E V O N I K G o l d s c h m i d t GmbH

Verwendung von 13-Hvdroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure zur Bräunung

menschlicher Haut

Gebiet der Erfindung Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von 13-Hydroxy-9, 1 1 - octadecadiensäure zur Bräunung menschlicher Haut und damit assoziierter Verfahren.

Stand der Technik

Viele Verbraucher wünschen sich einen dunkleren Teint („gesunde Bräune") und setzen sich daher entweder gefährlicher UV-Strahlung aus oder greifen zu kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen in Form sogenannter „Selbstbräuner".

Künstliche Hautbräunung lässt sich auf kosmetischem bzw. medizinischem Wege bewirken, wobei im Wesentlichen folgende Ansätze eine Rolle spielen:

Durch regelmäßige Einnahme von Carotin-Präparaten wird Carotin im

Unterhaut- Fettgewebe gespeichert, die Haut färbt sich allmählich orange bis gelbbraun.

Mit Hilfe abwaschbarer Make-up-Präparate kann eine leichte Hauttönung erzielt werden (z.B. Extrakte aus frischen grünen Walnussschalen, Henna).

Die Anfärbung kann auch auf dem Wege der chemischen Veränderung der Hornschicht der Haut mit sogenannten selbstbräunenden Zubereitungen erfolgen. Wichtigster Wirkstoff ist das Dihydroxyaceton (DHA). Die auf diese Weise erzielte Hautbräunung ist nicht abwaschbar und wird erst mit der normalen Abschuppung der Haut (nach ca. 10— 15 Tagen) entfernt.

Dihydroxyaceton kann als Ketotriose bezeichnet werden und reagiert als reduzierender Zucker mit den Aminosäuren der Haut bzw. den freien Amino- und Imino- Gruppen des Keratins über eine Reihe von Zwischenstufen im Sinne einer Maillard- Reaktion zu braungefärbten Stoffen, sogenannten Melanoiden, welche gelegentlich auch Melanoidine genannt werden.

Nachteile der Bräunung mit Dihydroxyaceton liegt darin, daß die mit ihm gebräunte Haut

· häufig ungleichmäßig gebräunt ist

• keinen natürlichen Hautbräunungsfarbton aufweist

• nach dem Auftragen auf die Haut unangenehm riecht

• es zu starken Verfärbungen der Handinnenflächen und der Nägel kommt und

• im Gegensatze zu„sonnengebräunter" Haut nicht gegen Sonnenbrand geschützt ist.

Dihydroxyaceton führt häufig zur Verfärbung von Kleidern, Bettwäsche und sonstigen Textilien.

Ein anderer Weg zur strahlungsfreien Hautbräunung besteht darin, einen Wirkstoff auf die Haut aufzutragen, der die Melaninsynthese anregt und so eine

Bräunung durch Stimulation des hauteigenen Bräunungssystems erreicht wird.

Die bekanntesten Stimulatoren der Melaninsynthese sind Tyrosin und

Tyrosinacylderivate, insbesondere N-Acetyltyrosin und N-Caproyltyrosin und deren Salze. Auch durch D-Quiroinositol kann die Melaninsynthese angeregt werden. Die Anregung der Melaninsynthese ahmt den natürlichen

Bräunungsprozess nach und führt damit zu einem natürlicheren Farbton als

Dihydroxyaceton.

Alle klassischen Selbstbräunungsprodukte zeigen nur sehr schlechte

hautpflegende Eigenschaften. Essenzielle Fettsäuren werden seit langer Zeit als kosmetische Wirkstoffe eingesetzt. Sie kommen zum Beispiel im Nachtkerzenöl, Traubenkernöl, Weizenkeimöl, Leinöl, Hagebutten- Johannesbeer- oder Himbeerkernöl vor. Diese Öle enthalten unter anderem Linolsäure (Omega-6). Diese wird in der Haut durch die 15-Lipoxygenase (15-LOX) und nachfolgende Reduktion in einen stark wirksamen entzündungshemmenden Metaboliten umgewandelt, das antiinflammatorische 13-HODE (13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure). 13- HODE hemmt das entzündungsauslösende Leukotrien LTB4.

Daher ist die topische Applikation der vorgenannten Öle sowie des 13-HODE selber zur Reduktion von trockener, sensibler und schuppiger Haut in der Literatur beschrieben.

So beschreibt beispielsweise die WO2004034958 die Verwendung von

Fettsäure-Derivaten in kosmetischen und pharmazeutischen Präparationen zur Synthese von 13-HODE in der Epidermis, um trockener Haut vorzubeugen. Die WO2009153169 beschreibt ein Derivat der 13-Hydroxy-9, 1 1 - octadecadiensäure, nämlich 8-Methoxy-13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure, als Haut aufhellenden Wirkstoff und deren Verwendung in Kompositionen.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Selbstbräunungsmittel bereitzustellen, das mindestens einen Nachteil des Standes der Technik zu überwinden vermag.

Beschreibung der Erfindung Insbesondere vor der Offenbarung der WO2009153169 wurde völlig

überraschend gefunden, dass 13-Hydroxy-9,1 1 -octadecadiensäure als Wirkstoff zur Bräunung der Haut eingesetzt werden kann.

