UTILISATION D'UN ADDITIF POUR AMELIORER LA QUALITE

DE BOISSONS A BASE DE MOUTS VEGETAUX

La présente invention a pour objet un additif pour le traitement de boissons à base de moûts végétaux, notamment le vin, la bière, le cidre ou les jus de fruits, et plus particulièrement pour améliorer la qualité de telles boissons, à savoir notamment la stabilité protéique et pour éviter le trouble de telles boissons, généralement dû à la présence de levures, de particules en suspension, principalement des protéines, pouvant présenter des tailles et des compositions très différentes. Domaine de l'invention

Il est connu que la commercialisation des boissons susvisées en bouteilles demande non seulement qu'elles soient limpides lors de la mise en bouteille mais qu'elles le restent au cours du temps, surtout pour les vins qui sont conservés sur des durées relativement longues. Or il est connu que les traitements actuels de stabilisation des vins sont peu satisfaisants, du fait de précipitations de sels tartriques ou protéiques dites dans le métier de l'oenologie "casses tartriques et protéiques".

Une solution connue consiste à traiter les moûts et les vins à la bentonite mais les doses nécessaires en fonction des besoins peuvent être suffisamment élevées pour appauvrir les caractéristiques organoleptiques des vins ainsi traités. Des essais ont été conduits par voie enzymatique en utilisant des protéases exogènes ou obtenues à partir de levures, afin d'éliminer les protéines responsables de la casse protéique mais les résultats n'ont pas donné satisfaction.

Etat de la technique On connaît dans l'état de la technique l'article « Effect of free and immobilised stem bromelain on protein hazein white wine », auteurs I. BENUCCI, M. ESTI and K. LIBURDIn publié dans la revue « Australian Journal of Grape and Wine Research 20, 347-352, 2014».

On connaît également la demande de brevet américain US20030165592 décrivant un procédé de vinification consistant à utiliser une protéase pour éliminer des protéines instables à la chaleur qui provoquent un précipité induit par la chaleur ; ce document expose que l'introduction d'une protéase au début de la fermentation, avant la génération de facteurs inhibiteurs, évite l'utilisation de bentonite normalement requise pour une stabilisation du vin. Ce document expose également que la protéase peut être utilisée en tant qu'agent anti-moussant dans les jus de fruit et pendant la fermentation des jus de fruit. Il cite différentes sources de protéases : microbiennes, végétales et/ou animales, la protéase devant conserver une activité suffisante au pH du fruit (entre 2,5 et 4,0 environ) pour éliminer les protéines instables à la chaleur, et notamment:

- les protéases fongiques provenant de sources telles que Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Rhizomucor meihei et Neosartorya fischeri;

- les protéases de levure provenant de sources telles que Candida olea et Saccharomyces cerevisiae; Protéases bactériennes de Bacillus subtilis, ou Bacillus lichenifomis;

- les protéases animales pepsine et trypsine provenant de bovins ou de porc.

Inconvénients de l'art antérieur

Parmi toutes ces solutions, les protéases végétales sont privilégiées dans les boissons alimentaires. Il est toutefois admis dans l'art antérieur, et notamment dans le document US20030165592, que les protéases végétales suivantes : la ficine de Ficus spp., la papaïne de Carica papaya, la bromélaïne d'Ananas comosus ou d'Ananas bracteratus, ne présentent pas une bonne activité au pH acide des fruits et ne sont donc pas censées pouvoir hydrolyser les protéines des fruits. Il est précisé que la bromélaine et / ou la papaïne (obtenues auprès de Valley Research, Inc., South Bend, Ind.) ont été utilisées pour comparer avec l'activité de protéases produites par A. niger. II apparaît donc dans l'art antérieur que la bromélaïne ne permet pas d'obtenir des résultats satisfaisants pour la stabilisation des boissons à base de moûts végétaux, et plus généralement pour améliorer leur qualité.

Solution apportée par l'invention De manière surprenante, les inventeurs ont observé que la combinaison d'une protéase à cystéine, telle que la bromélaïne et d'un cofacteur tel qu'agent soufré ou un sel de calcium, permet de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et de proposer un additif de stabilisation protéique particulièrement actif.

