La invention se encuadra en el sector farmaceutico y es aplicable en el sector medico en la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal en humanos como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima, como asi mismo en cualquier circunstancia normal o patológica en que interese determinar los niveles de este enzima in vivo.

ESTADO DE LA TECNICA.

La lactasa intestinal se localiza en la mucosa del intestino delgado con su centro activo expuesto hacia la luz del intestino y es el enzima responsable de la hidrólisis de la lactosa, el azucar de la leche. Este azucar no se absorbe como tal a nivel intestinal, por lo que es imprescindible la hidrólisis previa a sus componentes galactosa y glucosa, que son los finalmente absorbidos. La deficiencia de lactasa intestinal conduce a la malabsorción e intolerancia a la lactosa. Debido a la carencia de este enzima, la lactosa no hidrolizada en el intestino delgado provoca retraso en la velocidad de vaciamiento gastric y aumento del transito intestinal, incremento de la pression osmotic y retencion de fluido en la luz intestinal, dando lugar su fermentación bacteriana en el colon a la production de gases, como hidrógeno, metano y dioxide de carbono y a la formation de acidos grasos de cadena corta. Como consecuencia de estos hechos el proceso de digestion se reduce y disminuye la absorción de monosacaridos, presentándose dolor y calambres abdominales, flatulencia, ruidos intestinales audibles y diarrea. En el adulto este cuadro se conoce como hipolactasia o intolerancia a la lactosa, que constituye el trastorno genetic mas frecuente, afectando a alrededor a la mitad de la especie humana.

En el caso del recken nacido, la deficiencia congénita del enzima impide la correcta utilización de la lactosa originandose trastornos severos, como diarrea intensa y

deshidratación, derivados tanto de la disminución del aporte energetic como del acumulo intestinal del disacarido no hidrolizado, lo que requiere una detection precoz y el cambio alimenticio a una leche carente de lactosa. La deficiencia de lactasa se presenta ademas de forma secundaria en un numero importante de patologias intestinales que conllevan deterioro en diverso grado de la mucosa intestinal, como la enfermedad celiac, enfermedad inflamatoria intestinal crónica (la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), sindrome de colon irritable, resecciones intestinales, fibrosis quistica, neonatos prematuros, administración de quimioterapia, o como trastorno adicional a la ancianidad, entre otras. La valoración de la actividad lactasa es, pues, de particular interns en gastroenterologia, pediatria y, en general, en procesos patológicos en los que se precise evaluar la integridad funcional de la mucosa intestinal o realizar el diagnóstico diferencial con la deficiencia de este enzima. Hasta ahora, el diagnóstico de la deficiencia de lactasa intestinal se ha basado en: - Determinacion directa del enzima lactasa en una muestra de mucosa de intestino delgado del paciente obtenida por biopsia mediante endoscopia (1).

- Evaluacion de las consecuencias metabólicas derivadas de la deficiencia del enzima tras una prueba de sobrecarga oral de lactosa (1-2 g por Kg de peso corporal), como la aparición de sintomas de deficiencia en el sujeto (dolor abdominal, flatulencia, diarrea, etc. ), y determinacion de glucosa en plasma (2), de galactosa en plasma (2) y orina (3) y de carbohidratos en heces (4). Evaluation de gases espirados tras la sobrecarga de lactosa resultantes de la fermentación en el colon de la lactosa no metabolizada, como es la determinación en el aliento de hidrógeno espirado (5), de l4co2 (6) o 13CO2 (7) tras la sobrecarga de lactosa conteniendo 14C-lactosa o 13C-lactosa, respectivamente, o bien de la razon 13C02/H2 (8). Determinación en suero de la razón 13C/2H-glucosa (9) tras la sobrecarga con lactosa conteniendo 13C-lactosa y 2H-glucosa.

Otros métodos de evaluation de la actividad de la lactasa intestinal se basan en el empleo de determinados disacáridos que son analogos estructurales de la lactosa y que son por ello susceptibles de funcionar como sustratos de ese enzima, por lo que una vez ingeridos son transformados por la action de la lactasa intestinal en determinados monosacaridos que son absorbidos por la mucosa del intestino, pudiendo determinarse la eliminación de alguno de ellos en la orina. Asi, los métodos descritos en las patentes espanolas ES-P-478590 y ES-P-482073, se basan en la evaluation in vivo mediante la

administración oral de 3-O-metil lactosa y la determinacion de 3-O-metil-D-glucosa en orina.

Por otra parte, en la patente espanola ES-P-9001680 se describe la preparación del disacarido 4-O-p-galactopiranosil-D-xilosa de la formula para la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal. Dicho disacarido se administra oralmente, actúa como sustrato de la lactasa intestinal y por tanto se hidroliza, en el tracto intestinal, en xilosa y galactosa, ambos son absorbidos y la xilosa es eliminada por la orina donde puede determinarse directamente mediante un método colorimétrico simple. Las cantidades de xilosa excretadas en orina estran correlacionadas con los niveles de lactasa intestinal.

La patente espanola ES-P-9001680 zambien describe un método de preparación para la 4-0-p-galactopiranosil-D-xilosa, que comprende una sintesis a partir de bencil ß-D-xilopiranósido que implica reacciones de protection selectiva, glicosilacion y desprotección.

La patente espanola ES-P-9502185 describe procedimientos enzimáticos para la preparación de mezclas de disacaridos galactopiranosil-xilosas que contienen 4-O-ß- galactopiranosil-D-xilosa y sus regioisómeros 2-O-ß-galactopiranosil-D-xilosa y 3-O-ß- galactopiranosil-D-xilosa. La patente espanola ES-P-9502185 describe zambien el empleo de una mezcla de los tres dichos regioisómeros en la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal de ratas lactantes, demostrando que la eliminación de xilosa en orina tras la administracion oral de esa mezcla a los animales a lo largo de su desarrollo es proporcional a la actividad lactasa intestinal determinada postmortem en mucosa intestinal de los mismos animales.

La patente espanola ES-P-20010419 describe un procedimiento enzimático para obtener 4-O-ß-galactopiranosil-D-xilosa que implica una reaction enzimática entre D-

xilosa y un sustrato ß-D-xilopiranósido y una posterior fase de aislamiento y purificaci6n de 4-0-p-galactopiranosil-D-xilosa.

Es objeto de esta patente describir el empleo de 4-0-p-galactopiranosil-D-xilosa preparada segun el procedimiento descrito en la patente española ES-P-20010419 para la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal en humanos como prueba diagnóstica no invasiva de la deficiencia de este enzima. En la presente patente se emplea tambien un método alternativo al descrito en patentes anteriores basado en la determinación de xilosa en sangre, el cual conlleva ventajas substanciales para la aplicación de la prueba diagnóstica.

