La présente invention concerne l’utilisation de dérivés coumariniques comme outils de diagnostic in vitro ou ex vivo de l’efflux bactérien, une méthode de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une résistance par efflux de bactéries, ainsi que des dérivés coumariniques spécifiques pour une telle utilisation.

Les antibiotiques ont permis de faire considérablement reculer la mortalité associée aux maladies infectieuses au cours du 20 ^ème siècle. Hélas, leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale, que ce soit en ville ou à l’hôpital ; ainsi que leur mauvaise utilisation (e.g. traitements trop courts, trop longs ou à posologies inadaptées), ont conduit à l’apparition de souches résistantes de bactéries à ces antibiotiques. Ponctuelles au départ, les résistances sont devenues massives et préoccupantes. La multirésistance (également bien connue sous l’anglicisme « Multiple Drug Resistance » ou MDR) est un phénomène imputé à divers mécanismes exprimés dans une même souche bactérienne contre des familles d’antibiotiques différentes. En février 2017, l’OMS a publié une liste de bactéries résistantes représentant une menace à l’échelle mondiale. M. tuberculosis, A. baumannii, P. aeruginosa et les entérobactéries productrices de bêta-lactamases à spectre étendu (bien connues sous l’acronyme EBLSE) représentent ainsi une urgence dite « critique » car elles résistent à un grand nombre d’antibiotiques.

Le développement de nouveaux antibiotiques pour lutter contre les bactéries multirésistantes s’avérant beaucoup plus lent que celui des résistances aux antibiotiques existants, des recherches se sont concentrées sur le diagnostic de la résistance bactérienne et/ou l’étude des pathogènes multirésistants avec pour objectif de limiter l’apparition des phénotypes MDR au sein des différentes souches bactériennes de référence. Il existe des tests diagnostiques appelés tests de susceptibilité aux antibiotiques sur milieu agar ou par dilution en bouillon permettant une mesure directe de la concentration minimale inhibitrice (bien connue sous l’acronyme CMI) des antibiotiques sur différents pathogènes à partir de l’échantillonnage et de l’isolement des bactéries lorsque la concentration de celles-ci est suffisante. À l’issue de ces tests, on regarde si la valeur de la CMI observée est inférieure, égale ou supérieure à une valeur seuil déterminée par le comité européen sur les tests de sensibilité aux antimicrobiens, pour identifier si la souche bactérienne est sensible, intermédiaire, ou résistante à l’antibiotique respectivement. Ces tests nécessitent que les bactéries se développent jusqu'à leur phase exponentielle pour interpréter la croissance ou non, selon la nature et la concentration de l’agent antibactérien utilisé, afin d’en déterminer la sensibilité. Toutefois, ces tests prennent beaucoup de temps (3 jours à plus d’une semaine), ce qui incite les médecins à prescrire des antibiotiques à large spectre de manière empirique dès la prise en charge du patient. Pendant ce temps d’attente, le patient est alors exposé à des antibiotiques qui sont peut-être inadaptés et/ou inefficaces, ce qui contribue encore plus au développement de profils de résistance bactérienne. Des tests basés sur la microdilution en bouillon automatisée ont été mis au point pour détecter plus rapidement la croissance bactérienne (e.g. le jour même du prélèvement). Il faudra cependant encore attendre 1 jour à 1 semaine pour obtenir des CMI et commencer alors une thérapie ciblée. La microscopie à force atomique, la spectroscopie Raman, les sondes ADN, ou les techniques microfluidiques ont également été proposées pour améliorer la pertinence, la fiabilité, et/ou la rapidité de ces tests. De manière générale, les méthodes de diagnostic précitées ne donnent toutefois pas entière satisfaction, les données obtenues ne permettant d’accéder qu’à un profil de résistance globale des bactéries cliniques étudiées. Actuellement, les laboratoires d’analyses médicales « de ville » utilisent de plus en plus la performance de la spectrométrie de masse en se tournant vers les plateformes mettant en œuvre un spectromètre de masse à temps de vol utilisant la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF pour «Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - time-of-flight mass spectrometer »). Mais les coûts d’investissement de cette méthode d’analyse restent encore très élevés pour être utilisée en routine.