Ainsi, dans son acceptation la plus générale, l'invention concerne un additif pour améliorer la qualité de boissons à base de moûts végétaux comprenant une protéase à cystéine et un cofacteur.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un additif comprenant une protéase à cystéine et un cofacteur pour améliorer la qualité des boissons à base de moûts végétaux par l'augmentation de l'hydrolyse protéïque.

La protéase à cystéine peut être de tout type : d'origine végétale, animale, bactérienne ou synthétique.

Parmi les protéases à cystéine d'origine végétale, on peut citer les protéases extraites de différents fruits tels que l'ananas, la papaye, la figue, le kiwi, le gingembre... Plus généralement, les protéases à cystéines incluent les cathepsines, les caspases, les calpaïnes

Dans un mode de réalisation préféré, la protéase à cystéine est d'origine végétale. Une telle protéase peut être la bromélaïne extraite de l'ananas, soit extraite du fruit d'ananas (hors feuilles, tiges et racines), soit extraite de la tige (feuilles, tiges et racines). Dans un mode de réalisation tout à fait préféré, la bromélaïne est extraite du fruit.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un additif pour la stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux comprenant de la bromélaïne caractérisé en ce que la bromélaïne est extraite du fruit d'ananas et en ce qu'il contient en outre un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré.

On entend par « extraite du fruit d'ananas » au sens de la présente invention, le fait que ladite variété de bromélaïne est obtenue par une extraction à partir des seuls fruits de l'ananas, comprenant la peau et la pulpe, après élimination des feuilles, tiges et racines. Ce mode d'extraction n'est pas habituel, la tradition consistant plutôt à utiliser les déchets des ananas pour l'extraction de la bromélaïne, ou encore spécifiquement les tiges de l'ananas. En effet, en médecine traditionnelle, à Hawaï, au Japon et à Taiwan, on utilise le latex (la sève) des tiges d'ananas pour nettoyer les plaies et les brûlures et accélérer leur guérison, ainsi que pour faciliter la digestion et pour traiter certains cancers. En 1957, Ralph Heinicke, du Pineapple Research Institute, a découvert que les tiges des plants d'ananas, jusque-là considérées comme de simples résidus de production, étaient riches en cet enzyme. Dès les années 1960, les Européens se sont intéressés à la bromélaïne. Aujourd'hui, elle est utilisée sur ce continent pour accélérer la guérison après une intervention chirurgicale ou une blessure sportive ainsi que pour soigner la phlébite et la sinusite et depuis plus de 30 ans, la bromélaïne est aussi utilisé par l'industrie alimentaire pour attendrir la viande. Pour ces raisons, la bromélaïne commercialisée est généralement issue de déchets d'ananas, et principalement les tiges.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la protéase à cystéine est extraite du gingembre.

Le cofacteur utilisé pour potentialiser l'activité de la protéase à cystéine peut être un composé soufré ou un sel de calcium.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit acide aminé ou peptide soufré est la cystéine, la méthionine, le glutathion, la N-acéthyl cystéine, la γ-Glu-Cys (γ- glutamylcystéine) ou le Cys-Glu (l'acide cystéinylglutamique) .

Dans un autre mode de réalisation préféré, le sel de calcium est le chlorure de calcium.

La boisson à base de moûts végétaux peut être notamment de la bière, du vin (blanc, rosé, rouge), un jus de fruits, du cidre...

Par « l'amélioration de la qualité des boissons à base de moûts végétaux », on entend les améliorations associées à l'hydrolyse protéique telles que l'amélioration de stabilité protéique (ou la réduction de l'instabilité protéique), et/ou en ce qui concerne les boissons alcoolisées, l'amélioration de la fermentation alcoolique. La détermination de la quantité de cofacteurs présente dans la boisson à base de moût végétaux peut être réalisée soit au moment de l'ajout de l'additif, soit préalablement par type de boisson. Dans ce dernier cas, il est possible de préparer à l'avance des additifs adaptés aux différents types de boissons à base de moûts végétaux et de les ajouter sans étape de dosage de la quantité de cofacteurs.

