La présente invention a pour objet l'utilisation d'antifongiques actifs sur les champignons du genre Candida, et le cas échéant sur ceux du genre Rodhotorula, pour la préparation de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des scléroses tissulaires, et autres pathologies dérivées, chez l'homme ou l'animal, liées à la présence dans l'organisme humain ou animal de champignons dérivés de ceux mentionnés ci-dessus.

Cette invention découle de la mise en évidence par l'Inventeur du fait qu'un antifongique actif sur les Candida, connu sous la dénomination commune internationale (DCI) Nystatine, permet de résorber les scléroses des tissus de l'organisme, lorsqu'il est utilisé, d'une part à une posologie nettement inférieure à sa posologie usuelle dans le cadre du traitement des candidoses, et, d'autre part, pendant une durée de traitement beaucoup plus longue que la durée usuelle de traitement des candidoses.

Cette mise en évidence est le résultat de nombreuses années d'observations des effets de la Nystatine in vivo pendant de longues périodes de traitement effectuées par l'Inventeur sur lui-mme.

Dans son livre autobiographique publié en Bulgarie le 27 avril 1998 ("Chronicle of a Dance with the Devil", par Roumen Antonov, Pygmalion Press ISBN954-8336-39-1), l'Inventeur fait part des essais effectués sur lui-mme, et quelques autres volontaires, avec un médicament supposé actif contre Candida albicans, sans pour autant désigner ce médicament.

Ayant constaté que ce médicament, qui en réalité était la Nystatine, avait un effet de résorption des nécroses ou scléroses tissulaires originaires d'anciennes cicatrices, l'Inventeur émis l'hypothèse que ces scléroses tissulaires pouvaient résulter du développement de Candida albicans dans les régions de l'organisme ou s'accumulent les cellules mortes et les débris tissulaires.

C'est ainsi que l'Inventeur rechercha la présence de Candida albicans dans des plaques d'athérome in vitro. L'expérience consiste à inciser une plaque d'athérome et à la traiter avec un antifongique local liquide actif contre Candida albicans. On constate alors

de façon reproductible la décomposition in vitro de la plaque d'athérome après addition de l'antifongique.

Par ailleurs, la mise en culture de ces plaques d'athérome permet d'observer une structure en forme de Y qui, bien que relativement atypique, pouvait suggérer la présence de Candida albicans à l'intérieur de cette plaque d'athérome.

Toutefois, cette simple observation ne permettait pas à elle seule de conclure avec certitude sur la présence ou non de Candida albicans dans les plaques d'athérome. Une telle confirmation nécessitait la mise en oeuvre d'expériences complémentaires.

Des expériences récentes de cultures sur milieu Sabouraud et de colorations spécifiques, notamment par fluorescence, des micro-organismes présents dans les plaques d'athérome, ont permis à l'Inventeur de conclure sans ambiguïté sur la présence d'un champignon apparenté aux champignons du genre Candida dans les plaques d'athérome, et autres tissus sclérotiques, bien que présentant des filaments ayant des dimensions jamais décrites jusqu'à présent pour des champignons du genre Candida. De plus, l'Inventeur a ainsi pu mettre en évidence que le champignon susmentionné était parfois accompagné d'un champignon du genre Rodhotorula, ce dernier étant lui-mme pour la première fois décrit par l'Inventeur sous forme filamenteuse.

Par ailleurs, les études in vivo menées depuis longtemps par l'Inventeur, lui ont permis de déterminer les posologies en antifongiques nécessaires à la prévention ou au traitement des pathologies, notamment des diverses scléroses, liées au développement de ces champignons dans l'organisme.

L'invention a pour objet un champignon dérivé, notamment par mutation, d'un champignon du genre Candida, tel que Candida lipolitica, ou Jarowia lipolitica, ou dérivé d'autres germes ou champignons, notamment d'autres espèces de champignons lipolytiques, ledit champignon étant capable de se développer en phase parfaite sexuée sous forme filamenteuse dans l'organisme humain ou animal, notamment dans le système vasculaire, les différents organes, ainsi que dans la peau.

Le champignon susmentionné est caractérisé également en ce qu'il est capable, après avoir été prélevé sur un hôte, notamment dans des plaques d'athéromes humaines, de se développer in vitro dans un milieu nutritif, tel que le milieu Sabouraud, sous forme de colonies filamenteuses de couleur blanchâtre, et d'un mycélium substratique présentant des filaments bien visibles dans le milieu nutritif.

