AKTIVSUB¬ STANZ

SUBSTANZ A.S.

A: TAXOL-W.S. EM 1:100 128O00 512*000

A.S. 12.8 Mio. 51.2 Mio.

B: TAXOL-W.S. EM 1:100 < 4*000 < 4 ^* 000

A.S. < 400*000 < 400 ^* 000

C: BACCATIN-III- EM 1:100 128*000 256 ^* 000

W.S. A.S. 12.8 Mio. 25.6 Mio.

D: BACCATIN-III- EM 1:100 < 4*000 < 4'000

W.S. A.S. < 400*000 < 400*000

Man beachte, dass die erfindungsgetreue Konzentratbildung der herkömm¬ lichen Formulierung weit überlegen ist in der Wirkung. So betragt deren Bio¬ reaktivität schon in der kurzen Expositionszeit von 24 h das 30-fache und bei 48 h Exposition das über 125-fache des bislang Üblichen und Erreichbaren.

MARIGENOL®-Konzentrate mit C _1η i-Citronellylester als Coemulgator und mit einer 1:1 Tensid-Mischung Invadin JFC 800%/Soprophor FL formuliert. Herkömmlich formulierte Konzentrate mit Isopropylmyristat als Coemulgator und mit Cremophor® EL (BASF), aber ohne Ethylalkohol aufgebaut. In beiden Fallen gleiches anteiliges Verhältnis W.S. : Coemulgator : Tenside angenommen.

Die analytische Nachprüfung der unterschiedlichen Formulierungen am Insti¬ tut für Polymere an der E.T.H. in Zürich ergab die nachfolgenden Messdaten:

Mizellare Grosse

MIZELLGROSSE

PRÄPARAT in nm

A: TAXOL-W.S. 2.2-2.3 ohne Filter

B: TAXOL-W.S. 5 - 6

60 - 100 starke Streuung breite Verteilung

10%-Filter

C: BACCATIN-III-W.S. 2.2 - 3.0 ohne Filter, aber 75°-Winkel

D: BACCATIN-III-W.S. 4 - 12 starke Streuung breite Verteilung

10%-Filter

ESTER¬

VERBINDUNGEN:

Q: QUERCETIN- 2 - 3

PENTA-UNDECENOAT

QE: ß-OESTRADIOL- 2 - 3

DI-OLEAT

F: APIGENIN- 2 - 3

TRILAURAT

L: GENISTEIN- 2 - 3

TRILAURAT

Gemessen wurde die wässerige Emulsion 1:100 (CMC-Grenzwert für die ho¬ mogene Verteilung der Tenside) der 1%-igen Konzentrate mittels dynami¬ scher Lichtstreuung (DLS) in je 3 Winkelstellungen (60°, 90° und 120°), mit je 10 Einzelmessungen, an einem speziell ausgerüsteten "Fiberoptic Spectro- meter" des Instituts für Polymere, E.T.H., Zürich. Für die Beschreibung der Methodik und des Gerätes vgl. "Mode-selective dynamic light scatteπng: theory versus expeπmental realization". Thomas Gisler et al., Applied Op- tics/Vol. 34, No.18/20, June 1995.

8.0 Prüfung auf Schutz- und antivirale Wirkung gegenüber sensitiven MT4- Zellen, infiziert mit dem AIDS-VIRUS HIV ("Human Immunodeficiency Virus") Tests wurden durchgeführt am Institut für Infektionskrankheiten der Univer¬ sität Turm (Direktor: Prof. Dr. P. GIOANNINI), von Dott. Alberto BIGLINO, Leiter der Abteilung für Infektionskrankheiten am Ospedale Generale di Asti, U.S.L. 19, unter Mitarbeit von Dotta. Brunella FORNO und Dotta. Annamaria POLLONO. Juni/Juli 1994 und Marz/Apπl 1995.

8.1 Schutzeffekt auf die Wirtzellen (MT4-Lymphozyten)

MT4-Zeilen (eine eternalisierte T-Zelllinie, welche sehr empfindlich ist gegen den HlV-zytopathogenen Effekt "CEP", aus einer 24h alten Kultur wurden bei einer Konzentration von 2x1θ5/ml suspendiert, in 1.2 ml aliquote Teile in

Polypropylen Rörchen aufgeteilt und mittels Zentrifugierung pelletiert.