Le cofacteur peut être ajouté au milieu réactionnel selon trois protocoles (non limitatifs) :

(i) par ajout lors de l'étape de broyage/extraction telle que définie à l'Exemple 2, étape 1 ; ou

(ii) par ajout pendant ou après l'étape de concentration/filtration telle que définie à l'Exemple 2, étape 2, 3 ou 4 ; ou

(iii) par ajout dans le milieu réactionnel, avant, après ou simultanément à l'ajout de l'extrait d'ananas

Lorsque le cofacteur est un acide aminé ou peptide soufré, son ajout peut être réalisé sous forme de poudre ou bien d'extraits riches en acide aminé soufré (écorce de levure sèche, crucifère, alliacés oignon, choux,...).

Lorsque le cofacteur est un acide aminé ou peptide soufré, sa présence dans le milieu réactionnel peut être obtenue par conversion ou bioconversion dans le milieu réactionnel de précurseurs dudit acide aminé ou peptide soufré.

Lors de la mise en contact de l'additif et de la boisson à traiter, il est possible :

- d'ajouter la protéase et le cofacteur sont forme libre directement dans la boisson

- d'immobiliser la protéase ou le cofacteur sur un support tel une résine, de la bentonite, de l'agar-agar...

Concernant les conditions de mise en œuvre du traitement des moûts végétaux conformément à l'invention, les inventeurs ont mis en évidence une influence non négligeable du pH du moût végétal sur l'activité de l'additif. En particulier, l'ajout de l'additif peut modifier le pH du moût. Or, de manière générale, plus le pH du vin est bas, plus il faudra augmenter la dose de cofacteur pour optimiser l'hydrolyse protéique. L'Homme du métier saura adapter la dose de cofacteur en fonction du pH du milieu réactionnel et du moût à traiter.

A titre indicatif, pour une utilisation efficace de l'additif dans le vin, le pH est avantageusement mais de manière non limitative compris entre 3 et 4, après ajout de l'additif. De préférence, le pH du milieu sera compris entre 3,2 et 3,8, et de manière encore plus préférée proche ou égal à 3,8 après ajout de l'additif dans le vin. Pour l'utilisation de l'additif dans la bière, le pH du milieu devra de préférence être compris entre 4 et 6 après ajout de l'additif. Un deuxième objet de l'invention concerne un additif pour améliorer la qualité des boissons à base de moûts végétaux, comprenant une protéase à cystéine et un composé soufré autre que la cystéine.

Dans un mode de réalisation préféré, le composé soufré est choisi parmi le glutathion et la méthionine.

A titre d'exemple d'additifs particuliers selon l'invention, on peut citer les associations suivantes :

- Bromélaïne et glutathion

- Bromélaïne et méthionine

- Bromélaïne et composé soufré autre que la cystéine

- Protéase à cystéine extraite du gingembre et glutathion

- Protéase à cystéine extraite du gingembre et méthionine

- Protéase à cystéine et composé soufré autre que la cystéine

Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'un additif pour améliorer la qualité de boissons à base de moûts végétaux.

Dans un mode de réalisation particulier dans lequel la protéase à cystéine est extraite du fruit d'ananas, ce procédé comporte les étapes suivantes :

- broyage de fruits d'ananas frais avec un tampon à pH supérieur à 5, et de préférence à pH 7, et un peptide ou un acide aminé soufré (les fruits peuvent par exemple être des fruits avariés impropres à la commercialisation)

- centrifugation à une température comprise entre 2°C et 8°C. - clarification et ultrafiltration.

Ces gammes de pH et de températures ne sont données qu'à titre indicatif et non limitatif, et ne sont qu'un mode de réalisation considéré comme avantageux. La force du tampon est avantageusement comprise entre 0,05 et 1 Mol., et de préférence 0,1 Mol. L'homme du métier pour déterminer la force optimale par des expériences de routine, par des essais successifs avec des forces variées.

Dans un mode de réalisation préféré où l'additif comprend de la bromélaïne extraite du fruit d'ananas et de la cystéine, la préparation de l'additif est réalisée dans un tampon phosphate 0,1 M avec de la cystéine à 15 mM et à pH 7.

L'additif ainsi préparé est utile notamment pour la stabilisation protéique des boissons à base de moûts végétaux ou l'amélioration de la fermentation alcoolique des boissons alcoolisées à base de moûts végétaux.

Un quatrième objet de l'invention concerne un procédé d'amélioration de la qualité des boissons à base de moûts végétaux par l'augmentation de l'hydrolyse protéique, consistant à ajouter pour un litre de jus de fruit, de bière ou de vin, une dose compatible avec les doses usuelles en oenologie et brasseries d'un additif comprenant une protéase à cystéine et un cofacteur.

