Utilisation d'adapalène pour moduler l'expression de l' IL-1 ra.

L'invention concerne l'utilisation d'adapalène pour moduler l'expression de IL-1 ra (lnterleuline-1 receptor accesory protein), en particulier chez des patients atteints d'acné.

L'acné est une maladie chronique liée à l'inflammation du follicule pilosébacé, sous dépendance hormonale, et qui implique trois étapes bien définies (Cunliffe WJ et al., Br J Dermatol 2000: 142: 1084-1091 ; Gollnick HP et al., J Dermatol 1991 : 18: 489- 499.).

La première étape, qui commence généralement à la puberté, correspond à la stimulation de la production des glandes sébacées, induisant une hyper séborrhée. La seconde étape correspond à la formation de micro comédons considérés comme la première lésion élémentaire de l'acné provoquée par des anomalies de la prolifération, de l'adhésion et de la différentiation de kératinocytes dans la partie basse du canal sébacé du follicule pileux.

La troisième étape correspond à la formation de lésions inflammatoires dans lesquelles Propionibacterium acnés (P. acnés), une bactérie anaérobie, joue un rôle essentiel.

Les traitements employés contre l'acné sont destinés à freiner le développement des bactéries avec des antiseptiques comme le peroxyde de benzoyle ou des antibiotiques, ou à réduire la sécrétion de sébum (rétinoïdes). Utilisés seulement en cas d'acné sévère, les traitements par voie orale se décomposent en trois catégories : les antibiotiques (tétracycline et érythromycine), les rétinoïdes (surtout représentés par l'isotrétinoïne) et les traitements hormonaux associant un oestrogène et un progestatif.

Les inventeurs ont mis en évidence de façon surprenante que l'adapalène à une action comédolytique et se comporte comme un stimulateur de l'expression d'IL-1 ra dans la peau et permet en particulier d'augmenter l'expression de celle-ci dans les kératinocytes.

Un objet de la présente invention concerne ainsi l'utilisation de l'Adapalène, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression de NL-I ra et/ou à induire l'augmentation de l'expression de NL-I ra par les cellules de l'épiderme et en particulier par les kératinocytes.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de l'Adapalène, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression de l'IL-1 ra et/ou à induire l'augmentation de l'expression de NL-1 ra par les cellules de l'épiderme acnéiques.

L'utilisation de l'adapalène ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci vise également à prévenir la formation de comédons chez les patients dont les cellules de l'épiderme acnéique sous-expriment NL-1 ra. Le médicament est de préférence appliqué de manière topique. Ainsi, il peut se présenter sous la forme d'un gel, d'une lotion ou d'une crème.

La présente invention vise également une méthode pour induire une augmentation de l'expression de NL-1 ra par les cellules de l'épiderme d'un patient nécessitant un traitement, caractérisé en ce qu'il est administré audit patient de l'Adapalène ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

Les détails de l'invention vont être exposés dans la description détaillée qui suit.

On entend par sels de l'adapalène, les sels formés avec une base pharmaceutiquement acceptable, notamment des bases minérales telles que la soude, la potasse et l'ammoniaque ou des bases organiques telles que la lysine, l'arginine, la N-méthyl-glucamine. On entend également par sels de l'adapalène les sels formés avec des aminés grasses telles que la dioctylamine et la stéarylamine.

L'adapalène est un dérivé stable sur le plan chimique de l'acide naphtoïque. La formule chimique de ce dérivé est la suivante : acide 6[3-(1 -adamantyl)-4- métoxyphényl]-2-naphtoïque.

