Hamburg

Beschreibung

Verwendung von 4-(4-Hydroxyphenyl)-2-Butanon als demethylierendes Agens

Die vorliegende Erfindung betrifft kosmetische bzw. dermatologische Zubereitungen, enthaltend Wirkstoffe zur Pflege und zum Schutze der Haut, insbesondere der empfindlichen Haut wie auch ganz besonders im Vordergrunde stehend der durch intrinsische und/oder extrinsische Faktoren gealterten oder alternden Haut sowie die Verwendung solcher Wirkstoffe und Kombinationen solcher Wirkstoffe auf dem Gebiete der kosmetischen und dermatologischen Hautpflege.

Unter kosmetischer Hautpflege ist in erster Linie zu verstehen, daß die natürliche Funktion der Haut als Barriere gegen Umwelteinflüsse (z.B. Schmutz, Chemikalien, Mikroorganismen) und gegen den Verlust von körpereigenen Stoffen (z.B. Wasser, natürliche Fette, Elektrolyte) gestärkt oder wiederhergestellt wird.

Wird diese Funktion gestört, kann es zu verstärkter Resorption toxischer oder allergener Stoffe oder zum Befall von Mikroorganismen und als Folge zu toxischen oder allergischen Hautreaktionen kommen.

Ziel der Hautpflege ist es ferner, den durch tägliches Waschen verursachten Fett- und Wasserverlust der Haut auszugleichen. Dies ist gerade dann wichtig, wenn das natürliche Regenerationsvermögen nicht ausreicht. Außerdem sollen Hautpflegeprodukte vor Umwelteinflüssen, insbesondere vor Sonne und Wind, schützen und die Hautalterung verzögern.

Die chronologische Hautalterung wird z.B. durch endogene, genetisch determinierte Faktoren verursacht. In Epidermis und Dermis kommt es alterungsbedingt z.B. zu folgenden Strukturschäden und Funktionsstörungen, die auch unter den Begriff„Senile Xerosis" fallen können: a) Trockenheit, Rauhigkeit und Ausbildung von Trockenheitsfältchen, b) Juckreiz und

c) verminderte Rückfettung durch Talgdrüsen (z.B. nach Waschen).

Exogene Faktoren, wie UV-Licht und chemische Noxen, können kumulativ wirksam sein und z.B. die endogenen Alterungsprozesse beschleunigen bzw. sie ergänzen. In Epidermis und Dermis kommt es insbesondere durch exogene Faktoren z.B. zu folgenden Strukturschäden- und Funktionsstörungen in der Haut, die über Maß und Qualität der Schäden bei chronologischer Alterung hinausgehen: d) Sichtbare Gefäßerweiterungen (Teleangiektasien, Cuperosis);

e) Schlaffheit und Ausbildung von Falten;

f) lokale Hyper-, Hypo- und Fehlpigmentierungen (z.B. Altersflecken) und

g) vergrößerte Anfälligkeit gegenüber mechanischem Stress (z.B. Rissigkeit).

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Produkte zur Pflege der auf natürliche Weise gealterten Haut, sowie zur Behandlung der Folgeschäden der Lichtalterung, insbesondere der unter a) bis g) aufgeführten Phänomene.

Produkte zur Pflege gealterter Haut sind an sich bekannt. Sie enthalten z.B. Retinoide (Vitamin A-Säure und/oder deren Derivate) bzw. Vitamin A und/oder dessen Derivate. Ihre Wirkung auf die Strukturschäden ist allerdings umfangsmäßig begrenzt. Darüber hinaus gibt es bei der Produktentwicklung erhebliche Schwierigkeiten, die Wirkstoffe in ausreichendem Maße gegen oxidativen Zerfall zu stabilisieren. Die Verwendung Vitamin A-Säure-haltiger Produkte bedingt darüber hinaus oft starke erythematöse Hautreizungen. Retinoide sind daher nur in geringen Konzentrationen einsetzbar.