Es ist bekannt, dass die Expression des POMC Genes in Keratinocyten durch UV Strahlung aktiviert wird. POMC ist der Vorläufer von α-MSH, einem Haupt- Aktivator der Melanocyten. Eine erhöhte α-MSH Aktivität induziert die

Bräunungsreaktion der Haut. Es wurde nun unerwartet und überraschend gefunden, dass die Inkubation von Keratinocyten mit 13-HODE die Expression von POMC sowohl nach UV-Stimulation als auch ohne vorherige UV- Stimulation signifikant erhöht, was zu einer verstärkten Bräunungsreaktion der Haut führt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die Verwendung von 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure zur Bräunung menschlicher Haut, die

Verwendung von 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure zur Stimulierung der Melaninbildung und Verfahren zur Bräunung oder Verbesserung der Bräunung menschlicher Haut.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Haarfärbeverfahren.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass 13-Hydroxy-9, 1 1 - octadecadiensäure auch zur Behandlung der Kopfhaut geeignet ist, um dort auf die Melanocyten einzuwirken, die die Färbung des nachwachsenden Haars bewirken, wodurch die natürliche Haarfarbe wieder gewonnen werden kann. Weitere Vorteile von 13-HODE sind, dass es die Bräunung der Haut steigert, eine gleichmäßige und natürliche Bräunung der Haut ermöglicht, keine unerwünschten Gerüche beim Auftragen auf die Haut entwickelt, kein unerwünschtes Austrocknen der Haut mit sich bringt, keine unerwünschte Verfärbung bestimmter Hautareale, wie z.B. der Handinnenflächen und der Nägel verursacht und eine Verfärbung von Textilien nach Auftragen auf die Haut vermeidet.

Noch ein Vorteil ist es, dass eine intensivere Bräunung durch Sonnenlicht trotz hoher UV-Lichtschutzfilter ermöglicht wird.

Über dies hinaus wird durch den Einsatz von 13-HODE eine lange anhaltende Hautbräunung mit natürlicherer Farbgebung erreicht.

Besonders vorteilhaft ist die hohe Lagerstabilität in Zubereitungen.

Unter den Begriffen„13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure" und„13-HODE", die hier synonym verwendet werden, sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sämtliche Konfigurationsisomere sowie Stereoisomere der

Verbindung umfasst; solche sind beispielsweise 13-Hydroxy-9Z, 1 1 E- octadecadiensäure, 13-Hydroxy-9E, 1 1 Z-octadecadiensäure, 13-Hydroxy- 9Z, 1 1 Z-octadecadiensäure, 13-Hydroxy-9E, 1 1 E-octadecadiensäure Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben

Massenprozent. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein 13-HODE bevorzugt, welches eine 9-Z 1 1 -E Konfigurationsisomerie aufweist.

Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein 13-HODE, welches eine S- Stereokonfiguration am C13 aufweist.

Besonders bevorzugt wird ein 13-HODE, welches eine 9Z, 1 1 E

Konfigurationsisomerie und eine S-Stereokonfiguration am C13 aufweist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure als aktives Selbstbräunungsmittel in einer Formulierung, insbesondere in einem Selbstbräuner oder einer

Sonnenschutzformulierung.

Sonnenschutzformulierungen erkennt der Fachmann an ihrer augenfällig Zubereitung als solche. Die augenfällige Zubereitung einer

Sonnenschutzformulierung lässt sich insbesondere daran ausmachen, dass UV-Strahlung absorbierende Substanzen enthalten sind. Beispiele solcher Substanzen sind Ester der Zimtsäure, Ester der Salicylsäure, Benzophenon, feindisperse Metalloxide bzw. Salze wie Titandioxid oder Zinkoxid.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure zum Erhalt bestehender Hautbräune. Unter dem Begriff„Erhalt besthender Hautbräune" ist zu verstehen, dass Haut eines bestimmten Bräunungsgrades über einen bertachten Zeitraum weniger schnell aufhellt (an Hautbräune verliert), als dieselbe betrachte Haut ohne weitere Behandlung. Die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung von 13-HODE genannten Formulierungen sind insbesondere kosmetische Formulierungen. Die im Folgenden hinsichtlich„Formulierungen" getroffenen Aussagen treffen ebenfalls für die unten beschriebenen, in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Formulierungen zu und beziehen sich auch auf diese.

Diese Formulierungen enthalten bevorzugt von 0,00001 Massenprozent bis 1 Massenprozent, bevorzugt 0,00005 Massenprozent bis 0,5 Massenprozent, besonders bevorzugt 0,0001 Massenprozent bis 0, 1 Massenprozent 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure bezogen auf die Gesamtmasse der

Formulierung.

Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Formulierung kann z.B. mindestens eine zusätzliche Komponente enthalten, ausgewählt aus der Gruppe der

Emollients,

Emulgatoren,

Verdicker/Viskositätsregler/Stabilisatoren,

UV-Lichtschutzfilter,

Antioxidantien,

Hydrotrope (oder Polyole),

Fest- und Füllstoffe,

Perlglanzadditive,

Deodorant- und Antitranspirantwirkstoffe,

Insektrepellentien,

Selbstbräuner,

Konservierungsstoffe,

Konditionierm ittel,

Parfüme,

Farbstoffe,

kosmetische Wirkstoffe,

Pflegeadditive,

Überfettungsmittel,

Lösungsmittel.

Substanzen, die als beispielhafte Vertreter der einzelnen Gruppen eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise der deutschen Anmeldung DE 102008001788.4 entnommen werden. Diese Patentanmeldung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt somit als Teil der Offenbarung.

Bezüglich weiterer fakultativer Komponenten sowie den eingesetzten Mengen dieser Komponenten wird ausdrücklich auf die dem Fachmann bekannten einschlägigen Handbücher, z. B. K. Schräder, "Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika", 2. Auflage, Seite 329 bis 341 , Hüthig Buch Verlag Heidelberg, verwiesen.

Die Mengen der jeweiligen Zusätze richten sich nach der beabsichtigten

Verwendung.

Typische Rahmenrezepturen für die jeweiligen Anwendungen sind bekannter Stand der Technik und sind beispielsweise in den Broschüren der Hersteller der jeweiligen Grund- und Wirkstoffe enthalten. Diese bestehenden Formulierungen können in der Regel unverändert übernommen werden. Im Bedarfsfall können zur Anpassung und Optimierung die gewünschten Modifizierungen aber durch einfache Versuche komplikationslos vorgenommen werden.

Bevorzugt enthalten die Formulierungen im Zusammenhang mit der

vorliegenden Erfindung als zusätzliche Komponente mindestens einen

Selbstbräuner und/oder einen UV-Lichtschutzfilter. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein nichttherapeutisches, kosmetisches Verfahren zur Bräunung menschlicher Haut ohne Einwirkung von UV-Strahlung, dadurch gekennzeichnet, dass 13-Hydroxy- 9, 1 1 -octadecadiensäure und/oder mindestens eine Formulierung enthaltend 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure auf die Haut aufgetragen wird.

Der Wirkmechanismus von 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure erlaubt auch eine vorteilhafte Bräunung der menschlichen Haut unter UV-Lichteinstrahlung, da er den Bräunungseffekt einer definierten Lichtmenge verstärkt. Somit ist ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nicht-therapeutisches, kosmetisches Verfahren zur Beschleunigung und/oder Intensivierung der UV- induzierten Bräunung menschlicher Haut, dadurch gekennzeichnet, dass 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure und/oder mindestens eine Formulierung enthaltend 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure auf die Haut aufgetragen wird. In derselben Weise vorteilhaft erweist sich der Wirkmechanismus von 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäurebei bei alternativen Bräunungsverfahren, da hierdurch Nachteile der alternativen Verfahren, wie beispielsweise

ungleichmäßige Färbung, ausgeglichen werden können.

Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nichttherapeutisches, kosmetisches Verfahren zur Verbesserung der durch

Dihydroxyaceton und/oder Erythrulose induzierten Bräunung menschlicher Haut, dadurch gekennzeichnet, dass 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure und/oder mindestens eine Formulierung enthaltend 13-Hydroxy-9, 1 1 - octadecadiensäure auf die Haut aufgetragen wird.

Der Wirkmechanismus von 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure ermöglicht eine Wiederherstellung der ursprünglichen Haarfarbe von alterungsbedingt ergrautem Haar. Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein nicht-therapeutisches, kosmetisches Verfahren zur Färbung menschlicher Haare, bevorzugt menschlicher Kopfhaare, dadurch gekennzeichnet, dass 13- Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure und/oder mindestens eine Formulierung enthaltend 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure auf die Haut, bevorzugt die Kopfhaut, aufgetragen wird.

Den vorgenannten Verfahren ist gemein, dass eine einmalige Anwendung zwar einen Effekt zeigt, um jedoch nachhaltige Färbungen zu erreichen, ist eine wiederholte Applikation nötig; daher werden bei den erfindungsgemäßen Verfahren die 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure und/oder die mindestens eine Formulierung enthaltend 13-Hydroxy-9,1 1 -octadecadiensäure bevorzugt wiederholt, jedoch mindestens einmal, insbesondere zweimal oder dreimal täglich auf die Haut aufgetragen. 13-Hydroxy-9, 1 1 -octadecadiensäure kann ähnlich wie beta-Carotin helfen, polymorphe Lichtdermatose vorzubeugen oder zu lindern. Dabei führt die Behandlung der zu schützenden Haut mit 13-HODE über einen dualen

Mechanismus zu einer Prävention bzw. Verminderung der durch die polymorphe Lichtdermatose hervorgerufenen Hautveränderung. Zum einen bewirkt die verstärkte Melaninproduktion einen effizienteren Schutz vor der UV- Strahlung des Sonnenlichts, die als Hauptursache für die Symptome der polymorphen Lichtdermatose angesehen wird. Zum anderen hat 13-HODE einen anti-inflammatorischen Effekt, der zur Hautberuhigung führt und die negativen Begleiterscheinungen der polymorphen Lichtdermatose (Rötung, Juckreiz, Bläschenbildung etc.) abmindert.