Referencias 1. Dahlqvist, A. (1964). Anal. Biochem. 7,18-25. <BR> <BR> <P>2. Newcomer, A. D. , McGill, D. B. , Thomas, P. J. & Hermann, A. F. (1975) N. Engl. J.

Med. 293,1232-1236.

3. Goda, T. , Bustamante, S., Thornburg, W. & Koldovsky, O. (1984) Biochem. J. 221, 261-263.

4. Kerry, K. R. & Anderson, C. M. (1964) Lancet 1, 981-984. <BR> <BR> <P>5. Metz, G. , Jenkins, D. J. , Peters, T. J. , Newman, A. & Blendis, L. M. (1975) Lancet 1, 1155-1157.

6. Sasaki, Y. , Lio, M. , Kameda, H, . Ueda, H. & Aoyagi, T. (1970) J. Lab. Clin. Med.

76, 824-835.

7. Koetse, H. A. , Stellaard, F., Bijleveld, C. M. , Elzinga, H. , Boverhof, R. , Van der<BR> Meer, R. , Vonk, R. J. & Sauer, P. J. (1999) Scand. J. Gastroenterol. 34, 35-40.<BR> <P>8. Koetse, H. A. , Vonk, R. J., Pasterkamp, S. , Pal, J., de Bruijn, S. & Stellaard, F.

(2000) Scand. J. Gastroenterol. 35, 607-611. <BR> <BR> <P>9. Vonk, R. J. , Stellaard, F. , Priebe, M. G. , Koetse, H. A., Hagedoorn, R. E. , de Bruijn,<BR> S. , Elzinga, H. , Lenoir-Wijnkoop, I. & Antoine, J. M. (2001) Eur. J. Clin. Invest. 31, 226-233.

DESCRIPCION DE LA INVENCION.

Los métodos utilizados hoy para el diagnostico de la deficiencia de lactasa intestinal, descritos en el apartado anterior, estran afectos por una serie de desventajas que en lineas generales implican escasa fiabilidad y molestias importantes en los pacientes ademas de la necesidad de aparataje especializado, como se describe a continuación. La determinación directa de la actividad lactasa en una muestra de mucosa de intestino delgado del paciente obtenida por biopsia mediante endoscopia, ademas de ser una prueba cruenta e invasiva y que requiere control radiológico, indica solamente la actividad del enzima en una parte o una zona determinada del intestino, que ademas no coincide generalmente con la de mayor presencia de este enzima (el yeyuno medio), por dificultades de acceso a través de endoscopia, y es ademas variable de unas tomas a otras, no suministrando pues información sobre la actividad total del enzima en el individuo. El resto de los métodos son pruebas no invasivas que suponen una sobrecarga oral de lactosa (de 25 a 50 g) y posterior evaluation de las consecuencias metabólicas de la deficiencia de lactasa, como es la medición en el aliento de gases procedentes de la metabolización de la lactosa no hidrolizada por las bacterias que pueblan el intestino grueso; estas pruebas son indirectas, puesto que no permiten la medida directa de la actividad del enzima in vivo, y dependen de la capacidad de production endogen de gases, como H2 o CO2, por el sujeto, lo que ademas de ser variable de unos individuos a otros se afecta por factores diversos, como el habit de fumar, la dieta, la ingesta de laxantes o la antibioterapia oral, por lo que presentan una importante proportion de falsos positivos y falsos negativos siendo por ello su fiabilidad escasa. Por otro lado, las pruebas de sobrecarga de lactosa requieren la ingesta de cantidades de ese azucar muy superiores a las presentes en una dieta fisiologicamente equilibrada, lo que provoca molestias gastrointestinales considerables en los sujetos deficientes como dolores abdominales, flatulencia y diarrea. En lactantes con presunta deficiencia, la sobrecarga de lactosa puede resultar de hecho peligrosa por la presentación de diarrea importante y deshidratación potencial, lo que obviamente requiere otro tipo de prueba. La aplicación de las pruebas de sobrecarga de lactosa, en sus diversas modalidades, requieren de equipamiento no rutinario, como cromatografos de gases o detectores electroquimicos para la medida de gases en el aliento, que aunque usual en los medios hospitalarios no lo es en cualquier centro sanitario en general, o del empleo de contadores de centelleo, o aparataje mucho mas especializado y restringido

como cromatografia de gases y espectrometria de masas para la determinación de 4c02, 13C02 y 13C/2H-glucosa, cuando la sobrecarga implica la utilización de 1- 14C-glucosa o 13C-lactosa/2H-glucosa. La administración oral de 3-O-metil lactosa y determinación posterior de la 3-O-metil-D-glucosa eliminada en orina, no empleada hasta ahora en la clinica, supone, por un lado, la absorción a sangre de un compuesto no fisiol6gico, como es la 3-O-metil-D-glucosa, y requiere de sistemas de cromatografia de gases o de cromatografía liquida de alta pression para su determinación.

OBJETO DE LA INVENCION.

Superar los inconvenientes de las pruebas diagnósticas actualmente utilizadas y descritas en el parrain anterior, proporcionando una tecnologia para la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal, como prueba no invasiva para el diagnóstico de la deficiencia de este enzima, que se basa en la evaluation directa de la actividad global del enzima en el individuo completo, no en la valoración de las consecuencias de su deficiencia, no requiere de aparataje especializado, no provoca molestias aparentes en los pacientes portadores de deficiencia de lactasa y es altamente fiable, entre otras ventajas que se describen en el párrafo siguiente.

Utilizar en humanos el método basado en la utilización de 4-galactosilxilosa integrando en este método una técnica alternativa a la determinacion de xilosa en orina, consistente en valorar la concentracion de xilosa en sangre tras la administración al paciente de 4-galactosil-xilosa, bastando la extraction de un volumen minimo de sangre por muestra (2-3 gotas), que resulta mas conveniente para el caso de su utilización en nines y recken nacidos por ser en estos sujetos menos molesto y mas fiable.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION.