Die Epigenetik ist ein noch relativ junges Forschungsfeld im Life Science Bereich, das in den letzten Jahren eine große Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Dies ist nicht weiter verwunderlich, denn die Epigenetik untersucht, wie sich Umweltfaktoren auf unseren Körper auswirken. Dabei geht es weniger darum, die oben beschriebenen morphologischen Veränderungen weiter deskriptiv zu analysieren, sondern vielmehr darum, die zugrundeliegenden molekularbiologischen Regulationsmechanismen zu verstehen. Im Gegensatz zur klassischen Genetik beschäftigt sich die Epigenetik nicht mit Veränderungen der Primärsequenz der DNA, sondern mit den Mechanismen der Genregulation. Dabei fungiert die Epigenetik als Bindeglied zwischen Umwelt und Genom.

Eine der am besten beschriebenen Komponenten der Epigenetik ist die sogenannte DNA- Methylierung. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine Modifizierung der DNA, welche in Säugetieren in der Regel symmetrisch auf beiden DNA-Strängen an der C5 Position von Cytosinnukleotiden stattfindet, wenn sich diese in 5 ^' -Richtung neben Guanosinnukleotiden befinden (CpG) [Bird, 202]. Das hohe Mutationspotenzial der methylierten Cytosinnukleotide führt dazu, dass der Anteil der CpG-Dinukleotide bezogen auf das gesamte Genom sehr gering ist. Die hydrolytische Deaminierung des methylierten Cytosins führt spontan zu der Entstehung von Thymin, wobei es zu einer TG- Fehlbasenpaarung kommt. Im Vergleich dazu findet die Deaminierung eines unmethylierten Cytosins zu Uracil wesentlich langsamer statt und die Reparatur der entstehenden UG- Fehlbasenpaarung ist wesentlich effizienter, da es sich bei Uracil nicht um eine natürlich vorkommende Base der DNA handelt [Coulondre et a., 1978; Jurkowska et al., 2010]. Trotz der hohen Mutationsrate gibt es einige CG-reiche DNA Abschnitte im Genom, die als CpG- Inseln bezeichnet werden. Diese kurzen DNA-Abschnitte werden definiert als 0,5-4 kb lange Regionen, deren Verhältnis von tatsächlichem zu erwartetem CG-Gehalt größer als 0,65 ist [Takai and Jones, 2002]. Ca. 70% aller Promotoren des humanen Genoms werden mit solchen CpG-lnseln in Verbindung gebracht [Saxonov et al., 2006]. Dort liegen sie in der Regel unmethyliert vor, was mit der transkriptioneilen Expression des korrespondierenden Gens korreliert. Es sind jedoch auch einige biologische Prozesse bekannt, bei denen die Methylierung einer CpG-lnsel zu der Stilllegung spezifischer Gene führt. Beispiele hierfür sind die Inaktivierung des X-Chromosoms sowie Keimbahn- und gewebespezifischer Gene [Bird, 2002, Avner and Heard, 2001 , Bird, 1986]. Dies verdeutlicht die fundamentale Rolle der DNA-Methylierung für die Regulation der Genexpression. Weitaus häufiger lässt sich jedoch die Methylierung in promotorfernen Bereichen, wie z.B. in repetitiven Sequenzen oder in parasitären Sequenzen, finden, wo die Methylierung die Transkription dieser Sequenzen verhindert und somit zur Integrität des Genoms beiträgt [Yoder et al., 1997, Walsh et al., 1998]. Insgesamt weisen ca. 3-5% der Cytosine in der genomischen DNA eine Methylierung auf, was letztlich bedeutet, dass ca. 80% der gesamten CpG-Loci des Genoms methyliert sind [Ehrlich et al., 1982, Gama-Sosa et al., 1983].

Im Vergleich zu der DNA-Methylierung in gesunden Zellen konnte eine Vielzahl von Studienergebnissen belegen, dass das DNA-Methylierungsmuster in entarteten Krebszellen häufig verändert vorliegt. So wurde im Krebsgewebe vermehrt eine globale Methylierungsabnahme des Genoms festgestellt (Hypomethylierung), die vor allem durch eine Verminderung des Methylierungslevels in repetitiven Elementen entsteht [Ehrlich, 2002]. Diese Hypomethylierung kann die Reaktivierung dieser transponierenden Elemente verursachen [Yoder et al., 1997, Wash et al., 1998] und wirkt sich somit negativ auf die genomische Integrität aus [Gaudet, 2003]. Parallel zu der globalen Hypomethylierung konnte ebenso eine Hypermethylierung von CpG-lnseln beobachtet werden, die mit dem Promotorbereich von Genen assoziiert sind [Herman and Baylin, 2000, Jones and Baylin, 2007]. Diese Hypermethylierung geht häufig mit der transkriptioneilen Inaktivierung des Gens einher. Da unter anderem Tumorsuppressorgene von dieser Hypermethylierung betroffen sind, kommt es zu einer Fehlregulation wichtiger zellulärer Mechanismen. Um solche epigenetischen Veränderungen von klassischen genetischen Mutationen zu unterschieden, werden sie als„Epimutationen" bezeichnet [Jeggo and Holliday, 1986].