Cette dose peut être comprise entre 1 mg/L et 10000 mg/L.

De manière avantageuse mais non limitative, cette dose est comprise entre 0.5 g/ Hl et 300 g/HI, soit entre 5 mg/l et 3000 mg/l.

Dans un autre mode de réalisation d'intérêt, elle est comprise entre 1 mg/l et 100mg/l.

Dans un mode de réalisation particulier dans lequel on utilise un extrait « brut » ou « pré-purifié » tel que défini à l'exemple 2 d'une protéase à cystéine, le procédé d'amélioration de la qualité des boissons à base de moûts végétaux par l'augmentation de l'hydrolyse protéique, consiste à ajouter pour un litre de jus de fruit, de bière ou de vin, une dose comprise entre 1 mg/ml et 30 mg/ml, de préférence entre 5 mg/ml et 30 mg/ml, d'un additif comprenant une protéase à cystéine et un cofacteur. Dans un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de stabilisation protéique de boissons à base de moûts végétaux consistant à ajouter, pour un litre de jus de fruit, de bière ou de vin, une dose comprise entre 1 mg/ml et 30 mg/ml, de préférence entre 5 mg/ml et 30 mg/ml, d'un additif « brut » ou « pré-purifié » comprenant de la bromélaïne caractérisé en ce que la bromélaïne est extraite du fruit d'ananas et en ce qu'il contient en outre un acide aminé soufré ou un peptide comprenant un acide aminé soufré. Il est à noter que le composé soufré peut être apporté par l'extrait d'ananas qui en contient naturellement et/ou par ajout à partir d'une source externe.

De manière générale, plus l'extrait de bromélaïne est purifié, moins il contient de composé soufré, notamment de cystéine et plus il faudra en ajouter pour préparer l'additif. Ces paramètres peuvent sans difficulté être ajustés par l'homme du métier.

Les exemples qui suivent illustrent de manière non limitative l'invention.

FIGURES

La Figure 1 représente le profil électrophorétique d'un échantillon de vin blanc traité avec différentes concentrations d'additif selon l'invention (VB = vin blanc ; EFT = extrait de fruits tropicaux)

Les Figures 2 et 3 représentent la variation des protéines de raisin du témoin en fonction des traitements appliqués.

Les Figures 4, 5 et 6 représentent la diminution de la quantité de protéines du vin en fonction du pH en présence d'un additif selon l'invention, Figure 4 à pH 3, Figure 5 à pH 3,4 et Figure 6 à pH 3,8.

PARTIE EXPERIMENTALE

EXEMPLE 1 : Sélection d'une forme optimale de la bromélaïne Un des aspects de la présente invention concerne le choix d'une forme optimale de la bromélaïne en tant que protéase à cystéine utilisée dans l'additif pour boissons à base de moûts végétaux selon l'invention. Le tableau 1 ci-dessous présentent les différentes formes de bromélaïnes (en anglais cysteine proteinases) issues de l'espèce Ananas comosus répertoriés par les inventeurs :

La bromélaïne objet de la présente invention peut être extraite à partir du fruit d'ananas. Ce dernier contient néanmoins deux types de bromélaïnes : principalement le type « fruit bromelain » mais aussi le type « stem bromelain », beaucoup moins présent.

EXEMPLE 2 : Extraction et pré-purification par filtration et ultrafiltration de l'activité enzymatique La description qui suit présente un exemple non limitatif de procédé de préparation d'un extrait d'ananas contenant de la bromélaïne et de la cystéine pouvant être utilisé en tant qu'additif selon l'invention. Etape 1 : broyage et extraction

- Disposer de 100g de déchets d'ananas frais plus 200ml de tampon phosphate 0,1 M à pH 7 auxquels sont ajoutés de la cystéine 15mM.

- Broyer (broyeur à ailettes en inox) à vitesse maximale pendant 1 minute.

- Laisser au repos pendant 1 heure.

- Centrifuger à 8000 tr/min pendant 20 minutes à +4°C.