La metodologia objeto de la invention se basa en el empleo de 4-galactosil-xilosa (4-O-p-galactopiranosil-D-xilosa). Este compuesto funciona como un analogo estructural de la lactosa, el substrate fisiologico de la lactasa, de manera que tras su administración oral es hidrolizado por el enzima de la mucosa intestinal, pasando los productos de la reaction a la sangre y uno de ellos, la xilosa, aparece en la orina, donde

puede ser valorado mediante una simple determinación colorimétrica. Alternativamente, en la presente invention se describe la valoración de xilosa en sangre puede determinarse igualmente la presencia de xilosa en sangre, para lo que bastan unas pocas gotas de la misma, dada la elevada sensibilidad del método de valoración de xilosa. Esta alternativa supone una ventaja substancial especialmente en el caso de lactantes y nines en general, puesto que al evitar la toma de orina de varias horas resulta menos molesto y proporciona mayor fiabilidad. En esta invention se pone de manifiesto que la ingestion de 4-galactosil-xilosa por sujetos humanos tolerantes a la lactosa se sigue de la aparición de xilosa tanto en orina como en sangre, lo que es expression de la actividad de la lactasa intestinal en estos sujetos. Igualmente se pone de manifiesto que tanto la excretion urinaria de xilosa, como la concentracion de xilosa en sangre, se reduce tras administrar 4-galactosil-xilosa a sujetos humanos portadores de deficiencia de lactasa intestinal (intolerantes a la lactosa). Adicionalmente, se pone de manifiesto por primera vez que el uso de 4-galactosil-xilosa y la determinación de xilosa en orina permite distinguir con fiabilidad y de modo sencillo a los individuos portadores de deficiencia de lactasa frente a aquellos que sufren alergia a algen componente de la leche En comparación con los métodos utilizados hoy para el diagnostico de la deficiencia de lactasa intestinal, el método que se describe en esta invention ofrece las siguientes ventajas : Alta fiabilidad, ya que esta metodologia esta basada en la evaluation directa de la actividad del enzima a través de la determinación de xilosa en orina o plasma, no en la valoración de las consecuencias metabólicas derivadas de su deficiencia, tales como la producción de H2 o COa resultantes de la fermentación en el colon del disacárido no hidrolizado. En consecuencia, todas aquellas circunstancias descritas en el primer párrafo de este apartado, que afectan a la generación endogen de gases y que reducen por ello marcadamente la fiabilidad de las pruebas de medida de gases en el aliento tras la sobrecarga de lactosa con producción frecuente de falsos positivos y falsos negativos, no ejercen influencia alguna sobre los resultados que se obtienen con la invención aqui descrita.

La informacion que suministra es directamente indicativa de la actividad lactasa total in vivo en el individuo.

Elevada sensibilidad: el limite minimo de detection de xilosa cuando se determina madiante analisis colorimétrico basado en la reaction con floroglucinol es de 0,1 a 0,05 g.

Sencillez del aparataje requerido, disponible de rutina en cualquier centre sanitario con las minimas facilidades de laboratorio de bioquimica clinica, ya que la evaluation del enzima in vivo se basa solamente en la determinación de xilosa, lo que puede hacerse mediante un simple ensayo colorimetrico.

Ausencia de molestias o trastomos gastrointestinales adversos en los pacientes portadores de deficiencia de lactasa con la realización de la prueba, debido a que la dosis oral a que se administra el disacarido, 4-galactosil-xilosa, es muy reducida, que en sujetos adultos es de 0,25 g cuando la determinación de xilosa se realiza en orina y 3,0 g cuando la determinación de xilosa se lleva a cabo en sangre. Esto hace prever que las dosis a administrar en nines pueden ser aun mas inferiores. Lo reducido de la dosis del disacarido es consecuencia de la alta sensibilidad de la determinación de xilosa.

Zambien es de resaltar que la hidrólisis de 4-galactosil-xilosa por la lactasa intestinal origina la apariciónwde dos productos fisiologicos, galactosa y xilosa, que son los finalmente absorbidos por la mucosa intestinal.

No requiere una participación activa por parte del sujeto, lo que resulta de particular interns en sujetos lactantes.

No hay que administrar compuestos marcados con isotopes radiactivos.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Eliminación de xilosa en orina tras la administracion oral de 4 mg de 4- galactosil-xilosa (circulo negro) y actividad lactasa intestinal (circulo blanco) en ratas lactantes durante el crecimiento.

Figura 2: Niveles de xilosa en plasma tras la administracion oral de 8 mg de 4- galactosil-xilosa (circulo negro) y actividad lactasa intestinal (circulo blanco) en ratas lactantes durante el crecimiento.

Figura 3: Eliminación de xilosa en orina de un voluntario humano adulto con tolerancia a la ingesta lactea (sujeto 1, hombre) tras la administracion oral de 1 g de 4-galactosil- xilosa.

Figura 4: Eliminación de xilosa en orina de voluntarios humanos a lo largo del tiempo tras la administracion oral de diferentes dosis de 4-galactosil-xilosa a dos voluntarios humanos adultos con tolerancia a la ingesta lactea (sujeto 1, hombre; sujeto 2, mujer).

Figura 5: Eliminación de xilosa en orina de voluntarios humanos a lo largo del tiempo tras la administracion oral de 250 mg de 4-galactosil-xilosa a tres hombres [sujetos 1 (circulo negro, circulo blanco), 7 (triangulo negro, triangulo blanco) y 11 (cuadrado negro, cuadrado blanco) ] y cinco mujeres, [sujetos 2 (circulo negro, circulo blanco), 3 (cuadrado negro, cuadrado blanco), 6 (rombo negro, rombo blanco), 8 (triangulo invertido negro, triangulo invertido blanco) y 9 (triangulo negro, triangulo blanco) tolerantes a la ingesta lactea.

Figura 6: Eliminación de xilosa en orina a lo largo del tiempo tras la administración oral de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a tres voluntarios humanos [sujetos 12 (hombre), 5 (mujer) y 10 (mujer) ] con intolerancia a la ingestion lactea.

Figura 7: Valoración de xilosa en orina por cromatrografia de gases en el sujeto 1, tolerante y en el sujeto 12, intolerante a la ingestion lactea tras la ingestion de 0,28 g de 4-galactosil-xilosa.

Figura 8: Niveles de xilosa en plasma sanguineo de voluntarios humanos adultos tras la administracion oral de 3 g de 4-galactosil-xilosa a los sujetos 1 (circulo blanco) y 2 (circulo negro) con tolerancia normal a la ingesta lactea y al sujeto 12 hipolactásico (cuadrado negro).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION.