Somit ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung 13-Hydroxy-9, 1 1 - octadecadiensäure zum Schutz der Haut vor und/oder zur Behandlung von polymorpher Lichtdermatose.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.

Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:

Abbildung 1 : Stimulation der UV-induzierten POMC-Expression in NHEKs durch 13-HODE. Gezeigt wird die relative Genexpressionsstärke von POMC normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Werte beziehen sich auf die

Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle. Abbildung 2: Stimulation der basalen (d.h. nicht durch UV-induzierten) POMC- Expression in NHEKs durch 13-HODE. Gezeigt wird die relative

Genexpressionsstärke von POMC normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Werte beziehen sich auf die Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle.

Abbildung 3: Reduktion der UV-stimulierten Induktion von IL-6 durch 13-HODE. Gezeigt wird die relative Genexpressionsstärke von IL-6 normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Balken zeigen die relative Induktion der Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle.

Abbildung 4: Reduktion der UV-stimulierten Induktion von IL-8 durch 13-HODE. Gezeigt wird die relative Genexpressionsstärke von IL-8 normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Balken zeigen die relative Induktion der

Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle. Abbildung 5: Reduktion der UV-stimulierten Induktion von TNFa durch 13- HODE. Gezeigt wird die relative Genexpressionsstärke von TNFa normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Balken zeigen die relative Induktion der Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle.

Abbildung 6: Reduktion der UV-stimulierten Induktion von COX2 durch 13- HODE. Gezeigt wird die relative Genexpressionsstärke COX2 normiert auf die 18S rRNA als Referenz. Die Balken zeigen die relative Induktion der

Genexpressionsstärke im Vergleich zur nur mit dem Vehikel behandelten Kontrolle.

Abbildung 7: Blau-Gelb-Parameter b ^*

Abbildung 8: ITA° (Individual Typology Angle).

Beispiele:

Beispiel 1: 13-HODE-stimulierte POMC-Induktion

Im vorliegenden Beispiel wurde die Wirkung von 13-HODE auf die POMC- Genexpression in UV-B-stimulierten Keratinozyten (normal human epidermal keratinocytes, NHEKs) untersucht. Dazu wurden zunächst primäre humane epidermale Keratinozyten aus neonataler Vorhaut präpariert. Die

Vorgehensweise ist in folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Grether-Beck et al., J Invest Dermatol 2005, 125: 545 - 553; und Grether-Beck et al., Exp Dermatol 2008, 17: 771 - 779. Nachfolgend wurden die Zellen in definiertem Serum-freien Keratinozyten-Wachstumsmedium SFM (Invitrogen, Heidelberg, D) unter Zusatz von Rinderhypophysenextrakt (Invitrogen, Heidelberg, D) und rekombinantem epidermalen Wachstumsfaktor (Invitrogen, Heidelberg, D) kultiviert. Die Zellen wurden bis zur Passage 2 oder 3 bei 37 °C und 5% CO ₂ inkubiert. Für den Test auf Stimulation der UV-B-induzierten POMC- Genexpression wurden die Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und bis zur Subkonfluenz (maximal 70%) kultiviert.

Anschliessend wurde das Medium von den Zellen abgenommen und durch frisches Medium suppiementiert mit 13-HODE ersetzt. Hierfür wurde eine 1000x Stocklösung von 3000 pg/ml 13-HODE gelöst in DMSO eingesetzt.

Endkonzentration von 13-HODE im Medium war 3 g/ml, Endkonzentration von DMSO im Medium 0, 1 % (v/v). Als Kontrolle wurden Kultivierungen ohne 13- HODE, nur mit dem Vehikel DMSO durchgeführt. Sämtliche Kultivierungen wurden dreifach vorgenommen (3 biologische Replikate).

Nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Zellen einer Dosis von 160 J/m ² UV- B-Strahlung ausgesetzt. Dazu wurde zunächst das Medium durch PBS-Puffer ersetzt, die Deckel der 6-Well-Platten wurden entfernt, und die Zellen wurden unter einer Bank ausgestattet mit 4 FS 20 Sonnenlichtbirnen (Westinghouse Electric Corporation, Pittsburgh, PA, USA) der Strahlung ausgesetzt. Die abgegebene Leistung wurde mittels IL 1700 Research Radiometer und SEE 240 UV-B Photodetektor (International Light Inc., Newbury Port, MA) bestimmt und betrug 2,4 W/m ² bei einer Distanz von 22 cm. Zu Vergleichszwecken wurden auch unbestrahlte Kontrollansätze mitgeführt, um den Einfluss der UV- Strahlung auf die POMC-Genexpression ermitteln zu können.

Nach der Bestrahlung wurde das PBS durch Kultivierungsmedium mit 3 pg/ml 13-HODE ersetzt, und die Zellen wurden bis zur Zellernte für weitere 6 h kultiviert.