La recherche s’est par conséquent tournée vers la mise au point de moyens de détection de mécanismes de résistance spécifiques. À titre d’exemple, il existe sur le marché des tests employés en routine qui permettent d’identifier rapidement la surexpression ou non de R>-lactamases au niveau de bactéries cliniques isolées sur agarose ou directement au sein des échantillons sanguins afin de rendre compte d’une résistance par inactivation enzymatique. Cette identification permet de mettre en évidence la sensibilité in vitro d’une souche bactérienne en présence d’antibiotiques connus comme étant substrats des R>-lactamases, notamment les pénicillines, les céphalosporines, les carbapénèmes et les inhibiteurs de R>-lactamases. Dans le cas où les cultures bactériennes sont positives avec ces tests, il est nécessaire de confirmer la présence, la quantité, et la nature des R>-lactamases impliquées dans la résistance des souches aux antibiotiques testés.

D’autres mécanismes de résistance existent tels que l’efflux, l’imperméabilité, et la modification du site d’action. Cependant, aucun test n’existe actuellement pour diagnostiquer l’efflux bactérien en clinique.

Le mécanisme de résistance par efflux est un de ceux qui contribuent de façon majeure à l’inefficacité des antibiotiques existants. Il constitue la première ligne de défense bactérienne, en diminuant partiellement l’activité propre de l’antibiotique (diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotique), potentialise l’effet d’autres mécanismes de résistance préexistants (inactivation enzymatique de l’antibiotique, modification de sa cible, altération de la perméabilité membranaire bactérienne), conférant ainsi aux souches correspondantes des niveaux de résistance élevés, facilite la sélection de mutants résistants de haut niveau, et favorise la multirésistance de souches cliniques. Les pompes à efflux, également appelées transporteurs membranaires, sont des complexes protéiques ubiquitaires mis en œuvre pour la détoxification cellulaire. Elles reconnaissent de façon primaire des substrats physiologiques tels que des nutriments ou des produits de catabolisme, mais peuvent expulser activement du cytoplasme ou du périplasme vers l’extérieur des bactéries, des substrats nocifs pour celles-ci tels que des antibiotiques, des détergents, des antiseptiques, ou des toxines. Les pompes à efflux sont classées en fonction de leur composition, de la nature des substrats pris en charge, de leur source d’énergie, et du nombre de régions transmembranaires. Les pompes à efflux reconnues capables de transporter les antibiotiques au niveau des bactéries peuvent être regroupées selon les cinq principales familles suivantes : la famille ABC bien connue sous l’anglicisme « ATP-Binding Cassette », la famille SMR bien connue sous l’anglicisme « Small Multidrug Resistance », la famille MFS bien connue sous l’anglicisme « Major Facilitator Superfamily », la famille MATE bien connue sous l’anglicisme « Multidrug And Toxic compound Extrusion », et la famille RND bien connue sous l’anglicisme « Resistance Nodulation cell Division ». Les bactéries à Gram positif possèdent des transporteurs à spectre étroit, et ne reconnaissent donc de façon préférentielle qu’une ou deux classes d’antibiotiques. A contrario, les bactéries à Gram négatif possèdent un nombre important de transporteurs dont la plupart ont un spectre large de reconnaissance de substrats. La plupart des systèmes d’efflux impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif appartiennent à la famille RND. Ils sont capables d’exporter des molécules de structures très différentes, ce qui leur confère une très large spécificité de substrats et la particularité de pouvoir entrainer des résistances multiples aux antibiotiques (MDR). Les transporteurs RND fonctionnent en association avec deux autres constituants protéiques : une protéine de fusion membranaire intervenant au niveau périplasmique (MFP, pour « Membrane Fusion Protein ») et une protéine de membrane externe (OMF, pour « Outer Membrane Factor »).

Blair et al. (American Society For Microbiology Journal, 2016, 7, 4, 1 -6) ont décrit plusieurs méthodes pour quantifier le taux d’efflux au sein de différentes souches bactériennes, mettant en œuvre des composés fluorescents tels que le bromure de 3,8-diamino-1-éthyl-6-phénylphénanthridinium (également appelé bromure d’éthidium), le trichlorhydrate du 2'-(4-éthoxyphényl)-5-(4-méthyl-1 - pipérazinyl)-2,5'-bi-1 /-/-benzimidazole (également connu sous la référence « Hoechst 33342 »), le 9-(diéthylamino)-5/-/-benzo[a]phénoxazin-5-one (également connu sous la référence « Nile Red »), le 1 ,2-dinaphthylamine, la doxorubicine, ou certaines fluoroquinolones comme la ciprofloxacine (CIP).

