DIURETIQUES POUR TRAITER LE CANCER

L'invention concerne l'utilisation d'un composé appartenant à la famille des diurétiques pour traiter le cancer.

Le traitement du cancer peut se faire à différents stades de la maladie, en particulier par le traitement des tumeurs cancéreuses primaires ou la prévention de l'apparition et/ou le traitement des tumeurs cancéreuses secondaires. L'apparition de métastases cancéreuses est la cause majeure des décès des patients atteints d'un cancer. L'identification de nouveaux médicaments capables de prévenir l'évolution métastatique d'une tumeur cancéreuse est donc primordiale.

Le dasatinib est un puissant inhibiteur de nombreuses tyrosines kinases (BCR-Abl et Src principalement), qui agit en se logeant dans le site actif de la kinase en compétition avec ΓΑΤΡ. L'action dérégulée de ces tyrosines kinases entraîne une prolifération anormale des cellules myéloïdes à l'origine de l'apparition de leucémies. Le dasatinib est principalement utilisé pour le traitement des leucémies myéloïdes chroniques résistantes à l'Imatinib.

Des effets anti-métastatiques du dasatinib ont également été observés sur divers modèles expérimentaux, mais ce médicament n'a pas été retenu comme traitement anti- métastatique chez l'homme, principalement en raison de sa faible tolérabilité par les patients (fatigue, hyponatrémie, diarrhée, saignements gastro-intestinaux, effusions pleurales et péricardiaques et anémie) qui peut être expliquée par son activité inhibitrice des tyrosines kinases.

L'althiazide (numéro CAS : 5588-16-9) est un diurétique thiazidique utilisé principalement en combinaison avec le spironolactone qui agit au niveau du néphron en inhibant la réabsorption du sodium, provoquant ainsi une augmentation de la diurèse et l'excrétion du sodium et des chlorures. L'état de l'art met en avant une corrélation entre l'hypertension, les traitements contre l'hypertension et la mortalité liée au cancer. Si la bibliographie semble montrer une augmentation de la mortalité liée au cancer chez les patients souffrants d'hypertension, il semblerait également qu'on observe une incidence de l'apparition de cancer suite à des traitements contre l'hypertension. En effet, les diurétiques, qui sont principalement des thiazides, pourraient être un facteur de risque de cancer rénal. Sur ce point, les résultats publiés sont très contradictoires, et ne permettent pas de conclure si la corrélation est directe ou indirecte et si elle peut être étendue à tous les cancers ou si elle se restreint aux cancers rénaux. Une autre étude analyse l'impact de l'hypertension et des traitements anti- hypertenseurs sur la mortalité associée au cancer chez la femme. Les résultats observés sont variables et diffèrent selon les types de cancers. Pour les patients prenant un traitement anti- hypertenseur, la mortalité liée à certains cancers semble diminuer, alors qu'elle est augmentée pour d'autres.

Il existe donc un manque en molécules thérapeutiques tolérables pour les patients et efficaces pour le traitement ou la prévention des maladies causées ou exacerbées par la prolifération et la dispersion des cellules tumorales cancéreuses.

C'est pourquoi l'un des buts de l'invention est de fournir un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer.

Un autre but de l'invention est de fournir un composé pour son utilisation dans le traitement des tumeurs cancéreuses primaires et secondaires et/ou la prévention de l'apparition et du développement des tumeurs cancéreuses secondaires.

La présente invention concerne une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (II)

dans laquelle :

a peut représenter:

• rien,

• une liaison simple,

• une double liaison ;

b représente :

• rien si a représente rien,

• une liaison simple si a est soit une liaison simple soit une liaison double ;

la valeur de i étant :

• nulle si a représente rien, égale à 1 si a est une simple ou une double liaison ;

a représente rien, alors b représente rien et i vaut 0 :

Ri et R ₅ peuvent représenter indépendamment l'un de l'autre :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

R ₃ et R ₇ peuvent représenter indépendamment l'un de l'autre :

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

R4 peut représenter :

• H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ; si a représente une simple liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 : o R _\ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

o R ₂ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi NR _a R _b , OR _a , SR _a , SOR _a , S0 ₂ R _a , S0 ₂ NR _a R _b , CONR _a R _b , dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène, une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée ou cyclique de 1 à 20 carbones, avec éventuellement des hétéroatomes et/ou des halogènes, ou un cycle aromatique de 1 à 20 carbones, contenant éventuellement des hétéroatomes et étant éventuellement substitués ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atome d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi NR _a R _b , OR _a , SR _a , SOR _a , S0 ₂ R _a , S0 ₂ NR _a R _b , CONR _a R _b , dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène, une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée ou cyclique de 1 à 20 carbones, avec éventuellement des hétéroatomes et/ou des halogènes, ou un cycle aromatique de 1 à 20 carbones, contenant éventuellement des hétéroatomes et étant éventuellement substitués ;

o R ₃ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

o R ₅ et R ₇ représentent rien

o R ₆ représente H

o R ₄ est tel que défini ci-dessus

si a représente une double liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 : o Ri, R ₅ , R _Ô et R ₇ représentent rien ;

o R ₂ , R ₃ et R ₄ sont tels que définis ci-dessus.

Au sens de la présente Invention, le « traitement du cancer » se réfère à la fois au traitement de la tumeur cancéreuse primaire en prévenant la progression locale de celle-ci et à la prévention de formation des tumeurs cancéreuses secondaires appelées aussi métastases cancéreuses, dans des tissus distants.

Une « tumeur cancéreuse » est définie par le développement d'un tissu nouvellement formé au sein d'un tissu normal. La tumeur cancéreuse est provoquée par le dysfonctionnement du développement cellulaire.

La présente invention concerne aussi une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (III)

dans laquelle, :

a peut représenter:

• rien ;

• une liaison simple ;

• une double liaison.

b représente :

• rien si a = rien

• une liaison simple si a est soit une liaison simple soit une liaison

la valeur de i étant :

• nulle si a représente rien,

• égale à 1 si a est une simple ou une double liaison ;

si a représente rien, alors b représente rien et i vaut 0 :

o R ₃ et R ₇ peuvent représenter indépendamment l'un de l'autre :

H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

o R ₄ peut représenter :

H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ; R ₅ représente H ₂ ;

a représente une simple liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 :

R ₂ peut représenter :

• H,

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , SOR _a , S0 ₂ R _a , et S0 ₂ NR _a R _b „ dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène, une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée ou cyclique de 1 à 20 carbones, avec éventuellement des hétéroatomes et/ou des halogènes, ou un cycle aromatique de 1 à 20 carbones, contenant éventuellement des hétéroatomes et étant éventuellement substitués ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atome d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , SOR _a , S0 ₂ R _a , et S0 ₂ NR _a R _b „ dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène, une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée ou cyclique de 1 à 20 carbones, avec éventuellement des hétéroatomes et/ou des halogènes, ou un cycle aromatique de 1 à 20 carbones, contenant éventuellement des hétéroatomes et étant éventuellement substitués ;

R ₃ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S, SO, S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ; o R. ₅ et ¾ représentent H ;

o R ₇ représentent rien ;

o R ₄ est tel que définis ci-dessus

si a représente une double liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 : o R ₅ , ¾ et R ₇ représentent rien

o R ₂ , R ₃ et R ₄ sont tels que définis ci-dessus

La présente invention concerne aussi une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (III)

dans laquelle :

a peut représenter :

• rien ;

• une liaison simple ;

• une double liaison,

b représente :

• rien si a représente rien ;

• une liaison simple si a est soit une liaison simple soit une liaison double la valeur de i étant :

• nulle si a représente rien ;

• égale à 1 si a est une simple ou une double liaison ;

si a représente rien, alors b représente rien et i vaut 0 :

o R ₃ et R ₇ ρβμνεηί représenter indépendamment l'un de l'autre :

• H ;

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

o R ₅ représente H ₂ ;

o R4 peut représenter : • H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

si a représente une simple liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 : o R ₂ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 10 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant . éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi S et S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a R _b , dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi, S et S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atome d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a Rb„ dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

o R ₃ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

o R ₅ et R _Ô représentent H ;

o R ₇ représentent rien ;

o R4 est tel que définis ci-dessus

si a représente une double liaison, alors b représente une simple liaison et i vaut 1 : o R ₅ , e et R ₇ représentent rien

o R ₂ , R ₃ et R4 sont tels que définis ci-dessus La présente invention concerne aussi une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (IV)

dans laquelle :

R ₃ peut représenter :

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

R4 peut représenter :

• H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

La présente invention concerne aussi une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (V) :

dans laquelle :

R ₂ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 10 atomes de carbones, monocyclique ou polycyclique de 3 à 20 atomes de carbone, notamment bicyclique, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi S et S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a R _b , dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi, S et S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atome d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a R _b „ dans lesquelles R _a et/ou Rb représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

R ₃ peut représenter :

H ;

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

R peut représenter :

H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

La présente invention concerne aussi une famille de composé pour son utilisation dans le traitement du cancer, ladite famille de composés étant de formule (VI) :

dans laquelle :

R ₂ peut représenter : • H ;

• une chaîne alkyle ou alcényle linéaire, ramifiée, de 1 à 10 atomes de carbones, comportant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi S et S0 ₂ , et étant éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a Rb, dans lesquelles R _a et/ou R _b représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

• un groupe aryle de 1 à 20 carbones, éventuellement substitué par une ou plusieurs chaînes alkyles et comportant éventuellement 1 ou plusieurs hétéroatomes ou fonctions choisis parmi, S et S0 ₂ , et/ou 1 ou plusieurs atome d'halogènes, lesdits hétéroatomes formant éventuellement des fonctions, notamment des fonctions choisies parmi SR _a , et S0 ₂ NR _a R _b „ dans lesquelles R _a et/ou Rb représentent, indépendamment, un hydrogène ou une chaîne alkyle ou alcényle linéaire de 1 à 10 carbones ;

R ₃ peut représenter :

• H ;

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes ;

R4 peut représenter :

• H ;

• un atome d'halogène

• une chaîne alkyle linéaire de 1 atome de carbone, éventuellement substituée par 1 ou plusieurs atomes d'halogènes.