Die Isolation der Gesamt-RNA sowie die nachfolgende Analyse der

Genexpression mittels quantitativer Real Time PCR (qRT-PCR) erfolgte wie vormals beschrieben (Grether-Beck et al., J Invest Dermatol 2005, 125: 545 - 553; Grether-Beck et al., Exp Dermatol 2008, 17: 771 - 779).

Zusammengefasst wurde die Gesamt-RNA mittels RNeasy Total RNA Kit (Qiagen, Hilden, D) isoliert. Die RNA-Konzentration wurde mittels

photometrischer Messung bei 260/280 nm (Biophotometer, Eppendorf, D) bestimmt. Von jeder Probe wurden 100 ng Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt, wobei das Superscript ^® lll -First Strand Synthesis System for RT- PCR (Invitrogen, Karlsruhe, D) eingesetzt wurde. Für die PCR-Reaktion wurde der SYBR ^® Green PCR Master Mix entsprechend der Herstellerangaben eingesetzt. Neben der POMC-Expression wurde auch die Expression des 18s rRNA-Gens als Referenz quantitativ bestimmt. Für beide Zielgene wurden jeweils folgende Primer-Paare eingesetzt:

POMC:

5- GCTACGGCGGTTTCATG-3 ^' (Seq ID Nr. 1 ) und

5- TG ATG ATG G C GTTTTTG AAC A-3 ^' (Seq ID Nr. 2);

18S:

5 ^' - GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG -3 ^' (Seq ID Nr. 3) und

5 ^' - CATTCTTGGCAAATGCTTTCG -3 ^' (Seq ID Nr. 4).

Die PCR-Reaktionen wurden auf einem Opticon 1 (MJ Research, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Für sämtliche PCRs wurden Doppelbestimmungen der biologischen Triplikate durchgeführt, und für die Auswertung wurden Mittelwerte aller Messungen kalkuliert. Das PCR-Protokoll wies folgendes Profil auf: Schritt 1 ), 10 Minuten Aktivierung der Hot Start Polymerase bei 94 °C; Schritt 2), 20 Sekunden Denaturierung bei 95 °C; Schritt 3), 20 Sekunden Primer-Annealing bei 55 °C; Schritt 4), 30 Sekunden Extension bei 72 °C. Die Zyklenzahl der Schritte 2)-4) lag bei 46. Für den relativen Vergleich der Genexpression wurde die 2(-delta delta C(T))-Methode angewandt (Livak KJ, and Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 (-delta delta C(T)) method. Methods 2001 , 25: 402 - 408).

Die Auswertung der Genexpressionsanalyse zeigte, dass die Behandlung der Keratinozyten mit 13-HODE die UV-induzierte POMC-Expression signifikant (p<0,01 ) stimuliert. Nur mit UV behandelte Zellen zeigten gegenüber der unbehandelten Kontrolle eine Induktion der POMC-Expression um den Faktor 1 ,8. Die Stimulation mit 13-HODE hingegen führte in den UV-behandelten Zellen zu einer um den Faktor 4,9 gesteigerten POMC-Expression im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Beispiel 2: 13-HODE-stimulierte POMC-Induktion ohne UV

Im vorliegenden Beispiel wurde die Wirkung von 13-HODE auf die POMC- Genexpression in Keratinozyten untersucht, die im Gegensatz zu Beispiel 1 nicht durch vorherige UV-Bestrahlung stimuliert wurden. Dazu wurden zunächst primäre humane epidermale Keratinozyten aus neonataler Vorhaut präpariert. Die Vorgehensweise ist in folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

beschrieben (Grether-Beck et al., J Invest Dermatol 2005, 125: 545 - 553;

Grether-Beck et al., Exp Dermatol 2008, 17: 771 - 779). Nachfolgend wurden die Zellen in definiertem Serum-freien Keratinozyten-Wachstumsmedium SFM (Invitrogen, Heidelberg, D) unter Zusatz von Rinderhypophysenextrakt

(Invitrogen, Heidelberg, D) und rekombinantem epidermalen Wachstumsfaktor (Invitrogen, Heidelberg, D) kultiviert. Die Zellen wurden bis zur Passage 2 oder 3 bei 37 °C und 5% CO ₂ inkubiert. Für den Test auf Stimulation der POMC- Genexpression wurden die Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und bis zur Subkonfluenz (maximal 70%) kultiviert.

Anschließend wurde das Medium von den Zellen abgenommen und durch frisches Medium supplementiert mit 13-HODE ersetzt. Hierfür wurde eine 1000x Stocklösung von 10000 pg/ml 13-HODE gelöst in DMSO eingesetzt.

Endkonzentration von 13-HODE im Medium war 10 pg/ml (w/v),

Endkonzentration von DMSO im Medium 0, 1 % (v/v). Als Kontrolle wurden Kultivierungen ohne 13-HODE, nur mit dem Vehikel DMSO durchgeführt.

Sämtliche Kultivierungen wurden dreifach vorgenommen (3 biologische

Replikate).

Nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Zellen zunächst in PBS-Puffer gewaschen, und anschließend mit frischem Kultivierungsmedium mit 10 pg/ml 13-HODE versetzt. Nachfolgend wurden die Zellen bis zur Zellernte für weitere 24 h kultiviert.

