Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein einen oder mehrere ABC-Transporter hemmendes cis-Imidazolin, insbesondere Nutlin, in Kombination mit mindestens einem oder mehreren Zytostatika, wobei das Zytostatikum durch den ABC-Transporter vermittelt aus einer Krebselle transportiert werden kann und deren Verwendung bei der Krebsbehandlung sowie verwandte Aspekte.

Beschreibung

Das Protein p53, oft als der „Wächter des Genoms" bezeichnet, ist ein Transkriptionsfaktor, der in Antwort auf zellulären Stress (niedriger Sauerstoffspiegel, Hitzeschock, DNA Beschädigung, usw.) aktiviert wird und so wirkt, um eine weitere Proliferation der gestressten Zelle durch Unterstützung des Anhalten des Zellzyklus oder Apoptose zu verhindern (El-Deiry, W.S. The p53 pathway und Cancer therapy. Cancer Journal 11 229-236 (1998); Lane, D.P., Hupp, T.R. Drug discovery und p53. Drug Discovery Today 8 (8) 347-355 (2003)). Seine Rolle als ein Tumorsuppressor wird durch die Beobachtung deutlich, dass ungefähr 50% der menschlichen Tumore mutiertes oder nicht-funktionelles p53 aufweisen. MDM2, ein negativer Schlüsselregulator von p53, der in vielen menschlichen Tumoren überexprimiert wird, funktioniert durch Bindung an und Einbringen von p53 in den proteasomalen Abbau. Nutlin-3 inhibiert die p53-MDM2 Interaktion mit eine IC ₅₀ von 0,09 μM. Es induziert die Expression von p53-regulierten Genen und zeigt potente antiproliferative Aktivität in Zellen mit funktionellem p53, jedoch nicht in Zellen mit mutiertem p53. Nutlin-3 inhibiert auch das Wachstum von menschlichen Tumor-Xenografts in Nacktmäusen um 90% bei einer Dosis von 200 mg/kg (Vassilev, L.T., Vu, B.T., Graves, B., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science 303 844-848 (2004)). Somit reguliert Murine double minute 2 (MDM2) die Aktivität des Tumorsuppressorproteins p53 negativ.

Nutlin-3 ist ein MDM2 Inhibitor, der als nicht-genotoxischer Aktivator des p53-Signalwegs für die Krebstherapie präklinisch erforscht wird (Vassilev, 2007) und der auch anti- angiogenetische Effekte bewirkt (Secchiero et al., 2007a).

Obwohl die anti-Krebs Aktivität von Nutlin-3 anfänglich auf Zellen beschränkt schien, die Wildtyp p53 enthalten (Vassilev, 2007), ergaben kürzliche Ergebnisse, dass Nutlin-3 auch die Cytotoxizität von Cisplatin, Carboplatin oder Doxorubicin in p53-negativen und p53- Mutanten menschlichen Tumorzellen erhöht. Der Mechanismus schließt die Inhibierung der E2F1 Bindung an MDM2 und umgekehrt die Induktion der transkriptionellen Aktivierung von freiem E2F1 ein (Ambrosini et al., 2007). Darüber hinaus fördert Nutlin-3 die Reifung von p53-negativen Zellen akuter myeloider Leukämie über die Induktion von E2F1 (Secchie- ro, 2007b).

Von Nutlin-3 wurde bereits gezeigt, das es Apoptose und/oder neuronale Differenzierung in p53 Wildtyp Neuroblastomzellen induziert (van Maerken et al., 2006). Darüber hinaus erhöhte Nutlin-3 die Sensitivität von Neuroblastom gegenüber der Chemotherapie-induzierten A- poptose (Barbieri et al., 2006). Das Neuroblastom ist der häufigste extracraniale solide Tumor während der Kindheit. Ungefähr die Hälfte aller Fälle tragen ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten der Erkrankung, mit Gesamt-Überlebensraten von weniger als 40% trotz intensiver multimodaler Therapie (Maris et al., 2007).

Die Chemotherapie-Resistenz spielt eine signifikante Rolle in Neuroblastom-Patienten mit schlechter Prognose, und neue Therapieoptionen werden dringend benötigt. Das Rhabdomyosarkom ist das häufigste Sarkom in Kindern. Alveolare Rhabdomyosarkome sind durch einen schlechten Ausgang charakterisiert. Das gesamte fünf- Jahre Überleben von Patienten mit metastatischem Rhabdomyosarkom liegt bei lediglich 27 %, und neue Behandlungsstrategien sind erforderlich (Breitfeld und Meyer, 2005). Umfangreiche Untersuchungen sind durchgeführt worden, mit dem Ziel die Entwicklung der MDR in der Tumortherapie zu verhindern. Dabei wurden zahlreiche Inhibitoren der wichtigsten ABC-Transporter entwickelt. Die parallele Gabe von Inhibitoren führte jedoch meistens zu einer erhöhten allgemeinen Toxizität der Zytostatika, da ABC-Transporter wichtige physiologische Bestandteile von Blut- Gewebeschranken sind. So konnten erhöhte ZNS- Nebenwirkungen von Tumortherapeutika mit der Inhibition von an der Blut- Hirnschranke exprimiertem P-gp in Verbindung gebracht werden (Tanigawara Y. RoIe of P-glycoprotein in drug disposition. Ther Drug Monit. 2000 Feb; 22 (1): 137-40). Dadurch sind Dosislimitierun- gen der Zytostatika notwendig geworden, die für die Tumorsuppression nicht vorteilhaft waren. Neuere Untersuchungen ergaben jedoch hochspezifische Inhibitoren mit hoher Affinität zu ABCBl, die kaum zu unerwünschten Reaktionen führten oder das Zytostatika-Schema beeinflussten.

Cheok et al. (in Cheok CF, Dey A, Lane DP. Cyclin-dependent kinase inhibitors sensitize rumor cells to nutlin-induced apoptosis: a potent drug combination. Mol Cancer Res. 2007 Nov; 5 (11): 1133-45) zeigen eine Strategie zur nicht-genotoxischen Aktivierung von p53 in Krebs mit Wildtyp p53. Dabei werden Cyclin-abhängige Kinase (CDK) Inhibitoren (z.B. Roscovitin und DRB) in Kombination mit einem „small molecule" Inhibitor der MDM2 Interaktion (nutlin-3a) untersucht. Die Wirkstoffkombination ist dabei additiv bei der Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen und synergistisch bei Apoptose.

US 7,358,335 beschreibt ARF-BPl als Mediator der p53-abhängigen und unabhängigen Tumorsuppression und dessen Verwendung. Die Inaktivierung von ARF-BPl in den Tumorzellen mit Wildtyp p53 führt zu einer p53 Stabilisierung und aktiviert p53 -vermittelte Apoptose.