Une première méthode de mesure dite « directe » consiste à mettre en contact un des composés fluorescents précités (sonde), en concentration élevée, avec des cellules bactériennes en présence d’un inhibiteur d’efflux qui inhibe la source d’énergie de la pompe (e.g. carbonyl cyanide m-chlorophénylhydrazone ou CCCP) ; laver les cellules pour enlever l’excès de composé fluorescent et/ou d’inhibiteur dans le milieu ; mesurer la fluorescence de la sonde dans les cellules ; ajouter du glucose pour réactiver l’efflux ; et mesurer la fluorescence de la sonde dans les cellules au cours du temps et à intervalle réguliers. Au cours de la première étape, le composé fluorescent s’accumule dans les cellules. La fluorescence mesurée au cours de la troisième étape correspond à la quantité de composé fluorescent accumulé qui n’a pas pu être expulsé. Puis, la quatrième étape permet de restaurer l’efflux et d’expulser le composé fluorescent. La mesure de la fluorescence au cours de la cinquième étape permet de rendre compte d’un changement de fluorescence lié à l’expulsion du composé fluorescent. Le taux d’efflux peut par conséquent être mesuré sur plusieurs souches bactériennes, et par exemple comparé selon que la souche testée présente ou non une surexpression des pompes à efflux AcrAB-TolC.

Une deuxième méthode de mesure dite « indirecte » consiste à mesurer la fluorescence de cellules bactériennes, mettre en contact un des composés fluorescents précités avec les cellules bactériennes, et mesurer la fluorescence des cellules. La mesure de la fluorescence au cours de la première étape permet d’établir un contrôle de la fluorescence initiale sans ajout de composé fluorescent. Au cours de la deuxième étape, le composé fluorescent est expulsé des cellules bactériennes. La mesure de la fluorescence au cours de la troisième étape permet de rendre compte d’un changement de fluorescence lié à l’expulsion du composé fluorescent. Le taux d’efflux peut par conséquent être mesuré sur plusieurs souches bactériennes, et par exemple comparé selon que la souche testée exprime beaucoup, de manière basale, peu ou pas les pompes à efflux AcrAB-TolC. L’accumulation d’un composé fluorescent dans les cellules bactériennes rend compte d’un faible taux d’efflux.

Les méthodes précitées présentent les inconvénients suivants : les composés fluorescents mis en œuvre dans ces méthodes posent des problèmes de coût (e.g. pour la doxorubicine), de toxicité et/ou de sécurité lors de leur manipulation (e.g. bromure d’éthidium, « Hoechst 33342 »), et/ou de faisabilité lorsque les bactéries ne fermentent pas le glucose ou dans le cas de bactéries sauvages lorsqu’elles ne permettent pas une bonne reproductibilité des résultats de la méthode directe ; les rendant inadaptés pour une utilisation dans le diagnostic de l’efflux en routine clinique. Par ailleurs, certains composés fluorescents comme le bromure d’éthidium ont un influx qui implique la présence de porines, rendant les méthodes précitées inappropriées pour tester des souches cliniques dans lesquelles les porines sont sous- exprimées par résistance innée ou acquise.

D’autres méthodes comme les « Western-blot » (également appelé transfert de protéines ou technique des immuno-empreintes) ou les RT-PCR (bien connus sous l’anglicisme « Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction » pour Réaction en Chaîne par Polymérase après Transcription Inverse) peuvent permettre de quantifier les niveaux d’efflux au sein de différentes souches. Cependant, la purification de protéines membranaires reste à ce jour complexe et ne peut être utilisée de manière systématique en routine. De plus, le taux de transcription d’ARNm calculé n’est pas forcément représentatif des protéines fonctionnelles correspondantes adressées à la membrane bactérienne.

Par conséquent, il existe un besoin en une méthode de diagnostic précoce, de routine, et en temps réel, pour identifier et quantifier la résistance par efflux chez un patient ou un animal en vue ou en cours d’un traitement antibiotique, et permettre un traitement personnalisé des infections, dans le but de limiter les multirésistances aux antibiotiques.

Le but de la présente invention est par conséquent de pallier les inconvénients de l’art antérieur et de fournir un outil de diagnostic in vitro ou ex vivo de l’efflux bactérien utilisable en routine clinique, révélant le niveau d’efflux en temps réel de différentes bactéries, facile à mettre en œuvre, et précoce.