La présente invention concerne aussi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ; ledit composé étant l'althiazide de formule (I)

L'althiazide de formule (I) comprend l'ensemble de forme de Palthiazide répondant à cette formule, à savoir :

• L' énantiomère de formule (IA)

• L' énantiomère de formule (IB)

• La forme racémique,

• L'ensemble des mélanges des formes (IA) et (IB), avec de teneurs en énantiomère (IA) compris de 1% à 99%, en particulier compris de 0% à 10%, de - 10% à 20%, de 20% à 30%, de 30% à 40%, de 40% à 50%, de 50% à 60%, de 60% à 70%, de 70% à 80% ; de 80% à 90% et de 90% à 100%, lesdites teneurs étant mesurées notamment selon la méthode d' analyse de la pureté chirale décrite dans la partie Matériels et Méthodes.

La présente invention concerne ainsi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ; ledit composé étant l'althiazide de formule (IA),

et étant sous sa forme pure ou avec une pureté chirale supérieure à 99%

La pureté chirale supérieure à 99% est mesurée par exemple selon la méthode d' analyse de la pureté chirale décrite dans la partie Matériels et Méthodes. La présente invention concerne ainsi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ; ledit composé étant l'althiazide de formule (IB),

et étant sous sa forme pure ou avec une pureté chirale supérieure à 99%.

La pureté chirale supérieure à 99% est mesurée par exemple selon la méthode d' analyse de la pureté chirale décrite dans la partie Matériels et Méthodes.

La présente invention concerne aussi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ; ledit composé étant la forme racémique de l'althiazide.

Au sens de la présente invention, il est entendu par « forme racémique de l'althiazide », un mélange d'énantiomère de l'althiazide dans lequel les puretés chirales respectives des énantiomères de formule (IA) et (IB) sont comprises de 49.5 % à 50.5 %, mesurées notamment selon la méthode d'analyse de la pureté chirale décrite dans la partie Matériels et Méthodes.

La présente invention concerne aussi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ; ledit composé étant de formule :

le 4-amino-6-chloro-l,3-benzenedisulfonamide (ACB) 1 ' Hydrochlorothiazide

le trichlormethiazide le cyclothiazide,

1 ' hydroflumethiazide le methyclothiazide

le bendrofluthiazide le chlorothiazide

La présente invention concerne aussi un composé pour son utilisation dans le traitement du cancer ladite famille de composés étant de formule (Vlla) ou (Vllb) :

(Vlla) (Vllb) l'Indapamide PAcetazolamide

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé selon l'invention de formule (II) pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dans le traitement des tumeurs cancéreuses primaires. Au sens de la présente invention, il est entendu par « tumeur cancéreuse primaire », une tumeur naissant au niveau même d'un organe.

La présente Invention concerne aussi Palthiazide de formule (I) ou un énantiomère de formule (IA) ou (IB) pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dès l'apparition de la tumeur primaire afin de prévenir la progression de celle-ci localement.

La présente Invention concerne aussi un composé de formule (IVa), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (V e), (Vf), (Via), (Vlla) ou (Vllb) pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dès l'apparition de la tumeur primaire afin de prévenir la progression de celle-ci localement.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (II) selon l'invention pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dans le traitement du cancer à l'état pré-métastatique.

La présente Invention concerne aussi l'althiazide de formule (I) ou un énantiomère de formule (IA) ou (IB) pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dans le traitement du cancer à l'état pré-métastatique.

La présente Invention concerne aussi un composé de formule (IVa), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (Ve), (Vf), (Via), (Vlla) ou (Vllb) pour son utilisation en association avec un composé anticancéreux dans le traitement du cancer à l'état pré-métastatique.

L'althiazide, utilisé seul, présente un effet anti-métastatique en conditions physiologiques normales. Au sens de l'invention, le « traitement du cancer à l'état pré- métastatique » se réfère à la prévention des tumeurs cancéreuses secondaires. Il s'agit d'un traitement du cancer avant l'apparition des métastases, dans le cas de tumeurs considérées à « haut risque » de métastases ou dès l'apparition des premières métastases et à la prévention de l'apparition des suivantes. Les termes « tumeur cancéreuse secondaire » ou « métastase » définissent le développement anormal de tissus provenant de la migration par la circulation par voie sanguine ou lymphatique de cellules cancéreuses. Au sens de la présente invention, l'expression « tumeurs à « haut risque » de métastases » désigne le dernier stade de stratification des patients, déterminé en fonction du stade de développement de la tumeur, du score de Gleason et de la valeur de PSA. Par exemple, les cancers de la prostate à haut risque sont les cancers localement avancés (T2c et T3 clinique), de haut grade (Gleason 4+3=7 et supérieur à 7) ou associée à une valeur de PSA total > 20 ng/ml ou dont la cinétique est > 2 ng/ml/an ou le temps de doublement < 3 mois.

Au sens de la présente Invention, un effet anti-migratoire est donc considéré comme un bon indicateur in vivo de l'activité anti-métastatique.

Une méthode permettant de déterminer si une molécule est susceptible de traiter le cancer à l'état pré-métastatique a été décrite dans la demande internationale WO 2011/007259. Ce procédé consiste à isoler des molécules capables d'inhiber l'émergence de cellules souches hématopoïetiques du plancher de l'aorte sans division cellulaire, mais par transition endothélio-hématopoïétiques. Cette émergence implique la perte de polarité cellulaire des cellules en émergence, la perte de jonctions cellulaires avec ces cellules voisines et l'acquisition de propriétés migratoires. Ce modèle est utilisé parce qu'il mime chacune des étapes de la transition épithélio-mésenchymateuse, la première étape de la métastase cancéreuse. La transition endothélio-hématopoïétiques a lieu dans une région de l'embryon appelée Aorte-Gonade-Mesonephros (AGM).

La colonisation des tissus hématopoïetiques par les cellules souches hématopoïetiques mime quant à elle l'apparition et/ou la progression d'une tumeur cancéreuse métastatique puisqu'elle implique l'intravasation, l'extravasation, ou encore la migration des CSH suivant un gradient de SDF1. Le premier tissu colonisé est le tissu hématopoïétique caudal (THC).

Afin d'évaluer l'inhibition de la transition endothélio-hématopoïétiques, des embryons transgéniques CD4LGFP (green fluorescent protein) sont utilisés. Les CSH y expriment la GFP sous le contrôle du promoteur CD41, ce qui permet de les suivre in vivo sous un microscope à fluorescence. Le read-out est le nombre de cellules souches hématopoïetiques CD41:GFP accumulées dans l'AGM (mimant l'initiation du processus métastatique) et/ou dans le THC de l'embryon de zebrafish (mimant la progression du processus métastatique). L'accumulation des cellules CD4LGFP dans le THC implique que chaque cellule a effectué une transition endothélio-hématopoïétiques, une intravasation, une extravasation au niveau du THC, s'est installé dans une niche stromale et a proliféré. Parallèlement, la caractérisation phénotypique des embryons permet d'isoler des composés capables de prévenir la transition endothélio-hématopoïétiques et leur migration vers le THC sans entraîner d'effets toxiques sur l'embryon en développement. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (II) selon l'invention pour son utilisation dans le traitement des tumeurs cancéreuses primaires et secondaires.

La présente invention concerne aussi le composé de formule (I), (IA) ou (IB) selon l'invention pour son utilisation dans le traitement des tumeurs cancéreuses primaires et secondaires.

La présente invention concerne aussi le composé de formule (IVa), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (Ve), (Vf), (Via), (Vlla) ou (Vllb) selon l'invention pour son utilisation dans le traitement des tumeurs cancéreuses primaires et secondaires.

Le composé de l'invention concerne ainsi une utilisation chez des patients pouvant être atteints de cancer à différents stades de la maladie : pour le traitement de tumeurs cancéreuses primaires uniquement ou après migration et présence de métastases.

En conditions d'hypoxie, c'est-à-dire dans les conditions retrouvées au sein d'une tumeur cancéreuse, l'althiazide de formule (I) est cytotoxique.

Au sens de l'Invention, les « conditions d'hypoxie » correspondent à une diminution du taux d'oxygène comprise de 1% à 0,1%. Cette condition est retrouvée au sein des tumeurs à croissance rapide pour lesquelles la microcirculation au sein des cellules est diminuée.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé selon l'invention de formule (II) pour son utilisation comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, notamment comme agent anti-métastatique, dans le traitement du cancer.

La présente invention concerne aussi le composé selon l'invention de formule (I), (IA) ou (IB) pour son utilisation comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anticancéreux, notamment comme agent anti-métastatique, dans le traitement du cancer.

La présente invention concerne aussi le composé selon l'invention de formule (IVa), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (Ve), (Vf), (Via), (Vlla) ou (Vllb) pour son utilisation comme agent anticancéreux ou potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, notamment comme agent anti- métastatique, dans le traitement du cancer.

Au sens de la présente invention, les termes « agents anti-cancéreux » désignent un composé permettant de lutter contre le cancer. Au sens de l'invention, l'expression « potentialisateur d'un agent anti-cancéreux » désigne un composé capable d'améliorer les propriétés anti-cancéreuses d'un agent anti-cancéreux.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé selon l'invention pour son utilisation comme agent anti-cancéreux dans le traitement du cancer ; ledit composé étant l'althiazide de formule (I)

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) selon l'invention pour son utilisation comme agent anti-métastatique dans le traitement du cancer, seul ou en association avec :

• un agent anti-mitotique, notamment vinca-alcaloïde, dolastatine, taxane ou épothilone,

• un agent anti-métabolite, notamment analogue pyrimidique, analogue des purines ou analogue de l'acide folique),

• un agent alkylant, notamment moutarde azotée, oxazaphosphorine, triazène et hydrazine, éthylène imine, nitrosourée, alkyle ou alcane sulfonate ou organoplatine,

• un agent modificateur de TADN, notamment inhibiteur des topo-isomérases I et II,

• un anti-angiogénique, notamment molécule interagissant avec les voies d'activation de l'angiogenèse tumorale, molécule directement anti-angiogénique, ou inhibiteur des métalloprotéinases de la matrice,

• un anticorps monoclonal.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé selon l'invention pour son utilisation comme potentialisateur d'un agent anti-cancéreux dans le traitement du cancer ; ledit composé étant l'althiazide de formule (I)

(I) Lorsqu'il est administré avec d'autres molécules anti-cancéreuses actives en conditions physiologiques normales, l'althiazide est cytotoxique. Lorsqu'il est administré avec d'autres molécules anti-cancéreuses actives en conditions d'hypoxie, l'althiazide est cytotoxique.