Auch über die Krebsforschung hinaus wurde In den vergangenen Jahren immer klarer, dass die Epigenetik für die Entwicklung eines gesunden Organismus ebenso wichtig ist, wie die DNA selbst. Deutlich wurde bei den wissenschaftlichen Untersuchungen auch, dass das Epigenom - die Gesamtheit aller epigenetischen Modifikationen - durch äußere Einflüsse viel leichter verändert werden kann als die Gene selbst. Epigenetisch wirksame Moleküle treten dabei als die Mittler zwischen Umwelt und Erbgut in Aktion. Es konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass äußere Faktoren Gene an- oder abschalten können und so phänotypische Veränderungen und/oder Krankheiten auslösen (Jaenisch & Bird, 2003, Bird et al. 2007; Reik, 2007; Feinberg, 2008). Neue Studien konnten außerdem zeigen, dass epigenetische Veränderungen - insbesondere des DNA-Methylierungsmusters - auch während der Alterung auftreten (Fraga et al. 2005; Esteller et al. 2012; Winnefeld & Lyko 2012).

Kürzlich konnte zudem gezeigt werden, dass epigenetische Veränderungen (Hypermethylierungen) auch während der Hautalterung zu beobachten sind (Grönniger et al., 2010), was zu einer "Stilllegung" von hautrelevanten Genen führt.

Um eine Verbesserung des Hautzustandes zu erreichen, ist es daher wünschenswert epigenetische Veränderungen - die entweder im Alter oder bei bestimmten Hautzuständen auftreten - rückgängig zu machen, um so die hautrelevanten Gene zu reaktivieren.

Bis dato ist allerdings nur eine begrenzte Anzahl an Substanzen bekannt, die eine DNA- demethylierende Aktivität besitzen.

In diesem Zusammenhang zeigte überraschenderweise die Substanz "Himbeerketon"(4-(4- Hydroxyphenyl)-2-Butanon) eine demethylierende Wirkung wodurch CpG-Dinukleotide in der DNA von Sec31 B hypomethyliert wurden (gezeigt im COBRA Assay). Darüber hinaus konnte durch den Einsatz von Himbeerketon eine Expressionssteigerung von altersabhängig hypermethylierten Genen erreicht werden (gezeigt für die Gene Tet2, DDAH2, Sec31 B).

Himbeerketon (auch Rheosmin, Oxyphenylon oder Frambinon genannt, nach IUPAC 4-(4- Hydroxyphenyl)-butan-2-on) ist ein natürlich in der Himbeere vorkommendes Phenol, das den wesentlichen Geruchseindruck der Beere ausmacht (eine sogenannte „character- impact-Verbindung").

Seine chemische Struktur ist wie folgt gekennzeichnet:

Die Verwendung von Himbeerketon zur Aromatisierung von Lebensmitteln und vereinzelt auch Kosmetika ist an sich bekannt. Auch wurde seine Verwendung als Hautaufheller („whitening agent") beschrieben.

Dennoch konnte dies nicht den Weg zur vorliegenden Erfindung weisen.

Die Lösung der Aufgaben, die der Erfindung zugrunde lagen, besteht folglich in der Verwendung von Himbeerketon als demethylierendes Agens.

Vorteilhaft wird diese Verwendung in topischen Zubereitungen, insbesondere kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen verwirklicht.

Bevorzugt enthalten kosmetische oder dermatologische Zubereitungen gemäß der Erfindung 0,001 - 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,01 - 1 Gew -% Himbeerketon, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung der Zubereitungen.

Emulsionen sind vorteilhafte Darreichungsformen im Sinne der vorliegenden Erfindung, z.B. in Form einer Creme, einer Lotion, einer kosmetischen Milch sind vorteilhaft und enthalten z.B. Fette, Öle, Wachse und/oder andere Fettkörper, sowie Wasser und einen oder mehrere Emulgatoren, wie sie üblicherweise für einen solchen Typ der Formulierung verwendet werden.

