La présente invention est également relative à des séquences d'acides nucléiques codant pour lesdits polypeptides, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, et à l'utilisation desdites séquences comme amorces et comme sondes ou pour l'expression des urotensines II de mammifères et notamment de l'urotensine II humaine ou murine.

L'urotensine II est un neuropeptide qui a d'abord été caractérisé dans l'urophyse des poissons téléostéens. Chez ces poissons, 1'urotensine II est un peptide cyclique comprenant 12 acides aminés. La caractérisation de l'urotensine II chez plusieurs espèces de poissons téléostéens a montré que la structure de l'heptapeptide cyclique C-terminal est conservée, tandis que l'on observe des substitutions dans la partie N-terminale de la molécule. Cet heptapeptide présente la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val (SEQ ID NO : 9) (1-3).

On a longtemps pensé que ce peptide était produit exclusivement dans l'urophyse des poissons téléostéens (3), un petit organe neurohémal présentant des similitudes avec la neurohypophyse, localisé à l'extrémité caudale de la moelle épinière ; toutefois, il est apparu que ce neuropeptide n'est pas confiné au système neurosecrétoire caudal du poisson. II a également été isolé à partir d'extraits de cerveaux de truite, de raie (4) ou de lamproie (5). En outre, un peptide similaire à l'urotensine II de poisson a été détecté dans le système nerveux central (SNC) de la grenouille (Rana ridibunda) (6) et chez un gastéropode (Aplysia californica), au niveau du ganglion cérébral (7).

Ce peptide, qui comprend chez la grenouille, 13 acides aminés, présente des similarités de structure avec les urotensines II de poisson, et notamment la région cyclique contenant l'heptapeptide précité.

Ce neuropeptide, présente également des similarités avec la soma- tostatine (2,3) ; toutefois, l'urotensine II de poisson présente essentiellement des effets cardiovasculaires, que l'on peut également observer lorsque cette urotensine est admi- nistrée à un mammifère, tel que le rat ou le lapin (8,9) : effet contractile sur les artères

(action observée chez le rat (8) et le lapin (10)), contraction des muscles lisses (effet spasmogène sur certains muscles lisses (vessie et iléum), chez les amphibiens (11)), effets sur le rythme cardiaque (observés chez les amphibiens (12)).

Il a également été montré que l'urotensine II de poisson est exprimée sous la forme de précurseurs, dont les structures primaires ont été déterminées à partir du système neurosécrétoire caudal de la carpe (Cyprinus carpio) (13).

Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, qu'une urotensine II était exprimée chez les mammifères, notamment chez l'homme et chez les murins et qu'elle pouvait présenter, chez l'homme une activité sur la survie et/ou la régénération des motoneurones et sur la pression artérielle (hypertension).

La présente invention a pour objet des polypeptides, isolés de mammifères, caractérisés en ce qu'ils comprennent à leur extrémité C-terminale un heptapeptide présentant la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa dans laquelle Xaa représente Val ou Ile, en ce qu'ils appartiennent à la famille des urotensines II et en ce qu'ils présentent au moins 45 %, et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1, correspondant à la prépro-urotensine II humaine.

La similarité est quantifiée à l'aide du logiciel Clustal notamment accessible sur l'Internet (site http ://wvw2. ebi. ac. uk/clustalw/).

La présente invention englobe en particulier : -la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID NO : 1), la pro-urotensine II humaine (SEQ ID NO : 2) et 1'urotensine II humaine (SEQ ID NO : 3), -la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID NO : 30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID NO : 31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID NO : 32), -la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID NO : 33), la pro- urotensine II de souris (SEQ ID NO : 34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID NO : 35).

Ces séquences polypeptidiques de mammifères présentent globale- ment une faible similarité avec les séquences de poisson ou de grenouille (figure 1 et figure 4) : -16 % de similarité entre la prépro-UII-a ou la prépro-UII-y de carpe et la prépro-UII humaine ; -25 % de similarité entre la prépro-UII de grenouille et la prépro- UII humaine.