Au sens de l'Invention, les « conditions physiologiques normales » sont définies par des conditions où le taux d'oxygène est de 21%. Cet état est également appelé normoxie, en opposition aux conditions d'hypoxie dans lesquelles le taux d'oxygène est fortement diminué (de 1% à 0,1%).

L'althiazide de formule (I) potentialise les effets anti-cancéreux d'autres médicaments. Les Inventeurs ont ainsi observé une amélioration des médicaments déjà utilisés comme anti- cancéreux après ajout de l'althiazide. Par exemple, la rapamycine n'est plus active en conditions de tumeur hypoxiques et l'althiazide restaure cette activité.

Un test de cytotoxicité (MTT) permet de montrer une restauration ou une amélioration de l'activité cytotoxique des molécules anti-cancéreuses en association avec l'althiazide. Le principe de ce test repose sur la réduction du cycle tétrazolium en formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, conduisant à la formation d'un précipité de couleur violette dans la mitochondrie. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes (mais également à l'activité métabolique de chaque cellule). Après incubation des cellules avec du MTT pendant 3 h à 37 °C les cellules, leur mitochondries et donc les précipités violets de formazan sont dissout dans un mélange DMSO/EtOH (1 : 1). Un dosage par spectroscopie de la densité optique à une longueur d'onde comprise de 570 à 590 nm permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et métaboliquement actives. Le test est le même en condition normale et en condition d'hypoxie. L'althiazide potentialise l'effet cytotoxique des traitements administrés aux patients à différents stades du cancer, à la fois sur les tumeurs cancéreuses primaires et sur les tumeurs cancéreuses secondaires.

L'althiazide a pour effet de potentialiser et/ou de réduire les doses des autres agents anticancéreux et ainsi réduire les problèmes de tolérabilité.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) selon l'invention pour son utilisation en association avec un autre agent anti-cancéreux dans le traitement du cancer.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) selon l'invention pour son utilisation comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, ledit autre agent anti-cancéreux étant un rayonnement ou un agent chimique, notamment un agent de chimiothérapie, de radiothérapie, un radio-pharmaceutique ou un anti- angiogénique.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit autre agent anti-cancéreux étant choisi parmi

les agents alkylants tels que les alkylsulfonates notamment busulfan, la dacarbazine, la procarbazine, la cloretazine, les moutardes azotées telles que chlorméthine, melphalan, chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, les nitrosourées tels que la carmustine, la lomustine, la sémustine, la streptozocine l'altretamine, la fotémustine ;

les alcaloïdes antinéoplasiques tels que la vincristine, la vinblastine, la vinorelbine, la vindesine ;

les taxanes tel que le paclitaxel ou le taxotère ;

les antibiotiques antinéoplasiques tels que l'actinomycine, la bleomycine ; - les agents intercalants tels la mitoxantrone, l'étoposide, la bléomycine, l'actinomycine D, l'amsacrine, l'alliptinium ;

- les antimétabolites antinéoplasiques: les antagonistes des folates, le méthotrexate; les inhibiteurs de la synthèse des purines; les analogues de la purine tels que mercaptopurine, 6-thioguanine; les inhibiteurs de la synthèse des pyrimidines, les inhibiteurs d'aromatase, la capécitabine, les analogues de la pyrimidine tels que fluorouracil, gemcitabine, cytarabine et cytosine arabinoside; le bréquinar, la nelarabine ;

- les inhibiteurs de topoisomérases de groupe I et II tels que l'irinotecan, l'exatecan, le topotecan, le teniposide, la camptothécine ou l'étoposide ;

- les agonistes et antagonistes hormonaux anticancéreux incluant le tamoxifène ;

- les inhibiteurs de kinase, tels que l'imatinib, le nilotinib et le dasatinib, la midaustorin, le sorafenib, le lestaurtinib, le tandutinib, le sirolimus, l'everolimus ou le tensirolimus ;

les inhibiteurs de facteurs de croissance ;

- les anti-inflammatoires tels que le pentosane polysulfate, les corticostéroïdes, la prednisone, la dexamethasone ;

le ceplene (dichlorhydrate d'histamine) ; les antracyclines tels que la daunorubicine, l'epirubicine, la pirarubicine, l'idarubicine, la zorubicine, l'aclarubicine, l'annamycine, la doxorubicine, la mitomycine et la méthramycine ;

les complexes métalliques anticancéreux, les dérivés du platine tel que le cisplatine, le carboplatine, l'oxaliplatine, le satraplatine ;

l'interféron alpha ;

le triphénylthiophosphoramide ;

les agents antiangiogéniques ;

la thalidomide ;

les inhibiteurs de la farnesyl-tranferase tel le tipifarnib ;

les inhibiteurs de l'ADN methyltransferase tel le MG98 ;

les adjuvants d'immunothérapie tel le gemtuzumab ozogamicin, le HuM 195 ; les agents biothérapeutiques tel le CT388-I L3;

- les antisens tel le GTI-2040 ;

les vaccins.

Selon un mode de réalisation la présente invention concerne le composé de formule (II) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux êtres humains ou aux animaux à un dosage de 0,016 mg/kg à 16 mg/kg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. La présente invention concerne aussi le composé de formule (I), (IA) ou (IB) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux êtres humains ou aux animaux à un dosage de 0,016 mg/kg à 16 mg/kg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

La présente invention concerne aussi le composé de formule (IVa), (Va), (Vb), (Vc), (Vd), (Ve), (Vf), (Via), (Vlla) ou (Vllb) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux êtres humains ou aux animaux à un dosage de 0,016 mg/kg à 16 mg/kg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Au sens de la présente invention, il est entendu par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est de pureté et de qualité suffisante pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.

Les « excipients pharmaceutiquement acceptables » s'entendent de substances non toxiques, biologiquement tolérables et biologiquement aptes à être administrées à un sujet, tel qu'une substance inerte, ajoutée à une composition pharmacologique ou utilisée comme véhicule, support ou diluant pour faciliter l'administration d'un agent et qui est compatible avec celui- ci. Des exemples d'excipients pharmaceutiquement acceptables incluent, par exemple, au sens de l'invention, les huiles, les tensioactifs (tels que le Tween), des alcools, des polyols, le glycérol et les huiles végétales, l'eau, des solutions salines, des solutions de glycérol, l'éthanol, le N-(l-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA), diolesyl- phosphatidyl éthanolamine (DOPE), et des liposomes.

Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux êtres humains à un dosage de 0,016 mg/kg à 1,6 mg/kg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. En-dessous de 0,016 mg/kg en substance active, l'althiazide de formule (I) n'est pas efficace lors d'une administration à l'être humain. Au-dessus de 1,6 mg/kg en substance active, l'althiazide de formule (I) provoque une toxicité chez l'être humain.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux animaux à un dosage de 0,1 mg/kg à 16 mg/kg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Au sens de l'invention, une administration aux animaux inclut une administration, en particulier, aux animaux domestiques tels que le chien ou le chat.

En-dessous de 0,1 mg/kg en substance active, l'althiazide de formule (I) n'est pas efficace lors d'une administration à l'animal. Au-dessus de 16 mg/kg en substance active, l'althiazide de formule (I) provoque une toxicité chez l'animal.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré, aux êtres humains ou aux animaux, sous forme unitaire de 1 mg à 160 mg, en mélange avec des pharmaceutiquement acceptables.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux êtres humains sous forme unitaire de 1 mg à 100 mg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. En-dessous de 1 mg de substance active, l'althiazide de formule (I) n'est pas efficace lors d'une administration à l'être humain. Au-dessus de 100 mg de substance active, l'althiazide de formule (I) provoque une toxicité chez l'être humain.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, ledit composé étant formulé pour être administré aux animaux sous forme unitaire de 1 mg à 160 mg, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables. En-dessous de 1 mg de substance active, l'althiazide de formule (I) n'est pas efficace lors d'une administration à l'animal. Au-dessus de 160 mg de substance active, l'althiazide de formule (I) provoque une toxicité chez l'animal.

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode pour le traitement du cancer comprenant l'administration, aux êtres humains, du composé de formule (I) selon l'invention, utilisé comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anticancéreux, à un dosage de 1 mg/kg/j à 100 mg/kg/j, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode pour le traitement du cancer comprenant l'administration, aux animaux du composé de formule (I) selon l'invention, utilisé comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, à un dosage de 1 mg/kg/j à 160 mg/kg/j, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Lorsque l'althiazide de formule (I), selon l'invention, est utilisé comme potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, les doses en substances actives telles que définies ci-dessus sont inférieures, en raison d'une synergie entre l'althiazide de formule (I) et l'agent anti-cancéreux en association

Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode pour le traitement du cancer comprenant l'administration, aux animaux, du composé de formule (I) selon l'invention, à un dosage de 1 mg/kg/j à 160 mg/kg/j, en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables.

Lorsque l'althiazide de formule (I), selon l'invention, est utilisé comme potentialisateur d'un agent anti-cancéreux, les doses en substances actives telles que définies ci-dessus sont inférieures, en raison d'une synergie entre l'althiazide de formule (I) et l'agent anti-cancéreux en association.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation comme agent anti-cancéreux ou potentialisateur d'un agent anti-cancéreux selon l'invention, ledit composé étant utilisé par administration par voies orale, parentérale, spray d'inhalation, voies nasale, vaginale, rectale, sous-linguale ou locale, notamment topique.

Par « voies parentérales » on entend par exemple les voies intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, intracérébroventriculaire, intracisternale ou sous-cutanée. De préférence le composé de l'Invention est utilisé par administration par « voie orale ». Une administration par voie orale est privilégiée pour un composé anti-métastatique qui est donné comme traitement journalier et sur le long terme (plusieurs années).

Les formes unitaires d'administration par voie orale appropriées comprennent les comprimés, les gélules molles ou dures, les capsules, les poudres, les granules, les solutions ou suspensions orales et les formes d'administration intraveineuses.

Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.

On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.

Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié.

Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélangeant avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs de goût ou des édulcorants. Pour une administration par voie intraveineuse, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.

Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. Les formulations appropriées pour la forme d'administration choisie sont connues par l'homme du métier et décrites, par exemple dans : Remington, The science and Practice of Pharmacy, 22 ^ème édition, 2013, The Pharmaceufical Press.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé pour son utilisation selon l'invention, ledit cancer étant

- un cancer tête et cou

un cancer du poumon ;

un cancer digestif, tel qu'un cancer du rectum, un cancer de l'estomac ; un cancer gynécologique tel qu'un cancer de l'utérus, un cancer du col de l'utérus, un cancer du vagin, cancer des ovaires ;

- un cancer urogénital tel qu'un cancer de la vessie, un cancer de la prostate, des vésicules séminales, des testicules, tumeurs des cellules germinales

un cancer ORL tel qu'un cancer de la bouche, des joues, du palais, de la langue, des amygdales, du pharynx, de l'oropharynx et de l'hypopharynx ou un cancer des fosses nasales, des sinus, du nasopharynx et du larynx ;

un cancer du sein ;

cancer de l'intestin grêle ;

cancer du colon ;

cancer du foie ;

- cancer des canaux biliaires ;

cancer de la vésicule biliaire ;

cancer du pancréas ;

cancers du rein ;

- cancers des glandes endocrines y compris cancer de la thyroïde, de l'hypophyse, des glandes surrénales ;

cancers de la peau y compris hémangiomes, mélanomes, sarcomes, incluant le sarcome de Kaposi ;

- tumeurs du cerveau, des nerfs, des yeux, des méninges, incluant astrocytomes, gliomes, glioblastomes, rétinoblastomes, neurinomes, neuroblastomes, schwannomes, méningiomes ;

- tumeurs malignes hématopoïétiques ; leucémies, (Acute Lymphocytic Leukemia (ALL), Acute Myeloid Leukemia (AML), Clironic Myeloid Leukemia (CML), Chronic lymphocytic leukemia (CLL)) chloromes, plasmocytomes, leucémies des cellules T ou Β, lymphomes non hodgkiniens ou hodgkiniens, myélomes, hémopathies malignes diverses ;

toute forme de cancer à haut risque métastatique.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne le composé de formule (I) pour son utilisation selon l'invention, en association avec un autre agent anti-cancéreux, ledit autre agent anti-cancéreux étant un rayonnement, notamment un agent de radiothérapie, ledit cancer étant

un cancer de la tête ;

- un cancer du cou ;

- un cancer du poumon ;

- un cancer digestif, tel qu'un cancer du rectum, un cancer de l'estomac ;

un cancer gynécologique tel qu'un cancer de l'utérus, un cancer du col de l'utérus, un cancer du vagin, cancer des ovaires ;

- un cancer urogénital tel qu'un cancer de la vessie, un cancer de la prostate, des vésicules séminales, des testicules, tumeurs des cellules germinales ;

un cancer ORL tel qu'un cancer de la bouche, des joues, du palais, de la langue, des amygdales, du pharynx, de l'oropharynx et de l'hypopharynx ou un cancer des fosses nasales, des sinus, du nasopharynx et du larynx ;

un cancer du sein ;

- cancer de l'intestin grêle ;

cancer du colon ;

cancer du foie ;

cancer des canaux biliaires ;

cancer de la vésicule biliaire ;

- cancer du pancréas ;

cancers du rein ;

cancers des glandes endocrines y compris cancer de la thyroïde, de l'hypophyse, des glandes surrénales ;

cancers de la peau y compris hémangiomes, mélanomes, sarcomes, incluant le sarcome de Kaposi ;

- tumeurs du cerveau, des nerfs, des yeux, des méninges, incluant astrocytomes, gliomes, glioblastomes, rétinoblastomes, neurinomes, neuroblastomes, schwannomes, méningiomes ; tumeurs malignes hématopoïétiques ; leucémies, (Acute Lymphocytic Leukemia (ALL), Acute Myeloid Leukemia (AML), Clironic Myeloid Leukemia (CML), Chrome lymphocytic leukemia (CLL)) chloromes, plasmocytomes, leucémies des cellules T ou B, lymphomes non hodgkiniens ou hodgkiniens, myélomes, hémopathies malignes diverses ;

- toute forme de cancer à haut risque métastatique

La présente invention concerne aussi un procédé de séparation de la forme racémique de l'althiazide de formule (I), pour obtenir les énantiomères de formule (IA) et de formule (IB) sous forme pure, ou avec une pureté chirale supérieure à 99%, par une technique de séparation par fluide supercritique (SFC), notamment à une température comprise de la température ambiante à 80°C et notamment par SFC avec une phase mobile acide ou par SFC avec une phase mobile comprenant de l'acétonitrile.

Ce mode de séparation permet d'obtenir une grande pureté des énantiomères (>99%), tout en limitant la perte d'énantiomère lors de la séparation. Par exemple, lors de la séparation avec de l'acétonitrile, les puretés obtenues sont de 100% pour le premier énantiomère (IA) et de 99.4 % pour le second énantiomère (IB), avec un taux de récupération massique des deux énantiomères (IA) et (IB) de 83.7 %

La présente invention concerne aussi un procédé de conservation des énantiomères, pour préserver leur pureté chirale, par un stockage à une température maximale de 5°C, et à l'abri de la lumière.

Ce mode de conservation permet de conserver la pureté chirale du produit, mais ne permet pas de totalement préserver les énantiomères de l'althiazide d'une dégradation en un autre produit qu'une forme d'althiazide.

La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique contenant un composé de formule (IA) ou (IB) en association avec un véhicule pharmacologiquement acceptable.

GLOSSAIRE :

PS A (prostate spécifie antigeri) : antigène prostatique spécifique AGM : région aorte-gonade-mesonephros CSH : Cellules souches hématopoïétiques THC : Tissus hématopoïétique caudal

GFP (Green fluorescent protein) : Protéine fluorescente verte

NOEC (No Observed Effect Concentration) : concentration à laquelle le composé testé n'est pas efficace

EC50 (Effective concentration 50%) : concentration à laquelle le composé testé a une efficacité de 50 %

EHT : transition endothélio-hématopoïetique

EMT {epithelial-mesenchymal transition) : transition épithélio-mesenchymateuse

ACB : le 4-amino-6-chloro-l,3-benzenedisulfonamide

FIGURES

Figure 1 : Similitudes des processus de migration des cellules endothéliales et épithéliales lors de ΓΕΗΤ et ΓΕΜΤ. Les principales étapes sont conservées (perte de polarité et de jonctions cellulaires, dégradation et migration à travers la matrice extra cellulaire, intravasation et extravasation dans la circulation sanguine puis colonisation et prolifération dans les tissus distants).

Figure 2 : Observation de la sortie et de la migration locale des CSH dans la région Aorte-Gonade-Mesonephros (AGM) de l'embryon de zebrafish au stade 48hpf. Après traitement avec I'althiazide à ΙΟμΜ on observe une réduction de la perte de jonction et de la migration locale des CSH.

Figure 3 : Pourcentage de cellules accumulées dans le THC après incubation des embryons de zebrafish en présence de molécules appartenant aux classes thérapeutiques diurétique ou anti-hypertenseur. L'althiazide est le composé chimique le plus efficace sur Pirihibition de la migration des CSH dans les tissus distants. Le dasatinib est utilisé comme molécule de référence. Les composés sont testés à la concentration de 10 μΜ.

- Figure 4 : Validation de l'effet de l'althiazide sur la migration des CSH dans l'embryon de zebrafish in vivo. Diminution du nombre de cellules ayant migrés dans le THC de 36,2 % après traitement par l'althiazide par balnéation à la concentration de 10 μΜ. Le nombre d'embryons est respectivement n = 64 et n = 74. Barre d'erreur calculée avec l'erreur-type. Test statistique: test de student. p-value: 2.9864E-7 Figure 5 : Comparaison des effets anti -migratoires du dasatinib et de l'althiazide sur l'embryon de zebrafish in vivo. Les deux molécules sont diluées à la concentration de 10 μΜ et testées par balnéation sur des embryons de zebrafish. La solution contrôle contient une quantité équivalente de DMSO (1 %). Dans ce test, les nombres d'embryons sont respectivement de n = 80, n = 79 et n = 81. Barre d'erreur calculée avec l'erreur-type. Test statistique: test de student. p-value: 5.6595E-6

Figure 6 : Courbe de l'effet dose de l'althiazide sur l'embryon de zebrafish. Observation du nombre de cellules ayant migrés dans les tissus distants (THC) après traitement par balnéation (pourcentage d'efficacité) avec une solution contenant l'althiazide aux concentrations de 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ. NOEC : No Observed Effect Concentration. EC50: Effective concentration 50 %.

Figure 7 : Evaluation de la toxicité de l'althiazide et du dasatinib sur l'embryon de zebrafish par la mesure du pourcentage de survie des embryons en fonction de la concentration d'althiazide et de dasatinib (A) ou de la durée du traitement (B). Les molécules sont diluées aux concentrations de 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ et 1000 μΜ et incubées durant 24, 48 et 72 heures. La solution contrôle contient une quantité équivalente de DMSO (1 %). Le nombre d'embryons étant respectivement n = 50, n = 50 et n = 50). Barre d'erreur calculée avec l'erreur-type. Test statistique: test de student. p-value: 1.49852E-7.

Figure 8 : Test de migration et de cytotoxicité sur des cellules 4T1 en culture en présence d'althiazide (A) ou de dasatinib (B) aux concentrations de 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ et 100 μΜ. Barre d'erreur calculée avec l'erreur-type.

Figure 9 : Pourcentage de cellules accumulées dans le THC après incubation des embryons de zebrafish en présence de molécules appartenant à la classe des composés thiazidiques à différentes concentrations. L'althiazide est le composé chimique le plus efficace sur l'inhibition de la migration des cellules CD41 dans les tissus distants. Les composés sont testés à la concentration de 10 μΜ ou de 25 μΜ.