La metodologia consiste en la adminiskación por via oral de una disolución acuosa de 4-galactosil-xilosa a sujetos humanos tras ayuno de al menos 8 horas, determinandose la cantidad de xilosa presente en la orina excretada a partir de entonces tras un periodo de tiempo determinado. La metodologia puede llevarse a cabo igualmente determinando la aparici6n de xilosa en sangre valorándola en plasma, o suero sanguineo, preparado a partir de una muestra de sangre extraida pasado un periodo de tiempo tras la ingesta del disacarido. La determinación de xilosa puede llevarse a cabo mediante analisis colorimétrico basado en la reaction con floroglucinol y usándose como blanco, bien la orina basal o bien el plasma o el suero sanguineo basal, segun la metodologia que se emplee. La 4-galactosil-xilosa ingerida es hidrolizada por la lactasa intestinal, de manera que los productos de esta reaction enzimatica, galactosa y xilosa, son absorbidos a la sangre a traves de la mucosa intestinal, siendo luego excretada la xilosa en la orina, por lo que la cantidad de xilosa que a parece tanto en sangre como en orina tras ingerir el disacarido es expression directa de la actividad del enzima in vivo.

La 4-galactosil-xilosa utilizada para la realización de esta invention fue preparada segun el procedimiento descrito en la patente espanola ES-P-20010419.

Tanto la eliminación de xilosa en orina, como la aparición de xilosa en sangre, tras la administracion oral de 4-galactosil-xilosa se correlacionan estrechamente con la actividad lactasa intestinal, segun se ha examinado en ratas lactantes, se representa en las Figs. 1 y 2 y se describe en los Ejemplos 1 y 2 La ingestion de 4-galactosil-xilosa por sujetos voluntarios humanos adultos con capacidad normal de digestion de lactosa o tolerantes a la lactosa, esto es, que poseen niveles normales de actividad lactasa intestinal, juzgado en base a que no refirieron el padecimiento de ningun tipo de molestia o trastomo gastrointestinal adverso tras la toma de leche o cualquier alimento lacteo, dio lugar a la excretion paulatina de xilosa en orina a lo largo de un periodo de 8 horas a partir de la administracion del disacarido, como consecuencia de su hidrólisis por la lactasa intestinal. Esto demuestra que la 4- galactosil-xilosa es substrate in vivo de la lactasa intestinal de humanos, begun se representa en las Figs. 3,4 y 5 y se describe en los Ejemplos 3 al 11.

La excretion de xilosa en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa aumentó con la cantidad de 4-galactosil-xilosa ingerida, cuando esta se empleo a

dosis de 0,25 g, 0,5 g, 1 g y 3 g. La ingestion de 4-galactosil-xilosa no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno en los sujetos estudiados. Esto demuestra que la eliminación de xilosa por sujetos humanos es dependiente de la dosis que se administre de 4-galactosil-xilosa, siendo suficiente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil- xilosa para detectar con fiabilidad xilosa en orina tras la ingesta de este compuesto, segun se representa en la Fig. 4 y se describe en los Ejemplos 4 y 5.

La proportion de xilosa excretada en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa estuvo dentro del mismo rango cuando se administro la misma cantidad de 4-galactosil-xilosa a individuos del mismo sexo. Esto demuestra que los resultados obtenidos con esta metodologia se reproducen con fidelidad de unos individuos normales a otros, segun se representa en la Fig. 5 y se describe en los Ejemplos 4 al 11.

La administracion de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a voluntarios humanos adultos con intolerancia a la lactosa, portadores de una deficiencia de lactasa intestinal, da lugar a una disminución marcada en la eliminación de xilosa en orina respecto a los valore medios observados en voluntarios tolerantes, en function del grado de deficiencia del enzima. Esto se observe en dos sujetos estudiados que eran intolerantes a la lactosa, uno de ello diagnosticado previamente como hipolactásico intenso y otro que refirio presentar intolerancia a la lactosa desde el nacimiento, begun se representa en las Figs.

6A y 6B, respectivamente, y se describe en los Ejemplos 12 y 13, respectivamente. La ingestion de 4-galactosil-xilosa por estos dos sujetos intolerantes no les provoco molestias ni trastomos gastrointestinales de ningun tipo. Esto demuestra que la metodologia que se presenta permite la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal y es una prueba valida para el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos, no provoca molestias aparentes en los sujetos portadores de una deficiencia y basta solamente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa para detectar con fiabilidad deficiencias intensas del enzima.

La administracion oral de 4-galactosil-xilosa y la posterior determinación de la xilosa resultante en orina permite distinguir entre pacientes intolerantes a la lactosa que son portadores de una deficiencia de lactasa intestinal y pacientes intolerantes a la ingestion de leche que lo son por presentar un cuadro de alergia a componentes de la leche pero que no son portadores de una deficiencia del enzima, puesto que en estos

ultimos la eliminación urinaria de xilosa esta dentro de los limites normales. Esto se demuestra en la Fig. 6C y se describe en el Ejemplo 14; en esta Figura 6C se muestra que la eliminación urinaria de xilosa tras la ingestion de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa por una voluntaria adulta intolerante a la lactosa, que refirio padecer desde la ninez reacciones alergicas cutáneas tras la toma de leche o alimentos lacteos, no fue signiRcativamentc diferente del comportamiento observado por la media de los voluntarios tolerantes mujeres estudiados. La ingestion de 4-galactosil-xilosa por esta voluntaria adulta alérgica intolerante a la lactosa no le ocasiono reaction alérgica alguna ni ningun tipo de trastomo gastrointestinal.

La eliminación de xilosa en orina tras la administracion de 0,25 g de 4-galactosil- xilosa a sujetos tolerantes a la lactosa, y su disminución en sujetos intolerantes a la lactosa hipolactásicos, se muestra adicionalmente por una técnica de valoración de xilosa diferente de la reaction colorimétrica con floroglucinol, como es la cromatografía de gases. Esto se presenta en la Fig. 7 y se describe en el Ejemplo 15, en que se demuestra igualmente que la eliminación de xilosa en orina se reduce marcadamente cuando se administra 4-galactosil-xilosa a un sujeto intolerante a la lactosa hipolactásico en comparación un sujeto tolerante a la lactosa.

La administracion oral de 3 g de 4-galactosil-xilosa a voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa dio lugar a la aparición gradual de xilosa en plasma sanguineo determinada colorimétricamente con floroglucinol, que alcanzo un maxim alrededor de las 2 horas tras la ingesta del disacárido. La administracion oral de la misma cantidad de 4-galactosil-xilosa a un voluntario humano adulto intolerante a la lactosa diagnosticado como hipolactásico origine una disminución marcada en la cantidad de xilosa determinada en plasma sanguineo de este sujeto tras 2 horas de ingerir el disacárido ; no dando lugar esta prueba a molestia o trastomo gastrointestinal alguno en este sujeto intolerante a la lactosa. Esto se muestra en la Fig. 8, describe en el Ejemplo 16 y demuestra que la determinación de xilosa en sangre tras la administracion oral de 4- galactosil-xilosa permite la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal y es una prueba valida para el diagnostico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos.