Mack et al. (in Mack JT, Brown CB, Tew KD. ABCA2 as a therapeutic target in Cancer and nervous System disorders. Expert Opin Ther Targets. 2008 Apr;12(4):491-504.) beschreiben den ABCA2 Transporter als Target für die Entwicklung von anti-Krebs Wirkstoffen.

Trotz der oben genannten Verbesserungen im Rahmen der Behandlung von p53 -abhängigen und unabhängigen Tumoren bleibt die Behandlung von chemoresistenten Krebserkrankungen problematisch. Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Behandlung solcher Krebserkrankungen zu verbessern. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das zur Verfügung stellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, wobei diese mindestens ein einen oder mehrere ABC- Transporter hemmendes cis-Imidazolin in Kombination mit mindestens einem oder mehreren Zytostatika, wobei das Zytostatikum durch den ABC-Transporter vermittelt aus einer Krebselle transportiert werden kann, umfasst.

US 2005-0288287 beschreibt entsprechende chirale cis-Imidazoline und pharmazeutisch akzeptable Salze und Ester davon, die die Interaktion von MDM2 Protein mit einem p53- ähnlichen Peptid inhibieren und daher eine anti-proliferative Aktivität aufweisen.

Überraschenderweise wurde im Rahmen der Versuche, die die Grundlage für die vorliegende Erfindung darstellen gefunden, dass bestimmte cis-Imidazoline, wie bevorzugt Nutline und insbesondere Nutlin-3 den P-gp-vermittelten Wirkstoffausstrom in Multi-drug resistenten (chemoresistenten) Krebszellen inhibieren können, was einen neuen MDM2-unabhängigen anti-Krebs Mechanismus dieser Substanzen darstellt. Dieser neue Mechanismus eröffnet die Möglichkeit, P-gp-exprimierende, MRPl-exprimierende und möglicherweise weitere ABC- Transporter exprimierende Krebszellen unabhängig von ihrem p53- oder MDM2-Status mit Kombinationen von Substanzen dieser Erfindung (cis-Imidazolinen), bevorzugt ausgewählt aus Nutlinen, und Zytostatika, die in diesen Zellen als ABC-Transportersubstrate alleine unwirksam sind, zu behandeln. Unter Chemoresistenz versteht man die im Vergleich zu einer anderen Zelle verminderte Empfindlichkeit einer Zelle gegenüber einem Zytostatikum.

Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das cis-Imidazolin zusammen oder in getrennten Behältern mit dem Zytostatikum vorliegt. Die Darreichungsformen der (beiden) Bestandteile spielen solange keine Rolle, wie die (beiden) Bestandteile am erwünschten Ort der Behandlung (d.h. in dem zu behandelnden Patienten) gemeinsam wirken können.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Kombination von cis-Imidazolin mit mindestens einem oder mehreren Zytostatika, zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verbindungen in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeu- tisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegen. Als „Vorläufer" werden diejenigen Substanzen bezeichnet, die erst durch den Stoffwechsel in aktive Substanzen umgewandelt werden.

Erfindungsgemäß kann die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Iηjektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt.

Bevorzugt ist weiterhin pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das cis-Imidazolin ausgewählt ist aus den Nutlinen, zum Beispiel Nutlin-2 und/oder Nutlin-3, und chemischen Derivaten davon. US 2005-0288287 beschreibt die Gruppe der entsprechenden Verbindungen und ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Unter einer „chemischen Derivatisierung" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung die gezielte Veränderung von insbesondere reaktiven Seitengruppen eines Moleküls des erfindungsgemäßen Wirkstoffs verstanden werden. Entsprechende Umsetzungen sind dem Fachmann in der pharmazeutischen Chemie bekannt. Als bevorzugte Beispiele können Moleküle, die z.B. eine HOOC- oder OH-Gruppe besitzen über eine Veresterung mit einem Alkohol derivatisiert werden. Die Veresterung erfolgt dabei durch übliche Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Es ist weiterhin möglich, die HOOC-Gruppe in eine Hydrazidgruppe zu überführen, z.B. durch Umsetzen mit tert.-Alkylcarbazaten und anschließende Spaltung mit Säuren (beschrieben z.B. in DE 196 36 889), und ein eine Hydrazidgruppe aufweisendes Pharmakon mit einem eine Carbonylkomponente enthaltenen Spacer umzusetzen, wie z.B. in DE 196 36 889 Al beschrieben. Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, die eine H ₂ N-Gruppe besitzen, können z.B. zu Iminderivaten derivatisiert werden. Die Reaktion zu den Iminderiva- ten erfolgt dabei durch übliche Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, die eine Carbonylkomponente besitzen, können z.B. zu Carboxy- hydrazon-, Sulfonylhydrazon-, bzw. Hydrazonderivaten durch übliche Verfahren umgesetzt werden, die dem Fachmann geläufig sind. Es ist weiterhin möglich, eine HO-Gruppe oder eine NH ₂ -Gruppe eines Wirkstoffs in eine Carbonylkomponente zu überführen, z.B. durch Veresterung bzw. Amidbildung mit einer Carbonsäure-tragenden Carbonylkomponente. Die Carbonylkomponente kann des weiteren durch andere chemische Reaktionen eingeführt wer- den, so z.B. durch eine elektrophile Substitution an einer HO- oder NH ₂ -Gruppe des Wirkstoffs mit einer geeigneten Carbonylkomponente.

Weiter bevorzugt ist dann eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der das cis-Imidazolin ausgewählt ist aus den Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

worin

Xi ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cj-Ci ₂ Alkoxy und Ci-Ci ₂ Alkoxy substitu- tiert mit Trifluormethyl oder Fluor;

X ₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, CpCn Alkyl, und - C(X ₄ Xs)-X ₆ ;

X ₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Ci-Ci ₂ Alkoxy, Halogen und - CQUXs)-Xe unter der Voraussetzung, dass, wenn X ₂ Wasserstoff, Halogen oder Ci-Ci ₂ Alkyl ist, X -C(X ₄ Xs)-X ₆ ist;

X ₄ und X ₅ sind Ci-Ci ₂ Alkyl und können miteinander verbunden sein, um ein Cycloalkyl zu bilden;

X ₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ci-Ci ₂ Alkyl, Cyano, -CH ₂ -OH, -CH ₂ -O-Ci- Ci ₂ Alkyl, -CH ₂ -O-Ci-C ₁₂ Alkyl substituiert mit Ci-Ci ₂ Alkoxy, -C(O)X ₇ , und -CH ₂ -NX ₈ X ₉ ; X ₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Cj-Ci ₂ Alkoxy, Morpholino und NX ₈ X ₉ ;