L'adapalène est un rétinoïde topique de seconde génération (comme le tazarotène) qui se lie sélectivement aux sous-types RARγ (trouvé principalement dans l'épiderme) et RARβ (trouvé principalement dans les fibroblastes du derme) du récepteur nucléaire de l'acide rétinoïque (RAR), activant les gènes responsables de la différentiation cellulaire. Il ne se lie en revanche pas aux protéines de liaison de l'acide rétinoïque cellulaire. Cependant, au niveau clinique, l'adapalène présente également une activité sur les lésions inflammatoires superficielles (Millikan LE, lnt J Dermatol 2000: 39: 784-788). Les mécanismes de l'activité anti-inflammatoire semblent en particulier liés à la modulation de l'immunité non spécifique. Ainsi, l'adapalène inhibe le métabolisme oxydatif de l'acide arachidonique via la voie de la lipoxygénase, le chimiotactisme de polynucléaires neutrophiles et la production de radicaux libres. Il inhibe également la production de leucotriènes par la voie de la lipoxygénase.

L'adapalène a été décrit par la Demanderesse dans le brevet EP 0 199 636, cette dernière a également proposé un procédé de synthèse de ce composé dans le brevet EP 0 358 574.

La Demanderesse commercialise l'adapalène formulé à une concentration pondérale de 0,1 % sous forme d'une lotion alcoolique, d'un gel aqueux et d'une crème. Ces compositions sont destinées au traitement de l'acné.

Les inventeurs identifient dans le cadre de la présente invention, une molécule, exprimée par les kératinocytes, jouant un rôle essentiel dans le développement de l'inflammation cutanée : l'IL-1 ra.

L'IL-1 est une cytokine proinflammatoire, très active, produite par les monocytes et les macrophages, mais aussi par les cellules endothéliales et les lymphocytes. Elle va stimuler la production de prostaglandines, de NO et de chemokines. L'IL-1 est transcrite à partir de trois gènes portés par le chromosome 2 et qui présentent de nombreuses homologies : l'IL-1 alpha, I ¹ IL- 1 béta et l'IL-1 ra. Ces 3 protéines se fixent sur le récepteur de l'IL-1 qui comprend deux types :

• le récepteur I est composé de deux sous-unités I ^* IL-I Rl et I ^* IL-I R AcP

• le récepteur de type II, IL-1 RII,

La molécule d'IL-1 se fixe sur les deux parties du récepteur de type I et entraîne ainsi une activation de son domaine cytoplasmique TIR (analogue au récepteur ToII). L'IL-1 ra ne se fixe que sur la partie IL-1 Rl et empêche alors l'activation du signal intra-cellulaire. Les effets de I' IL-I sont bloqués. La fixation sur le récepteur de type II n'entraîne aucun signal intra-cellulaire. Le récepteur de type I est retrouvé sur de très nombreuses cellules tandis que le récepteur de type II est exprimé principalement sur les neutrophiles, les monocytes et les lymphocytes B.

L'IL-1 Ra est sécrété par le foie comme une protéine de la phase aiguë et joue donc un rôle de modulateur de la réponse inflammatoire.

Rien n'encourageait donc l'homme du métier à soupçonner un mécanisme d'action de l'Adapalène passant par des Récepteurs membranaires des cytokines proinflammatoires.

Or, les inventeurs ont montré, dans le cadre de la présente invention, que l'adapalène induit une augmentation de l'expression de l'IL-1 ra par les cellules de l'épiderme, en particulier les kératinocytes de lésions acnéiques inflammatoires. Par augmentation, il faut entendre une hausse, une sur-expression, une élévation du niveau d'expression du gène de l'IL-10 ou une surproduction de son produit d'expression (ARNm, protéine).

L'augmentation de l'expression de l'IL-1 ra avec l'Adapalène intervient dans l'action comédolytique de l'Adapalène. En effet, l'IL-1 ra étant une cytokine antagoniste du récepteur à I ¹ IL- 1 alpha, elle exerce des effets anti-inflammatoires au niveau de la peau. Les inventeurs ont mis en évidence qu'en bloquant le récepteur de I' I L-I alpha, l'IL-1 ra prévient la formation des comédons qui sinon serait induite par I ¹ IL- 1 alpha.

L'invention concerne donc l'utilisation d'un composé modulateur de l'expression de l'IL-1 ra, tel que l'adapalène ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression de l'IL-1 ra par par les cellules de l'épiderme, et plus particulièrement par les kératinocytes.

Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'un composé modulateur de l'expression de l'IL-1 ra, tel que l'adapalène ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour préparer un médicament destiné augmenter l'expression de l'IL-1 ra par les cellules de l'épiderme acnéique, en particulier par les kératinocytes d'une lésion cutanée, en particulier d'une lésion acnéique inflammatoire.

Un autre objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'un composé modulateur, plus particulièrement stimulant, de l'expression de l'IL-1 ra, tel que l'adapalène ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour préparer un médicament destiné à prévenir la formation de comédons chez les patients dont les cellules de l'épiderme acnéique, en particulier les kératinocytes, sous-expriment NL1 RA.

De préférence, les médicaments utilisés ici ont vocation à être utilisées, pour traiter l'acné, de manière optimale, chez les patients dont les cellules de l'épiderme acnéique, en particulier les kératinocytes, sous-expriment NL1 RA.

La présente invention vise également une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique comprend un composé modulateur de l'expression de l'IL-1 ra, tel que l'adapalène ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans un milieu physiologiquement acceptable.

L'homme du métier peut facilement déterminer et prescrire la quantité requise d'agent thérapeutiquement actif. Par exemple, il peut démarrer avec des doses d'agent thérapeutiquement actif à des niveaux inférieurs que ceux requis pour obtenir l'effet thérapeutique désiré et accroître progressivement le dosage jusqu'à ce que l'effet désiré soit obtenu.

Dans le cas de l'adapalène, pour donner un ordre de grandeur, la composition selon l'invention comprend entre 0.001 et 5% et avantageusement entre 0.01 et 1 % en poids d'adapalène par rapport au poids total de la composition, préférentiellement entre 0.03 et 0.5%, de préférence, entre 0.1 et 0.4 % en poids d'adapalène, encore plus préférentiellement 0.3 % en poids d'adapalène.

La composition peut comprendre en outre tout additif usuellement utilisé dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique, tel que des agents propénétrants, des agents tensioactifs liquides mouillants, des séquestrants, des antioxydants, des filtres solaires, des conservateurs, des charges, des électrolytes, des humectants, des colorants, de bases ou d'acides usuels, minéraux ou organiques, des parfums, des huiles essentielles, des actifs cosmétiques, des hydratants, des vitamines, des acides gras essentiels, des sphingolipides, des composés auto-bronzants tels que la DHA, des agents apaisants et protecteurs de la peau tels que l'allantoïne. Bien entendu l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels composés complémentaires, et/ou leur quantité, de manière telle que les propriétés avantageuses de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées.

Ces additifs peuvent être présents dans la composition à raison de 0 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition.

Une telle composition peut être administrée par toute voie connue, classiquement associée au traitement (utilisant l'adapalène) d'un désordre dermatologique, Le., par voie topique, entérale, parentérale ou oculaire.

De préférence, le traitement est administré par voie topique.

La composition pharmaceutique se présente de préférence sous la forme d'un gel, d'une lotion ou d'une crème. Classiquement la composition se présente sous la forme d'un gel aqueux. On entend par gel aqueux, une composition contenant, dans une phase aqueuse, une masse visco-élastique formée à partir de suspensions colloïdales (gélifiant).

A titre d'exemple non limitatif, on peut citer les gélifiants de la famille des polyacrylamides tels que le mélange Sodiumacryloyldimethyltaurate copolymer/isohexadecane/ polysorbate 80 vendu sous le nom Simulgel 600 par la société Seppic, le mélangepolyacrylamide/isoparaffine C13-14/laureth-7 comme, par exemple, celui vendu sous le nom de Sepigel 305 par la société Seppic, la famille des polymères acryliques couplés à des chaînes hydrophobes tel que le

PEG-150/decyl/SMDI copolymer vendu sous le nom de Aculyn 44 (polycondensat comprenant au moins comme éléments, unpolyéthylèneglycol à 150 ou 180 moles d'oxyde d'éthylène, de l'alcool décylique et du méthylène bis (4- cyclohexylisocyanate)(SMDI), à 35% en poids dans un mélange de propylèneglycol (39%) et d'eau(26%)), la famille des amidons modifiés tels que l'amidon de pomme de terre modifié vendu sous le nom de Structure Solanace ou bien leurs mélanges. Les gélifiants préférés sont issus de la famille des polyacrylamides tel que le Simulgel 600 ou le Sepigel 305 ou leurs mélanges.