Teniendo en cuenta el patron que sigue la aparición de xilosa en sangre y orina a lo largo del tiempo tras la administracion oral de 4-galactosil-xilosa a voluntarios

humanos tolerantes e intolerantes a la lactosa y la alta sensibilidad del método empleado de valoración colorimétrica de xilosa con floroglucinol, las muestras de fluidos corporales a utilizar con esta metodologia en sujetos adultos pueden ser orina basal previa a la ingesta de 4-galactosil-xilosa y orina total de 3 o 4 horas tras la ingesta de ese compuesto, o bien una muestra de sangre basal previa a la ingesta de 4-galactosil- xilosa y otra muestra de sangre extraida tras 2 horas de la administraci6n de ese compuesto, siendo suficiente un volumen de 0,2 ml de sangre (2-3 gotas) en cada muestra.

Esta prueba es igualmente aplicable en nines y en lactantes, tanto determinando xilosa en orina como en sangre, pudiendose disminuir a la mitad la dosis a administrar oralmente de 4-galactosil-xilosa y pudiendo ser zambien suficiente la utilización de muestras de sangre de 0,2 ml (2-3 gotas), como una primera aproximación.

La determinación de xilosa en sangre representa una ventaja substancial al poderse realizar con confianza con 50R1 de suero o plasma, para lo que bastan 2-3 gotas de sangre por muestra. Esto resulta de especial interns en lactantes y nines en general, donde las pruebas que requieren recogida de orina total de varias horas presentan la dificultad de la inseguridad en el volumen de orina recogido y la posible production de reacciones cutáneas en la region perineal, siendo menos molesto y mas fiable la toma de unas pocas gotas de sangre.

EJEMPLOS DE REALIZACION DE LA INVENCION.

Ejemplo 1. Correlación entre la eliminación de xilosa en orina y de la aparición de xilosa en sangre tras la administracion oral de 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa intestinal. Esto se ha demostrado en ratas lactantes comparando a lo largo del desarrollo de estos animales la eliminación de xilosa en orina tras administrarles oralmente 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa determinada postmortem en mucosa intestinal, que como es conocido declina fisiologicamente durante el crecimiento. Para ello, un grupo constituido por 20 ratas lactantes pertenecientes a dos camada y con 12 dias de edad, se mantuvo en ayuno durante 6 horas separadas de la madre. Transcurrido ese tiempo, se recogio orina basal de cada animal mediante pression vesical transabdominal e inmediatamente se administraron a cada uno 4 mg de 4-

galactosil-xilosa diluida en 0,3 ml de agua destilada utilizando una sonda intraesofagica.

A partir de ese momento se recogio orina durante las 6 horas siguientes, determinándose en la misma la xilosa eliminada mediante analisis colorimetrico basado en la reaction con floroglucinol y usándose la orina basal como blanco. Inmediatamente tras la recogida de orina, se sacrificaron cuatro de los animales en los que se determine directamente la actividad lactasa en la mucosa intestinal. Para ello se reseco un trozo de intestino delgado, se lavo, se recogio la mucosa mediante raspado con vidrio y se homogeneizó esta ; midiéndose la actividad lactasa espectrofotometricamente en el homogeneizado. Los animales restantes fueron devueltos a la madre y con ellos se repitió el experimento en condiciones similares a los 15, 18, 21,26 y 35 dias de edad en que quedo extinguida la población inicial de animales. Los resultados de esta experiencia aparecen recopilados en la Fig. 1. En la que se aprecia: 1) Que se detecta la presencia de xilosa en orina procedente de la hidrólisis de la 4-galactosil-xilosa administrada por la acci6n de la lactasa intestinal; 2) Que el curso de la eliminación de xilosa en orina, originada por la administracion oral de 4-galactosil-xilosa a lo largo del crecimiento de los animales, corre paralelo con la conocida modificacion fisiológica de la actividad lactasa intestina que declina a lo largo del desarrollo, correlacionándose estrechamente la eliminacion de xilosa en orina con la actividad lactasa intestinal como lo indica el coeficiente de correlaci6n lineal (r) de 0,96 obtenido entre ambos parametros, segun se representa en el inserto de la Fig. 1. Previamente a esta experiencia se encontro que la eliminación de xilosa en orina aumenta con el incremento de la cantidad de 4-galactosil-xilosa que se administre oralmente a los animales al margen de la edad de los animales, variando las dosis de este disacarido de 2 a 32 mg diluidas en 0,3 ml de agua. Esta experiencia demuestra que la metodologia que se presenta es util para la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal, siendo el procedimiento empleable para la evaluation no invasiva de esta actividad de manera incruenta con fines diagnósticos.

Ejemplo 2. Correlación entre la eliminación de xilosa en orina y de la aparición de xilosa en sangre tras la administraci6n oral de 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa intestinal. Esto se ha demostrado en ratas lactantes comparando a lo largo del desarrollo de estos animales la cantidad de xilosa en plasma analizada tras

administrarles oralmente 4-galactosil-xilosa con la actividad lactasa determinada postmortem en mucosa intestinal. Para ello, un grupo constituido por 60 ratas lactantes pertenecientes a dos camadas y con 12 dias de edad, se mantuvo en ayuno durante 6 horas separadas de la madre. Transcurrido ese tiempo, se extrajo sangre basal de cada animal mediante punción cardiac e inmediatamente se administraron a cada uno 8 mg de 4-galactosil-xilosa diluida en 0,3 ml de agua destilada utilizando una sonda intraesofagica. Pasadas 3 horas de la administracion del disacárido se extrajo de nuevo una muestra de sangre, obteniéndose el plasma sanguineo o fraccion sobrenadante por centrifugacion de esa muestra determinándose xilosa en el mismo mediante analisis colorimetrico con floroglucinol y usándose el plasma de la sangre basal como blanco.

Inmediatamente tras la extracci6n de sangre, se sacrificaron cuatro de los animales en los que se determine directamente la actividad lactasa en la mucosa intestinal de la misma manera que lo descrito en el Ejemplo 1. Los animales restantes fueron devueltos a la madre y con ellos se repitió el experimento en condiciones similares a los 15,18, 21,26 y 35 dias de edad en que quedo extinguida la población inicial de animales. Los resultados de esta experiencia aparecen recopilados en la Fig. 2. En la que se aprecia: 1) Que se detecta la aparición de xilosa en plasma sanguineo procedente de la hidrólisis de la 4-galactosil-xilosa administrada por la accon de la lactasa intestinal; 2) Que el curso de la aparición de xilosa en plasma sanguineo, originada por la administracion oral de 4- galactosil-xilosa a lo largo del crecimiento de los animales, corre igualmente paralelo con el declive fisiologico de la actividad lactasa intestina a lo largo del desarrollo, correlacionándose de manera muy estrecha la aparición de xilosa en plasma sanguineo con la actividad lactasa intestinal como lo indica el coeficiente de correlación lineal (r) de 0,98 obtenido entre ambos parametros, segun se representa en el inserto de la Fig. 2.