Au niveau N-terminal de l'UII humaine, ces séquences ne présentent aucune similarité avec les UII de non-mammifères antérieurement décrites.

L'invention englobe également des polypeptides ou des peptides dérivés des urotensines II de mammifère et de leurs précurseurs, selon l'invention, par

addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ; il peut s'agir par exemple de polypeptides dans lesquels des modifications ont été apportées, notam- ment par substitution des acides aminés dextrogyres par des acides aminés levogyres (pseudopeptides) ou de polypeptides obtenus par modélisation moléculaire et présen- tant une activité d'urotensine II au niveau de la jonction neuromusculaire ou des autres cibles biologiques de l'urotensine II.

La présente invention a également pour objet un fragment d'acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence codant pour une urotensine II de mammifère telle que définie ci-dessus ou de sa séquence complémentaire, sens ou anti-sens, à 1'exception de 1'EST ayant pour numéro d'accession Gen Bank, le n° AA535545.

Dans ce cadre, la présente invention englobe en particulier les ADNc, les ARNm et les ADN gnomiques des urotensines II et de leurs précurseurs.

Elle englobe en particulier les séquences suivantes : * séquences humaines : -la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine, de séquence SEQ ID NO : 4, qui comprend 551 pb et dans laquelle : . le segment 1-32 est une séquence non-codante, . le segment 33-407 code pour la prépro-urotensine II humaine, le segment 33-92 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 408-551 est non-codant (voir figure 2), -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine (séquence SEQ ID NO : 5), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II humaine, le précurseur de l'urotensine II humaine et correspond au segment 93-407 de la SEQ ID N0 : 4 ; -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine (séquence SEQ ID NO : 6), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II humaine et correspond au segment 372-407 de la séquence SEQ ID NO : 4 ; -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine, codant pour un dipeptide (Pro-Tyr), en amont du site de clivage tribasique, lui-même situé juste en amont de la séquence codant pour l'urotensine II humaine et spécifique de ladite séquence humaine (voir figure 2) ; -des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID NO : 4 et notamment les séquences SEQ ID NO : 7-8 et 10-17 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes : . les séquences SEQ ID NO : 7 et NO : 8, correspondant respective- ment aux segments 267-292 et 535-511 de la séquence SEQ ID NO : 4 ;

. les séquences SEQ ID NO : 10 et 11 correspondant respectivement aux positions 198-216 et 381-404 de la séquence ID NO : 4 ; . les séquences SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13, correspondant respectivement aux positions 46-65 et 214-195 de la séquence SEQ ID NO : 4 ; . les séquences SEQ ID NO : 14 (positions 9-28 de la séquence SEQ ID NO : 4) et SEQ ID NO : 13 ; . les séquences SEQ ID NO : 15 (positions 14-33 de la séquence SEQ ID NO : 4) et SEQ ID NO : 13 ; . les séquences SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 16 (positionsl50-131 de la séquence SEQ ID NO : 4) ; . les séquences SEQ ID NO : 17 (positions 8-27 de la séquence SEQ ID NO : 4) et SEQ ID NO : 13.

-des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID NO : 4 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 4. Lesdites sondes sont de préférence utilisées dans les conditions d'hybridation suivantes : . hybridation : 5X SSPE (0,9 M NaCI/0,05 M tampon sodium phosphate, pH 7,7/0,005 M EDTA), 0,1 % SDS, 10X Denhardt's (0,2 % Ficoll/0,2 % polyvinylpyrrolidone/0,2 % BSA), 50 ug/ml ARNt, 50 pg/ml ADN de sperme de saumon dénaturé. 37°C, une nuit.

. lavages : 5X SSPE/0,1 % SDS, 4 fois 5 minutes, température ambiante, 3X SSPE/0,1 % SDS, 2 fois 10 minutes, 30°C.