X ₈ und X ₉ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Ci-Ci ₂ Alkyl, Ci-Ci ₂ Alkyl substituiert mit Ci-Ci ₂ Alkoxy oder Cyano und Ci-Ci ₂ Alkoxy;

Yi und Y ₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano und Azetylen;

R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Piperidinyl substituiert, Heterocyclen mit fünf oder sechs Ringatomen, Piperidinyl substituiert mit -NX ₈ X ₉ und worin n = 1 oder 2 ist,

Ri kann einer oder mehr Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff,

Oxo, Ci-Ci ₂ Alkyl substituiert mit R ₂ , -C(O)R ₃ und -SO ₂ -C ₁ -Ci ₂ Alkyl;

R ₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Ci-Ci ₂ Alkoxy, Trifluormethyl, - cyano, -NH-SO ₂ -Ci-C ₁₂ Alkyl, -NH-C(O)-Ci-Ci ₂ Alkyl, -C(O)-Ci-C ₂ Alkyl, -C(O)R ₄ , -

C(O)-NX ₈ X ₉ , -SO ₂ -Ci-Ci ₂ Alkyl und -SO ₂ -NX ₈ X ₉ ,

R ₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heterocyclen mit fünf Ringatomen, Ci-Ci ₂

Alkyl, Ci-Cj ₂ Alkoxy und Ci-Ci ₂ Alkyl substituiert mit Ci-Ci ₂ Alkoxy; und

R ₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, CpCi ₂ Alkoxy, Morpholino und -

NX ₈ X ₉ und wobei die absolute Stereochemie an der 4- und 5-Position des Imidazolinrings jeweils S und R ist, und Enantiomeren und chemischen Derivaten davon, und pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Estern davon.

Noch weiter bevorzugt ist dann eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der das cis-Imidazolin ausgewählt ist aus den Verbindungen der allgemeinen der allgemeinen Formel (II)

(H) worin R ₅ ausgewählt ist aus H, Oxo, und Ci-C ₆ Alkyl, R ₆ ausgewählt ist aus H, Oxo, und Cj-C ₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Ci-C ₆ Alkoxy,

Trifluormethyl, -Cyano, -NH-SO ₂ -Ci-C ₆ Alkyl, -NH-C(O)-C ₁ -C ₆ Alkyl, -C(O)-Ci-C ₆ Alkyl, und -SO ₂ - Ci-C ₆ Alkyl,

R ₇ ausgewählt ist aus Ci-C ₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Trifluormethyl oder Fluor,

R ₈ ausgewählt ist aus Ci-C ₆ Alkyl, und Enantiomeren und chemischen Derivaten davon, und pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Estern davon.

Der zweite wesentliche Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Zytostatikum. Erfindungsgemäß ist das Zytostatikum dadurch gekennzeichnet, das es im Rahmen der Resistenzentwicklung einer Krebszelle durch einen ABC-Transporter vermittelt aus einer Krebselle transportiert wird. Entsprechende, im Rahmen der „Multi-drug" Resistenz dann wirkungslose (oder schlechter wirksame) Zytostatika sind zum Beispiel bevorzugt ausgewählt aus Vincristin, Doxorubicin, Daunorubicin, Vinblastin, Methotrexat, SN-38, CPT-I l, Mithramycin, Mitoxantron, Epirubicin, Etoposid, p- Aminohippurat, Ochratoxin, Cisplatin, Sulphinpyrazon, 9-(2-Phosphonylmethoxyethyl)adenin (PMEA), 9-(2-Phosphonylmethoxyethyl)guanin (PMEG), Azidothymidin (AZT), 3'-Azido-3'- desoxythymidin Monophosphat (AZTMP), 3TC, d4T, 6-Thioguanine, 6-Mercaptopurin, To- potecan, 5-HP, ZD1694, GW1843, Methotrexat/Antifolat, Flavopiridol, 5-FU, Lamivudin, Zidovudin, Iressa, Colchicin, Adriamycin, Digoxin, Saquinavir, Paclitaxel, Verapamil, PSC833, GG918, V-104, Cyclosporin A, V-104, Fumitremorgin C, Actinomycin D, Doxeta- xel, Irinotecan, Mitomycin C, Tamoxifen, Tenoposid und Gefitinib. Die Effektivität aller dieser Zytostatika kann gemäß der vorliegenden Erfindung verbessert werden (siehe z.B. CaI- cagno AM, Kim IW, Wu CP, Shukla S, Ambudkar SV. ABC drug transporters as molecular targets for the prevention of multidrug resistance and drug-drug interactions. Curr Drug Deliv. 2007 Oct;4(4):324-33).

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, in welcher der den Wirkstoff transportierende ABC-Transporter ausgewählt ist aus ABCBl, ABCCl, ABCC2, ABCC3, ABCC4, ABCC5 und/oder ABCG2. Weiter bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszelle ein mutiertes oder Wildtyp-p53 Protein umfasst. Besonders bevorzugt ist die Verwendung in p53-negativen und p53-Mutanten menschlichen Tumorzellen. Noch weiter bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammenset- zung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszelle mindestens einen ABC- Transporter überexprimiert. Die Überexpression von ABC-Transporter ist einer der wesentlichen Schritte bei der Entwicklung vieler Multi-drug resistenten Krebserkrankungen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung dann ein Verfahren zur Identif- zierung von ABC-Transporter inhibierenden Substanzen, wobei das die Schritte von a) in Kontakt bringen einer einen ABC-Transporter exprimierenden Zelle mit mindestens einer den ABC-Transporter potentiell inhibierenden Substanz, zusammen mit mindestens einem durch den ABC-Transporter vermittelt transportierten Zytostatikum, und b) Messen des Ausstroms und/oder der Ansammlung des mindestens einen ABC-Transporter exportierten Zytostatikums in Anwesenheit der potentiell inhibierenden Substanz und, gegebenenfalls, der Abwesenheit der potentiell inhibierenden Substanz, umfasst. Das Verfahren kann in vitro oder in vivo (z.B. in einem nicht-humanen rekombinanten ABC-Transporter exprimierenden Tiermodell) durchgeführt werden. Bevorzugt sind die potentiell inhibierenden Substanzen erfindungsgemäß ausgewählt aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)