La présente invention a donc pour premier objet l’utilisation d’un dérivé coumarinique répondant à la formule (I) suivante :

( dans laquelle :

- R ¹ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, un groupe acide carboxylique -CO2H, un groupe ester -CO2R ⁷ dans lequel R ⁷ est un groupe alkyle, un groupe nitrile -CEN, un groupe fluoroalkyle, un groupe nitro -NO2, ou un groupe sulfonate -OSO2R ⁸ dans lequel R ⁸ est un groupe alkyle ;

- R ² représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, un groupe alkyle, un groupe hydroxyle -OH, un groupe fluoroalkyle, un groupe acide carboxylique - CO2H, un groupe ester -CO2R ⁹ dans lequel R ⁹ est un groupe alkyle, ou un groupe alkoxy -OR ¹⁰ dans lequel R ¹⁰ est choisi parmi les groupes alkyle, halogénoalkyle et alcényle ;

- R ³ représente un atome d’hydrogène, un groupe alkyle, un groupe alkoxy - OR ¹¹ dans lequel R ¹¹ est un groupe alkyle ; - R ⁴ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, un groupe alkyle, un groupe hydroxyle -OH, un groupe fluoroalkyle, un groupe alkoxy -OR ¹² dans lequel R ¹² est un groupe alkyle, un groupe amine -NR ¹³ R ¹⁴ dans lequel R ¹³ et R ¹⁴ , identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d’hydrogène et un groupe alkyle, un groupe sulfonate -OSO2R ¹⁵ dans lequel R ¹⁵ est un groupe alkyle, ou un groupe acyle -OCOR ¹⁶ dans lequel R ¹⁶ est un groupe alkyle ;

- R ⁵ représente un groupe alkyle, un groupe alcényle, ou un groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel choisi parmi un groupe aryle, un groupe hétéroaryle, un atome d’halogène, un groupe alkoxy -OR ¹⁷ dans lequel R ¹⁷ est un groupe alkyle ou halogénoalkyle, un groupe ester -OC(=O)R ¹⁸ dans lequel R ¹⁸ est un groupe alkyle, un groupe thioéther -SR ¹⁹ dans lequel R ¹⁹ est un groupe alkyle, un groupe nitrile -CEN, un groupe amine -NR ²⁰ R ²¹ dans lequel R ²⁰ et R ²¹ , identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d’hydrogène et un groupe alkyle, ou forment ensemble avec l’atome d’azote un hétérocycle azoté, un groupe succinimide, un groupe pyrrole, un groupe pyrazole, un groupe triazole, un groupe imidazole, un groupe thiazole, un groupe oxazole, un groupe amide -NHC(=O)R ²² dans lequel R ²² est un groupe alkyle, et un groupe sélénié -SeR ²³ dans lequel R ²³ est un atome d’hydrogène ou un groupe alkyle ; et

- R ⁶ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, ou un groupe alkyle, en tant qu’outil de diagnostic in vitro ou ex vivo de l’efflux de bactéries.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des dérivés coumariniques particuliers de formule (I) peuvent être utilisés comme outils de détection de la résistance par efflux de bactéries. Ces dérivés coumariniques de formule (I) possèdent un groupe -OR ⁵ particulier en position 7 qui leur permet à la fois d’être de très bons substrats des pompes à efflux et d’avoir des propriétés de fluorescence appropriées pour permettre leur détection quantitative dans les bactéries et établir une corrélation entre leur accumulation dans les cellules bactériennes et le niveau d’expression de l’efflux par les pompes desdites cellules bactériennes.

Le groupe R ¹

L’atome d’halogène en tant que groupe R ¹ peut être un atome de chlore ou de fluor, et de préférence un atome de chlore. Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁷ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle comprend de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe fluoroalkyle en tant que groupe R ¹ peut être un groupe fluoroalkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe fluoroalkyle peut comprendre de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le groupe fluoroalkyle est avantageusement un groupe trifluorométhyle CF3.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁸ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ¹ est un acide carboxylique -CO2H ou un ester -CO2R ⁷ , et avantageusement -CO2H OU-CO2CH3.

Le groupe R ²

Le groupe alkyle en tant que groupe R ² peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Un atome d’halogène en tant que groupe R ² peut être un atome de chlore ou un atome de fluor, et de préférence en atome de chlore.