Le gélifiant tel que décrit ci-dessus peut être utilisé aux concentrations préférentielles allant de 0,1 à 15 % et, plus préférentiellement, allant de 0,5 à 5 %.

Les médicaments et compositions tels que décrits précédemment, conviennent au traitement des lésions inflammatoires de tout type d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, rosacées, les acnés nodulocystiques, les acnés conglobata, les acnés séniles, les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse, professionnelle ou l'acné occupationnelle.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1 . Evaluation de l'expression de I ¹ IL- 1 ra dans des explants de peau humaine saine, après 24 heures d'incubation avec 10 ^~7 M et 10 ^~6 M d'adapalène ou de milieu contrôle (n= 8 dans chaque groupe). Barres et barres d'erreur représentent moyenne et SEM. ^* p < 0.05 [Test de Wilcoxon apparié adapalène vs. témoin].

Figure 2. Evaluation de l'expression de l'IL-1 ra dans des explants de peau humaine saine provenant de deux groupes de donneurs sains, après 24 heures d'incubation avec 10 ^'7 M et 10 ^'6 M d'adapalène ou de milieu contrôle (n= 4 dans chaque groupe). Barres et barres d'erreur représentent moyenne et SEM. ^* p < 0.05 [Test de Wilcoxon apparié adapalène vs. témoin].

Figure 3. Evaluation de l'expression de NL-I ra dans des explants de peau acnéique, après 24 heures d'incubation avec 10 ^~7 M et 10 ^~6 M d'adapalène ou de milieu contrôle (n= 8 dans chaque groupe).

Barres et barres d'erreur représentent moyenne et SEM. ^* p < 0.05 [Test de Wilcoxon apparié adapalène vs. témoin].

Figure 4. Evaluation de la quantité d'IL-1 ra sécrétée dans les surnageants de culture d'expiants de peau humaine saine (a) et d'expiants de peau acnéique (b), après 24 heures d'incubation avec 10 ^'7 M et 10 ^'6 M d'adapalène ou de milieu contrôle (n= 8 dans chaque groupe).

Barres et barres d'erreur représentent moyenne et SEM. ^* p < 0.05 [Test de Wilcoxon apparié adapalène vs. témoin].

MATERIELS AND METHODES

Matériel

L'invention a été réalisée à partir de biopsies prélevées chez des sujets acnéiques afin de se retrouver dans des conditions les plus proches des études réalisées in vivo.

1 ) Biopsies cutanées

a) Peau acnéiαue

Une biopsie de peau (1 x 1.5 cm) a été obtenue à partir de papules inflammatoires de lésions du dos de 8 patients acnéiques (sous aucun traitement local depuis 15 jours ou général depuis 1 mois, ou 3 mois pour l'isotrétinoïne). Les fragments prélevés ont été immédiatement mis en culture.

b) Peau saine

Des fragments de peau saine de 8 donneurs sains ont été obtenus à partir de plasties mammaires (chirurgie plastique) ou de prépuce (chirurgie infantile).

B. Méthodes

2) Explants de peau saine ou de peau acnéique

Les fragments de peau saine et de peau acnéique ont été incubés à 37°C en atmosphère humide et en présence de 5 % de CO2 pendant 24 heures dans du milieu de culture KGM sans hydrocortisone (PromoCell, Heidelberg, Allemagne). Le milieu de culture a été additionné de 2 concentrations différentes d'Adapalène (Galderma, Sophia Antipolis) : 10 ^"7 M et 10 ^"6 M. Le milieu de culture seul a servi de milieu contrôle. Après l'incubation, les explants ont été retirés du milieu de culture puis ont été congelés en azote liquide pour l'étude immunohistochimique. Les surnageants de culture ont été congelés à -80 ⁰ C afin d'évaluer la sécrétion protéique par une technique de dosage ELISA.