worin X ₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ci-Ci ₂ Alkoxy und Ci-Ci ₂ Alkoxy substitutiert mit Trifluormethyl oder Fluor; X ₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Halogen, Ci-Ci ₂ Alkyl, und -C(X ₄ Xs)-X ₆ ; X ₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Ci-Cj ₂ Alkoxy, Halogen und -C(X ₄ Xs)-X ₆ unter der Voraussetzung, dass, wenn X ₂ Wasserstoff, Halogen oder Ci-Cj ₂ Alkyl ist, X -C(X ₄ Xs)-X ₆ ist; X ₄ und X ₅ sind Ci-Ci ₂ Alkyl und können miteinander verbunden sein, um ein Cycloalkyl zu bilden; X ₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ci-Ci ₂ Alkyl, Cyano, -CH ₂ -OH, -CH ₂ -O-Ci-Ci ₂ Alkyl, -CH ₂ -O-Ci-Ci ₂ Alkyl substituiert mit Ci-Cj ₂ Alkoxy, -C(O)X ₇ , und -CH ₂ -NX ₈ X ₉ ; X ₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, C _J -CJ ₂ Alkoxy, Morpholino und NX ₈ X ₉ ; X ₈ und X ₉ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C _J -C _J2 Alkyl, Cj-Ci ₂ Alkyl substituiert mit Ci-Ci ₂ Alkoxy oder Cyano und Ci- C ₁₂ Alkoxy; Y) und Y ₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano und Azetylen; R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Piperidinyl substituiert, Heterocyclen mit fünf oder sechs Ringatomen, Piperidinyl substituiert mit - NX ₈ X ₉ und

worin n = 1 oder 2 ist, R ₁ kann einer oder mehr Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Oxo, C ₁ -C] ₂ Alkyl substituiert mit R ₂ , -C(O)R ₃ und -SO ₂ -Ci-Ci ₂ Alkyl; R ₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Ci-Ci ₂ Alkoxy, Trifluor- methyl, -cyano, -NH-SO ₂ -Ci-Ci ₂ Alkyl, -NH-C(O)-Ci-Ci ₂ Alkyl, -C(O)-Ci-Ci ₂ Alkyl, - C(O)R ₄ , -C(O)-NX ₈ X ₉ , -SO ₂ -Ci-Ci ₂ Alkyl und -SO ₂ -NX ₈ X ₉ , R ₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heterocyclen mit fünf Ringatomen, Ci-Ci ₂ Alkyl, Ci-Ci ₂ Alkoxy und Ci-Ci ₂ Alkyl substituiert mit Ci-Ci ₂ Alkoxy; und R ₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Cj-Ci ₂ Alkoxy, Morpholino und -NX ₈ X ₉ und wobei die absolute Stereochemie an der 4- und 5-Position des Imidazolinrings jeweils S und R ist, und Enantiomeren und chemischen Derivaten davon, und pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Estern davon.

Weiter bevorzugt sind die potentiell inhibierenden Substanzen erfindungsgemäß ausgewählt aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (II)

(H) worin R ₅ ausgewählt ist aus H, Oxo, und Ci-C ₆ Alkyl, R ₆ ausgewählt ist aus H, Oxo, und Ci- C ₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Ci-C ₆ Alkoxy, Trifluormethyl, -Cyano, -NH-SO ₂ - C ₁ -C ₆ Alkyl, -NH-C(O)-Ci-C ₆ Alkyl, -C(O)-C ₁ -C ₆ Alkyl, und -SO ₂ - CpC ₆ Alkyl, R ₇ ausgewählt ist aus Ci-C ₆ Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Trifluormethyl oder Fluor, R ₈ ausgewählt ist aus C ₁ -C ₆ Alkyl, und Enantiomeren und chemischen Derivaten davon, und pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Estern davon.

Der zweite wesentliche Bestandteil im Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Zytostatikum. Erfindungsgemäß ist das Zytostatikum dadurch gekennzeichnet, das es in Rahmen der Resistenzentwicklung einer Krebszelle durch einen ABC-Transporter vermittelt aus einer Krebselle transportiert wird. Entsprechende Zytostatika sind zum Beispiel bevorzugt ausgewählt aus Vincristin, Doxorubicin, Daunorubicin, Vinblastin, Methotrexat, SN- 38, CPT-I l, Mitoxantron, Epirubicin, Etoposid, p-Aminohippurat, Ochratoxin, Cisplatin, Sulphinpyrazon, 9-(2-Phosphonylmethoxyethyl)adenin (PMEA), 9-(2-

Phosphonylmethoxyethyl)guanin (PMEG), Azidothymidin (AZT), 3'-Azido-3'- desoxythymidin Monophosphat (AZTMP), 3TC, d4T, 6-Thioguanine, 6-Mercaptopurin, To- potecan, 5-HP, ZD 1694, GWl 843, Methotrexat/Antifolat, Flavopiridol, 5-FU, Lamivudin, Zidovudin, Iressa, Colchicin, Adriamycin, Digoxin, Saquinavir, Paclitaxel, Verapamil, PSC833, GG918, V-104, Cyclosporin A, V-104, Fumitremorgin C, Actinomycin D, Doxeta- xel, Irinotecan, Mitomycin C, Tamoxifen, Tenoposid und Gefϊtinib.

Die beiden Bestandteile werden dann erfindungsgemäß mit einer einen ABC-Transporter exprimierenden Zelle in Kontakt gebracht. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der ABC-Transporter ausgewählt ist aus ABCBl (MDRl /P-gp), ABCCl, ABCC2 (MRP2), ABCC3, ABCC4, ABCC5 und ABCG2 (BCRP). Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Zelle eine Krebszelle ist, die ein mutier- tes oder Wildtyp-p53 Protein umfasst. Besonders bevorzugt ist ein Screening in p53- negativen und p53-Mutanten menschlichen Tumorzellen. UKF-NB-3-Zellen und UKF-NB- 3 ^r DOX ²⁰ Zellen exprimieren Wildtype p53, während UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ (C135F), UKF-NB-4 (C175F), und Be(2)-C (C135F)-Zellen p53-Mutationen aufweisen. Noch weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszelle mindestens einen ABC-Transporter überexprimiert. Die Überexpression von ABC-Transporter ist einer der wesentlichen Schritte bei der Entwicklung vieler Multi-drug resistenten Krebserkrankungen.

Weiter bevorzugt ist ein erfϊndungsgemäßes Verfahren, wobei die Zelle für den ABC- Transporter rekombinant ist. Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanten Zellen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Beispiele sind Zellen auf Basis von UKF-NB-3 oder UKF-Rhb-1 (siehe Beispiele).

Das oben genannte Verfahren umfasst weiterhin das Messen des Ausstroms und/oder der Ansammlung des mindestens einen ABC-Transporter exportierten-Zytostatikums in Anwesenheit der potentiell inhibierenden Substanz und, gegebenenfalls, der Abwesenheit der potentiell inhibierenden Substanz. Beispiele für geeignete Zytostatika sind Rhodamin 123, JC-I und Calcein-AM. Bevorzugt ist weiter, dass das Zytostatikum markiert ist, so dass der Ausstrom leicht gemessen werden kann. Dazu können alle, die Wirkung und den Ausstrom des Zytostatikums bevorzugt nicht oder nur wenig behindernden Marker verwendet werden, wie zum Beispiel Fluoreszenzmarker oder radioaktive Markierungen. Der Ausstrom kann dabei chromatographisch, photometrisch, fluorometrisch (z.B. per FACS) oder über einen Antikörper gemessen werden. Gegebenenfalls kann bevorzugt zur Erzeugung eines Vergleichswertes der Ausstrom auch in Abwesenheit der potentiell inhibierenden Substanz vorgenommen werden.

Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dann in einem weiteren Schritt die identifizierte Substanz ausgewählt und chemisch derivatisiert (siehe oben) und, gegebenenfalls, das Verfahren wiederholt. In mehreren Selektionsrunden kann die identifizierte Substanz so in ihrer Aktivität verbessert werden, d.h. den Ausstrom noch besser inhibieren.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft dann eine ABC-Transporter inhibierende Substanz, identifiziert mit einem erfindungsgemäßen Verfahren. Optimalerweise wird diese Substanz zusammen mit dem entsprechenden Zytostatikum gemeinsam entwickelt, um als Kombination in einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung angewendet zu werden.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft dann die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer ABC-Transporter inhibierenden Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls in Kombination mit einem Zytostatikum, zur Behandlung von proliferativen Erkrankungen, insbesondere bevorzugt von Krebserkrankungen. Bevorzugt ist eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebserkrankung Chemoresistenz und/oder Multi-drug Resistenz umfasst, wobei diese bevorzugt ABC-Transporter-vermittelt sind. Weiter bevorzugt ist eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei an der Krebserkrankung ein mutiertes oder Wildtyp-p53 Protein beteiligt ist. Die Verwendung kann zum Beispiel zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen.

Beispiele für entsprechende Krebserkrankungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind ausgewählt ist aus soliden Tumoren, Brustkrebs, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom und alveolärem Rhabdomyosarkom, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen, sowie Prostatakarzinome.

Ein noch weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung, umfassend Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer ABC-Transporter inhibierenden Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls in Kombination mit einem Zytostatikum. Bevorzugt ist eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebserkrankung Chemoresistenz und/oder Multi-drug Resistenz umfasst, wobei diese bevorzugt ABC-Transporter-vermittelt sind. Weiter bevorzugt ist eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei an der Krebserkrankung ein mutiertes oder Wildtyp-p53 Protein beteiligt ist. Auch hier sind Beispiele für entsprechende Krebserkrankungen ausgewählt aus soliden Tumoren, Brustkrebs, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom und alveolärem Rhabdomyosarkom, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen, sowie Prostatakarzinome.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindung(en) Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von zur Behandlung von proliferativen Erkrankungen, und bevorzugt Krebserkrankungen. Diese Herstellung und Anwendung kann analog zu den oben beschriebenen Weisen erfolgen.

Obwohl der breite Bereich von anti-Krebs Wirkstoffen, die eine verbesserte Aktivität in Kombination mit Nutlin 3 zeigten, und die Inhibierung des Rhodamin 123 Ausstroms eine zentrale Rolle of P-gp anzeigen, kann die Interferenz mit anderen ABC Transportern mit den vorliegenden Daten nicht unbedingt ausgeschlossen werden. Eine weitere systematische Analyse des Einflusses von Nutlin-3 auf die Aktivität of ABC Transporter wird gerade durchgeführt. Darüber hinaus ist Nutlin-3 ein Razemat, wobei Nutlin-3a dasjenige Enantiomer ist, das als MDM2 Antagonist wirkt, während Mutlin-3b MDM2 nicht beeinträchtigt (Vassilev, 2007). Da die Überexpression of ABC Transporter zu den wichtigsten Chemoresistenzme- chanismen zählt, können Nutline und insbesondere Nutlin-3 als eine neue Lead-Struktur für das Design von ABC Transporter Inhibitoren dienen.

Die Erfindung soll nun in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren und das Sequenzprotokoll weiter beschrieben werden, ohne jedoch auf die Beispiele beschränkt zu werden. Für die Zwecke der Erfindung sind alle hier zitierten Publikationen durch Bezugnahme aufgenommen.

Legenden für Figuren

Figur 1. Einfluss von Nutlin-3 auf die chemosensitiven p53-Wildtyp (UKF-NB-3) oder Vinc- ristin-resistenten, p53 -mutierten, P-Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ ) Neuroblastom- und chemosensitiven, p53-Wildtyp (UKF-Rhb-1) oder Vincristin-resistenten, p53 -mutierten, P-Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ ) Rhabdomyosar- comzellen. A) Zeil-Lebensfähigkeit relativ zur nicht-behandelten Kontrolle von Nutlin-3- behandelten UKF-NB-3 (•), UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ (■), UKF-Rhb-1 (A) oder UKF-Rhb- l ^r VCR ¹⁰ (T) Zellen bestimmt durch den MTT Assay nach 96 h Inkubation; B) Expression der p53 Zielgene p21, MDM2 und GADD45 (GADD) in Nutlin-3 (20 μM)-behandelten UKF- NB-3 oder UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen nach 8 h, nachgewiesen durch real-time PCR; C) Expression der p53 Zielgene p21, MDM2 und GADD45 (GADD) in Nutlin-3 (20 μM)- behandelten UKF-Rhb-1 oder UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ Zellen nach 8 h, nachgewiesen durch real- time PCR; D) Repräsentative Photographien, die die Effekte von Vincristin, Nutlin-3 oder deren Kombination auf UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ oder UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ Zellen zeigen. * P < 0,05 verglichen mit nicht-behandelten Kontrollen.

Figur 2. Einfluss von Nutlin-3 auf die Vincristin Cytotoxizität und Rhodamin Ansammlung in Krebszellen. A) Lebensfähigkeit von chemosensitiven, p53-Wildtyp (UKF-NB-3) oder Vincristin-resistenten, p53-mutierten, P-Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-NB- 3 ^r VCR ¹⁰ ) Neuroblastomzellen, behandelt mit Vincristin (VCR), Nutlin-3 oder Kombinationen von VCR und Nutlin-3; B) Lebensfähigkeit von chemosensitiven, p53-Wildtyp (UKF-Rhb-1) oder Vincristin-resistenten, p53 -mutierten, P-Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-Rhb- l ^r VCR ¹⁰ ) Rhabdomyosarcomzellen, behandelt mit Vincristin (VCR), Nutlin-3 oder Kombinationen von VCR und Nutlin-3; C) Repräsentative Photographien, die die Rhodamin 123 Fluoreszenz in p53-Wildtyp (UKF-NB-3) oder Vincristin-resistenten, p53 -mutierten, P- Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ ) Neuroblastomzellen; Rhodamin Fluoreszenz in p53-Wildtyp (UKF-NB-3) oder Vincristin-resistenten, p53-mutierten, P- Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ ) Neuroblastomzellen zeigen, bestimmt durch Durchflusszytometrie. n.d. = keine lebensfähigen Zellen nachweisbar; * P < 0,05 ver- glichen mit nicht-behandelter Kontrolle; P < 0,05 verglichen mit jeder einzelnen Behandlung