Die Pellets wurden dann entweder infiziert mit 200 μl einer Stammlösung von

HIV III B Zellen (Titer: 600 CCIDso/ml) oder scheininfiziert mit reinem Medium, für 90 Min. bei 37°C inkubiert und anschliessend mit 1 ml reinem Medium ver¬ setzt, um die anfangliche Zellkonzentration wieder einzustellen und die HIV Konzentration auf 100 CCIDso/ml zu bringen. [CCIDso/ml = 50% c_ell c_ulture

[nfective dose].

100 μl Volumina der im Test eingesetzten MARIGENOL®-Konzentrate, ver¬ dünnt zu wasserigen Ultramikroemulsionen 10-3 _un d dann zusätzlich ver¬ dünnt von 10-3 auf 10-5 _m it Medium RPMI 1640, wurden dreifach eingebracht in flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Löchern. In jedes Loch wurden 100 μl der HlV-infizierten oder der schein-infizierten MT4-Kultur eingegeben, um so 4 Versuchsreihen aufzustellen:

- einfache Kultur (Kontrollen; Prüfung auf Lebensfähigkeit der MT-4

Zellen: 105 Zellen/ml oder 2x1θ4/Loch)

- Kultur + HIV (Virus CPE-Kontrolle; Konzentration 50 CCIDso/ml oder

10 CCIDso/Loch)

- Kultur + Wirksubstanz in Mikroemulsion

- Kultur + HIV + Wirksubstanz-Mikroemulsion in den

Verdünnungen 10-3 bis 10-5 ( = 1'000 ppm, 100 ppm und 10 ppm, bzw. 10 ppm, 1 ppm und 0.1 ppm W.S. -Gehalt)

Inkubation der Kulturen bei 37°C in einer 5% CO2 + 95% Luftfeuchte Atmos¬ phäre. 5 Tage nach der Infektion werden 100 μl der Überstandes in jedem Loch entfernt und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines Methylte- trazolsalzes überprüft (MTT, Sigma, 25 μl/Loch in 5 mg/ml Losung), in einem 2-h Inkubationstest, dem sich eine Solubilisierung mit 100 μl DMSO/Loch und die photometrische Ablesung auf optische Dichte bei 550 nm anschliesst. Restwerte der Zell-Vitalitat (Überlebenstest) werden ausgedruckt als %-Dif- ferenz gegenüber den HIV CPE-Kontrollen, das Mittel als Null gesetzt. Der gemessene Titer ist Dosis-abhängig. Er sinkt vom Anfangswert von 300% CCIDso auf 120% CCID50 und bis auf 2% CCIDso-

Die beste Schutzwirkung auf die Wirtzellen wurde bislang mit einem 1%- Konzentrat von ß-Sitosteryl-Palmitat bei einer Konzentration von 10-4 (= 100

O 98/13359 -- , .3, — PCT/CH96/00329

ppm Konzentrat in wasseriger Ultramikroemulsion) erzielt; sehr beachtens¬ wert sind auch die Ergebnisse mit 1%-Konzentraten, enthaltend ß-Sitosteryl- Caproylat, ß-Sitosteryl-Laurat, ß-Sitosteryl-Arachidat oder ß-Sitosteryl-Behe- nat.

72 Wirkung auf die HlV-Infizierbarkeit. (Virulenz, direkte antivirale, bzw. viruzide Wirkung gegen die erworbene Immunschwache, das humane "Aquired Immuno-Deficiency Syndrome. AIDS")

Aliquote Mengen von 2 klinisch aufbereiteten Präparaten von Aids-Patienten ("Isolates" mit den Stämmen 21/4 und 4/5) wurden in vollständigem RPMI Medium bei einem Titer von 300 CCIDso/ml resuspendiert und wahrend 3 h bei

+4°C inkubiert mit einem MARIGENOL®-Konzentrat, als Mikroemulsionen in komplettem Medium auf die Konzentratioen 10-2 bis 10-5 verdünnt, und sodann zusammen mit einem "leeren" Tragerkonzentrat und mit reinem Me¬ dium allein auf ihre Wirkung geprüft

Nach der Vorinkubation wurde der HIV Titer mittels der CCIDso-Methode erfasst (CCID50 = c_ell c_ulture mfective (Jose 50 %). Von jeder der 6 Virus- Suspensionen wurden kurz zweifache Reihenverdunnungen angefertigt, wo¬ von je 200 μl während 90 Min. mit MT-4 Zellen Pellets inkubiert wurden, wie oben angegeben (Siehe 7.1). Am Schluss der Inkubierung werden die Pellets auf die ursprüngliche Zellkonzentration gebracht, indem man jeder Probe die notige Menge Medium zufugt und sie anschliessend mit je 200 μl in 8 Locher einer Mikrotiterplatte einbringt Nach der Inkubation während 5 Tagen wird die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen, wie oben dargestellt Der HIV Titer wird als reziproker Wert jener Verdünnung angegeben, welche 4 von