Figure 10 : Taux de cellules ayant migrées au cours d'un test de migration sur des cellules MDA-MB-231, en fonction de la quantité d'althiazide ajoutée (10, 50 ou 100 μΜ) par rapport au test de contrôle. Figure 11 : Impact de l'althiazide sur l'expression des facteurs de transcription des gènes impliqués dans la transition épithelio-mésenchymateuse (TEM) en condition hypoxique. Les gènes ZEB1, SNAIL, , Vimentin et N-cadh ont un impact délétère et doivent être inhibés. Le gène E-cadh à un effet bénéfique et doit être surexprimé. Les colonnes en blanc mentionnent le contrôle tandis que les colonnes en noir sont les résultats d'expression de ces gènes avec une concentration en althiazide de ΙΟΟμΜ.

Figure 12 : Test de viabilité cellulaire et de cytotoxicité sur des cellules MDA- MB-231 en présence de doxorubicine seule (colonnes blanches) ou d'un mélange althiazide et doxorubicine (colonnes noires), à différente concentration (doxorubicine :0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 μΜ ; althiazide 100 μΜ).

- Figure 13 : Test de cytotoxicité sur des cellules MDA-MB-231 en présence de doxorubicine seule (Contrôle) ou de d'un mélange de doxorubicine additionné d'un composé de l'invention à une concentration de 50μΜ.

Figure 14 : Test préparatoire de séparation entre les deux énantiomères de l'althiazide avec 5 injections de 2mL chacune. Le trait en bas des pics indique les moments d'ouverture de la collecte de chaque produit. Le premier pic correspond à l'énantiomère AZ(A) et le second à l'énantiomère AZ(B).

- Figure 15 : Chromatogramme de l'althiazide AZ-M015 ( forme racémique). Le premier pic avec un temps de rétention de 10.15 minutes correspond au produit AZ(A), et le second pic avec un temps de rétention de 13.4 minutes correspond au produit AZ(B).

- Figure 16 : Chromatogramme de l'échantillon EV-VZWOO 1-070-002. Le premier pic avec un temps de rétention de 10.2 minutes correspond au produit AZ(A), et le second pic avec un temps de rétention de 13.5 minutes correspond au produit AZ(B).

- Figure 17 : Chromatogramme de l'échantillon EV-VZWOO 1-070-005 après 24h de stockage sous température contrôlée à 5°C et protégé de la lumière. Le premier pic avec un temps de rétention de 10.09 minutes correspond au produit AZ(A), et aucun pic proche de 13.5 minutes n'est visible.

- Figure 18 : Chromatogramme de l'échantillon EV-VZWOO 1-070-006 après 24h de stockage à température ambiante sans protection contre la lumière. Le premier pic avec un temps de rétention de 10.25 minutes correspond au produit AZ(A), et le second pic avec un temps de rétention de 13.79 minutes correspond au produit AZ(B).

MATERIELS ET METHODES

Le batch d'althiazide utilisé est noté AZ-M015 et est sous forme racémique. Le premier énantiomère de formule (IA) et issu de ΓΑΖ-Μ015 est noté AZ(A). Le second énantiomère de formule (IB) et issu de ΓΑΖ-Μ015 est noté AZ(B).

L'analyse de la pureté chirale des produits à tester a été réalisée par une technique de séparation par fluide supercritique (SFC) sur un chromatographe Berger prep, commercialisé par Thar Instruments La phase mobile de la séparation est constituée d'un mélange de méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique et de C0 ₂ dans un rapport 20/80. La phase stationnaire choisie est une colonne Chiralpak IC 59m, de 250 mm par 20mm, commercialisé par sigma aldrich. Le débit d'injection est de 50 ml par minutes, à 40°C sous une pression de 100 bars. Le produit à analyser est dissous dans du méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique, avec une concentration de 1 mg/ml. 10 μΐ de ce produit est injecté. Le détecteur est un détecteur UV avec une longueur d'onde supérieure à 275 ran.

L'analyse de la pureté en phase inverse des produits à tester a été réalisée par une technique de chromatographie à phase inverse par chromatographie liquide à ultra haute pression (UHPLC) sur un chromatographe en phase liquide Waters UPLC2, commercialisé par Waters. La phase mobile de la séparation varie au cours de la méthode selon le protocole du tableau 1.

Tableau 1 : Composition de la phase mobile utilisée pour l'analyse par UHPLC. Entre chaque point, le flux varie par gradient (TFA : Trifluoroacétate) La colonne utilisée est une colonne Waters Acquity UPLC CSH Cl 8 1.7 μηι, 2.1*100 mm, commercialisé par Water^Le flux de phase mobile est de 0,6 ml/minute. Le détecteur est un détecteur UV avec une longueur d'onde de 210 nm. Le produit à analyser est dissous dans de l'acétonitrile, avec une concentration de 1 mg/ml, et le volume injecté est de 1 μL.

La séparation des deux énantiomères de l'althiazide AZ-M015 AZ(A) et AZ(B) a été réalisée par une technique de séparation par fluide supercritique (SFC) sur un chromatographe Berger prep. Le décalage du temps de rétention de chaque énantiomère permet de récupérer en sortie de séparation, en premier le composé AZ(A) et en second le composé AZ(B). La récupération est indexée sur le signal du détecteur pour l'ouverture et la fermeture de la récupération de chaque composé.

La phase mobile de la séparation est constituée d'un mélange de méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique et de C0 ₂ dans un rapport 20/80 ou d'un mélange d'acétonitrile et de C0 ₂ dans un rapport 30/70. La phase stationnaire choisie est une colonne Chiralpak IC 5μπι, de 250 mm par 20mm. Le débit d'injection est de 50 ml par minutes, à 40°C sous une pression de 100 bars. Le produit à séparer est dissous dans un mélange de méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique ou dans de l'acétonitrile. Une série d'injections est réalisée. Le détecteur est un détecteur UV avec une longueur d'onde supérieure à 275 nm. La collecte des produits respectifs est commencée quand le signal dépasse une valeur de détection de seuil haut et est stoppée quand le signal passe en dessous d'une valeur de détection de seuil bas. Les valeurs de seuil haut et seuil bas sont choisies lors d'un essai préparatoire en fonction d'un compromis entre la quantité d' énantiomères récupérée, la pureté souhaitée et les conditions d'analyse. Les produits collectés sont évaporés avant d'être analysés pour connaître leur pureté respective.

La solubilisation de l'althiazide et des énantiomères a été obtenue par une solubilisation dans un solvant constitué de 95% de Tris 1M au pH10,8 et complété avec 5% d'éthanol pur. L'althiazide et les énantiomères sont resuspendus à la concentration de 2mg/ml. Chacune des solutions est vortexée 30 secondes puis placée dans un bain à ultrason pour une sonication de 5min ; cette opération est répétée une fois. La dissolution est totale malgré l'absence de DMSO.

La solubilisation de l'althiazide et des énantiomères a également été obtenue par une solubilisation dans une solution constitué d'un mélange de 3,7% de NaHC0 ₃ 0.2M et de 21% de Na ₂ C0 ₃ 0.2M au pH10,6 et complété avec de l'eau pur. L'althiazide et les énantiomères sont resuspendus à la concentration de 2,5mg/ml. Chacune des solutions est vortexée 30 secondes puis placée dans un bain à ultrason pour une sonication de 1min. La dissolution est totale malgré l'absence de DMSO.

Les tests de stabilité des énantiomères ont été réalisés par une comparaison de la racémisation et de la dégradation des échantillons stockés soit à température ambiante sans protection contre la lumière, soit sous température contrôlée à 5°C et à l'abri de la lumière.

Les produits stockés sont analysés régulièrement (T=0, lh, 2h, 3h, 6h, 24h) pour suivre l'évolution de la racémisation des énantiomères.

La lignée de zebrafish transgénique Tg(cd41 :GFP) est maintenue en conformité avec les protocoles décrits par le comité éthique en expérimentation animale. Les poissons sont maintenus à la température de 28 °C et leur stade de développement est déterminé comme précédemment. Les molécules sont testées sur des embryons de zebrafish au stade 25 hpf. Les embryons sont déchorionnés et transférés dans une plaque 96 puits (1 embryon / puits) contenant les composés à tester dans un volume final de 100 μΐ du milieu de croissance des embryons (60 μg sel pour 1ml H ₂ 0). Pour les composés chimiques dilués en DMSO, la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 1%. Les embryons traités sont incubés 24 heures dans un incubateur à 28 °C.

Les embryons sont imagés à l'aide d'un lecteur de plaque après avoir été anesthésiés avec 0,16 % de tricaïne (éthyl-3-aminobenzoate). Une quantification du nombre de cellules fluorescentes (CD41 :GFP) accumulées dans le CHT est réalisée.

L'étude de toxicité est réalisée sur 72 heures. Les embryons sont traités à 25 hpf avec les doses utilisées pour le test de composés chimiques de chacun des composés, dans une plaque 96 puits, dans un volume final de 100 μΐ du milieu de croissance des embryons. Les embryons sont incubés 72 h à 28 °C. Le milieu est changé toutes les 24 h. Le taux de survie des embryons et l'apparition de défauts de développement sont analysés tous les jours.

Les tests de migration cellulaires sur la lignée cellulaire 4T1 sont réalisés in vitro dans des plaques 12 puits, sur la lignée cellulaire 4T1. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau (S VF) et incubées à 37 °C et 5 % de C0 ₂ . La monocouche cellulaire est blessée à l'aide d'une pointe de pipette de 10 μ. Le milieu est aspiré et remplacé par un milieu contenant les composés à tester aux concentrations décrites. Les puits sont imagés à l'aide d'un microscope et la réparation de la surface blessée mesurée aux temps indiqués afin de mettre en évidence le pouvoir anti migratoire cellulaire des composés chimiques testés. La moyenne des mesures obtenues est comparée aux puits contrôles : (valeur moyenne des composés traités/ valeur moyenne des contrôles) *100 = % de la valeur moyenne.

Les tests de migration cellulaires sur la lignée cellulaire MDA-MB-231 sont réalisés in vitro dans des plaques 96 puits. Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées à la densité de 50000 cellules par puit, afin de former une monocouche. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture DMEM supplémenté de 0.2 % de sérum de veau fœtal et incubées à 37 °C, 5 % de C0 ₂ et 1% d'0 ₂ pendant 24h. La monocouche cellulaire est blessée à l'aide d'une pointe de pipette. Les cellules sont alors rincées à l'aide de PB S afin d'éliminer les cellules en suspension puis les différents traitements sont ajoutées, ainsi que du DMEM supplémenté de 10 % de SVF. Les cellules sont incubées pendant 18 heures à 37°C, 5% C02 et 20% 02.