Figur 3. Einfluss of Nutlin-3 auf die zelluläre Ansammlung von ABC Transportersubstrat. A) Konzentrations-abhängiger Effekt von Nutlin auf Rhodamin (0,5 μM). Ansammlung in p53- mutierten, P-Glycoprotein-überexprimierenden (UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ ) Neuroblastomzellen; B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Experimente, die die Rhodamin 123 (2 μM) oder CaI- cein-AM (2 μM) Ansammlung in MDCKII Zellen, MDCKII Zellen, stabil transfiziert mit MDR-I, das für P-Glycoprotein (MDCKII MDRl) kodiert, oder MDCKII Zellen, stabil transfiziert mit MRP-I (MDCKII MRPl), ohne (weiße Peaks) oder mit (schwarze Peaks) Nutlin-3 (20 μM) Behandlung; zeigen C) Rhodamin (2 μM) Ansammlung in MDCKII, MDCKII MDRl, oder MDCKII MRPl Zellen ohne oder mit Nutlin-3 (20 μM) Behandlung, bestimmt durch Durchflusszytometrie; D) Calcein-AM (2 μM) Ansammlung in MDCKII, MDCKII MDRl, oder MDCKII MRPl Zellen, ohne oder mit Nutlin-3 (20 μM) Behandlung, bestimmt durch Durchflusszytometrie. * P < 0,05 verglichen mit nicht-behandelter Kontrolle.

Materialien und Methoden Zelllinien

Die Neuroblastomzelllinien UKF-NB-4 und UKF-NB-3 sowie die Sublinien adaptiert an Do- xorubicin (20 ng/ml) (UKF-NB-3 ^r DOX ²⁰ ) oder Vincristin (10 ng/ml) (UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ ) wurden wie beschrieben etabliert (8,9). Be(2)-C-Zellen wurden von ATCC (Manassass, VA, USA) bezogen. Die alveoläre Rhabdomyosarkomzelllinie UKF-Rhb-1 wurde in unserem Labor aus einer Knochenmarksmetastase etabliert. Die alveoläre Rhabdomyosarkomzelllinie Rh30 wurde von Dr. PJ. Houghton (St. Jude's Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee) zur Verfügung gestellt. Die Vincristin-resistenten Rhabdomyosarkomzelllinien UKF- Rhb-l ^r VCR ¹⁰ und Rh30 ^r VCR ¹⁰ wurden durch Adaptation von UKF-Rhb-1 bzw. Rh30 an das Wachstum in Gegenwart von 10 ng/ml etabliert.

UKF-NB-3-Zellen und UKF-NB-3 ^r DOX ²⁰ Zellen exprimieren Wildtype p53, während UKF- NB-3 ^r VCR ¹⁰ (C135F), UKF-NB-4 (C 175F), und Be(2)-C (C135F)-Zellen p53 -Mutationen aufweisen (Kotchetkov et al., 2005; Michaelis et al., 2007). UKF-NB-3 -Zellen exprimieren keine erhöhten P-gp-Mengen, während alle anderen Neuroblastomazellen eine hohe P-gp- Expression zeigen (Kotchetkov et al., 2005; Michaelis et al., 2007). Die Untersuchung des p53-Status von UKF-Rhb-1 und UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ ergab, dass parenterale UKF-Rhb-1 - Zellen Wildtype-p53 exprimieren und UKF-Rhb-1 ^r VCR -Zellen eine p53 -Mutation aufweisen (K291X). UKF-Rhb-1 -Zellen zeigen keine P-gp-Expression, UKF-Rhb-1 ^r VCR ¹⁰ -Zellen eine hohe P-gp-Expression (Daten nicht gezeigt). Rh30 hat eine p53-Mutation (R273C) (12) aber keine P-gp-Expression. Rh30 ^r VCR ¹⁰ zeigt eine hohe P-gp-Expression.

Die Zelllinien MDCKII MDRl (Bakos et al., 1998), MDCKII MRPl (Bakos et al., 1998), MDCKII MRP3 (Kool et al., 1999), und die nicht-transfizierte Kontrollzelllinie MDCKII wurden von Dr. P. Borst, Dr. M. de Haas, und Dr. A. H. Schinkel (Nederlands Kanker Insti- tuut, NKI, Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. P53-negative, P-gp-negative PC- 3 Prostatakrebszellen, die kein MRP-I exprimieren, wurden von ATCC (Manassass, VA, USA) bezogen. Die Adaptation von PC-3 an Vincristin 10 ng/ml resultierte in einer Zelllinie (PC-3 ^r VCR ¹⁰ ), die MRP-I -Überexpression jedoch keine P-gp-Expression zeigte.

Alle Zelllinien wurden in IMDM, ergänzt mit 10 % FBS, 100 IU/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin bei 37 ⁰ C kultiviert.

Mutationsanalyse von p53

Das TP53-Gen wurde mit cDNAs mit den folgenden Primerpaaren sequenziert: TP53 Ex2-3-f GTGACACGCTTCCCTGGAT (SEQ ID NO. 1) und TP53 Ex2-3-r TCATCTGGACCTGGGTCTTC (SEQ ID NO. 2); TP53 Ex4-5-f CCCTTCCCAGAAAACCTACC (SEQ ID NO. 3) und TP53 Ex4-5-r CTCCGTCATGTGCTGTGACT (SEQ ID NO. 4); TP53 EX6-7f GTGCAGCTGTGGGTTGATT (SEQ ID NO. 5) und TP53 Ex6-7r GGTGGTACAGTCAGAGCCAAC (SEQ ID NO. 6) ; Tp53 Ex8-9-f CCTCACCATCATCACACTGG (SEQ ID NO. 7) und TP53 Ex8-9-r GTCTGGTCCTGAAGGGTGAA (SEQ ID NO. 8). Darüber hinaus wurden die Zelllinien auf TP53 -Mutationen mittels Sequenzanalyse genomischer DNA wie beschrieben untersucht. Die PCR wurde wie beschrieben durchgeführt. Jedes Amplikon wurde bidirektional sequenziert. Die P53 cDNA wurde durch Amplifϊzieren von vier überlappenden Polymerase Kettenreakti- ons-(PCR) Fragmenten sequenziert, die die gesamte kodierende Sequenz abdeckten. Die Pri- mersequenzen und Fragmentgrößen waren:

GACACGCTTCCCTGGATTGGC (SEQ ID NO. 9) und GCAAAACATCTTGTTCAGGGC (SEQ ID No. 10), 452bp;

GTTTCCGTCTGGGCTTCTTGC (SEQ ID No. 11) und GGTACAGTC AGAGCC AACCTC (SEQ ID No. 12), 367 bp;

TGGCCCCTCCTCAGCATCTTA (SEQ ID NO. 13) und C AAGGCCTC ATTCAGCTCTC (SEQ ID No. 14), 481 bp;

CGGCGCACAGAGGAAGAGAATC (SEQ ID NO. 15) und

CGCACACTTATTGCAAGCAAGGG (SEQ ID NO. 16), 444 bp.