3) Immunohistochimie

L'expression de I'1L-1 ra a été évaluée par une technique d'immunoperoxydase au niveau des explants de peau saine de 8 donneurs sains et de la peau acnéique de 8 patients. Pour cela, des coupes au cryostat de 5 μm d'épaisseur ont été réalisées à partir des explants de peau, puis ont été fixées à l'acétone à 4°C pendant 10 minutes. Après saturation des sites non spécifiques par l'albumine bovine (BSA) pendant 30 minutes à température ambiante, les lames ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante et en atmosphère humide en présence de l'anticorps primaire correspondant [anticorps monoclonal anti-IL-1ra à 10 μg/ml (R&D Systems)] ou d'un anticorps isotype irrelevant pour le témoin négatif (normal goat IgG à (R&D Systems), anticorps monoclonal lgG2a (DAKO, Trappes, France), anticorps monoclonal IgGI (DAKO)). Après un lavage de 15 minutes dans du TBS / BSA 0.1 % / Tween 20 0.05 %, les lames ont été incubées avec un anticorps secondaire biotinylé (DAKO) pendant 30 minutes à température ambiante et en atmosphère humide. Après une nouvelle étape de lavage, les lames ont été incubées 30 minutes en présence de streptavidine/peroxydase (DAKO) pendant 30 minutes à température ambiante et en

atmosphère humide. Après un dernier lavage, les lames ont été incubées 5 minutes en présence de l'AEC (DAKO), substrat de la peroxydase, puis contre-colorées par l'hémalun de Mayer. Les lames ont été lues au microscope.

Les lames ont été lues au microscope Leitz par 2 investigateurs.

Une échelle semi-quantitative a été utilisée pour définir l'intensité du marquage : 0 = nulle, 1 = faible, 2 = moyenne, 3 = forte.

Une moyenne a été établie sur 8 donneurs sains ou 8 patients acnéiques dans chacun des groupes « contrôle », « Adapalène 10 ^"7 M » et « Adapalène 10 ^"6 M.

4) DOSAGE ELISA

La sécrétion protéique de l'IL-1 ra (patients uniquement) dans les surnageants de culture des explants de peau acnéique et de peau saine, incubés en présence ou non d'Adapalène, a été évaluée par un dosage ELISA en utilisant le kit de détection IL-1ra Cytoscreen kit (Biosource Europe S. A., Nivelles, Belgique) et en suivant les instructions du fournisseur.

Une moyenne a été établie sur 8 donneurs sains ou 8 patients acnéiques dans chacun des groupes « contrôle », « Adapalène 10 ^~7 M » et « Adapalène 10 ^"6 M.

5) ANALYSE STATISTIQUE

Le test de Wilcoxon apparié a été utilisé pour l'analyse statistique et p < 0.05 (par comparaison au milieu contrôle) a été considéré significatif.

Exemple 1 : Mesure de l'expression de I Lira sur peau saine et sur peau acnéique par Immunohistochimie

Immunohistochimie : Peau saine (Figure 1)

- L'IL-1 ra est très faiblement à faiblement exprimée dans l'épiderme des donneurs sains, son intensité d'expression étant en moyenne de 0.8 (+/- 0.7).

- La moyenne effectuée sur 8 donneurs sains ne met pas en évidence un effet modulateur de l'Adapalène sur l'expression de NL-I ra dans l'épiderme des donneurs sains. L'intensité d'expression de cette cytokine est en effet de 0.9 (+/- 0.5) avec 10 ^'7 M d'Adapalène et 0.8 (+/- 0.4) avec 10 ^'6 M d'Adapalène.