Die Isolation der Gesamt-RNA sowie die nachfolgende Analyse der

Genexpression mittels quantitativer Real Time PCR (qRT-PCR) erfolgte wie vormals beschrieben (Grether-Beck et al., J Invest Dermatol 2005, 125: 545 - 553; Grether-Beck et al., Exp Dermatol 2008, 17: 771 - 779).

Zusammengefasst wurde die Gesamt-RNA mittels RNeasy Total RNA Kit (Qiagen, Hilden, D) isoliert. Die RNA-Konzentration wurde mittels

photometrischer Messung bei 260/280 nm (Biophotometer, Eppendorf, D) bestimmt. Von jeder Probe wurden 100 ng Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt, wobei das Superscript ^® lll -First Strand Synthesis System for RT- PCR (Invitrogen, Karlsruhe, D) eingesetzt wurde. Für die PCR-Reaktion wurde der SYBR ^® Green PCR Master Mix entsprechend der Herstellerangaben eingesetzt. Neben der POMC-Expression wurde auch die Expression des 18s rRNA-Gens als Referenz quantitativ bestimmt. Für beide Zielgene wurden jeweils folgende Primer-Paare eingesetzt:

POMC:

5- GCTACGGCGGTTTCATG-3 ^' (Seq ID Nr. 1 ) und

5- TG ATG ATG G C GTTTTTG AAC A-3 ^' (Seq ID Nr. 2);

18S:

5 ^' - GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG -3 ^' (Seq ID Nr. 3) und

5 ^' - CATTCTTGGCAAATGCTTTCG -3 ^' (Seq ID Nr. 4).

Die PCR-Reaktionen wurden auf einem Opticon 1 (MJ Research, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Für sämtliche PCRs wurden Doppelbestimmungen der biologischen Triplikate durchgeführt, und für die Auswertung wurden Mittelwerte aller Messungen kalkuliert. Das PCR-Protokoll wies folgendes Profil auf: Schritt 1 ), 10 Minuten Aktivierung der Hot Start Polymerase bei 94 °C; Schritt 2), 20 Sekunden Denaturierung bei 95 °C; Schritt 3), 20 Sekunden Primer-Annealing bei 55 °C; Schritt 4), 30 Sekunden Extension bei 72 °C. Die Zyklenzahl der Schritte 2)-4) lag bei 46. Für den relativen Vergleich der Genexpression wurde die 2(-delta delta C(T))-Methode angewandt (Livak KJ, and Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 (-delta delta C(T)) method. Methods 2001 , 25: 402 - 408).

Die Auswertung der Genexpressionsanalyse zeigte, dass die Behandlung der Keratinozyten mit 10 pg/ml 13-HODE die basale (nicht durch UV stimulierte) POMC-Expression im Vergleich zur mit dem Vehikel (DMSO) behandelten Kontrolle 1 ,2-fach erhöht. Beispiel 3: Reduktion der UV-stimulierten Induktion proinflammatorischer Markergene durch 13-HODE

Im vorliegenden Beispiel wurde die Wirkung von 13-HODE auf die Expression verschiedener proinflammatorischer Markergene in UV-B-stimulierten

Keratinozyten (normal human epidermal keratinocytes, NHEKs) untersucht. Die experimentelle Vorgehensweise war weitestgehend identisch zu der in Beispiel 1 geschilderten Vorgehensweise. Unterschiede bestanden lediglich in der Auswahl der genspezifischen Primer für die Durchführung der quantitativen Real-Time PCR.

Folgende Primer-Paare wurden jeweils eingesetzt:

IL-6:

5 ^' -AGCCGCCCCACACAGA-3 ^' (Seq ID Nr. 5) und

5 ^' -CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3 ^' (Seq ID Nr. 6);

IL-8:

5 ^' -CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3 ^' (Seq ID Nr. 7) und

5 ^' -TTAG C ACTC CTTG G C AAAACTG-3 ^' (Seq ID Nr. 8);

TNF-a:

5 ^' -GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3 ^' (Seq ID Nr. 9) und

5 ^' -TG C C C AG ACTC G G C AAAG-3 ^' (Seq ID Nr. 10);

COX-2:

5 ^' -G AATC ATTC AC C AG G C AAATTG-3 ^' (Seq ID Nr. 1 1 ) und

5 ^' -TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3 ^' (Seq ID Nr. 12);

18S:

5 ^' - GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG -3 ^' (Seq ID Nr. 3) und

5 ^' - CATTCTTGGCAAATGCTTTCG -3 ^' (Seq ID Nr. 4).

Die Auswertung der Genexpressionsanalyse zeigte, dass die Bestrahlung der Keratinozyten mit UV-Licht zu einer deutlichen Induktion der Expression der untersuchten proinflammatorischen Marker-Gene führte. Im Vergleich zur nichtbestrahlten Kontrolle wurden Induktionen der Genexpression um den Faktor 10, 1 (IL-6), 1 1 ,2 (IL-8), 7,4 (TNF-α) bzw. 2,5 (COX2) beobachtet.