Medizinische topische Zusammensetzungen im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten in der Regel ein oder mehrere Medikamente in wirksamer Konzentration. Der Einfachheit halber wird zur sauberen Unterscheidung zwischen kosmetischer und medizinischer

Anwendung und entsprechenden Produkten auf die gesetzlichen Bestimmungen der Bundesrepublik Deutschland verwiesen (z.B. Kosmetikverordnung, Lebensmittel- und Arzneimittelgesetz).

Es ist dabei ebenfalls von Vorteil, den erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoff als Zusatzstoff zu Zubereitungen zu geben, die bereits andere Wirkstoffe für andere Zwecke enthalten.

Sofern die kosmetische oder dermatologische Zubereitung im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Lösung oder Emulsion oder Dispersion darstellt, können als Lösungsmittel verwendet werden:

Wasser oder wäßrige Lösungen

Öle, wie Triglyceride der Caprin- oder der Caprylsäure, vorzugsweise aber Rizinusöl; Fette, Wachse und andere natürliche und synthetische Fettkörper, vorzugsweise Ester von Fettsäuren mit Alkoholen niedriger C-Zahl, z.B. mit Isopropanol,

Propylenglykol oder Glycerin, oder Ester von Fettalkoholen mit Alkansäuren niedriger C-Zahl oder mit Fettsäuren;

Alkohole, Diole oder Polyole niedriger C-Zahl, sowie deren Ether, vorzugsweise Ethanol, Isopropanol, Propylenglykol, Glycerin, Ethylenglykol, Ethylenglykol- monoethyl- oder -monobutylether, Propylenglykolmonomethyl, -monoethyl- oder - monobutylether, Diethylenglykolmonomethyl- oder -monoethylether und analoge Produkte.

Insbesondere werden Gemische der vorstehend genannten Lösungsmittel verwendet. Bei alkoholischen Lösungsmitteln kann Wasser ein weiterer Bestandteil sein.

Die Ölphase der Emulsionen, Oleogele bzw. Hydrodispersionen oder Lipodispersionen im Sinne der vorliegenden Erfindung wird vorteilhaft gewählt aus der Gruppe der Ester aus gesättigten und/oder ungesättigten, verzweigten und/oder unverzweigten Alkancarbonsäuren einer Kettenlänge von 3 bis 30 C-Atomen und gesättigten und/oder ungesättigten, verzweigten und/oder unverzweigten Alkoholen einer Kettenlänge von 3 bis 30 C-Atomen, aus der Gruppe der Ester aus aromatischen Carbonsäuren und gesättigten und/oder ungesättigten, verzweigten und/oder unverzweigten Alkoholen einer Kettenlänge von 3 bis 30 C-Atomen. Solche Esteröle können dann vorteilhaft gewählt werden aus der Gruppe Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Isopropylstearat, Isopropyloleat, n-Butylstearat, n-Hexyllaurat, n- Decyloleat, Isooctylstearat, Isononylstearat, Isononylisononanoat, 2-Ethylhexylpalmitat, 2- Ethylhexyllaurat, 2-Hexyldecylstearat, 2-Octyldodecylpalmitat, Oleyloleat, Oleylerucat, Eru- cyloleat, Erucylerucat sowie synthetische, halbsynthetische und natürliche Gemische solcher Ester, z.B. Jojobaöl.

Ferner kann die Ölphase vorteilhaft gewählt werden aus der Gruppe der verzweigten und unverzweigten Kohlenwasserstoffe und -wachse, der Silkonöle, der Dialkylether, der Gruppe der gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten Alkohole, sowie der Fettsäuretriglyceride, namentlich der Triglycerinester gesättigter und/oder ungesättigter, verzweigter und/oder unverzweigter Alkancarbonsäuren einer Kettenlänge von 8 bis 24, insbesondere 12 - 18 C-Atomen. Die Fettsäuretriglyceride können beispielsweise vorteilhaft gewählt werden aus der Gruppe der synthetischen, halbsynthetischen und natürlichen Öle, z.B. Olivenöl, Sonnenblumenöl, Sojaöl, Erdnußöl, Rapsöl, Mandelöl, Palmöl, Kokosöl, Palmkernöl und dergleichen mehr.