Die Amplifikationsprodukte wurden gereinigt, und 25 ng des sauberen Produkts wurden Zyklus-Sequenzierung unter der Verwendung des BigDye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) unterzogen.

Wirkstoffe

Lösungen von Vincristin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) und Doxorubicin (Cell Pharm, Hannover, Germany) wurden nach den Herstellerangaben hergestellt. Nutlin-3, Rho- damin 123, Calcein-AM und JC-I wurden von Merck Biosciences (Darmstadt, Germany) bezogen.

Zelllebensfähigkeitstests

Die Zelllebensfähigkeit wurde mit Hilfe des 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT)- Assays nach 96 h-Inkubation (Mosmann, 1983) wie beschrieben (Michaelis et al., 2004) gemessen.

Real-time PCR

Die Gesamt-DNA wurde mit TRI-Reagenz (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) isoliert. Die reverse Transkription und die Real-time PCR wurden wie beschrieben durchgeführt. Die folgenden Primer-Sequencen wurden verwendet:

18s rRNA forward 5'-GTG AAA CTG CGA ATG GCT CAT (SEQ ID No. 17), 18s rRNA reverse 5'-CTG ACC GGG TTG GTT TTG AT (SEQ ID No. 18), 18s rRNA probe 5'-(VIC) TGG TCG CTC CTC TCC CAC - (TAMRA) (SEQ ID No. 19), MDM2 forward 5'-TGT TGG TGC ACA AAA AGA CA (SEQ ID No. 20), MDM2 reverse 5'-CAC GCC AAA CAA ATC TCC TA (SEQ ID No. 21), p21 forward 5'-GCC CGT GAG CGA TGG AA (SEQ ID No. 22), p21 reverse 5'-ACG CTC CCA GGC GAA GTC (SEQ ID No. 23), GADD45 forward 5'-GCA CGC CGC GCT CTC T (SEQ ID No. 24), GADD45 reverse CTT ATC CAT CCT TTC GGT CTT CTG (SEQ ID No. 25). Die Ergebnisse sind als relative Veränderungen dargestellt. Die relative Quantifizierung wurde mit der SDS2.1 Software (Applied Biosystems) bestimmt, die auf dem ABI PRISM 7900HT zur Verfügung gestellt wurde. Eine Normalisierung wurde unter der Verwendung von 18S rRNA als endogene Kontrolle erhalten. Die Ergebnisse sind als -fache Veränderung angegeben.

Durchflusszytometrie und Untersuchung des Ausstroms von ABC- Transportersubstraten

Die Expression der ABC-Transporter P-gp (Alexis Biochemicals via AXXORA Deutschland, Lörrach, Germany), MRP-I (Kamiya Biomedical Company, Seattle, WA, USA), MRP-3 (ABCC3, Kamiya Biomedical Company, Seattle, WA, USA), und Brustkrebs Resistenzprotein (BCRP/ABCG2, Kamiya Biomedical Company, Seattle, WA, USA) wurde durchflusszy- tometrisch unter Verwendung der Antikörper nach den Herstellerangaben durchgeführt.

Um den ABC-Transporter-vermittelten Ausstrom zu messen, wurden die Zellen mit Rhoda- min 123 (0.1 μM, P-gp, MRPs), JC-I (0.1 μM, P-gp), oder Clcein-AM (2 μM, MRPs) für 60 min inkubiert. Dann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für 60 min inkubiert, um den Substanzausstrom zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen im Durchflusszytometer untersucht (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Rhodamin 123 wurde auf dem FIl -Kanal gemessen, JC-I und Calcein-AM auf dem FL2-Kanal.

Daher wurde im Rahmen der Erfindung der Einfluss von Nutlin-3 auf chemoresistente Neuroblastom- und Rhabdomyosarkom-Zellen allein oder in Kombination mit cytotoxischen Wirkstoffen untersucht. Da von Nutlin-3 gezeigt wurde, dass es anti-Krebs Effekte bewirkt, die von der MDM2 Inhibierung unabhängig sind, wurden p53-mutierte Zellen mit eingeschlossen. Das überraschendste Ergebnis dabei war, dass Nutlin-3 als ein potenter Inhibitor der ATP-Bindungskassetten (ABC) Transporter P-Glykoprotein wirkt und daher eine neue Klasse von ABC Transporter-Inhibitoren definiert. Ergebnisse

Einfluss von Nutlin-3 auf die Lebensfähigkeit von Krebszellen

Die Nutlin-3 Sensitivität unterscheidet sich zwischen p53 Wildtyp und p53 mutierten Zellen deutlich (Tabelle 1; Figur IA). Die p53 Wildtyp Zellen zeigten IC ₅₀ Werte < 3 μM. Die p53- mutierten Zellen haben IC ₅₀ Werte > 17 μM. In Übereinstimmung damit induzierte die Nutlin-3 Behandlung die Expression of p53 Zielgenen (p21, MDM2, GADD45) in p53 Wildtyp Zellen, jedoch nicht in p53-mutierten Zellen wie für UKF-NB-3, UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ , UKF- Rhb-1, und UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ Zellen mittels real-time PCR in Figur IB und C gezeigt ist.