Gleichermaßen bestrahlte, aber mit 13-HODE behandelte Zellen wiesen in allen Fällen deutlich reduzierte Expressionslevel derselben Markergene auf. (Abbildung 3 bis 6)

Beispiel 4: Formulierungsbeispiele

Beispielformulierung 1 : O/W Selbstbräuner mit 13-HODE

Formulierung 1.1 1.2 1.3 1.4

Polyglyceryl-3 3.0% 3.0% 3.0% 3.0%

Methylglucose Distearate

Glyceryl Stearate 2.0% 2.0% 2.0% 2.0%

Stearyl Alcohol 1.0% 1.0% 1.0% 1.0%

Caprylic/Capric 9.5% 9.5% 9.5% 9.5%

Triglyceride

C12-15 Alkyl Benzoate 9.5% 9.5% 9.5% 9.5%

13-HODE — 0.1% 0.4% 1.0%

Water ad 100.0% ad 100.0% ad 100.0% ad 100.0%

Beispielformulierung 2 : O/W Creme für ethnische Haut (Selbstbräuner) mit 13- HODE

Formulierung 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

Glyceryl Stearate Citrate 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5%

Cetearyl Alcohol 3.0% 3.0% 3.0% 3.0% 3.0%

Glyceryl Stearate 1.0% 1.0% 1.0% 1.0% 1.0%

Cetearyl Ethylhexanoate 11.0% 11.0% 11.0% 11.0% 11.0%

Ethylhexyl Palmitate 11.0% 11.0% 11.0% 11.0% 11.0%

Myristyl Myristate 2.0% 2.0% 2.0% 2.0% 2.0%

13-Hode 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%

Glycerin; Tetrapeptide-30 — — — — 2.0%

Glycerin 5.0% 5.0% 5.0% 5.0% 5.0%

Water ad ad ad 100% ad ad

100% 100% 100% 100%

Carbomer 0.2% 0.2% 0.2% 0.2% 0.2%

Ethylhexyl Palmitate 0.8% 0.8% 0.8% 0.8% 0.8%

Sodium Hydroxide (10% in q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. water)

Dihydroxyacetone — 1.0% — 1.0% 1.0%

Erythrulose — — 0.2% 0.2% 0.2%

Water — 5.0% 5.0% 5.0% 5.0%

Beispielformulierung 3 : O/W Sonnenschutz-Creme

Formulierung 3.1 3.2

Polyglyceryl-3 Dicitrate/Stearate 3.00% 3.00%

Glyceryl Stearate 1 .25% 1 .25%

Cetearyl Alcohol 1 .25% 1 .25%

Diethylhexyl Carbonate 2.50% 2.50%

Oleyl Erucate 2.00% 2.00%

Myristyl Myristate 1 .20% 1 .20%

Caprylic/Capric Triglyceride 3.00% 3.00%

Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl 3.00% 3.00%

Triazine

Octocrylene 3.50% 3.50%

Titanium Dioxide; Diethylhexyl 4.40% 4.40%

Carbonate; Polyglyceryl-6

Polyhydroxystearate

13-Hode 1 .00% 1 .00%

Glycerin 3.00% 3.00%

Water ad 100.00% ad 100.00%

Glycerin, Tetrapeptide-30 2.50% —

Carbomer 0.15% 0.15%

Decyl Cocoate 1 .00% 1 .00%

Xanthan Gum 0.20% 0.20%

Sodium Hydroxide (10% in water) 0.40% 0.40%

Beispielformulierung 4 : Hautstraffende O/W Sonnenschutz-Lotion

Formulierung 4.1

Glyceryl Stearate Citrate 2.00%

Cetearyl Alcohol 1 .00%

C12-15 Alkyl Benzoate 5.00%

Triisostearin 1 .00%

Diethylhexyl Carbonate 4.00%

Octocrylene 6.00%

Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine 2.00%

Ethylhexyl Salicylate 4.00%

Caprylic/Capric Triglyceride; Xymenynic Acid 1 .50%

Xanthan Gum 0.20%

13-Hode 1 .00%

Titanium Dioxide; Trimethoxycaprylyisilane; Glycerin 3.00%

Glycerin 3.00%

Water ad 100.00%

Paraffinum Perliquidum 0.80%

Carbomer 0.20%

Sodium Hydroxide (10% in water) 0.65%

Beispielformulierung 5 : Leave-in Conditioner

Formulierung 5.1

Hydrolyzed Keratin 2.50%

Water ad 100.00%

Sodium Lactate; Sodium PCA; Glycine; Fructose; Urea; 2.00% Niacinamide; Inositol; Sodium Benzoate; Lactic Acid

PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 1 .00%

Quaternium-80 1 .50%

Ethanol 15.00%

PVP/VA Copolymer 4.00%

13-Hode 0.10%

Cocamidopropyl Betaine 4.00%

Citric Acid (30%) 3.00%

Beispielformulierung 6 : Leave-in Conditioning Spray

Formulierung 6.1

Laureth-4 0.5%

PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 0.5%

13-Hode 0.1 %

Quaternium-80 0.4%

Dimethicone Propyl PG-Betaine 0.6%

Cetrimonium Chloride 0.8%

Water ad 100.0%

Creatine 0.5%

Ethanol 15.0%

PVP/VA Copolymer 4.0%

Sodium Hydroxide (10% in water) 1 .2% Beispielformulierung 7 : Permanentes Haarfärbemittel