Etape 2 : lyophilisation de l'extrait sec susvisé

Etape 3 : Ultrafiltration

- Récupérer le surnageant après centrifugation

- Dialyser contre un tampon phosphate 0,01 M pH 7 à l'aide d'une membrane avec un seuil de coupure de 10 kDa

- Concentrer cinq fois Etape 4 : lyophilisation de l'extrait sec

La succession de l'étape 1 et 2 conduit à un extrait dit « brut ».

La succession de l'étape 1 , 3 et 4 conduit à un extrait dit « pré-purifié ».

EXEMPLE 3 : Effet de la cystéine sur l'activité de la bromélaïne lors de l'hydrolyse des protéines du mout de bière

Des essais d'hydrolyse de protéines à l'aide de protéases à cystéine ont été réalisés sur la bière. Le cas de la bière est un peu particulier. En effet, l'utilisation de la bromélaïne pour hydrolyser les protéines dans la bière est connu de l'art antérieur.

Toutefois, de manière inattendue, les inventeurs ont démontré que l'ajout de cystéine dans un moût de bière permet encore d'améliorer l'hydrolyse des protéines par rapport à un ajout de bromélaïne seule. Ce résultat obtenu par migration sur gel de préparations de protéines a été réalisé en utilisant un extrait « brut » de bromélaine tel que défini dans l'exemple 2 et en comparant la taille des protéines contenues dans les 4 mélanges suivants :

a. 1 ml moût de bière seul non traité

b. 1 ml moût de bière + 12,5 mg d'extrait « brut » de bromélaine

c. 1 ml mout de bière + 12,5 mg d'extrait « brut » de bromélaïne + 1 mM de cystéine

d. 1 ml de moût de bière + 12,5 mg extrait « brut » de bromélaine + 10 mM de cystéine

Après migration sur gel SDS PAGE, les bandes protéiques des essais b, c et d ont été comparées à celles de l'essai a. La révélation du profil protéique issu de l'essai d. sur gel montre une hydrolyse plus importante des protéines du mout de bière. A savoir une disparition plus prononcée des bandes protéiques.

Ces résultats ont permis de valider l'effet positif de la cystéine en tant que cofacteur sur l'activité de la bromélaïne dans le moût de bière (les résultats sur gel ne sont pas montrés). EXEMPLE 4 : Effet de différentes protéases à cystéine sur l'hydrolyse des protéines du moût de bière

Des expériences ont été réalisées afin de valider la possibilité d'étendre à d'autres protéases à cystéine les résultats obtenus en utilisant la bromélaïne pour hydrolyser les protéines de moûts végétaux. La protéase à cystéine testée est extraite du gingembre.

A l'exception de l'étape 1 où aucune cystéine n'a été ajoutée lors de l'extraction, l'extrait de gingembre a été obtenu en utilisant le même protocole que celui mis en œuvre pour préparer l'extrait « brut » de bromélaine utilisé dans l'exemple 3.

Des expériences ont été menées avec des extraits de gingembre dans les conditions suivantes :

a. 1 ml mout de bière seul non traité b. 1 ml mout de bière + 12,5 mg extrait « brut » de gingembre

c. 1 ml de mout de bière + 12,5 mg extrait « brut » de gingembre + 10 mM de cystéine. Après migration sur gel SDS PAGE, les bandes protéiques des essais b et c ont été comparés à l'essai a. La révélation du profil protéique de l'essai c. sur gel montre une hydrolyse plus importante des protéines du mout de bière, à savoir une disparition plus prononcée des bandes protéiques.

Ces résultats valident la capacité de la protéase à cystéine extraite du gingembre à hydrolyser les protéines du mout de bière en présence du cofacteur, la cystéine (les résultats sur gel ne sont pas montrés).

Conclusion : Ces résultats valident le fait que la bromélaïne mais aussi la protéase à cystéine extraite du gingembre sont capables d'hydrolyser les protéines de moûts végétaux. Ce résultat supporte l'hypothèse selon laquelle toutes les protéases à cystéine, notamment celles issues des fruits peuvent être utilisées avec un cofacteur pour hydrolyser les protéines des moûts végétaux. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles utilisations des protéases à cystéine avec leurs cofacteurs pour l'hydrolyse des protéines, en particulier dans le cadre de la stabilisation protéique dans les boissons à base de moûts végétaux.