* séquences de rat : -la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat, de séquence SEQ ID NO : 18, qui comprend 529 pb et dans laquelle : .le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de rat, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-529 est non-codant (voir figure 3), -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat (séquence SEQ ID NO : 19), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de rat, le précurseur de l'urotensine II de rat et correspond au segment 96-405 de la SEQ ID NO : 18 ; -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat (séquence SEQ ID NO : 20), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II de rat et correspond au segment 364-405 de la séquence SEQ ID NO : 18 ;

-des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID NO : 18 et notamment les séquences SED ID NO:36-42 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes : . tes séquences SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, correspondant respectivement aux positions 295-314 et 504-485 de la séquence SEQ IDNO : 18 ; . les séquences SEQ ID NO : 38 (positions 280-299 de la séquence SEQ ID N0 : 18) et SEQ ID NO : 37 ; . les séquences SEQ ID NO : 39 (positions 131-150 de la séquence SEQ ID NO : 18) et SEQ ID N0 : 40 (positions 314-295 de la SEQ ID N0 : 18) ; . les séquences SEQ ID NO : 41 (positions 322-341 de la séquence SEQ ID NO : 18) et SEQ ID N0 : 37 ; les séquences SEQ ID NO : 42 (positions 50-69 de la SEQ ID N0 : 18) et SEQ ID N0 : 40.

-des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID NO : 18 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 18, notamment la SEQ ID NO : 43 (positions 192-221 de la séquence SEQ ID NO : 18).

* séquences de souris -la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris, de séquence SEQ ID NO : 27, qui comprend 539 pb et dans laquelle : le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de souris, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-539 est non-codant (voir figure 4), -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID NO : 28), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de souris, le précurseur de l'urotensine de souris et correspond au segment 97-405 de la SEQ ID N0 : 27 ; -un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID NO : 29), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II de souris et correspond au segment 355-405 de la séquence SEQ ID NO : 27 ; -des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID NO : 27 et notamment les séquences SEQ ID NO : 21-26 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes : . les séquences SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22, correspondant respectivement aux positions 295-314 et 485-504 de la séquence SEQ ID NO : 27 ; . les séquences SEQ ID NO : 23 (positions 280-299 de la séquence SEQ ID N0 : 27) et SEQ ID N0 : 22 ;

. les séquences SEQ ID NO : 24 (positions 131-150 de la séquence SEQ ID NO : 27) et SEQ ID N0 : 22 ; . les séquences SEQ ID N0 : 25 (positions 295-314 de la séquence SEQ ID NO : 27) et SEQ ID N0 : 22 ; . les séquences SEQ ID NO : 24 et SEQ ID NO : 26 (positions 322-341 de la séquence SEQ ID N0 : 27).

-des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0 : 27 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID N0 : 27 et notamment la séquence SEQ ID NO : 44 (positions 204-233 de la séquence SEQ ID N0 : 27).

Les conditions d'hybridation des sondes murines sont similaires à celles exposées ci-dessus, pour les séquences humaines.

Compte tenu des données à la disposition des Inventeurs, il n'était pas évident que les mammifères puissent exprimer une urotensine II et que cette dernière exerçât effectivement d'autres effets que des effets cardiovasculaires.

Lesdits polypeptides peuvent être produits, soit en exprimant les séquences d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus dans des cellules hôtes, soit par synthèse, et notamment par synthèse selon la technique de Merrifield.

Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme première application de détecter soit la présence ou l'absence de l'ARNm codant pour une uro- tensine II de mammifère et notamment pour l'urotensine II humaine dans des échan- tillons biologiques (biopsies, par exemple), notamment chez des sujets présentant une pathologie neurodégénérative ou un traumatisme de la moelle épinière, soit de détecter une mutation dans la séquence du gène ou de l'ARINm codant pour l'urotensine (comparaison avec les séquences d'acides nucléiques selon l'invention).

Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme deuxième application, la production de vecteurs aptes à exprimer les précurseurs de l'urotensine II humaine, notamment dans le cadre d'une thérapie génique ciblée.

Dans le cadre de ces applications, les séquences nucléiques sont avantageusement, sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 6, les séquences de rat, SEQ ID NO : 18 à SEQ ID N0 : 20 et les séquences de souris, SEQ ID N0 : 27 à SEQ ID N0 : 29.

La présente invention a également pour objet une cellule transformée par au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polypeptide tel que défini ci-dessus ou au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour

tout ou partie desdits polypeptides, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Au sens de la présente invention, on entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable, aussi bien les véhicules usuels que ceux utilisés dans le cadre d'une thérapie génique.

De manière préférée, lesdites compositions sont administrées par voie intrathécale.

Les compositions selon la présente invention, permettent notamment de traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière, en particulier les maladies de la plaque neuromusculaire et plus particulièrement les maladies amyotrophiques, telles que la sclérose latérale amyotrophique ou les traumatismes de la moelle épinière, plus particulièrement les paraplégies et les hémiplégies.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID NO : 1), la pro-urotensine II humaine (SEQ ID NO : 2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID NO : 3), la prépro- urotensine II de rat (SEQ ID NO : 30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID NO : 31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID NO : 32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID NO : 33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID NO : 34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID NO : 35).

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que les séquences nucléiques sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 6, les séquences de rat, SEQ ID NO : 18 à SEQ ID NO : 20 et les séquences de souris, SEQ ID NO : 27 à SEQ ID NO : 29.

La présente invention a en outre pour objet, l'utilisation de polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II ou de séquences nucléiques codant pour lesdits polypeptides, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière ou les traumatismes de la moelle épinière.

Les polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II aptes à être utilisés conformément à l'invention peuvent avoir pour origine, aussi bien les invertébrés que les vertébrés, notamment les mammifères, et de préférence les mammifères humains.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID NO : 1), la pro-urotensine II humaine

(SEQ ID NO : 2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID NO : 3), la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID NO : 30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID NO : 31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID NO : 32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID NO : 33), la pro- urotensine II de souris (SEQ ID NO : 34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID NO : 35).

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que les polynucléotides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 6, les séquences de rat, SEQ ID NO : 18 à SEQ ID NO : 20 et les séquences de souris, SEQ ID NO : 27 à SEQ ID NO : 29.

La présente invention a, également, pour objet un kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence selon l'invention, apte à détecter la présence d'un ARNm, éventuellement modifié, codant pour une urotensine II de mammifère dans un échantillon biologique.

La présente invention a, en outre, pour objet l'utilisation desdits polypeptides, qui présentent également une activité hypertensive, pour la sélection d'antagonistes de cette activité (sélection d'anti-hypertenseurs présentant une activité à 1'encontre des urotensines II selon l'invention).

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 illustre l'alignement des séquences en acides aminés déduites respectivement des prépro-UII humaine, de grenouille et de carpe. Dans cette figure, la séquence signal est indiquée en italique ; les acides aminés conservés sont indiqués en noir ; les sites de clivage de la prohormone sont indiqués par des étoiles et les résidus acides conservés sont indiqués par un cercle noir. Le pont disulfure présent dans la séquence de l'UII est indiqué sous la séquence de l'urotensine II. Les acides aminés sont numérotés sur la droite de la figure ; -la figure 2 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII humaines ; -la figure 3 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de rat ; -la figure 4 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de souris ; -la figure 5 illustre la distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII humaine. La figure 5A illustre l'analyse en dot blot de l'expression de l'ARNm de la prépro-UII dans différents tissus humains, en utilisant le Masterblot de