Le groupe fluoroalkyle en tant que groupe R ² peut être un groupe fluoroalkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe fluoroalkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à

2 atomes de carbone. Le groupe fluoroalkyle est avantageusement un groupe trifluorométhyle -CF3, ou un groupe trifluoroéthyle -CH2-CF3.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁹ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle est de préférence linéaire ou ramifié, non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁰ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à

3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe halogénoalkyle en tant que groupe R ¹⁰ peut être un groupe halogénoalkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Il représente un groupe alkyle substitué par au moins un atome d’halogène tel qu’un atome de chlore ou de fluor, et de préférence un atome de chlore. Le groupe halogénoalkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe halogénoalkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe halogénoalkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle substitué par un atome de chlore ou de fluor, et de préférence un atome de chlore.

Le groupe alcényle en tant que groupe R ¹⁰ peut être un groupe alcényle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alcényle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alcényle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alcényle est avantageusement un groupe éthylène.

Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ² est un groupe alkyle, un groupe alkoxy -OR ¹⁰ , ou un groupe fluoroalkyle. Le groupe R ³

Le groupe alkyle en tant que groupe R ³ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire ou ramifié non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹¹ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ³ est un atome d’hydrogène ou un groupe alkoxy -OR ¹¹ .

Le groupe R ⁴

L’atome d’halogène en tant que groupe R ⁴ peut être un atome de chlore ou un atome de fluor, et de préférence un atome de fluor.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁴ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹² peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire ou ramifié non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle. Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹³ et/ou R ¹⁴ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁵ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire ou ramifié, non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle, éthyle ou propyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁶ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Le groupe alkyle est de préférence linéaire ou ramifié, non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ⁴ est un atome d’hydrogène, un atome d’halogène tel qu’un atome de fluor, ou un groupe alcoxy - OR ¹² tel qu’un groupe méthoxy ou éthoxy.

Le groupe R ⁵

Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁵ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 3 à 7 atomes de carbone. Un groupe alkyle est avantageusement un groupe éthyle, propyle, n- butyle, pentyle, sec-butyle, cyclopentyle, iso-propyle, cyclopropyleméthyle, hexyle, ou cyclohexyle, encore plus avantageusement un groupe n-butyle, pentyle, ou hexyle.

Le groupe alcényle en tant que groupe R ⁵ peut être un groupe alcényle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Un groupe alcényle comprend au moins une double liaison C=C. Le groupe alcényle peut comprendre de 2 à 15 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 3 à 7 atomes de carbone. Un groupe alcényle est avantageusement un groupe allylique CH ₂ -CH=CH ₂ .

Lorsque R ⁵ est un groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel

R ⁵ peut être un groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel choisi parmi un groupe aryle, un groupe hétéroaryle, un atome d’halogène, un groupe alkoxy -OR ¹⁷ dans lequel R ¹⁷ est un groupe alkyle ou halogénoalkyle, un groupe ester-OC(=O)R ¹⁸ dans lequel R ¹⁸ est un groupe alkyle, un groupe thioéther -SR ¹⁹ dans lequel R ¹⁹ est un groupe alkyle, un groupe nitrile -CEN, un groupe amine -NR ²⁰ R ²¹ dans lequel R ²⁰ et R ²¹ , identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d’hydrogène et un groupe alkyle, ou forment ensemble un hétérocycle azoté, un groupe succinimide, un groupe amide -NHC(=O)R ²² dans lequel R ²² est un groupe alkyle, un groupe pyrrole, un groupe pyrazole, un groupe thiazole, un groupe oxazole, un groupe imidazole, un groupe triazole, et un groupe sélénié -SeR ²³ dans lequel R ²³ est un atome d’hydrogène ou un groupe alkyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un groupe alkyle linéaire non cyclique.

Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 3 à 7 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe éthyle, propyle, n- butyle, pentyle, ou hexyle.

Le groupe aryle en tant que groupe fonctionnel d’un groupe alkyle substitué peut être un groupement hydrogénocarboné aromatique monocyclique ou polycyclique, de préférence comprenant de 5 à 10 atomes de carbone.

Le groupe aryle est avantageusement un groupe phényle.

Le groupe aryle peut être substitué par un radical alkyle, nitro -NO ₂ , trifluorométhyle -CF3, ou un atome d’halogène. Le radical alkyle en tant que substituant du groupe aryle peut être un radical alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un radical alkyle linéaire non cyclique. Le radical alkyle peut comprendre de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le radical alkyle est avantageusement un groupe méthyle.