Effizienz von Nutlin-3 in Kombination mit anti-Krebs Wirkstoffen

Von Nutlin-3 wurde bereits gezeigt, dass es die cytotoxische Aktivität von anti-Krebs Wirkstoffen verstärkt (Vassilev et al., 2007). Die Erfinder untersuchten zuerst die Kombination von Nutlin-3 und Vincristin in UKF-NB-3 und in UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen. In UKF-NB-3 Zellen induzierten Nutlin-3 und Vincristin eine additive Cytotoxizität (Figur 2A). Überraschenderweise und in scharfem Gegensatz zu den mit UKF-NB-3 erhaltenen Ergebnissen, erhöhten Nutlin dramatisch die Vincristin Sensitivität dieser Zellen in Konzentrationen, die für UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen nicht-toxisch waren (Figur 2A). Die Kombination of Nutlin-3 und Vincristin in Konzentrationen, die allein die Lebensfähigkeit der UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen nicht beeinträchtigten (Nutlin-3 20 μM, Vincristin 1 ,6 ng/ml) verursachten, die vollständige Zerstörung aller UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden für den Vergleich von UKF-Rhb-1 Zellen (p53 Wildtyp, geringe P-gp Expression) und UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ Zellen (Figur 2B) erhalten. Die Untersuchung von weiteren Zelllinien ergab, dass nicht-toxische oder moderat toxische Nutlin-3 Konzentration die IC _5O Konzentration von Vincristin in p53 Wildtyp und P-gp negativen Zellen leicht erhöhten (< 2-fach; UKF-NB-3, UKF-Rhb-1), jedoch die IC ₅₀ Konzentrationen von Vincristin in p53-mutierten und P-gp positiven Zellen massiv abnehmen ließen (92 bis 3434-fach; UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ , UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ , UKF- NB-4; Be(2)-C) (Tabelle 1). Das lässt vermuten, dass Nutlin-3 möglicherweise den P-gp- vermittelten Vincristin Ausstrom inhibiert. In der p53 Wildtyp- und P-gp überexprimierenden Zelllinie UKF-NB-3 ^r DOX ²⁰ , wurde die IC ₅₀ Konzentration für Vincristin durch Nutlin-3 (1 μM) 28,9-fach verringert (Tabelle 1). Der verringerte Effekt auf die Vincristin Sensitivität, verglichen mit anderen P-gp-überexprimierenden Zelllinien kann vielleicht durch die relativ geringe Nutlin-3 Konzentration erklärt werden, die aufgrund der höheren Nutlin-3 Sensitivität dieser p53 Wildtyp Zelllinie angewendet werden musste. Um weiter zu untersuchen, ob Nutlin-3 Krebszellen gegenüber anti-Krebs Wirkstoffen durch Interferenz mit P-gp-vermitteltem Wirkstoff-Ausstrom sensitiver macht, wurden UKF-NB- 3 ^r VCR ¹⁰ oder UKF-Rhb-l ^r VCR ¹⁰ Zellen mit Nutlin-3 in Kombination mit einer Zahl von zusätzlichen cytotoxischen Wirkstoffen mit verschiedenen cytotoxischen Wirkweisen behandelt. Die Nutlin-3 Behandlung erhöhte die Sensitivität von UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ und UKF-Rhb- l ^r VCR Zellen gegenüber den strukturell nicht- verwandten P-gp Substraten Doxorubicin, Paclitaxel, Etoposid, Mitoxantron und Actinomycin D deutlich, beeinträchtigt jedoch die Sensitivität gegen Cisplatin, das als ein P-gp Substrat bekannt ist, nicht signifikant.

Einfluss von Nutlin auf den ABC-T ransporter-vermittelten Ausstrom von Fluoreszenz- Substraten

Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den P-gp-vermittelten Substanzausstrom zu untersuchen, wurde dessen Einfluss auf den Ausstrom des fluoreszierenden P-gp Substrats Rhodamin 123 gemessen. Die Rhodamin 123 Fluoreszenz wurde in P-gp-negativen UKF-NB-3 Zellen, jedoch nicht in P-gp-überexprimierenden UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen (Figur 2C, D) nachgewiesen. Die Nutlin-3 Behandlung induzierte eine Ansammlung von Rhodamin 123 in UKF-NB- 3 ^r VCR Zellen (Figur 2C, D) in einer Konzentrations-abhängigen Weise (Figur 3A). Diese Effekte waren ähnlich zu denjenigen, die durch den bekannten P-gp Ausstrom-Inhibitor Verapamil induziert (Figur 2D) werden. Die Untersuchung des P-gp Substrats JC-I, das strukturell nicht mit Rhodamin 123 verwandt ist, führten zu ähnlichen Ergebnissen, der Ansammlung in UKF-NB-3 Zellen, jedoch nicht in UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen, und der Inhibierung des JC-I Ausstroms durch Nutlin-3 in UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen.

P-gp gehört zur Familie der sogenannten ATP-Bindungs-Kassette (ABC)-Transporter, von denen bekannt ist, dass sie viele Substanzen einschließlich vieler anti-Krebs Wirkstoffe aus der Zelle (Szakacs et al., 2006; Calcagno et al., 2007) hinaus transportieren. Zusätzlich zu P- gp, der das Genprodukt des Multi-drug Resistenzgens 1 (MDRl auch ABCBl genannt) ist, wurde von anderen ABC-Transportem einschließlich Multi-drug Resistenzprotein 1 (MRP- 1 /ABCCl) gezeigt, dass es an der Krebszellen-Chemoresistenz beteiligt ist (Szakacs et al., 2006; Calcagno et al., 2007). In UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen, spielt P-gp eine dominante Rolle unter den ABC-Transportern. Keine signifikante Überexpression anderer ABC Transporter konnte nachgewiesen werden. Darüber hinaus beeinträchtigte ein MRP-3 -spezifischer oder Brustkrebs Resistenzprotein (BCRP/ ABCG2)-spezifischer Inhibitor den Ausstrom verschiedener Fluoreszenzsubstrate aus UKF-NB-3 ^r VCR ¹⁰ Zellen nicht signifikant. Um weiter zu bes- tätigen, dass Nutlin-3 P-gp inhibiert, und um seine potentiellen Effekte auf andere ABC- Transporter zu untersuchen, wurde die Anhäufung von Rhodamin 123, das ein Substrat von P-gp und MRP-I ist, in MDCKII Zellen, die P-gp (MDCKII MDRl) oder MRP-I (MDCKII MRPl) stabil überexprimieren, jeweils mit oder ohne Nutlin Behandlung gemessen. Die Ergebnisse zeigten ein Fehlen der Rhodamin Ansammlung in MDCKII MDRl Zellen. Darüber hinaus verursachte Nutlin-3 eine starke Ansammlung von Rhodamin 123 in MDCKII MDRl Zellen, erhöhte die Rhodamin 123 Ansammlung in MDCKII MRPl Zellen jedoch nur in einem geringeren Ausmaß (Figur 3 B,C,D). Die Nutlin-3 (20 μM) Behandlung erhöhte die Rhodamin 123 Fluoreszenz in MDCKII MDRl Zellen 66 ± 21 -fach, in MDCKII Zellen 6,3 ± 0,6-fach, in MDCKII MRPl Zellen 3,8 ± 0,4-fach und in MDCKII MRP3 Zellen 4,6 ± 1,4- fach. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Calcein- AM in MDCKII MDRl, MDCKII MRPl, oder MDCKII MRP3 Zellen erhalten.

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