Clontech (ARN poly (A) de 50 tissus humains différents (80-448 ng/point, standardisé en utilisant le taux d'expression en ARN de 8 gènes domestiques). Les contrôles posi- tifs consistent en ADN génomique humain ; les contrôles négatifs incluent de 1'ADN ou de l'ARN de levure ou d'E. coli ainsi que des séquences génomiques répétées humaines (H). Le blot est hybride avec la sonde d'ADNc codant pour la prépro-UII humaine et exposé pendant 2 jours à un film X-Omat. La figure 5B illustre l'analyse en Northern Blot de l'expression de l'ARNim de prépro-UII dans la moelle épinière humaine ; 2 pg d'ARNm poly (A) de moelle épinière sont hybrides avec la sonde constituée par 1'ADNc de la prépro-UII humaine. La taille est déterminée en utilisant des marqueurs de taille des ARN (chaînes de nucléotides standards calibrés). La figure 5C correspond à des autoradiographies aux rayons X et montre la distribution de l'ARNm de la prépro-UII dans la moelle épinière humaine. Les sections frontales sont hybridées avec une ribosonde prépro-UII anti-sens (1) ou sens (2) et exposées pendant 10 jours à des films sensibles aux rayons X ; -la figure 6 est une comparaison des structures primaires de l'urotensine II de différentes espèces. Des tirets ont été introduits pour que les séquences présentent un alignement optimal. Les points illustrent les identités de rési- dus d'acides aminés entre les différentes séquences, par rapport à la séquence humaine.

-la figure 7 illustre la distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII de rat et de souris.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE -Mntériel et Méthodes * Isolement de 1'ADNc de la prépro-UII humaine : Une séquence EST (expressed sequence tag) codant pour un peptide ayant une certaine identité avec l'urotensine II de grenouille est enregistrée sous le n° AA535545 (Genbank). Cette séquence dérive d'une analyse EST de clones d'ADNc obtenus à partir de tumeurs du colon.

Deux amorces (5'-AACCCAAGAGGAAATTTGAGAAAGTT-3' (SEQ ID NO : 7) et 5'-CCAGGTAACAATGAACAGGGTGTAG-3' (SEQ ID NO : 8)) déduites de la séquence EST permettent de synthétiser un fragment de 269 pb par RT- PCR à partir d'un échantillon de tumeur du colon humain, dans les conditions suivantes : 94°C, 4 min, 1X ; 94°C, 1 min ; 55°C, 1 min ; 72°C, 1 min, 30X ;

72°C, 5 min, 1X.

Le produit de la PCR est marqué avec des 32p dCTP par amorçage aléatoire, puis hybride avec différents tissus humains contenant des ARN poly (A) ainsi qu'avec des contrôles positifs et négatifs (MasterBlot, Clontech, Palo Alto).

L'hybridation et les lavages sont réalisés dans les conditions suivantes : * préhybridation : incubation à 42°C, au moins 5 heures dans un milieu réactionnel comprenant : 50 % formamide, 5X SSC, 5X Denhardt's, 50 mM NaH2P04/Na2HP04,200 g/ml ADN de sperme de saumon, 0,1 % SDS.

* hybridation : même milieu que le milieu de préhybridation avec la sonde marquée en plus.

* lavages : 4 fois 5 minutes à température ambiante, 2X SSC + 0,1 % SDS, puis 2 fois 10 minutes à 42°C, 0,1 % SDS + 0,1 % SDS.

Le blot est exposé à un film X-OMAT (Kodak) et les signaux d'hybridation sont quantifiés à l'aide du logiciel Densylab (Bioprobe Systems, France).

Le signal d'hybridation le plus important est obtenu dans la moelle épinière.

Dans ces conditions, l'ARN poly (A) de moelle épinière humaine (Clontech) est utilisé pour l'amplification de l'extrémité 5'de 1'ADNc d'UII humaine avec un kit RACE (kit d'amplification Marathon cDNA, Clontech).