EXEMPLE 5 : Effet de l'additif sur un vin blanc

L'intérêt d'utiliser un additif selon l'invention a également été validé sur le vin. A titre d'exemple, un additif selon l'invention peut comprendre un composé actif principal constitué par :

- la bromélaïne extraite du fruit d'ananas (et non pas des tiges, feuilles ou racines)

- un peptide ou un acide aminé ayant un composé soufré, notamment la cystéine, la méthionine ou le glutathion, ou un sel de calcium notamment le chlorure de calcium.

L'ajout d'acide aminé soufré peut être réalisé sous forme de poudre ou de l'ajout d'extraits riches en acide aminé soufré (écorce de levure sèche, crucifère, alliacés oignon, choux,...). 1 ) Effet d'un extrait « brut » de bromélaïne sur un vin de type Sauviqnon blanc avec un pH 3,25

Le protocole suivi est le suivant :

Préparation :

• Vin : type Sauvignon blanc présentant un pH 3,25.

• Peser 3 quantités différentes d'extrait brut tel qu'obtenu par le procédé susvisé o 25,5mg à dissoudre dans 0,9ml de vin blanc

o 12,5 mg à dissoudre dans 0,9ml de vin blanc,

o 5 mg à dissoudre dans 0,9ml de vin blanc,

o 25,5mg à dissoudre dans 0,9ml d'eau.

• Laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante.

Adsorption et analyse des protéines après hydrolyse :

• Ajouter ensuite 0,1 ml de bentonite (électra) à 10g/I.

• Mettre à la roue pendant 30 minutes à 40 tr/min.

• Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

• Reprendre le culot dans 0,05ml de Laemmli 1X.

• Mettre sur une plaque agitant pendant 16 heures à température ambiante.

• Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

• Réaliser l'analyse d'électrophorèse grâce à l'appareil Experion®.

La Figure 1 représente les profils électrophorétiques d'un échantillon de vin blanc, avec le profil (1 ) du vin sans traitement, et les profils (2 à 4) du vin après traitement avec un additif selon l'invention, à des concentrations respectivement de 25,5, 12,5, 5 mg/ml. Le profil (5) correspond au profil de l'extrait susvisé, avec une concentration de 5 mg/ml dans de l'eau. Les profils ont été établis par un équipement d'électrophorèse EXPERION (nom commercial).

Il en ressort que les protéines du vin ont été partiellement hydrolysées. Les échantillons traités avec l'additif selon l'invention présentent les deux bandes associées aux protéines de raisin (28 et 33 kDa environ) et également une bande inférieure à 25 kDa qui correspond à la masse moléculaire de la bromélaïne.

2) Effet d'un extrait « brut » de bromélaïne sur un vin de type Sauviqnon blanc avec un pH 3,34 et un vin Sauviqnon blanc avec un pH ajusté à 3,8

Préparation :

• Vin : type Sauvignon blanc présentant un pH 3,34 et Sauvignon blanc avec un pH ajusté à 3,8.

• Peser deux quantités différentes d'extrait brut tel qu'obtenu par le procédé susvisé :

o 50mg à dissoudre dans 0,9ml de vin blanc

o 25,5mg à dissoudre dans 0,9ml d'eau.

• Laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante.

Adsorption et analyse des protéines après hydrolyse :

• Ajouter ensuite 0,1 ml de bentonite (électra) à 10g/I.

• Mettre à la roue pendant 30 minutes à 40 tr/min.

• Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

• Reprendre le culot dans 0,05ml de Laemmli 1X.

· Mettre sur une plaque agitant pendant 16 heures à température ambiante.

• Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

• Réaliser l'analyse d'électrophorèse grâce à l'appareil Experion®.

La Figure 2 représente les profils protéiques avec deux poids moléculaires, 28 Kda et 33 Kda, pour le premier vin de Sauvignon au pH 3,34.