L’atome d’halogène en tant que substituant du groupe aryle peut être un atome de chlore ou un atome de fluor, et de préférence un atome de chlore.

Le groupe hétéroaryle en tant que groupe fonctionnel d’un groupe alkyle substitué peut être un groupement hydrogénocarboné aromatique monocyclique ou polycyclique comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi un atome d’azote, d’oxygène, et de soufre.

Le groupe hétéroaryle comprend de préférence de 5 à 6 atomes de carbone.

Le groupe hétéroaryle est avantageusement un groupe pyridinyle.

Le groupe hétéroaryle peut être substitué par un radical alkyle, nitro -NO2, trifluorométhyle -CF3, ou un atome d’halogène. Le radical alkyle en tant substituant du groupe hétéroaryle peut être un radical alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un radical alkyle linéaire non cyclique.

Le radical alkyle peut comprendre de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le radical alkyle est avantageusement un groupe méthyle.

L’atome d’halogène en tant que substituant du groupe hétéroaryle peut être un atome de chlore ou un atome de fluor, et de préférence un atome de chlore.

L’atome d’halogène en tant que groupe fonctionnel d’un groupe alkyle substitué peut être un atome de fluor, un atome de brome, un atome de chlore, ou un atome d’iode, et de préférence un atome de brome.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁷ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁷ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle. Le groupe halogénoalkyle en tant que groupe R ¹⁷ peut être un groupe halogénoalkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique. Il représente un groupe alkyle substitué par au moins un atome d’halogène tel qu’un atome de chlore, de brome ou de fluor, et de préférence un atome de chlore ou de brome.

Le groupe halogénoalkyle en tant que groupe R ¹⁷ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le groupe halogénoalkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle substitué par un atome de chlore ou de brome ou de fluor, et de préférence un atome de chlore ou de brome.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁸ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁸ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Un groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁹ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un groupe alkyle linéaire non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ¹⁹ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Un groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²⁰ et/ou R ²¹ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²⁰ et/ou groupe R ²¹ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Un groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle, éthyle, propyle, ou isopropyle.

L’hétérocycle azoté formé par R ²⁰ , R ²¹ et l’atome d’azote peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, et de préférence de 3 à 7 atomes de carbone. L’hétérocycle azoté (non aromatique) peut comprendre un ou plusieurs hétéroatomes supplémentaires tels qu’un atome d’oxygène ou un atome d’azote. Un hétérocycle azoté est avantageusement un groupe pipéridine, morpholine, pyrrolidine, ou pipérazine.

Le groupe -NR ²⁰ R ²¹ est de préférence tel que R ²⁰ et R ²¹ forment ensemble avec l’atome d’azote un hétérocycle azoté, et de façon particulièrement préférée sans hétéroatomes supplémentaires.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²² peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un groupe alkyle linéaire non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²² peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 2 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²³ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique, et de préférence un groupe alkyle linéaire non cyclique.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ²³ peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle ou éthyle.

Le groupe fonctionnel préféré peut être choisi parmi un atome d’halogène tel qu’un atome de brome, un groupe amine -NR ²⁰ R ²¹ tel qu’un groupe N-diméthylamine, ou N-diisopropylamine, et un groupe thioéther -SR ¹⁹ tel qu’un groupe thioéthyle.

Lorsque R ⁵ est un groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel, R ⁵ répond de préférence à la formule (II) suivante :

-(CH2)n-groupe fonctionnel (II), dans laquelle n va de 2 à 10 (n est un entier), et le groupe fonctionnel est tel que défini dans l’invention.

En d’autres termes, dans ce mode de réalisation préféré, le groupe fonctionnel est un groupe fonctionnel terminal d’une chaine alkylène au sein du groupe R ⁵ . Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ⁵ est un groupe alkyle tel qu’un groupe n-butyle, pentyle, ou hexyle, ou un groupe alkyle substitué par un atome d’halogène en tant que groupe fonctionnel tel qu’un groupe bromobutyle.

Le groupe R ⁶

L’atome d’halogène en tant que groupe R ⁶ peut être un atome de chlore ou un atome de fluor, et de préférence un atome de fluor.

Le groupe alkyle en tant que groupe R ⁶ peut être un groupe alkyle linéaire ou ramifié, cyclique ou non cyclique.

Le groupe alkyle est de préférence linéaire non cyclique. Le groupe alkyle peut comprendre de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, et de façon particulièrement préférée de 1 à 3 atomes de carbone. Le groupe alkyle est avantageusement un groupe méthyle.