L'effet modulateur de l'Adapalène s'exerce de 2 manières [cf. figure 2 (a) et

(b)] :

- un effet inducteur lorsque l'expression dans le milieu contrôle est faible [figure 2(a)]. Dans le 1 ^er sous-groupe de donneurs sains, l'intensité d'expression de l'IL-1 ra passe en effet de 0.4 (+/- 0.6) dans le milieu contrôle à 1 .1 (+/- 0.4) avec 10 ^'7 M d'Adapalène puis à 1.2 (+/- 0.4) avec 10 ^~6 M d'Adapalène. un effet inhibiteur lorsque l'expression dans le milieu contrôle est plus importante [figure 2(b)]. Dans le 2 ^eme sous-groupe de donneurs sains, l'intensité d'expression de I ¹ IL- 1 ra passe en effet de 1.1 (+/- 0.6) dans le milieu contrôle à 0.5 (+/- 0.0) avec 10 ^'7 M et 10 ^"6 M d'Adapalène.

Immunohistochimie : Peau acnéique (Figure 3) - L ¹ ILI ra est très faiblement exprimée dans l'épiderme des patients acnéiques : l'intensité d'expression est en moyenne de 0.5 (+/- 0.5).

L'intensité d'expression de l'IL-1 ra est donc similaire dans la peau des donneurs sains et dans la peau acnéique.

- L'Adapalène augmente l'expression de cette cytokine dans l'épiderme des patients acnéiques. Cet effet est dose-dépendant et maximal à la concentration de 10 ^~6 M.

L'intensité d'expression est en effet de 0.8 (+/- 0.8) avec 10 ^'7 M d'Adapalène et de 0.9 (+/- 0.7) avec 10 ^~6 M d'Adapalène.

Exemple 2 : Mesure de l'expression de IL1 ra sur peau saine et sur peau acnéiαue par Dosage ELISA

Dosage ELISA : surnageants de culture des explants de peau saine [Figure 4(a)]

- La quantité d'IL-1 ra sécrétée dans les surnageants de culture par les explants de peau saine incubés avec le milieu contrôle est en moyenne de 585 pg (+/- 337) (moyenne établie sur 8 donneurs sains).

- En présence d'Adapalène 10 ^~7 M, la quantité d'IL-1 ra sécrétée dans les surnageants de culture est en moyenne de 600 pg (+/- 362), soit une augmentation de 2.6 % par rapport au milieu contrôle et de 564pg (+/- 255) en présence d'Adapalène 10 ^'6 M, soit une diminution de 3.5 % par rapport au milieu contrôle.

Dosage ELISA : surnageants de culture des explants de peau acnéique [Figure 4(b)]

- La quantité d'IL-1 ra sécrétée dans les surnageants de culture des explants de peau acnéique incubés avec le milieu contrôle est en moyenne de 1 145 pg (+/- 404).

La sécrétion d'IL-1 ra est donc en moyenne plus forte chez les patients acnéiques par comparaison aux donneurs sains.

- En présence d'Adapalène 10 ^'7 M, la quantité sécrétée d'IL-1 ra est en moyenne de 1 196 pg (+/- 422), soit une augmentation de 4.4 % par rapport au milieu contrôle et de 1 161 pg (+/- 409) en présence d'Adapalène 10 ^'6 M, soit une augmentation de 1.4 % par rapport au milieu contrôle.

Les résultats des exemples montrent que l'Adapalène (aux 2 concentrations utilisées) augmente, l'expression de l'IL-1 ra dans l'épiderme des patients acnéiques. Aucune modulation significative n'est observée chez les donneurs sains mais deux sous populations se dégagent.

L'augmentation de l'expression de l'IL-1 ra avec l'Adapalène intervient dans l'action comédolytique de l'Adapalène. En effet, l'IL-1 ra est une cytokine antagoniste du récepteur de I ¹ IL- 1 alpha et qui exerce des effets anti-inflammatoires au niveau de la peau (Suh D et al, 2002). En bloquant le récepteur de I ¹ IL- 1 alpha, l'IL-1 ra prévient la formation des comédons qui sinon serait induite par I ¹ IL- 1 alpha.