Il peut également se présenter sous la forme de colonies de levures blanchâtres d'aspect gras par rapport au milieu nutritif, et correspondant au champignon imparfait en phase asexuée.

Le champignon dérivé du genre Candida susmentionné selon l'invention, est davantage caractérisé en ce qu'il comprend des filaments dont le diamètre varie entre environ 4 à environ 8 t, et peut atteindre jusqu'à plus de 30 t en milieu nutritif in vitro, ou dans l'organisme.

Le champignon susmentionné de l'invention est également caractérisé en ce qu'il se développe en milieu anaérobie, in vivo ou in vitro.

L'invention concerne également un champignon tel que défini ci-dessus, déposé à la Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur à Paris sous le numéro I-2336 le 15 octobre 1999.

Les champignons susmentionnés, et plus particulièrement ceux dérivés du genre Candida tels que définis ci-dessus selon l'invention, sont davantage caractérisés en ce qu'ils peuvent se développer dans l'organisme humain ou animal, en association ou non avec un champignon du genre Rodhotorula, ou un dérivé de ce dernier, notamment en présence de Rodhotorula rubra ou Rodhotorula glutinis ou autre sous-espèce de Rodhotorula, ce champignon du genre Rodhotorula étant le cas échéant sous forme filamenteuse correspondant à une forme sexuée de ces champignons en phase parfaite, et ce, comme cela a déjà été mentionné ci-dessus, plus particulièrement dans les vaisseaux sanguins (tels que veines, capillaires, artères, artérioles, coronaires, etc.), ou autres tissus humains, les champignons susmentionnés pouvant tre extraits à partir de cet organisme.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'antifongiques actifs sur les champignons du genre Candida, notamment sur Candida albicans, Candida lipolitica, ou Jarowia lipolitica, et, le cas échéant sur les champignons du genre Rodhotorula, tels que Rodhotorula rubra ou Rodhotorula glutinis, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies liées à la présence dans l'organisme humain ou animal d'un champignon susmentionné, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, notamment d'un champignon dérivé de Candida lipolitica, ou autre germe, présentant la structure filamenteuse atypique susmentionnée, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula, et/ou en association avec des levures du type Candida lipolitica.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'antifongiques tels que définis ci-dessus et ci-après, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des scléroses ou nécroses tissulaires, ou de pathologies issues de ces scléroses ou nécroses, et étant liées à la présence dans l'organisme humain ou animal de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'antifongiques tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies liées au développement des scléroses ou nécroses dans l'organisme, à savoir d'un médicament destiné à prévenir ou à résorber les scléroses ou nécroses résultant du dépôt et de l'accumulation de débris cellulaires dans les tissus, ainsi que de leur maintien sous forme d'amas par les champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement par les champignons apparentés à ceux du genre Candida tels que définis ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula, se développant dans ces structures sclérotiques ou nécrotiques.

L'invention concerne également l'utilisation d'antifongiques tels que définis ci-dessus et ci-après, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'athérosclérose liée à la présence dans les vaisseaux sanguins de l'organisme humain ou animal, de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula, ainsi que des différentes pathologies associées à l'athérosclérose susmentionnée, telles que l'infarctus du myocarde, phlébites, et thromboses vasculaires cérébrales.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'antifongiques tels que définis ci- dessus et ci-après, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de scléroses ou nécroses de la peau, tels que l'eczéma, le psoriasis, les érythèmes, ichtyoses, liées à la présence dans l'organisme humain ou animal, de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula, ou encore d'un médicament destiné à la détersion des

cicatrices et plaies nécrotiques et l'élimination des sphacèles notamment dans les cas d'ulcères (par exemple des jambes) d'origine veineuse, d'escarres, de plaies traumatiques, chroniques, ulcérées ou atones, de brûlures superficielles et profondes, des nécroses cutanées d'origine traumatique, au sein desquels se situe le ou les champignons susmentionnés.

L'invention concerne également l'utilisation d'antifongiques tels que définis ci-dessus et ci-après, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de scléroses ou nécroses des articulations, notamment dans les cas d'arthrose, liées à la présence dans l'organisme humain ou animal de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'antifongiques tels que définis ci- dessus et ci-après, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies pulmonaires d'origne sclérotique, et plus particulièrement de l'asthme ou des toux spasmodiques, liées à la présence dans l'organisme humain ou animal de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement d'un champignon dérivé du genre Candida tel que défini ci-dessus, le cas échéant en association avec un champignon susmentionné du genre Rodhotorula.