Previamente a esta experiencia se encontro que la aparición de xilosa en plasma sanguineo alcanza su maxim nivel en torno a 3 horas tras la adminiskación oral de 4- galactosil-xilosa, que la cantidad de xilosa en plasma aumenta con el incremento de la cantidad de 4-galactosil-xilosa que se administre oralmente a los animales al margen de la edad de los animales cuando la dosis de este disacárido varié de 4 a 16 mg diluida en 0,3 ml de agua y que las cantidades de xilosa en suero sanguineo obtenido tras dejar reposar las muestras de sangre durante 20 minutos a temperatura ambiente y centrifugacion posterior fueron similares a las determinadas en plasma. Esta experiencia

demuestra que la determinación de xilosa en plasma o suero sanguineo tras las administracion oral de 4-galactosil-xilosa es igualmente útil para la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal, siendo el procedimiento empleable para la evaluation no invasiva de esta actividad de con fines diagnostics.

A continuación se describe una serie de ejemplos de realización de la invention llevados a cabo con diversos voluntarios humanos adultos, todos ellos fueron informados por escrito del estudio a realizar y dieron su consentimiento escrito de participación voluntaria en el mismo.

Ejemplo 3. La 4-galactosil-xilosa es substrate in vivo de la lactasa intestinal de humanos. Esto se ha demostrado en primer lugar administrando oralmente 1 g de 4- galactosil-xilosa disuelto en 50 ml de agua a un voluntario adulto hombre (sujeto 1) ayunado 8 horas y con tolerancia normal a la ingesta de leche y productos lacteos, o sea tolerante a la lactosa. A este sujeto se le tomo una muestra de orina basal inmediatamente antes de ingerir el disacárido 4-galactosil-xilosa y se volvio a recoger su orina tras la ingesta del mismo cada hora durante 8 horas, constituyendo cada muestra la totalidad de la orina excretada en cada periodo de tiempo. Se determine xilosa en todas las muestras mediante analisis colorimetrico basado en la reaction con floroglucinol y usándose la orina basal como blanco. La ingestion de 4-galactosil-xilosa no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno a este sujeto. Los resultados de esta experiencia aparecen recopilados en la Fig. 3, donde se representa la cantidad de xilosa determinada en cada muestra (con simbolo) y la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo (con simbolo) calculada adicionando a la cantidad de xilosa determinada en cada muestra las cantidades determinadas en todas las muestras precedentes. En esta Fig. 1 se aprecia: 1) Que se excreta xilosa en la orina de este sujeto tras la administracion oral de 4-galactosil-xilosa; 2) Que la eliminación de xilosa en orina fue maxima a las 2 horas y se acumulo progresivamente en la misma tras la administracion de este compuesto. Esta experiencia demuestra que la 4-galactosil- xilosa es substrate in vivo de la lactasa intestinal de humanos y que la determinación de xilosa en orina oral de 4-galactosil-xilosa es util para la evaluation in vivo de la

actividad lactasa intestinal en humanos, siendo el procedimiento empleable para la evaluation no invasiva de esta actividad de con fines diagnósticos.

Ejemplos 4 y 5. La eliminación de xilosa en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa varia con la cantidad de 4-galactosil-xilosa ingerida. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g, 0,5 g y 3 g de 4-galactosil-xilosa a un voluntario adulto hombre tolerante a la lactosa (sujeto 1, Ejemplo 4) y a un voluntario adulto mujer tolerante a la lactosa (sujeto 2, Ejemplo 5) en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1 y determinando igualmente xilosa colorimetricamente con floroglucinol en la orina excretada por ambos a lo largo del tiempo tras la ingesta del disacárido. Se dejo un periodo libre de entorno a una semana entre cada toma de 4-galactosil-xilosa por el mismo individuo. La ingestion de 4-galactosil-xilosa a las dosis utilizadas no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno a ninguno de estos dos sujetos.

Los resultados de estas experiencias aparecen recopilados en la Fig. 4 panel A (para el sujeto 1 y Ejemplo 4) y en la Fig. 4 panel B (para el sujeto 2 y Ejemplo 5), donde se representa la cantidad de xilosa acumulada en la orina tras la ingesta de 4-galactosil- xilosa para cada dosis administrada. En la Fig. 4A se incluyen los datos obtenidos con el mismo sujeto 1 tras ingerir 1 g del disacarido procedentes de la Fig. 3 para que pueda compararse con el resto de las dosis administradas. En estas Figuras 4A y 4B se aprecia: 1) Que la eliminación de xilosa en orina a lo largo del tiempo tras la ingesta de 4- galactosil-xilosa aumento al incrementarse la cantidad administrada tanto al sujeto 1 (Fig. 4A), como al sujeto 2 (Fig. 4B); 2) Que una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa permitió detectar con facilidad la aparición de xilosa en orina de cualquiera de estos dos sujetos. Estas experiencias demuestran : 1) Que la excretion de xilosa en orina por voluntaries humanos adultos tolerantes a la lactosa aumento con la cantidad de xilosa ingerida cuando esta se administro oralmente a dosis de 0,25 g, 05 g, 1 g y 3 g, sin que ninguna de las dosis utilizadas provoque molestias ni trastomo gastrointestinal alguno derivados de la realización de la prueba y 2) Que una dosis de 0,25 g de 4-galactosil- xilosa es suficiente como para determinar xilosa en orina con alta fiabilidad tras la ingesta de este disacárido.

Ejemplos 6 al 11. La proportion de xilosa excretada en orina por voluntarios humanos adultos tolerantes a la lactosa esta dentro del mismo rango cuando se administra la misma cantidad de 4-galactosil-xilosa a individuos del mismo sexo. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a 8 voluntarios adultos tolerantes a la lactosa, 3 hombres (sujeto 1, Ejemplo 4; sujeto 7, Ejemplo 6; sujetoll, Ejemplo 7) y 5 mujeres (sujeto 2, Ejemplo 5; sujeto 3, Ejemplo 8; sujeto 6, Ejemplo 9; sujeto 8, EjemplolO ; sujeto 9, Ej emplo 11) en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1 y determinando igualmente xilosa colorimétricamente con floroglucinol en la orina excretada por los sujetos a lo largo del tiempo tras la ingesta del disacarido.