Auch beliebige Abmischungen solcher Öl- und Wachskomponenten sind vorteilhaft im

Die wäßrige Phase der erfindungsgemäßen Zubereitungen enthält gegebenenfalls vorteilhaft Alkohole, Diole oder Polyole niedriger C-Zahl, sowie deren Ether, vorzugsweise Ethanol, Isopropanol, Propylenglykol, Glycerin, Ethylenglykol, Ethylenglykolmonoethyl- oder -monobutylether, Propylenglykolmonomethyl, -monoethyl- oder -monobutylether, Diethylenglykolmonomethyl- oder -monoethylether und analoge Produkte, ferner Alkohole niedriger C-Zahl, z.B. Ethanol, Isopropanol, 1 ,2-Propandiol, Glycerin sowie insbesondere ein oder mehrere Verdickungsmittel, welches oder welche vorteilhaft gewählt werden können aus der Gruppe Siliciumdioxid, Aluminiumsilikate, Polysaccharide bzw. deren Derivate, z.B. Hyaluronsäure, Xanthangummi, Hydroxypro- pylmethylcellulose, besonders vorteilhaft aus der Gruppe der Polyacrylate, bevorzugt ein Polyacrylat aus der Gruppe der sogenannten Carbopole, beispielsweise Carbo- pole der Typen 980, 981 , 1382, 2984, 5984, jeweils einzeln oder in Kombination.

Erfindungsgemäß verwendete Gele enthalten üblicherweise Alkohole niedriger C-Zahl, z.B. Ethanol, Isopropanol, 1 ,2-Propandiol, Glycerin und Wasser bzw. ein vorstehend genanntes Öl in Gegenwart eines Verdickungsmittels, das bei ölig-alkoholischen Gelen vorzugsweise Siliciumdioxid oder ein Aluminiumsilikat, bei wäßrig-alkoholischen oder alkoholischen Gelen vorzugweise ein Polyacrylat ist.

Feste Stifte enthalten z.B. natürliche oder synthetische Wachse, Fettalkohole oder Fettsäureester.

Übliche Grundstoffe, welche für die Verwendung als kosmetische Stifte im Sinne der vor- liegenden Erfindung geeignet sind, sind flüssige Öle (z.B. Paraffinöle, Ricinusöl, Isopropyl- myristat), halbfeste Bestandteile (z.B. Vaseline, Lanolin), feste Bestandteile (z.B.

Bienenwachs, Ceresin und Mikrokristalline Wachse bzw. Ozokerit) sowie hochschmelzende Wachse (z.B. Carnaubawachs, Candelillawachs)

Als Treibmittel für aus Aerosolbehältern versprühbare kosmetische und/oder dermatologische Zubereitungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die üblichen bekannten leichtflüchtigen, verflüssigten Treibmittel, beispielsweise Kohlenwasserstoffe (Propan, Butan, Isobutan) geeignet, die allein oder in Mischung miteinander eingesetzt werden können. Auch Druckluft ist vorteilhaft zu verwenden.

Die erfindungsgemäße Wirkung des Himbeerketons wird nachfolgende demonstriert:

1 . Kultivierung und Wirkstoffbehandlungen der HaCaT Zellen

Um die Zellen einer demethylierenden Behandlung zu unterziehen, wurden 100.000 Zellen in eine 25T-Flasche ausgesät. Am Folgetag wurden sie mit dPBS gewaschen und Himbeerketon (Konz. 100 μΜ) dem Kultivierungsmedium (KGM-Gold) zugesetzt. Als Kontrollen wurden Decitabin- (Konz. 1 μΜ, 5 μΜ) bzw. DMSO-behandelte Zellen mitgeführt. 6 Tage nach der Aussaat der Zellen wurden sie passagiert und eine Auffrischung des Mediums inkl. des Himbeerketons bzw. des Decitabins vorgenommen. Nach einer 10- tägigen Behandlung wurden die DNA und die RNA isoliert.