Par antifongiques actifs sur les champignons du genre Candida, et sur ceux du genre Rodhotorula, on entend notamment tout composé actif sur toute espèce du genre Candida et Rodhotorula, notamment tout composé actif sur Candida Albicans, Candida lipolitica, ou Jarowia lipolitica, et tout composé actif sur Rodhotorula rubra, ou sur toute espèce ou sous-espèce dérivées, notamment par mutation, des champignons susmentionnés.

Parmi les antifongiques susceptibles d'tre utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer : -la Flucytosine (DCI), -les antibiotiques antifongiques de contact de la famille des polyènes, -les antifongiques du groupe des imidazolés, tels que : . le Miconazole (DCI), . le Kétoconazole (DCI), . le Fluconazole (DCI) (antifongique bistriazolé).

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'antibiotiques antifongiques de contact de la famille des polyènes, et plus particulièrement ceux extraits de cultures de bactéries du genre Streptomyces, tels que : . l'Amphotéricine B (DCI) extrait de culture de Streptomyces nodosus, . la Nystatine (DCI) extrait de culture de Streptomyces noursei, ou tout dérivé de ces antifongiques, tels que ceux susceptibles d'tre obtenus par synthèse chimique.

A titre d'illustration, les polyènes susceptibles d'tre utilisés dans le cadre de la présente invention sont les suivants : -les tétraènes de formules 1 suivantes : . la nystatine de formule la <BR> . la pimarycine de formule 1b dans laquelle R = CH3 et l'arénomycine dans laquelle R = CHZ-CHZ-CHZ-CH, . le rimocide de formule lc

. la tétrine A de formule I d dans laquelle R = H, et la tétrine B dans laquelle R=OH -les pentanes de formules 2 suivantes : . la philipine de formule 2a dans laquelle R = H, et la pentamycine dans laquelle R=OH . la mycotitzine A de formule 2b dans laquelle R = H, et la mycotitzine B de formule 2b dans laquelle R = CH3

. l'eirotitzine A de formule 2c dans laquelle R = CH3, et l'eirotitzine B de formule 2c dans laquelle R = H . le composé de formule 2d suivante -les hexanes de formules 3 suivantes : . la dermostatine A de formule 3 dans laquelle R = CH3, et la dermostatine B de formule 3 dans laquelle R = CH2-CH3

-les heptanes de formules 4 suivantes : . l'amphotéricine B de formule 4a . la candidine de formule 4b

Avantageusement, 1'antifongique utilisé dans le cadre de la présente invention est la Nystatine.

Avantageusement encore, les doses d'antifongiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont environ 2 à environ 100 fois, notamment environ 5 à environ 50 fois, inférieures aux doses usuelles de ces mmes antifongiques (à savoir aux doses usuelles d'environ 10 comprimés de 500 000 UI par jour pendant 10 jours) dans le cadre du traitement des candidoses notamment buccopharyngées, intestinales ou vaginales.

De plus, la durée du traitement est beaucoup plus longue, notamment au moins environ 5 fois plus longue, dans le cas de la présente invention, que dans le cas du traitement des candidoses susmentionnées, et est plus particulièrement d'au moins environ 2 mois, notamment d'au moins environ 6 mois.

A titre d'illustration, les posologies utilisées dans le cas de l'utilisation des antifongiques, et plus particulièrement de la Nystatine, dans le cadre de la présente invention, sont les suivantes : -moins d'environ 100.000 unités par jour chez l'adulte, notamment chez les personnes ayant entre environ 20 ans et environ 30 à 40 ans, ou -entre environ 25.000 et environ 50.000 unités par jour chez les personnes de moins de 20 ans environ, et chez les enfants, -entre environ 25 000 et environ 125 000 unités par semaine, avantageusement environ 25.000 unités par semaine, chez les personnes de plus de 40 ans, pendant une durée de traitement illimitée.

Les posologies indiquées ci-dessus, sont données pour une ou plusieurs prises quotidiennes pendant la durée du traitement, ou, de préférence, pour une ou plusieurs prises par jour espacées par des intervalles d'environ 3 à environ 7 jours pendant la durée du traitement.