Une première série d'images de chaque puits (centre du puits) a été réalisée en début d'expérience (t=0) et après 18 heures de migration (t=18) à l'aide d'un microscope Nikon objectif 4x. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel ImageJ (National Institue of Health, USA).

Les traitements ont été réalisés en triplicata et la manipulation a été effectuée 3 fois.

Les tests de cytotoxicité sont réalisés en culture cellulaire en plaques 96 puits, sur la lignée de cellule 4T1. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal (condition contrôle) ou bien placées en présence d'une solution MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) à 1 mg/ml dans du milieu DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal (100 μΐ par puits). Les cellules sont incubées à 37 °C et 5 % de C0 ₂ pendant 4 heures. La réaction est stoppée par addition de 100 μΐ d'une solution contenant 10 % de SDS et 0,01 M de HC1. Les cellules sont placées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de C0 ₂ pendant 2 heures. L'absorbance est mesurée entre 570 et 590 irai. Le contrôle négatif est réalisé sur un puits sans cellules, contenant 200 μΐ d'une solution à 1 mg/ml de MTT dilué dans du milieu de culture DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal. La moyenne des mesures obtenues est comparée aux puits contrôles : (valeur moyenne des composés traités/ valeur moyenne des contrôles) * 100 = % de la valeur moyenne.

Les cultures cellulaires sont réalisées sur des lignées de cellules épithéliales cancéreuses mammaires humaines MDA-MB-231 (HTB-26™), issues de métastases présentes dans un épanchement pleural de patiente atteinte d'un adénocarcinome mammaire. Cette lignée est utilisée comme modèle de cellule cancéreuse triple négative (pas d'expression des récepteurs nucléaires aux œstrogènes de type ER, des récepteurs nucléaires à la progestérone ni de ne surexpression de l'oncogène codant pour la protéine HER2 (Human Epidermal Growth factor Receptor-2). Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (Eurobio, Fance) supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF) (Eurobio, Fance) à 37°C, 5% C02. Le milieu a été changé tous les 3 jours.

Les cellules ont été placées dans une atmosphère contrôlée à 1% d'oxygène 24h avant l'application des différents traitements. La prolifération est mesurée grâce à une coloration au cristal violet. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 10 000 cellules par puits. Après 24h de culture à 37°C, 5% C02 et 1% 02, le milieu a été renouvelé et additionné d'althiazide (aux concentrations décrites). Les cellules ont été incubées durant 24, 48 ou 72 heures supplémentaires à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Après rinçage des cellules avec du PBS, 50μ1 d'une solution de cristal violet 0,5% dans 20% éthanol a été ajoutée dans chaque puits. La plaque a été incubée à température ambiante sous agitation pendant 15 minutes. Les cellules ont été lavées puis lysées par une solution de SDS à 1 % afin de solubiliser le cristal violet. L'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide du spectrophotomètre Tecan Sunrise. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle.

La viabilité cellulaire est déterminée via l'indice IC50, mesuré par la technique MTT (bromure de 2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazolium) (Mosmann, 1983). Ce test colorimétrique est basé sur la réduction des sels de tétrazolium jaunes en cristaux de formazan violets insolubles en solution aqueuse. La mesure par spectrophotométrie de l'absorbance à 570 nm est directement proportionnelle au nombre de cellules viables

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 25 000 cellules par puits. Après 24h de culture à 37°C, 5% C02 et 1% 02, le milieu a été renouvelé et complémenté de doses croissantes de doxorubicine +/- althiazide. Les cellules ont été incubées pendant 24h à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Les cellules MDA-MB-231 ont été lavées puis incubées pendant 1 heure à 37°C avec 100 μL d'une solution de MTT à 0,5 mg / mL préparée dans du milieu de culture. Les cristaux de formazan ont été dissous dans 100 de DMSO et l'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide du spectrophotomètre Tecan Sunrise. L'IC50 a été déterminée à l'aide du logicel Graphpad Prism 5.0. Les traitements ont été réalisés en triplicata et la manipulation a été effectuée 5 fois.

L'expression des ARNm est mesurée par la méthode q-RT-PCR. Les cellules ont été ensemencées à la densité de 500 000 cellules / puits dans des plaques 6 puits. Après 24 heures à 37°C, 5% C02 et 1% 02, le milieu a été renouvelé et additionné des différents traitements. L'ARN a été isolé à l'aide du TRI Reagent® (sigma), dosé et rétro-transcrit en ADN complémentaire à l'aide du PrimeScript RT Reagent Kit (Takara). Les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes d'intérêts ont été déterminés par PCR quantitative (LightCycler® 480 Instrument II) avec les amorces listées dans le tableau 2:

Tableau 2 : Liste des amorces utilisées par qPCR

Les résultats sont calculés en suivant la méthode des Delta Delta Ct (Δ ACt). Les effets anti-métasta tique de l'althiazide sur la souris sont évalués sur des souris immunodéprimées dans lesquelles sont injectées des cellules issues d'une lignée tumorale dans la glande mammaire.

Les souris suivent un traitement sur 4 semaines avec une injection d'althiazide chaque jour. Les tumeurs mammaires des souris sont mesurées 3 fois par semaine durant 4 semaines.

Les souris pour lesquelles la tumeur mammaire a atteint 2g, sont sacrifiées et le nombre de métastases cancéreuses ayant envahi le poumon est comptabilisé.

Ce nombre est comparé au lot de souris contrôle injectées avec la même lignée de cellules tumorales et traitées au PBS. Une diminution du nombre de métastases dans les poumons des souris traitées avec l'althiazide par rapport au lot contrôle dans lequel les souris sont traitées avec du PBS, permet de valider l'effet anti-métastatique de l'althiazide in vivo chez la souris.

Les effets potentialisateurs de l'althiazide sur un agent anti-cancéreux chez la souris sont évalués sur des souris immunodéprimées dans lesquelles sont injectées des cellules issues d'une lignée tumorale dans la glande mammaire.

La dose maximale d'althiazide est donnée seule ou en association avec l'agent anti-cancéreux. Plusieurs doses d'agent anti-cancéreux sont testées.

Les souris suivent un traitement sur 4 semaines à raison d'une injection d'agent anticancéreux par semaine sur 4 semaines et une injection d'althiazide chaque jour durant les 4 semaines. La première dose d'althiazide est donnée le premier jour après l'injection des cellules issues d'une lignée tumorale dans la glande mammaire.

Les tumeurs mammaires des souris sont mesurées 3 fois par semaine et comparées aux lots de souris traitées au PBS seul ou à l'althiazide seul.

Une réduction de la taille des tumeurs cancéreuses dans le lot de souris traité avec l'althiazide et la doxorubicine par rapport au lot contrôle ou les souris sont traitées avec la doxorubicine seule, permet de valider l'effet potentialisateur de l'althiazide sur l'activité de la doxorubicine in vivo chez la souris. EXEMPLES

Exemple 1 : Action anti-métastatique de l'althiazide : test d'initiation et de progression du processus métastatique sur l'embryon de zebrafish.

L'althiazide a été testée sur l'embryon de zebrafish selon le procédé précédemment décrit dans la demande internationale WO 2011/007259. Ce procédé consiste à isoler des molécules capables d'inhiber l'émergence de cellules souches hématopoïétiques du plancher de l'aorte sans division cellulaire, mais par transition endothélio-hématopoïétiques. Cette émergence implique la perte de polarité cellulaire des cellules en émergence, la perte de jonctions cellulaires avec ces cellules voisines et l'acquisition de propriétés migratoires. Ce modèle est utilisé, dans le contexte de l'Invention, parce qu'il mime chacune des étapes de la transition épithélio-mésenchymateuse, la première étape de la métastase cancéreuse. La transition endothélio-hématopoïétiques a lieu dans une région de l'embryon appelée Aorte- Gonade-Mesonephros (AGM).

La colonisation des tissus hématopoïétiques par les cellules souches hématopoïétiques mime quant à elle l'apparition et/ou la progression d'une tumeur métastatique puisqu'elle implique l'intravasation, l'extravasation, ou encore la migration des CSH suivant un gradient de SDF1. Le premier tissu colonisé est le tissu hématopoïétique caudal (THC). Ce processus physiologique est considéré, dans le contexte de l'Invention, comme représentatif de l'apparition et/ou la progression d'une tumeur métastatique.

Afin d'évaluer l'inhibition de la transition endothélio-hématopoïétiques, des embryons transgéniques CD41:green fluorescent protein (GFP), dans lesquels les cellules souches hématopoïétiques (CSH) exprime la GFP, ont été utilisés, ce qui permet de les suivre in vivo sous un microscope à fluorescence.

Chaque embryon CD41 :GFP au stade de développement 25 heures post fécondation (hpf) a été ajouté dans un puits d'une plaque 96 puits contenant un des composés à tester. Les embryons traités ont été incubés 24 heures à 28 °C.

Chaque puits contenant les embryons à 50hpf a ensuite été imagé à l'aide d'un microscope à fluorescence pour analyser le nombre de cellules dispersées dans l'embryon et quantifier leur répartition dans les différentes régions de l'embryon.

Le read-out est le nombre de cellules souches hématopoïétiques CD41 :GFP accumulées dans l'AGM (mimant l'initiation du processus métastatique) et/ou dans le THC de l'embryon de zebrafish (mimant la progression du processus métastatique). L'accumulation des cellules CD41 :GFP dans le THC implique que chaque cellule a effectué une transition endothélio-hématopoïétiques, une intravasation, une extravasation au niveau du THC, s'est installé dans une niche stromale et a proliféré (Figure 1). Parallèlement, la caractérisation phénotypique des embryons a permis d'isoler des composés capables de prévenir la transition endothélio-hématopoïétiques et leur migration vers le THC sans entraîner d'effet toxique sur l'embryon en développement.

Selon la méthodologie décrite précédemment, l'althiazide s'est révélé efficace contre la migration des CSH localement et vers les organes distants (THC).