* Analyse en Northern blot (transfert d'ARN sur membrane) : 2 u. g d'ARN poly (A) de moelle épinière humaine (Clontech) sont déposés sur gel d'agarose-formaldéhyde ; après migration, on procède à un transfert sur membrane de nylon et à une hybridation avec le produit de la PCR spécifique de 1'ADNc de l'UII humaine marqué par incorporation de 32P dCTP.

* Hybridation in situ : Des ribosondes sens et anti-sens humaines sont préparées par trans- cription in vitro des produits de la PCR obtenus avec des amorces prépro-UII spéci- fiques 5'-CTGCCAGAGATGCTGGGTG-3' (SEQ ID NO : 10) et 5'- GACACAGTATTTCCAGAAGCAATC-3' (SEQ ID NO : 11) étendues à leur extré- mité 5'-terminale avec les promoteurs SP6 et T7 des ARN polymérases correspon- dantes ; la transcription est réalisée en présence de 35S UTP (Amersham) ou de digoxigénine-11-UTP (Boerhinger), et de T3 ou T7 ARN polymérase, dans les mêmes conditions de PCR que celles exposées ci-dessus.

Une portion de moelle épinière cervicale humaine a été obtenue par autopsie d'un sujet de sexe masculin âgé de 70 ans.

Le fragment de tissu est fixé dans du formaldéhyde 4 % pendant 24 heures, inclus dans du Tissue-Tek et congelé dans de l'azote liquide.

Des sections frontales (12 Lm d'épaisseur) sont coupées à l'aide d'un cryostat et conservées à-80°C.

Les sections sont prétraitées comme décrit dans H. Tostivint et al.

(14) et recouvertes d'un tampon de préhybridation (50 % formamide, 0,6 M NaCI, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,0,02 % Ficoll, 0,02 % polyvinylpyrrolidine, 0,1 % BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0,550 ptg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, 50 g/ml d'ARNt de levure).

L'hybridation est réalisée à 55°C pendant une nuit dans le même tampon (à l'exception de la concentration en ADN de sperme de saumon dénaturé : 60 , g/ml), complémenté avec 10 mM de dithiothréitol, du sulfate de dextran à 10 % et des ribosondes dénaturées par la chaleur.

Les sondes marquées au 35S et les sondes marquées à la digoxigénine sont diluées dans le tampon d'hybridation pour obtenir une concentration finale de 5.106 dpm/ml et 1 : 100 (v/v), respectivement.

Les coupes sont lavées dans du tampon 2X SSC à 60°C et traitées avec de la RNase A (50 ptg/ml) pendant 60 min à 37°C.

Cinq lavages dans des conditions stringentes sont effectués dans un tampon 0,1X SSC, 14 mM de p-mercaptoéthanol, 0,05 % de pyrophosphate de sodium à 60°C.

Les sections hybridées avec les ribosondes marquées au 35S sont déshydratées dans des solutions d'éthanol comprenant des concentrations croissantes d'acétate de sodium 0,3 M et exposées sur un film Hyperfilm-pmax (Amersham) pendant 2 semaines.

Les sections hybridées avec les ribosondes marquées à la digoxi- génine sont lavées dans un tampon 1 (100 mM Tris-HCl et 150 mM NaCl, pH 7,5), incubées pendant 30 min dans un tampon de blocage (2 % d'agent bloquant Boehringer dans du tampon 1) et incubées pendant 2 heures dans le tampon 1 conte- nant 1 : 500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline (Boehringer), 1 % de sérum de mouton normal et 0,1 % de Triton X100. Les sections sont rincées deux fois pendant 10 min dans le tampon 1 et 10 min dans le tampon 2 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCI et 50 mM MgCl2, pH 9,5), puis incubées pendant 3 heures dans une solution chromagène consistant en Fast Red TR/Naphtol AS-MX et 3 mM Levamisole (Sigma).

La réaction est arrêtée par rinçage dans un tampon TE (10 mM Tris- HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Les sections sont examinées avec un microscope (Leitz Orthoplan).