2. Isolierung der genomischen DNA aus HaCaT Zellen

Zur Isolierung der genomischen DNA aus kultivierten Zellen wurde das QIAamp® DNA Investigator Kit von Qiagen verwendet und nach dem Protokoll„Isolation of total DNA from Tissue" vorgegangen. Nach Zentrifugation der Zellen wurde das Zellpellet in 180 μΙ_ ATL- Puffer und 20 μΙ_ Proteinase K aufgenommen und die Zellen bei 56°C für 10 min lysiert. Alle weiteren Schritte erfolgten gemäß dem Protokoll. Nach der Aufarbeitung über die QIAamp MiniElute-Säulen wurde die DNA in 25 μΙ_ Tris-EDTA-Buffer, pH 8,0 eluiert. Im Anschluss wurde die DNA-Konzentration bestimmt.

3. Bisulfit-Konvertierung der DNA

Für die Bisulfit-Behandlung wurden maximal 1000 ng DNA eingesetzt. Das Kit EpiTect® Bisulfite Kit von Qiagen wurde nach den Herstellerangaben verwendet. Je 500 ng der Bisulfit-konvertierten DNA wurden mit 2x 10 μΙ_ Elutionspuffer von den Säulen eluiert. Folgende Cyclereinstellungen wurden gewählt: Denaturierung 99 °C 5 min

Inkubation 60 °C 25 min

Denaturierung 99 °C 5 min

Inkubation 60 °C 1 h 25 min

Denaturierung 99 °C 5 min

Inkubation 60 °C 4 h 55 min

4. COBRA

Bei der COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) handelt es sich um eine Methode, mit der der Methylierungszustand einzelner CpG-Dinukleotide eines Genabschnitts untersucht werden kann. Zunächst wird dabei auf Basis der Bisulfit-konvertierten DNA eine PCR zur Amplifikation der zu untersuchenden Gensequenz durchgeführt.

Die Primer wurden mit Hilfe der im Internet verfügbaren Software MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/index1 .html) so gestaltet, dass die Primersequenzen in der Regel 4 Cytosinnukleotide der originalen DNA abdeckten, die nicht in einem CpG- Kontext standen (verwendete Primer:Sec31 B_forward GTTTG G GGTTTTTG GTAGTAG AG A, Sec31 B_revers CAACAATAAACAAAAAAACCCTCAT).

Das PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese auf die erwartungsgemäße Bandenhöhe hin überprüft. Nach Aufreinigung des amplifizierten DNA-Fragmentes aus dem Gel wurde ein Restriktionsverdau mit einer Endonuklease (HpyCH4IV (R0619L)) durchgeführt, deren Schnittstelle mindestens ein CpG-Dinukleotid beinhaltete. Dieses blieb nach der Bisulfit-Behandlung der DNA nur erhalten, wenn es in der Originalsequenz methyliert vorlag.

Eine Auftrennung der verdauten DNA im Agarosegel ermöglichte eine Visualisierung der jeweils entstandenen Fragmente. Ein Vergleich der Bandenintensitäten der verdauten (in der Originalsequenz methyliert vorliegendes CpG) und der unverdauten Fragmente (in der Originalsequenz unmethyliert vorliegendes CpG) gab Aufschluss über den Methylierungszustand der untersuchten Gensequenz.

5. Isolierung von RNA aus HaCaT Zellen

Zur Isolierung der RNA aus kultivierten Zellen wurde das RNeasy® Mini Kit von Qiagen nach Herstellerangaben verwendet. Für den Homogenisierungsschritt wurden die QIAshredder Säulen verwendet. Das Eluierungsvolumen wurde je nach eingesetzter Zellzahl angepasst. Die Konzentration der RNA wurde mittels Nanodrop bestimmt. 6. Reverse Transkription

Die isolierte RNA wurde mit Hilfe des High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits von Applied Biosystems in cDNA umgeschrieben. Es wurden maximal 1000 ng RNA in die Reaktion eingesetzt.