La ingestion de 4-galactosil-xilosa a las dosis utilizadas no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno a ninguno de estos sujetos. Los resultados de estas experiencias aparecen recopilados en la Fig. 5 que comprende los paneles A, B, C y D, donde se representa la cantidad de xilosa determinada en cada muestra (con simbolos blancos) y la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo (con simbolo negros) calculada adicionando a la cantidad de xilosa determinada en cada muestra las cantidades determinadas en todas las muestras precedentes. En el panel A se representan los valores individuales obtenidos con cada uno de los sujetos hombres (sujetos 1,3 y 6). En el panel B representan los valores individuales obtenidos con cada uno de los sujetos mujeres (sujetos 2,3, 6,8 y 9). En los paneles C y D se representan los valores medios el error estándar de la media calculados para los valores correspondientes a los sujetos hombres y mujeres estudiados, respectivamente. En la Fig. 5A se incluyen los datos obtenidos con el sujeto 1 tras ingerir 0,25 g de 4- galactosil-xilosa procedentes de la Fig. 4A y en la Fig. 5B se incluyen los datos obtenidos con el sujeto 2 tras ingerir 0,25 g de 4-galactosil-xilosa procedentes de la Fig.

4B, con objeto de que puedan compararse con el resto sujetos estudiados en las mismas condiciones. En esta Fig 5 se aprecia: 1) Que el acumulo de xilosa eliminada en orina estuvo dentro del mismo rango, no excediendo el error estándar del 37% sobre la media en los hombres y del 8 % en las mujeres y 2) Que la maxima eliminación de xilosa estuvo entre 2 y 3 horas tras la ingesta del disacarido. Estas experiencias demuestran que los resultados obtenidos con esta metodologia se reproducen con fidelidad de unos individuos a otros.

Ejempos 12 y 13. La administracion de 4-galactosil-xilosa a voluntarios humanos intolerantes a la lactosa y posterior determinación de xilosa en orina permite detectar la deficiencia de lactasa intestinal. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g de 4- galactosil-xilosa a dos sujetos voluntarios con sintomatologia de intolerancia a la lactosa y determinando xilosa colorimetricamente con floroglucinol en la orina excretada por ambos a lo largo del tiempo tras la ingesta del disacárido. Uno de ellos (sujeto 12, Ejemplo 12), era un varan de 64 anos de edad con intolerancia severa a la ingesta lactea desde los 8 anos, diagnosticado previamente como hipolactásico tanto por biopsia intestinal como por pruebas de sobrecarga de lactosa, portando por tanto una deficiencia intensa de lactasa intestinal. El otro, (sujeto 5, Ejemplo 13) era una mujer de 30 anos de edad que refirio padecer sintomatologia de intolerancia a la lactosa desde el nacimiento, que precise entonces el abandono de la lactancia materna y el cambio a una leche sin lactosa, portando presuntamente una deficiencia congénita de lactasa intestinal. La ingestion de 4-galactosil-xilosa a las dosis utilizadas no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno a ninguno de estos dos sujetos. Los resultados de estas experiencias aparecen recopilados en la Fig. 6 panel A (sujeto 12, Ejemplo 12) y panel B (sujeto 5, Ejemplo 13), donde se representa la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo en ambos sujetos (con simbolos negros), incluyendo en cada caso la curva que representa los valores medios de los voluntarios tolerante a lactosa correspondientes a su sexo y tomadas de las Figs. 5C y 5D, para facilitar la comparación. En esta Fig. 6 se aprecia: 1) Que la eliminación de xilosa en orina por el sujeto 12 fue muy inferior a los valores medios de eliminación de xilosa en voluntarios tolerantes a la lactosa, excretando este sujeto 1,33 mg totales de xilosa en orina de 8 horas tras la ingestion del disacárido, que frente al valor medio encontrado en los voluntarios tolerantes hombres estudiados de 35,7 i 2,0 mg tras el mismo periodo de tiempo represents una disminución del 96%, lo que esta de acuerdo con su diagnóstico previo de deficiencia intensa de lactasa intestinal; 2) Que la eliminación de xilosa en orina por el sujeto 5 fue muy inferior a los valores medios de eliminación de xilosa en voluntarios tolerantes a la lactosa, excretando este sujeto 4,08 mg totales de xilosa en orina de 8 horas tras la ingestion del disacárido, que frente al valor medio encontrado en los voluntarios tolerantes mujeres estudiados de 23,5 2,0 mg tras el mismo periodo de tiempo represents una disminución del 83%, lo que indica que se este sujeto porta una

deficiencia zambien intensa de lactasa intestinal de character congenito, ya que presents intolerancia a la lactosa desde el nacimiento. Estas experiencias demuestran que la metodologia que se presenta permite la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal y el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos, no provoca molestias aparentes en los sujetos portadores de una deficiencia y basta solamente una dosis de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa para detectar con fiabilidad deficiencias intensas del enzima en sujetos adultos.

Ejemplo 14. La administracion de 4-galactosil-xilosa a voluntarios humanos intolerantes a la lactosa y posterior determinación de xilosa en orina, permite diferenciar entre pacientes intolerantes a la lactosa que portan una deficiencia de lactasa intestinal y pacientes intolerantes a la ingestion de leche que lo son por presentar un cuadro de alergia a componentes de la leche, pero que no son portadores de una deficiencia del enzima. Esto se ha demostrado con la administracion de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa y determinación posterior de xilosa colorimetricamente con floroglucinol en la orina excretada a lo largo del tiempo por un sujeto voluntario (sujeto 13), mujer de 25 anos de edad, que presents sintomatologia de intolerancia a la lactosa a partir de los 12 anos y que zambien refirio padecer alergia cutánea aguda tras la ingesta de leche. La ingestion de 4-galactosil-xilosa a la dosis utilizada no provoco molestias ni trastomo gastrointestinal alguno en este sujeto. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig. 6 panel C, donde se representa la cantidad de xilosa que se va acumulando en la orina a lo largo del tiempo en este sujeto (con simbolos negros), incluyendo zambien la curva que representa los valores medios de los voluntarios tolerante a lactosa correspondientes a su sexo y tomada de la Fig. 5D para facilitar la comparaci6n. En esta Fig. 6C se aprecia que este sujeto presents un patron de eliminación de xilosa practicamente normal, excretando a las 8 horas la misma cantidad total que la media de las mujeres tolerantes, no tratandose entonces de una deficiencia del enzima, sino de un caso de alergia a algun componente de la leche a la vista de los datos clinics referidos por el paciente. Esta experiencia demuestra que la metodologia que se presenta permite diferenciar entre pacientes intolerantes a la lactosa que portan una deficiencia de lactasa intestinal y pacientes intolerantes a la ingestion lactea que lo

son por presentar un cuadro de alergia a componentes de la leche, pero que no son portadores de una deficiencia real del enzima.