Les pics (1 1 , 12 et 13) quantifient la teneur en protéines de poids de 28Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,34 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. Les pics (21 , 22 et 23) quantifient la teneur en protéines de poids de 33 Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,34 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. On observe dans tous les cas une réduction de la teneur en protéine lors de l'ajout de l'additif, avec des effets différenciés en fonction du poids moléculaire. La Figure 3 représente les profils protéiques avec deux poids moléculaires, 28 Kda et 33 Kda, pour le premier vin de Sauvignon au pH 3,8. Les pics (41 , 32 et 33) quantifient la teneur en protéines de poids de 28Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,8 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. Les pics (41 , 42 et 43) quantifient la teneur en protéines de poids de 33 Kda respectivement du témoin sans additif, du vin à pH 3,8 traité avec 25,5 mg/ml d'additif et du vin traité avec 50 mg/ml d'additif. On observe dans tous les cas une réduction de la teneur en protéine lors de l'ajout de l'additif, avec des effets différenciés en fonction du poids moléculaire, de manière plus marquée que pour le vin à pH 3,34.

3) Effet d'un extrait « pré-purifié » de bromélaïne sur un vin de type Gewurztraminer à pH 3,8 / 3,4 et 3

Ces résultats ont été produits dans le cadre du plan d'expérience reproduit dans le Tableau 2 ci-après:

• Vin : type Gewurztraminer présentant un pH 3,8 et avec un pH ajusté à 3 et 3.4.

• Peser deux quantités différentes de cystéine et trois quantités différentes d'extrait pré-purifié tel qu'obtenu par le procédé susvisé

· Dissoudre dans le vin blanc et laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante.

Adsorption et analyse des protéines après hydrolyse :

• Ajouter ensuite 0,1 ml de bentonite (électra) à 10g/I.

• Mettre à la roue pendant 30 minutes à 40 tr/min. • Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

• Reprendre le culot dans 0,05ml de Laemmli 1X.

• Mettre sur une plaque agitant pendant 16 heures à température ambiante.

• Centrifuger pendant 10 minutes à 7000 tr/min à 10 °C.

· Prélever 60 μΙ du surnageant

• Ajouter 20 μΙ de Laemmli 4X

• Déposer 50 μΙ sur gel SDS PAGE

Les résultats sont présentés aux Figures 4, 5 et 6.

On observe d'une part une hydrolyse plus rapide et plus efficace des protéines en présence de cystéine, comme cela a été exposé précédemment. D'autre part, ces données mettent en évidence l'influence du pH sur l'hydrolyse et montrent que pour le vin, le pH optimal est 3,8.

EXEMPLE 6 : Evaluation de l'augmentation de l'activité de la bromélaïne en fonction du cofacteur ajouté

La cystéine est connue pour améliorer l'activité de la bromélaïne. Dans la présente expérience, les inventeurs ont comparé l'effet de trois autres cofacteurs sur l'activité de la bromélaïne : la méthionine, le glutathion et le CaC .

Pour tester la pertinence d'utiliser la méthionine et le glutathion en tant que cofacteurs d'une protéase à cystéine, les inventeurs ont comparé l'effet de ces cofacteurs par rapport à l'effet de la cystéine sur l'activité de la bromélaïne dans le vin.

A cet effet, le protocole suivant a été mis en œuvre:

• Vin : type Gewurztraminer présentant un pH 3,8.

• Ajouter pour 3 échantillons de vin 10 mM de cystéine, glutathion ou méthionine. · Peser quatre fois 8 mg d'extrait pré-purifié obtenu suite à la succession de l'étape 1 , 2 et 4 du procédé susvisé

• Dissoudre chaque extrait prépurifié dans le vin, le vin en présence de cystéine, le vin en présence de glutathion et le vin en présence de méthionine. • Laisser en contact pendant 16 heures, à la plaque agitant à 80 tr/min et à température ambiante.

• Prélever 60 μΙ du surnageant

• Ajouter 20 μΙ de Laemmli 4X

· Déposer 50 μΙ sur gel SDS PAGE

Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3 : Effet de différents cofacteurs sur l'activité de la bromélaïne sur vin.

Par ailleurs, le cofacteur CaC , a également été testé et montre un effet positif sur l'hydrolyse des protéines du vin même si ce résultat n'est pas présenté ici.

Conclusion : Ces résultats valident le fait que la cystéine et le CaC , mais également et pour la première fois, le glutathion, et la méthionine peuvent être utilisés comme cofacteurs de la bromélaïne, et par voie de généralisation des protéases à cystéine, pour l'hydrolyse des protéines. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles utilisations des protéases à cystéine et de leurs cofacteurs pour l'hydrolyse des protéines, en particulier dans le cadre de la stabilisation protéique dans les boissons à base de moûts végétaux.