7. Real-time PCR (qRT-PCR)

Zur Quantifizierung der relativen Expressionslevel der Gene DDAH2, Sec31 B und Tet2 wurden TaqMan Low Density Arrays von Applied Biosystems (Darmstadt) durchgeführt. Der PCR-Ansatz wurde nach folgendem Schema zusammen pipettiert: je Ansatz wurden 50 L TaqMan Gene Expression Master Mix in ein 1 ,5 mL Eppendorfgefäß pipettiert. Anschließend wurden 500 ng cDNA je Ansatz und Wasser (ges. 50 μί) zugefügt - unter der Annahme, dass die Menge an RNA, die in die cDNA Synthese eingesetzt wurde, komplett umgeschrieben wurde. Die Lösungen (100 μΙ) wurden dann in die Reservoire der LDA- Platten überführt. Die anschließende Zentrifugation der LDA-Platten (1200 rpm für 2 x 1 min) mit der Multifuge 3 S-R von Heraeus (Düsseldorf) verteilte letztendlich die cDNA-Proben in die einzelnen Wells. Mit einem Versiegeier wurden die Wells voneinander isoliert. Die PCR wurde mit dem 7900 HT Fast Real-time PCR System von Applied Biosystems durchgeführt:

Als Ladekontrolle erfolgte zunächst eine Normierung der Ct- Werte der einzelnen Proben auf ein housekeeping Gen (GAPDH):

ACt = Ct(Zielsequenz) - Ct(housekeeping Gen) Formel 1

Zur Berechnung der relativen Zykluszahl bezogen auf die Referenz (unbehandelte Probe) wurde folgende Gleichung herangezogen:

AACt = ACt(Referenz) - ACt(Probe) Formel 2

Unter der Annahme einer 100%igen Amplifikationseffizienz berechnet sich die relative Quantität folgendermaßen:

relative Quantität = 2AACt Formel 3

Iog10(relative Quantität) wurde hier für die graphische Darstellung gewählt. verwendete Taqman-Assays:

Name Assay ID Accession number

GAPDH HS99999905 m1 NM 002046

Tet2 HS00289469_m1 NM_001 127208

DDAH2 HS00203889_m1 NM_013974

Sec31 B Hs00248868_m1 NM_015490 Ergebnisse:

Um zu zeigen, dass eine DNA-Demethylierung in den verwendeten Zellen möglich ist, wurden sie mit dem DNMT-Inhibitor 5-Aza-2 ^' -Deoxycytidin (Decitabin) behandelt. Für Decitabin ist in vielen Zellkultursystemen eine inhibitorische Wirkung der DNA- Methyltransferasen und eine damit einhergehende Demethylierung beschrieben, was u.a. zu einer Reaktivierung von hypermethylierten und somit stillgelegten Genen führt. [Bachman et al., 1999, Paz et al., 2003]. Aus diesem Grund wurde Decitabin in diesen Versuchen als Positivstandard für eine demethylierende Behandlung der Keratinozytenzelllinie verwendet. Im direkten Vergleich zu Decitabin ist auch bei Himbeerketon eine demethylierende Aktivität zu beobachten. Die COBRA-Ergebnisse zeigten eindeutig eine verminderte Bandenintensität der verdauten PCR-Fragmente (M=methyliert) des beispielhaft untersuchten Gens Sec31 B, in den Himbeerketon-behandelten Zellen (100 μΜ Himbeerketon) im Vergleich zu den DMSO-Kontrollzellen (siehe Abbildung 1 ).

Darüber hinaus konnte eine „Reaktivierung" von im alter hypermethylierten Genen (Grönniger et al., 2010) sowohl in Gegenwart von Decitabin als auch in Gegenwart von Himbeerketon gemessen werden (Abb. 2). Die drei ausgewählten Gene (Sec31 B, Tet2 und DDAH2) zeigten dabei eine Steigerung der transkriptioneilen Genexpression. Bei Sec31 B wurde sogar eine deutlichere„Reaktivierung" in Gegenwart von Himbeerketon im Vergleich zum Positivstandard Decitabin beobachtet.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass durch die demethylierende Wirkung von Himbeerketon eine Reaktivierung der transkriptioneilen Genaktivität bei den exemplarisch ausgewählten Genen erreicht werden kann.

Das nachfolgenden Beispiel soll die vorliegende Erfindung verdeutlichen. O/W-Emulsion

Anteil (%)

Cetearylglucosid 1.5

Cetearylalkohol 5.0

Caprylic/Capric Triglycerid 3.0

Dicaprylylcarbonat 4.0

C12-15 Alkylbenzoat 3.0

Cyclomethicon 2.0

Propylenglycol 5.0

Panthenol 1.0

Natrium Hydroxid q.s.

4-(4-Hydroxyphenyl)-2-Butanon 0.1

Wasser Ad 100