Formulierung 7.1

Cetearyl Alcohol 7.0%

Lanolin 1 .5%

Ceteareth-20 1 .5%

Laneth-5 1 .0%

Polyquaternium-10 1 .0%

Ammonium sulfate 0.5%

Sodium sulfite 0.5%

Disodium EDTA 0.1 % p-Toluene-2,5-diamine, sulfate 0.85%

4-Amino-2-Hydroxytoluene 0.17%

5-Amino-6-Chloro-o-Cresol 0.36%

4-Chlororesorcinol 0.07%

Ammonium hydroxide (25%) 7.0%

13-Hode 0.1 %

Water ad 100.00%

Vor der Anwendung 1 :1 mit Entwickleremulsion mischen

Beispielformulierung 7A : Entwickleremulsion für Formulierung 7

Formulierung 8.1

Cetyl Alcohol 3.0%

Ceteareth-20 1 .0%

Sodium Cetearyl Sulfate 1 .0%

Hydrogen Peroxide (50%ig) 12.0%

Phosphoric Acid (85%) 0.5%

Sodium Stannate 0.1 %

Water ad 100.00% Beispielformulierung 8 : Tönungslotion (semipermanent)

Formulierung 9.1

Cetearyl alcohol 3.0%

Parafinium liquidum 1 .0%

PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 0.3%

Cetrimonium Chloride 4.0%

2,6-Dihydroxy ethylaminotoluene 0.25%

HC Red No.3 0.25%

HC Yellow No.2 0.3%

13-Hode 0.1 %

Water ad 100%

Beispiel 5: Humane in vivo Studie zum Nachweis des Erhalts der Hautbräune durch eine kosmetische Formulierung enthaltend 13-HODE

Um zu prüfen, inwieweit 13-HODE einen Einfluss auf den Erhalt der

Hautbräunung hat, wurde der Erhalt der Sommerbräune unter Einfluss von 13-HODE in Testformulierungen in einer klinischen Studie untersucht. Die Studie wurden über einen Zeitraum von 8 Wochen von Mitte September bis Mitte November in Deutschland durchgeführt. Gegenstand der Untersuchung war die Hautfarbe durch kolorimetrische Messungen mittels Skin-Colorimeter ^® CL 400 von Courage + Khazaka electronic GmbH, Köln, Deutschland. Die Messungen erfolgten jeweils auf der Innenseite des linken und rechten Vorarms auf einer definierten Fläche von 3 cm x 3 cm im Abstand von 1 1 -14 cm vom Handgelenk. Regisitriert wurde der Mittelwert, der sich aus den Einzelwerten von sechs bis neun Wiederholungsmessungen ergab. Es partizipierten 39 Personen im Alter von 21 -55 Jahren, davon 28 weiblich und 1 1 männlich.

Bestimmt wurde jeweils der Ausganswert der Hautfarbe TO vor der Behandlung und der Wert T8 nach 56 Tagen Behandlung mit Testformulierungen. Die Anwendungshäufigkeit betrug zwei mal täglich, morgens und abends. Die Testpersonen erhielten eine Formulierung für den linken und eine für den rechten Arm (Formulierung A, B, C, D; gemäß der nachfolgenden Tabelle). Produkt INCI Testform ulierung

A B C D

TEGO Care 450 Polyglyceryl-3 3.0 3.0 3.0 3.0

Methylglucose Distearate

TEGIN M Pellets Glyceryl Stearate 2.0 2.0 2.0 2.0

TEGO Alkanol 18 Stearyl Alcohol 1 .0 1 .0 1 .0 1 .0

TEGOSOFT CT Caprylic/Capric 9.5 9.5 9.5 9.5

Triglyceride

TEGOSOFT TN C12-15 Alkyl Benzoate 9.5 9.5 9.5 9.5

13-HODE 13-HODE - 0.1 0.4 1 .0

Water Water ad ad ad ad

100.0 100.0 100.0 100.0

Euxyl K 220 Water, 0.1 0.1 0.1 0.8

Methylisothiazolinone,

Ethylhexylglycerin

Perfume Perfume 0.4 0.4 0.4 0.4

Angaben in Massenprozent.

Wie die humane in vivo Studie zeigte, konnte über den Zeitraum von acht Wochen die Abnahme des Blau-Gelb-Parameters b ^* als auch die Zunahme des Parameters ITA° (28° > ITA° > 10° matt / hellbraun, 41 ° > ITA° > 28°

intermediär, 55° > ITA° > 41 ° hell, ITA° > 55° sehr hell) der Hautfarbe durch Anwendung von steigenden Konzentrationen 13-HODE in Formulierung unterschiedlich stark reduziert werden. Die Ergebnisse sind in Abbildungen 7 und 8 graphisch dargestellt.

Diese Ergebisse zeigen, dass aufgrund des Einsatzes von 13-HODE eine Reduktion der Aufhellung der Hautfarbe erzielt werden kann.