Après traitement à la concentration de 10 μΜ d'althiazide (concentration dans le milieu de croissance des embryons : 60 g de sel dans 1 ml d'H ₂ 0 distillée), le nombre de CSH accumulées dans l'AGM est supérieur aux nombrse de CSH accumulées dans les embryons de référence traités par la solution de dissolution de l'althiazide, le DMSO (Figure 2). L'althiazide réduit l'émergence des CSH et leur migration locale.

Après traitement à la concentration de 10 μΜ d'althiazide (concentration dans le milieu de croissance des embryons : 60 μg de sel dans 1 ml d'H ₂ 0 distillée), le nombre de CSH accumulées dans le THC est réduit de 41 % par rapport aux nombres de CSH accumulées dans les embryons de référence traités par la solution de dissolution de l'althiazide, le DMSO (Figure 3), et ceci sans provoquer d'effets toxiques. Cet effet est identique à celui observé avec le dasatinib, molécule de référence dans ce test, qui a été utilisé dans divers essais cliniques pour ses effets anti-métastatique potentiel. Bien que les effets anti-métastatiqùes du dasatinib aient été observés sur divers modèles expérimentaux il n'a pas été retenu comme traitement anti-métastatique chez l'homme, principalement en raison de sa faible tolérabilité (fatigue, Hyponatrémie, diarrhée, saignements gastro-intestinaux, effusions pleurales et péricardiaques et anémie) par les patients. Le dasatinib est un puissant inhibiteur de nombreuses enzymes kinases telles BCR-ABL, KIT et PDGFRa/β, à ce titre il est principalement utilisé pour le traitement des leucémies myéloïdes chroniques résistantes à l'imatinib, mais aussi un puissant inhibiteur de c-SRC, LYN, FY et EPHA2, ce qui peut expliquer sa faible tolérabilité.

Exemple 2 : Absence d'effet anti-métastatique d'autres diurétiques ou anti-hypertenseurs : évaluation de la progression du processus métastatique sur l'embryon de zebrafish.

Afin de vérifier la spécificité d'action de l'althiazide, d'autres molécules chimiques appartenant aux classes thérapeutiques de diurétique ou d'anti-hypertenseur (Chlortalidone, Metolazone, Pentolinium-bitartrate et Hydralazine-hydrochloride) ont été testées à la même concentration que l'althiazide (10 μΜ). Ces molécules chimiques ne provoquent pas de diminution du nombre de CSH accumulées dans le THC. Une diminution de 20 % est toutefois observée après traitement à la concentration de 10 μΜ de l'Hydrochlorothiazide qui a une structure proche de l'althiazide.

Un second test, sur un plus grand nombre d'embryons, a permis de confirmer l'efficacité de l'althiazide comme anti-métastatique avec une diminution du nombre de cellules ayant colonisés le THC de 36,2 % (Figure 4).

Exemple 3 : Activité anti-migratoire in vivo : test de la progression du processus métastatique in vivo sur l'embryon de zebrafish

Considérant qu'un effet anti-migratoire est un bon indicateur de l'activité anti-métastatique, nous avons évalué l'effet anti-migratoire de l'althiazide in vivo sur l'embryon de zebrafish.

Le nombre de CSH accumulées dans les tissus distants (THC) de l'embryon de zebrafish après traitement à la concentration de 10μΜ d'althiazide et de dasatinib, molécule de référence dans ce test, a été comparé. Nous en avons conclu que l'althiazide a un effet anti-migratoire aussi efficace que le dasatinib, utilisé à la même concentration (Figure 5).

Exemple 4 : Mesure du seuil d'efficacité de l'althiazide : test de doses efficacité/toxicité in vivo sur l'embryon de zebrafish

Afin de déterminer la concentration à laquelle l'althiazide n'est pas efficace (NOEC), la concentration à laquelle l'althiazide est efficace à 50 % (EC50) et la concentration à laquelle l'althiazide est efficace à 100 %, le nombre de cellules ayant migrés dans les tissus distants (THC) après traitement en balnéation avec une solution contenant l'althiazide aux concentrations de 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ pendant 24 heures a été quantifié.

A 1 μΜ, aucun effet n'est observé, à 10 μΜ, on observe une efficacité de 50 %, à 100 μΜ, on observe une efficacité de 100 % mais également l'apparition d'effets toxiques (Figure 6).

Parallèlement, nous avons analysé la toxicité de l'althiazide après traitement en balnéation avec une solution contenant l'althiazide aux concentrations de 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ pendant 24, 48 et 72 heures. L'étude de la toxicité a été basée sur l'analyse du pourcentage de viabilité des embryons après traitement. Aux concentrations de 1 μΜ, 10 μΜ et 100 μΜ, l'althiazide ne provoque aucune toxicité même après 72 h de traitement. Une toxicité de 50 % est observée après un traitement durant 24 heures, l'althiazide à la concentration de 1 mM. En comparaison aux doses évaluées avec l'althiazide, le dasatinib présente une très importante toxicité (Figure 7).

Exemple 5 : Cytotoxicité : test de cytotoxicité sur cellules 4T1 Les cellules 4T1 sont issues de tumeurs de la glande mammaire chez la souris. C'est un modèle particulièrement adapté et largement utilisé pour les études sur les tumeurs cancéreuses et plus particulièrement sur la métastase. En effet, les études d'efficacité in vivo chez le mammifère se font sur la souris et le modèle 4T1 est un modèle syngènique orthotopique de cellules murines injectées dans des souris BalbC, ce qui favorise le dialogue entre la tumeur et son environnement; condition essentielle pour la migration des cellules. De plus ce modèle est connu pour développer un nombre important de métastases dans un laps de temps relativement court. Les métastases apparaissent dans les poumons, ce qui facilite leur observation en visible.

Afin d'étudier les effets cytotoxiques de l'althiazide in vitro, nous analysons la mortalité cellulaire induite par le traitement avec l'althiazide par un marquage au sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium) sur les cellules 4T1. La quantité de cellules vivantes dans le puits est dosée par spectrométrie. Les résultats sont comparés à ceux obtenus après traitement avec la solution contrôle (Figure 8). Dans ce test, nous observons une très faible mortalité des cellules après traitement avec l'althiazide (80 % de cellules vivantes à la dose la plus importante 100 μΜ). Les cellules traitées avec le dasatinib présentent un taux de mortalité beaucoup plus élevé, à des doses beaucoup plus faibles (80 % de cellules vivantes à la dose la plus faible 10 nM et 20 % de cellules vivantes à 100 μΜ).

Exemple 6 : Activité anti-métastatique de l'althiazide in vitro : test de migration sur cellules 4T1.

Afin de valider le potentiel anti-migratoire de l'althiazide, nous effectuons un "scratch test" sur les cellules 4T1 en culture selon le protocole du test de migration cellulaire sur la lignée cellulaire 4T1 décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Ce test est utilisé pour évaluer le pouvoir migratoire d'un composé chimique sur des cellules en culture. L'expérience consiste à étudier la capacité des cellules à reconstituer un tapis cellulaire ('cicatrisation'), ce qui implique la propriété de migration des cellules composant la monocouche cellulaire sur la zone blessée. Le test est réalisé en plaque de microtitration 12 puits. Une blessure est réalisée à l'aide d'une pointe de pipette de 10 μΐ, puis les cellules sont traitées avec le dasatinib ou l'althiazide aux concentrations de 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ et 100 μΜ. Les cellules sont ensuite placées en conditions normoxique ou hypoxique. Une photo de la surface du puits est réalisée à t = 0 (après la blessure) puis à t = 24 h. La surface de la zone blessée est mesurée pour chaque puits et le pourcentage de migration est calculé dans chacune des conditions.

Nous observons une diminution de la migration des cellules de 40 % après traitement avec l'althiazide dès la concentration la plus faible 10 nM (Figure 8). Aux mêmes doses, le dasatinib est plus efficace mais provoque une toxicité beaucoup plus importante. Exemple 7 : Action anti-migratoire des autres composés thiazidiques : test d'initiation et de progression du processus migratoire sur l'embryon de zebrafish.

Afin de déterminer si l'action anti-métastatique de l'althiazide est également valable pour l'ensemble de la famille des thiazidiques, d'autres composés thiazidiques ont été testés.

L'efficacité anti-métastatique des composés thiazidiques a été déterminé comme pour la mesure de l'efficacité anti-métastatique de l'athiazide, quantifiée par le test de migration cellulaire sur la lignée cellulaire 4T1 décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Ces composés ont été testés à 10 et 25 μΜ. Chacun de ces composés permet de diminuer le nombre de cellules ayant colonisé le THC (tissu hématopoïétique caudal) et confirme ainsi l'activité anti-métastatique des composés thiazidiques. L'AZ-M015 diminue la migration de 30%. Toutefois, le composé le plus efficace est le MCZ puisqu'il permet de réduire la migration de 37 % lorsqu'il est utilisé à 10 μΜ et de 55% lorsqu'il est utilisé à 25μηι. De plus, les énantiomères de PAZ-M015, AZ(A) et AZ(B) permettent de réduire de manière plus importante l'invasion du THC par les cellules CD41 : GFP. Ces composés, en diminuant l'accumulation des cellules CD41 : GFP ont altéré un ou plusieurs des processus suivants : transition endothélio-hématopoïétiques, intravasation et/ou extravasation au niveau du THC.

Exemple 8. Test de migration cellules MDA-MB-231.

Afin de valider le potentiel anti-migratoire de l'althiazide, nous effectuons un "scratch test" est effectué sur les cellules MDA-MB-231 en culture selon le protocole du test de migration cellulaires sur la lignée cellulaire MDA-MB-231 décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Ce test est utilisé pour évaluer le pouvoir migratoire d'un composé chimique sur des cellules en culture. L'expérience consiste à étudier la capacité des cellules à reconstituer un tapis cellulaire ('cicatrisation'), ce qui implique la propriété de migration des cellules composant la monocouche cellulaire sur la zone blessée. Le test est réalisé en plaque de microtitration 96 puits. Une blessure est réalisée à l'aide d'une pointe de pipette, puis les cellules sont traitées avec l'althiazide.

Une première série d'images de chaque puits (centre du puits) est réalisée en début d'expérience (t=0) et après 18h de migration (t=18) à l'aide d'un microscope Nikon - objectif 4x. Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Image J (National Institue of Health, USA)

Une activité anti-migratoire de ΓΑΖ-Μ015 est observée aux concentrations de 10, 50 et ΙΟΟμΜ. Une diminution de l'ordre de 50% de la migration est observée (figure 10).