Aux posologies indiquées ci-dessus, la durée du traitement est d'environ au moins 6 mois pour les enfants et les personnes de moins de 20 ans environ, jusqu'à une ou plusieurs années chez les personnes de plus de 20 ans.

On peut noter qu'après de telles périodes de traitement, le système immunitaire devient capable de prendre le relais contre le développement de ces scléroses ou nécroses dues au développement de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement de champignons susmentionnés dérivés du genre Candida, par un processus

d'immunisation, et ce pendant une période comprise entre environ 3 ans et environ 5 ans.

Le traitement par les antifongiques susmentionnés peut alors cesser.

Dans le cas où cette immunisation viendrait à disparaître, le traitement à l'aide des antifongiques susmentionnés peut alors reprendre, de préférence avec des posologies environ deux fois inférieures à celles indiquées ci-dessus, et pendant une durée environ deux fois plus courte.

Les posologies et durées de traitement indiquées ci-dessus permettent de diminuer de façon significative les quantités de champignons tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement de champignons susmentionnés dérivés du genre Candida, ainsi que, le cas échéant, ceux du genre Rodhotorula, dans l'organisme.

L'invention a également pour objet, l'utilisation susmentionnée d'antifongiques tels que décrits ci-dessus, à des posologies permettant d'arrter la croissance desdits champignons dans l'organisme. Dans ce cas, la posologie utilisée dans le cadre de l'utilisation des antifongiques, et plus particulièrement de la Nystatine, est avantageusement d'environ 25.000 unités par semaine (en une ou plusieurs prises), chez les personnes de plus de 40 ans, pendant une durée de traitement illimitée.

L'invention a également pour objet les méthodes de traitement des pathologies susmentionnées, par administration aux patients susceptibles d'tre traités, des antifongiques susmentionnés, notamment aux doses indiquées ci-dessus, et pendant les durées susmentionnées.

Avantageusement, les antifongiques susmentionnés, sont utilisés, dans le cadre de la présente invention, pour la préparation de médicaments susceptibles d'tre administrés par voie orale, notamment sous forme de comprimés ou de suspensions buvables, ou par voie injectable.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en évidence de champignons tels que définis ci-dessus dans des biposies d'origine humaine.

1 Patients On a utilisé pour ces recherches des biopsies de vaisseaux effectuées à l'occasion d'opérations cardio-vasculaires pratiquées sur 69 patients, provenant de deux hôpitaux différents.

Les malades se répartissent de la façon suivante : 50 hommes et 19 femmes, âgés entre 32 et 81 ans.

Les matériaux recueillis lors des biopsies sont au nombre de 137, répartis selon leur genre entre : aorte 35 ; veine saphène 30 ; artère carotide 17 ; artère mammaire 39 ; artère pulmonaire, artère radiale, etc. 6.

4 patients ont subi 4 biopsies, 19 patients 3 biopsies, 13 patients 2 biopsies et 33 patients une seule biopsie.

2. Méthodologie Les matériaux biologiques ont été prélevés dans les meilleures conditions possibles de stérilité garanties par les hôpitaux lors d'opérations chirurgicales. En cours d'opération, les biopsies ont été placées dans des conteneurs stériles et transportées immédiatement au laboratoire. Au laboratoire, alors que les conditions de stérilité les plus strictes étaient respectées et l'air contrôlé, les matériaux biologiques ont été découpés en plus petits morceaux pour la suite du travail à effectuer et notamment la préparation de lames pour l'observation directe, 1ensemencement en milieu nutritif et la conservation en congélation pour des recherches ultérieures.

Pour les différents matériaux biologiques, un nombre maximal de tranches a été recherché afin d'augmenter le nombre de tranches ensemencées. Un contrôle de l'air a été effectué par la méthode de sédimentation sur un milieu nutritif solide dans le champ du travail et pendant toute la période du travail.

2. a. Matériaux biologiques préparés pour l'observation directe au microscope frottis Les frottis ont été préparés de la façon suivante : un petit morceau de matériau biologique a été placé entre deux lames. On laisse sécher et on fixe ensuite les lames en utilisant de la chaleur. A partir de chaque biopsie on prépare un frottis coloré Gram- Modification de Bôzuc : coloration au cristal-violet et au nitrate de carbone, lugol ; décoloration à l'acétone-alcool et obtention du contraste avec du safranine. Le frottis ainsi coloré s'observe au microscope à immersion sous objectif x 100. Un autre frottis est préparé pour l'observation sous fluorescence.