* Séquençaae Le produit de l'amplification est sous-clone dans un vecteur pGEM- T (Promega) et séquence avec les amorces SP6 et T7 en utilisant le kit de séquençage Amersham (Thermo Sequenase).

-Résultats * Caractérisation de 1'ADNc de prépro-UII humaine : Le cadre de lecture ouvert des ADNc du précurseur de 1'UII humaine code pour une protéine de 124 acides aminés (figure 1 et figure 2).

L'organisation des précurseurs UII humains est similaire à celle de la prohormone UII de carpe et à celle du précurseur UII de la grenouille. Tous ces précurseurs comprennent une séquence signal en N-terminal puis un peptide flanquant, un site de clivage protéolytique (Lys/Arg-Lys-Arg) et la séquence de l'urotensine II, localisée à l'extrémité C-terminale de chaque précurseur.

Les peptides flanquants N-terminaux des précurseurs de carpe, de grenouille et humain ne présentent quasiment pas de similarité.

L'UII humaine ne comprend que 11 acides aminés alors que l'UII de grenouille et de carpe en possèdent respectivement 13 et 12 (figure 6).

La séquence de l'heptapeptide cyclique C-terminal de l'urotensine II est conservée chez la grenouille et chez l'homme. Au contraire, la région N-terminale du peptide est très variable.

Chez la grenouille, comme chez la carpe, la région C-terminale du peptide flanquant contient un site de clivage potentiel dibasique (Arg-Lys et Arg-Arg) qui pourrait générer le dipeptide conservé Gln-Phe.

Cependant, chez l'homme, la séquence du dipeptide correspondant est totalement différente (Pro-Tyr) (figure 1 et figure 2).

* Distribution de l'ARNm de la prépro-UII humaine a été étudiée : La distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII humain a été étudiée par analyse dot blot (figure 5A).

Sur les 50 tissus différents testés, la moelle épinière présente le signal d'hybridation le plus important. L'ARNm de la prépro-UII est également observé dans la medulla oblongata mais l'intensité du signal est bien plus faible que celle obtenue dans la moelle épinière.

Dans les tissus périphériques, la présence d'ARNm de la prépro-UII est détectée dans le rein, la rate, l'intestin grêle, le thymus, la prostate, l'hypophyse, la glande surrénale et en moindres quantités, dans l'estomac, le pancréas, les ovaires et le foie (figure SA).

L'analyse par Northern blot révèle la présence d'une seule bande correspondant à un ARNm de la prépro-UII d'environ 700 pb, dans la moelle épinière humaine.

Le marquage de sections de la portion cervicale de la moelle épinière humaine par hybridation in situ montre que l'ARNm de la prépro-UII est localisé dans les motoneurones (figure 5C).

* Caractérisation de 1'ADNc de prépro-UII de rat et de souris : Le cadre de lecture ouvert des ADNc du précurseur de 1'UII de rat et de souris code pour une protéine de 123 acides aminés (figures 3 et 4).

La figure 7 illustre les résultats de la distribution dans divers tissus de rat et de souris par RT-PCR. Les ARN totaux sont extraits et soumis à une réaction de RT-PCR, dans des conditions similaires à celles exposées ci-dessus.

A la figure 7A, les produits PCR de rat (gauche) et de souris (droite) sont détectés par hybridation avec une sonde oligonucléotidique interne et spécifique de rat et de souris (respectivement les séquences SEQ ID NO : 43 et 44).

La figure 7B illustre le dépôt sur gel d'agarose des produits PCR GAPDH utilisés comme contrôle pour refléter des taux équivalents d'ARN RÉFÉRENCES 1. H. A. Bern et al., Rec. Prog. Horm. Res., 1985,41,533-552.

2. D. Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980,77,5021-5024.

3. J. M. Conlon et al., Regur. Pept., 1997,69,95-103.

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14. H. Tostivint et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93,12605-12610.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, 1'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre ni de la portée de la présente invention.