Exemple 9 : expression des marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse

La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) est la première étape du processus de formation de métastases cancéreuses. En effet les cellules épithéliales commence par effectuer une TEM (perte d'adhésion cellulaire, perte de polarité cellulaire et acquisition de propriétés migratoire) puis deviennent invasives ( Thiery & Sleeman, 2006).

La TEM est caractérisée par une surexpression des facteurs de transcription

SNAIL/SLUG/TWIST/ZEB 1 qui induisent une reprogrammation génique conduisant à l'acquisition des propriétés migratoires avec notamment l'augmentation de l'expression de la VIMENTINE et de la N-CADHERINE et la diminution de l'expression de Γ E-CADHERINE.

Ici, ΑΖ-Μ015 induit une diminution de l'expression des facteurs de transcription ZEB1 (-14%) et SNAIL (-19%), de la VIMENTINE (-22%) et la N-CADHERINE (-33%) ainsi qu'une augmentation de l'expression de ΓΕ-CADHERINE de 73 % (figure 11).

Ces modifications sont opposées à celles observées lors de la TEM. L'AZ-M015 est donc un inhibiteur de la TEM. Par cette inhibition, ΓΑΖ-Μ015 agit directement sur la dissémination métastatique en bloquant la première étape de ce processus cancéreux.

Exemple 10: Tests de potentialisation de cytotoxicité de l'althiazide

La doxorubicine est une substance largement utilisée dans les traitements de nombreux cancers (cancers bronchopulmonaires, cancers de l'estomac, cancers de l'ovaire, cancers de la vessie, cancers du sein, leucémies, myélomes multiples, lymphomes malins non hodgkiniens, maladie de Hodgkin, sarcomes de Kaposi associé au sida, sarcomes des os, sarcomes des tissus mous et tumeurs solides de l'enfant). L'utilisation des anthracyclines et notamment de la doxorubicine s'accompagne d'un risque de cardiotoxicité de manière dose dépendante pouvant évoluer vers une insuffisance cardiaque sévère et irréversible. Ainsi il est d'une part, important d'améliorer l'efficacité de ce traitement et d'autre part d'en réduire la toxicité. Dans ce test, Palthiazide a été ajouté à la doxorubicine et la viabilité cellulaire a été ensuite déterminée.

Les tests sont réalisés en culture cellulaire en plaques 96 puits, sur la lignée de cellule MDA-MB-231. Les cellules MDA-MB-231 sont ensemencées dans des plaques 96 puits à la densité de 10 000 cellules et incubées 24h à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Le milieu est ensuite renouvelé et additionné de concentrations croissantes de doxorubicine +/- ΙΟΟμΜ d'althiazide. Les cellules sont incubées 24h supplémentaires à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Les traitements ont été réalisés en triplicas et l'expérience a été répétée 5 fois. Un test de viabilité cellulaire est ensuite réalisé selon la méthode décrit dans la partie

Matériels et Méthodes. Les résultats sont normalisés par rapport à la condition contrôle (figure 12)

L'althiazide permet d'augmenter les effets de la doxorubicine lorsque celle-ci est utilisée entre 25 et 2,5 μΜ d'environ 15%. De plus, le traitement avec l'athiazide permet de diminuer l'IC50 de la doxorubicine de 45% en passant de 6,02μΜ à 3.318μΜ. L'althiazide est donc un potentialisateur de l'agent anticancéreux doxorubicine. Ainsi, ΓΑΖ-Μ015 permet d'augmenter l'efficacité des traitements anti-cancéreux et/ou de réduire la dose utilisée et ainsi diminuer les effets toxiques indésirables de cet anti-cancéreux.

Exemple 11: Tests de potentialisation de cytotoxicité de l'althiazide

Les tests sont réalisés en culture cellulaire en plaques 96 puits, sur la lignée de cellule MDA-MB-231. Les cellules MDA-MB-231 sont ensemencées dans des plaques 96 puits à la densité de 10 000 cellules et incubées 24h à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Le milieu est ensuite renouvelé et additionné de doxorubicine et d'un autre composé de l'invention (Formule (IA, IB, IVa, Va, Vb, Vc, Vd, Ve, Vf, Via, Vlla et Vllb) à une concentration de 50 μΜ. Les cellules sont incubées 24h supplémentaires à 37°C, 5% C02 et 1% 02. Les traitements ont été réalisés en triplicas et l'expérience a été répétée 5 fois.

Exemple 12 : Evaluation des effets anti-métastatique de l'althiazide sur la souris Les effets anti-métastatique de l'althiazide sur la souris sont évalués sur des souris immunodéprimées dans lesquelles sont injectées des cellules MDA-MB-231 dans la glande mammaire.

Les souris suivent un traitement sur 4 semaines avec une injection d'althiazide chaque jour.

Les tumeurs mammaires des souris sont mesurées 3 fois par semaine durant 4 semaines.

Les souris pour lesquelles la tumeur mammaire a atteint 2g, sont sacrifiées et le nombre de métastases cancéreuses ayant envahies le poumon est comptabilisé. Ce nombre est comparé au lot de souris contrôle injectées avec les cellules cancéreuses MDA-MB-231 et traitées au PBS.

Exemple 13 : Evaluation des effets potentialisateurs de l'althiazide sur la doxorubicine chez la souris

La dose maximale d'althiazide est donnée seule ou en association à la doxorubicine. 4 doses de doxorubicine sont testées.

Les cellules MDA-MB-231 sont injectées dans la glande mammaire des souris immunodéprimées .

Les souris suivent un traitement sur 4 semaines à raison d'une injection de doxorubicine par semaine sur 4 semaines et une injection d'althiazide chaque jour durant les 4 semaines. La première dose d'althiazide est donnée le premier jour après l'injection des cellules MDA-MB-231 dans la glande mammaire.

Les tumeurs mammaires des souris sont mesurées 3 fois par semaine et comparées aux lots de souris traitées au PBS seul ou à l'althiazide seul.

Exemple 14. Séparation des énantiomères de l'althiazide AZ-M015 a. Séparation par SFC acide

La séparation des deux énantiomères a été réalisée selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes, avec les paramètres suivants : • Phase mobile : méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique/C0 ₂ dans un rapport 20/80

• Produit à séparer : 49.2 mg de AZ-M015 dissous dans 2 ml de méthanol additionné de 0.01 % d'acide acétique.

• Injection : 10 injections de 5 mg chacune.

• Collecte : Seuil d'ouverture 50mUA, seuil de fermeture 30 mUA.

Les deux composées obtenues suite à cette séparation ont été appelés EV-VZW001- 070-001 (19.8 mg) et EV-VZW001-070-002 (20.1 mg).

b. Séparation par SFC acétonitrile version 1

La séparation des deux énantiomères a été réalisée selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes, avec les paramètres suivants :

• Phase mobile : acétonitrile/C0 ₂ dans un rapport 30/70

• Produit à séparer : 50.9 mg de AZ-M015 dissous dans 2 ml d'acétonitrile.

• Injection : 13 injections de 4 mg chacune.

• Collecte : Seuil d'ouverture 60mUA, seuil de fermeture 50 mUA.

Les deux composées obtenus suite à cette séparation ont été appelés EV-VZW001- 070-003 (21.7 mg) et EV-VZW001-070-004 (22.1 mg). La figure 14 montre les essais préparatifs pour le réglage de l'ouverture et la fermeture de la collecte de chaque énantiomère. Ce mode de collecte conduit nécessairement à une plus faible pureté du second énantiomère. c. Séparation par SFC acétonitrile version 2

La séparation des deux énantiomères a été réalisée selon le protocole décrit dans la partie Matériels et Méthodes, avec les paramètres suivants :

• Phase mobile : acétonitrile/C0 ₂ dans un rapport 30/70

• Produit à séparer : 74.9 mg de AZ-M015 dissous dans 4 ml d'acétonitrile.

• Injection : 20 injections de 3.8 mg chacune.

• Collecte : Seuil d'ouverture 50mUA, seuil de fermeture 40 mUA.

Les deux composées obtenus suite à cette séparation ont été appelés EV-VZW001- 070-005 (33.6 mg) et EV-VZW001-070-006 (29.1mg). Exemple 15 : Analyse des séparations a. Analyse du produit de départ.

Le composé de départ, le AZ-M015 a été analysé pour identifier la répartition des deux énantiomères par le protocole d'analyse de la pureté chirale décrit dans la partie Matériels et Méthodes. La figure 15 montre le chromatographe qui a été obtenu avec une répartition de 49.8 % d'énantiomère AZ(A) et 50.2% d'énantiomère AZ(B). b. Analyse des autres composés EV-VZW001-070-X.

Le tableau 3 indique les résultats obtenus pour les composés issus des trois séparations selon les protocoles d'analyse de la pureté chirale et d'analyse de la pureté en phase inverse tout deux décrits dans la partie Matériels et Méthodes.

Tableau 3 : Résultat d'analyse des composés issus des séparations.

La figure 16 montre le chromatogramme obtenu pour l'analyse de l'échantillon EV- VZWOO 1 -070-002. Exemple 16 : Test de stabilité des énantiomères

A l'issue de la séparation par SFC acétonitrile version 2, 1.5 mg de EV-VZWOO 1- 070-005 et 2.4 mg de EV-VZWOO 1-070-006 sont retirées pour les tests de stabilité.

L'échantillon EV-VZWOO 1-070-005 est stocké à une température de 5 °C dans des conditions de protection contre la lumière. L'échantillon EV-VZWOO 1-070-006 est stocké à température ambiante sur la paillasse sans protection contre la lumière. La figure 17 montre le chromatogramme obtenu lors de l'analyse de l'échantillon EV- VZWOO 1-070-005 après 24h de stockage.

La figure 18 montre le chromatogramme obtenu lors de l'analyse de l'échantillon EV- VZWOO 1-070-006 après 24h de stockage. Le tableau 4 montre l'évolution dans le temps des quantités d'énantiomère présent dans les échantillons.

Tableau 4 : Stabilité temporelle des énantiomères stockés ou non dans des conditions optimales