8 Proben einer Reihe (50%) infiziert. Der Inhalt eines Lochs gilt als infiziert, wenn die Ablesung der O.D. bei 550 nm tiefer ausfallt als das Mittel der 8 Kontroll-Locher minus 2.8 Mal die Standard-Abweichung (untere 95% Ver¬ trauensgrenze)

Mit den Wirksubstanzen Ergosteryl-10-Undecenoat und ß-Sitosteryl-Palmitat lasst sich m-vitro als Folge der Vorbehandlung der Stamme eine sehr deutliche Replikationshemmung und eine eigentliche Elimination feststellen Ihre Abwehrwirkung gegen eine Infektion ist Dosis-abhangig. Gar keine Hem¬ mung trat nach der Behandlung mit reinem Carπer-Konzentrat allein ein

Auswertung der Prufergebnisse:

TESTSUBSTRAT RESTWERTE im HIV-TITER (CCID50)

(Mittelwert aus 3 Kulturen)

HIV-Stamm 21/4 ("Clinical isolate") + 300

Medium

HIV-Stamm 4/5 ("Clinical i solate") + 200

Medium

HIV (2 Stämme) + 200

CARRIER-KONZENTRAT (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

HIV (2 Stamme) +ERGOSTERYL-10- 25

UNDECENOAT (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

HIV (2 Stamme) + 2 ß-SITOSTERYL-PALMITAT 1'000 ppm (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

HIV (2 Stämme) + 50 ß-SITOSTERYL-PALMITAT 100 ppm (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

HIV (2 Stamme) + 76 ß-SITOSTERYL-PALMITAT 50 ppm (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

HIV (2 Stamme) + 120 ß-SITOSTERYL-PALMITAT 10 ppm (Mittlerer Titer aus 2 Stammen)

Restwerte des HIV-1 Titers nach Vorinkubation wahrend 3 h bei + 4°C Vgl. auch die technische Beilage 1/1

Für die angewandte Prufmethodik vgl. u.a.: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al.: "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiviral com- pounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katho- lieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Pubhshers.

B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/503.50); J.Virol.Methods, 1987: 16, 171-85

A. Bergamini, CF. Perna et al., "A tetrazolium-based, coloπmetπc assay for quantification of HlV-induced catopathogenicicity in monocyte-macrophages, exposed to macrophage colony-stimulating factor". J.Virol.Methods, 1992. 40(3), 275-86.

Vgl. aber auch: Dr. Stefan Lanka, Dortmund: "HIV - Realität oder Artefakt?", raum&zeit 77/95, pp.17-26.

Paul Wallerstein: Das AIDS-Dilemma; Forschung in der Sackgasse. Rombach aktuell, 1988, Freiburg i.Br.

Jay A. Levy "HIV research: a need to focus on the πght target", The Lancet, Vol. 345, June 24, 1995, pp. 1619-21.

Molecular Cell Biology, second Edition, by J. Darneil, H. Lodish, D Balti¬ more; Scientific American Books, Chapter 5 Viruses, Structure and Func- tions, pp 177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.)

8.0 Andere Viren

8.1 Humaner Cytomegahe-Virus (CMV)

Die Prüfung wurde mit humanen, embryonalen Lungenfibroblasten als Wirt¬ zellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. Der Stamm "CVM umano AD169" wurde wahrend 4h bei +4°C mit unterschied¬ lichen Konzentrationen der Prufsubstanz C ₁₆ o-ß-Sitosterylester, formuliert als 1%-ιges Konzentrat und dann verdünnt zu einer wasserigen Mikroemul- sion 10-3, o-4 _un( j 10-5. mkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus- Suspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibro¬ blasten uberimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 120O00 Zellen pro shell- vial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation während 45 Minuten bei 1500 rpm und bei RT vollzogen, worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beige¬ geben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann wahrend 20 h bei 37°C und unter 5%-C0 ₂ -Atmosphare gehalten.

Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesam¬ melt, mit 2% Aceton-Methanol (2:1) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung. Die Vials wurden mit dem monoklonalen Antikörper "Antι-P-72 CMV" (einem unmittel¬ baren Vorlauferprotem des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und wahrend 30 Minuten bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert.

Es folgten 3 Waschungen in PBS, eine zweite Inkubation mit dem Fluores¬ zenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-igG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation während 30 Minuten bei 37°C, wie oben angegeben, an, gefolgt von einer 3-malιgen Waschung mit PBS. Die Proben werden dann mit 50% Glycerol in PBS auf Glasträger montiert.

Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bedingungen, aber ohne Vorbehandlung mit der Prüfsubstanz auf¬ bereitet worden sind.

Gezahlt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei, mit- hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskopes bei 25-facher Vergrosserung in wasseri¬ ger Phase.

Es lasst sich ganz eindeutig eine Dosis-abhängige, direkt viruzide Wirkung feststellen. Das Virus ist nicht mehr virulent genug, um die empfindlichen Wirtzellen zu infizieren.

ERGEBNIS:

VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-PALMITATES

(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)

KONTROLLEN: KONZENTRATION KONZENTRATION KONZENTRATION Anzahl der Anti- MIKROEMULSION MIKROEMULSION MIKROEMULSION gene (anti P-72) 1:1*000 1:10*000 1:100*000

115*000 0 2 82*000

Anzahl der "Nuclei positivi per P-72" (der infizierten Fibroblasten)

Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä di Torino, Juli-November 1995.

8.2 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)

Die antivirale/viruzide Wirkung einer wasserigen Mikroemulsion von geeig¬ neten MARIGENOL®-Konzentraten wird mithilfe einer konfluenten Monolayer- Kultur von VERO-Zellen (d.h. "Afπcan green monkey kidney cells") festge¬ stellt. Die Wirtzellen werden wahrend 3 h bei 4°C mit der Mikroemulsion oder mit dem Kulturmedium allein vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 10 ⁴ Herpes Simplex Viren, sog "plaque forming units" = PFU infiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dann Zugabe von 2% Methylceliu- lose zur Verhinderung der Spreitung des Virus, es entsteht ein elastisches

Vlies im Kulturmedium MEM + 2% Kalbserum. Anzuchtung wahrend 48 h, dann Fixieren und Farben der Monolayers mit 1% Kristallviolett in Methanol. Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "plaques" von lysierten Zellen, die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bilden. Die Herab¬ setzung des viralen Titers wird im %-Verhaltnιs zu den Kontrollen (21 Plaques pro Zelle) angegeben.

Als Prufsubstanzen wurden folgende Konzentrate in wasseriger Verdünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1:100) eingesetzt:

1 % C 20.0-SITOSTERYL-ESTER

1 % QUERCETIN-PENTA-10-UNDECENOAT

1 % C 16.0-SITOSTERYL-ESTER

1 % C 12.0-ERGOSTERYL-ESTER

Auswertung:

C ₂ o o-ß- QUERCETIN- Cιβ o-ß- C ι ₂ o-

VERDÜNNUNG SITOESTER: PENTA-UN- SITOESTER ERGOESTER

(ARACHIDAT) DECENOAT (PALMITAT) (LAURAT)

1 : rooo Zell-Lysis Zell-Lysis Zell-Lysis Zell-Lysis

1 : 10*000 76 % 48 % 24 % 62 %

1 : 100 ^* 000 5 % 0 % 0 % 0 %

Die Ergebnisse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus- infizierten VERO-Wirtzellen. Bei einer Konzentration von 10-4 ß-Sitosterylara- chidat erscheint die Zahl der Plaques, im Vergleich mit den Kontrollen, um

76% herabgesetzt. Der HSV-Titer ist deutlich verminder».

Bei dieser Konzentration der geprüften Substanzen findet auch keine Lysie- rung von eternahsierten Lymphozyten vom Typus MT-4, noch der VERO-

Zellen selber statt. (Siehe oben unter 8.0)

Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universita di Torino, Juli 1995.

8.3 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)

Wiederholung der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV-

Versuch. Vgl oben 8.1

VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-ARACHIDATES

(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)

KONTROLLEN: KONZENTRATION KONZENTRATION KONZENTRATION Anzahl der MIKROEMULSION MIKROEMULSION MIKROEMULSION infizierten Zellen 1:1 ^* 000 1:10'000 1:100 ^* 000

38 0 0 20

Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä di Torino, November-Dezember 1995.