2. b. Ensemencement L'ensemencement microbiologique se fait sur un milieu nutritif solide de Sabouraud, tout en cherchant à obtenir un contact maximal du matériau biologique avec le milieu nutritif. Pour cela, on découpe le milieu solide et on ensemence le matériau biologique dans la découpe obtenue.

Le milieu nutritif contient : 10 g de Peptone Difco 20 g de Glucose Difco 15 g d'Agar Difco de l'eau distillée jusqu'à 1000 ml.

Le milieu est stérilisé pendant 10 minutes à 121° C.

Une fois 1'ensemencement effectué, on enroule les boîtes de Petri avec du sparadrap textile afin de diminuer les risques de contamination pendant le temps de culture.

La culture du matériau se fait à 28° C pendant 30 jours en effectuant des contrôles journaliers sans décoller le sparadrap des boîtes de Petri.

2. c. Repiquage des souches pures obtenues Lorsqu'on repère une pousse de la plaque vers le milieu, on procède, en respectant les conditions de stérilité évoquées ci-dessus, au repiquage de la souche obtenue et on prépare de nouveau un frottis à coloration Gram pour observer la souche au microscope.

2. d. Identification Pour identifier les souches fongiques obtenues, on utilise l'API 32C de Bio- Mérieux, dont on se sert pour les levures, ainsi que des méthodes d'observations macroscopiques et microscopiques utilisées pour l'identification morphologique d'autres types de mycelium.

Sur 137 biopsies, 535 matériaux ont été découpés et ensemencés primairement sur le milieu nutritif solide.

3. Résultats 3. a. Résultats au microscope Sur 137 biopsies, 115 frottis ont été réalisés pour l'observation directe lors du découpage primaire des morceaux biologiques en vue de leur ensemencement. On observe alors au microscope des levures et/ou des filaments sur 87 % des frottis.

3. b. Souches fongiques isolées Dans une grande partie des matériaux biologiques ensemencés et dans des périodes de temps variables, on observe des pousses de souches fongiques dont la majeure partie est une souche fongique filamenteuse de couleur blanchâtre et à mycélium substratique avec des filaments bien visibles dans le milieu nutritif. Ces filaments sortent directement du matériau biologique tout en faisant très visiblement des formes concentriques.

Le temps nécessaire à l'apparition bien nette d'une colonie fongique se situe entre le 4sème et le 20ème jour après l'ensemencement primaire, avec deux points culminants : le 6elle le 136"jour. Du 21 septembre au 6 octobre, sur 50 patients, 21 ont eu des biopsies avec des résultats positifs (développement de la souche) soit 42 %. Il est intéressant de remarquer que le pourcentage de développement de la souche est de 75 % pour les patients qui ont eu 4 biopsies, de 70 % pour ceux qui ont eu 3 biopsies et que ce pourcentage descend à 29-26 % pour ceux qui ont eu 2 et 1 biopsies. Par biopsie, le pourcentage de résultats positifs est de 28 %.

Le deuxième type de souches fongiques trouvé en fonction de son taux de présence dans les matériaux biologiques est la Rhodotorula (Rubra, Glutinis). Il pousse directement du matériau biologique tout en rentrant dans le milieu. L'identification de cette souche a été effectuée par l'API 32C et il s'est avéré qu'il s'agit de la Rhodotorula Rubra et de la Rhodotorula Glutinis. Les cas de Rhodotorula se répartissent de façon égale entre les patients des deux hôpitaux. La Rhodotorula pousse plus rapidement, entre 3 et 7 jours à partir de 1'ensemencement. Dans la majorité des cas, elle pousse à partir de la biopsie d'un patient, là où plus tard poussera aussi la souche filamenteuse blanchâtre, et représente 12 % des patients.

La troisième souche fongique en fonction de son taux de présence dans les biopsies s'est avérée tre Candida Lipolitica (sur 2 patients). Dans tous les cas, elle a été isolée à côté de la souche fongique filamenteuse blanchâtre.

Pendant le temps des recherches, sur 3 des 535 ensemencements effectués, on a vu pousser des souches d'un genre différent qui, en fonction de l'endroit où elles avaient poussé dans les boîtes de Petri, ont été jugées comme des contaminants car elles n'avaient pas de relation directe avec le matériau biologique.

Dans aucune des boîtes de Petri avec un milieu nutritif et contrôle de l'air, on n'a pu trouver des levures ou des contaminants.