Ejemplos 15 y 16. La eliminación de xilosa en orina tras la administraci6n de 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a sujetos tolerantes a la lactosa, y su disminución en sujetos intolerantes a la lactosa hipolactásicos, se observa igualmente por una técnica de valoración de xilosa diferente de la reaction colorimetrica con floroglucinol. Esto se ha demostrado administrando 0,25 g de 4-galactosil-xilosa a un sujeto voluntario tolerante a la lactosa [sujeto 1 (estudiado zambien en el Ejemplo 3), Ejemplol5] por un lado, y por otro a un sujeto voluntario intolerante a la lactosa portador de una deficiencia intensa de lactasa intestinal [sujeto 12 (estudiado zambien en el Ejemplo 12), Ejemplo 16], y determinando xilosa por cromatografla de gases en la orina total recogida tras 3 horas de ingerir el disacárido con un cromatógrafo equipado con detector de ionization de llama y columna espiral de vidrio de 12 m de longitud, 0,2 mm de diametro interno y 0, 3 um de espesor. La presencia de xilosa en la orina se detects en forma de su trimetilsililderivado. Para ello la muestra de orina se liofilizo y se disolvió en 20 gl de piridina conteniendo 1 mM de bencil ß-D-xilopiranósido como referencia interna. A continuación se anadieron otros 20 ul de N-trimetilsililimidazol como agente sililante, se sonics la mezcla durante un minuto y se calent a 60°C durante 30 minutos, inyectándose luego 1-2 Zl de muestra en el cromat6grafo de gases. La temperatura del inyector y del detector empleada fue de 250°C, y el gradiente de temperatura en la columna fue el siguiente: 2 minutos a 180°C y un incremento de 5°C por minuto hasta llegar a 250°C, manteniéndose esa temperatura durante 15 minutos. La concentracion de xilosa en cada muestra se calcul6 a partir de las areas de los picos correspondientes en los cromatogramas. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig.

7, donde se muestran los cromatogramas correspondientes a las muestras de orina basal y de orina de 3 horas pertenecientes al sujeto tolerante y al sujeto intolerante, indicándose los tiempos de retention en minutos de los picos asignados a xilosa y al patron interno en cada caso. En esta Fig. 7 se aprecia que la xilosa excretada en orina de 3 horas tras la ingesta de 4-galactosil-xilosa por el sujeto 12 hipolactásico me igualmente muy inferior a la que excrete el sujeto 1 tolerante a la lactosa, segun se aprecia por al area de los picos correspondientes a xilosa en los cromatogramas,

determinándose con este procedimiento una cantidad de 2,1 mg totales de xilosa en orina de 3 horas del sujetol2 intolerante hipolactásico frente a 25,2 mg totales de de xilosa en orina de 3 horas del sujeto 1 tolerante a la lactosa, lo que represents una disminución del 92 % que esta en concordancia con la intensa deficiencia de lactasa intestinal que padece este sujeto hipolactasico y es similar al grado de la disminución de xilosa determinada colorimetricamente tras el mismo periodo de tiempo en este mismo sujeto que se aprecia en la Fig. 6A. Esta experiencia demuestra que la metodologia que se presenta permite el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de lactasa intestinal en humanos independientemente del método de medida que se emplee para la determinación de la xilosa eliminada.

Ejemplos 17 al 19. La determinacion de xilosa en sangre tras la administracion oral de 4-galactosil-xilosa permite el diagnostico no invasivo de la deficiencia de lactasa intestinal. Esto se ha demostrado administrando 3 g de 4-galactosil-xilosa a dos sujeto voluntarios tolerantes a la lactosa [sujetol, Ejemplo 17 y sujeto 2, Ejemplo 18 (estos sujetos fueron estudiados zambien en los Ejemplos 3 al 6) ] y al sujeto 12 intolerante a la lactosa hipolactásico [Ejemplo 19 (este sujeto fue estudiado zambien en los ejemplos 12 y 15] ) y determinando xilosa colorimetricamente con floroglucinol en el plasma sanguineo de muestras de sangre obtenidas de estos sujetos previamente a la ingesta del disacarido y tras la ingesta del mismo a intervalos de aproximadamente 1 hora durante 6 horas; en el sujeto hipolactásico se tomo una muestra de sangre basal y otra muestra de sangre tras 2 horas de ingerir el disacárido 4-galactosil-xilosa. La ingesta de los 3 g de 4-galactosil-xilosa no dio lugar a molestia o trastomo gastrointestinal alguno en este sujeto 12 intolerante a la lactosa ni en los dos sujetos tolerantes. Los resultados de esta experiencias aparecen recopilados en la Fig. 8, donde se aprecia: 1) Que aparece xilosa en el plasma sanguineo tras la administraci6n oral de 4-galactosil-xilosa a los sujetos 1 y 2 tolerantes a la lactosa, como consecuencia de la hidrólisis de este disacarido por la lactasa intestinal; 2) Que la aparición de xilosa en el plasma sanguineo de esto dos sujetos alcanzo un maxim alrededor de las 2 horas de ingerir 4-galactosil-xilosa para luego disminuir hasta ser indetectable a las 6 horas, como consecuencia del paso de xilosa a la orina; 3) Que en el sujeto 12 intolerante a la lactosa se detects xilosa en plasma sanguineo procedente de la muestra de sangre tomada tras 2 horas de la ingesta

de 4-galactosil-xilosa en una cantidad de 0,48 pg/100 p1 de plasma, que frente a la cantidad detectada a un intervalo de tiempo parecido en el sujeto 1, de 1, 72 ug/100 ml de plasma y en el sujeto 2, de 1, 95 wog/100 ml de plasma, represents una disminución de xilosa en el plasma del sujeto intolerante hipolactásico del 72 % y del 75 %, respectivamente. A la vista de la cantidad de xilosa detectada en el sujeto intolerante tras 2 horas de ingerir 4-galactosil-xilosa, 0,48 llg/100, ul de plasma, y la sensibilidad de la valoración (limite minimo de detection de xilosa con floroglucinol de 0,1 a 0,05 p), el volumen minimo de suero o plasma para realizar la medida con confianza se estima de 50 1li, lo que equivale a unos 0,2 ml de sangre (2 a 3 gotas). Estas experiencias demuestran que la determinacion de xilosa en sangre tras la administraci6n oral de 4- galactosil-xilosa permite la evaluation in vivo de la actividad lactasa intestinal y es una prueba valida para el diagnóstico no invasivo de la deficiencia de este enzima en humanos.