Selon une forme de réalisation préférée de l’invention, le groupe R ⁶ est un atome d’hydrogène ou un groupe alkyle tel qu’un groupe méthyle.

Dérivés coumariniques préférés dans l’application envisagée

Le dérivé coumarinique de formule (I) utilisable selon le premier objet de l’invention est choisi avantageusement parmi les dérivés coumariniques de formules (1-1 ) à (1-21 ) suivantes :

TABLEAU 1

Parmi ces dérivés coumariniques, ceux de formules (I-5), (1-10), (1-11 ), (1-12) et (1-13), (1-14) et (1-15) sont particulièrement préférés.

Les dérivés coumariniques (I) de l’invention ont de préférence une fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 320 nm à 390 nm, d’au moins 1000 UFR, et de façon particulièrement préférée d’au moins 3000 UFR (unités de fluorescence relative).

La détermination de la fluorescence d’un dérivé coumarinique peut être effectuée comme décrite dans la partie exemple.

Par conséquent, les dérivés coumariniques de l’invention répondant à la formule (I) sont utilisés comme outil de diagnostic pour caractériser la résistance par efflux des bactéries.

Les dérivés coumariniques (I) de l’invention sont en particulier capables d’être substrats des pompes à efflux, lorsque celles-ci sont surexprimées, avec une absence d’activité cytotoxique et perméabilisante de la membrane bactérienne. Lesdits dérivés coumariniques (I) sont ainsi sensibles à l’expression des pompes d’efflux (étant plus ou moins efflués de la cellule bactérienne par ces pompes), tout en étant détectables en tant que fluorophores, ce qui permet de considérer leur utilisation comme sondes fluorescentes biomarqueurs du processus d’efflux et de son niveau d’expression au sein des bactéries.

Grâce aux dérivés coumariniques (I) de l’invention, il est alors possible de mettre en évidence in vitro ou ex vivo la présence de bactéries résistantes par efflux dans un milieu biologique ou le degré de résistance par efflux de bactéries présentes dans un milieu biologique.

La mise en évidence in vitro est réalisée en dehors du corps humain sur un échantillon liquide comprenant des cellules bactériennes. La mise en évidence ex vivo est réalisée en dehors du corps humain sur un échantillon liquide comprenant des cellules bactériennes qui ont subi un traitement préalable avant utilisation.

Les dérivés coumariniques (I) de l’invention sont particulièrement utiles comme outils de diagnostic de la résistance par efflux de mycobactéries et de bactéries à Gram négatif, et de préférence de mycobactéries et bactéries à Gram négatif appartenant aux familles choisies parmi Mycobacteriaceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Moracellaceae et Burkholdriaceae.

De préférence, ils sont très utiles comme outils de diagnostic de la résistance par efflux de bactéries à Gram négatif, et de préférence de bactéries à Gram négatif appartenant aux familles choisies parmi Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Moracellaceae et Burkholdriaceae.

Les genres de la famille Mycobacteriaceae préférés sont Mycobactérium tels que par exemple Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, ou Mycobacterium africanum.

Les genres de la famille Enterobacteriaceae préférés sont Escherichia tels que par exemple Escherichia coli ; Klebsiella tels que Klebsiella aerogenes ou Klebsiella pneumoniae ; ou Enterobacter tels que Enterobacter cloacae.

Les genres de la famille Pseudomonadaceae préférés sont Pseudomonas tels que Pseudomonas aeruginosa.

Les genres de la famille Moraxellaceae préférés sont Acinetobacter tels qu’Acinetobacter baumannii.

Les genres de la famille Burkholderiaceae préférés sont Burkholderia tels que Burkholderia mallei, pseudomallei ou Burkholderia thailadensis. Les dérivés coumariniques de formule (I) sont également particulièrement utiles pour mettre en évidence l’efflux de pompes de la famille RND, plus particulièrement des pompes MmpL, AcrAB-TolC, MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexXY-OprM, MexEF- OprN, AdeABC, OqxAB, BpeAB-OprB, BpeEF-OprC ou AmrAB-OprA, plus particulièrement des pompes AcrAB-TolC, MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexXY-OprM, MexEF-OprN, AdeABC, OqxAB, BpeAB-OprB, BpeEF-OprC ou AmrAB-OprA, et encore plus particulièrement des pompes AcrAB-TolC.

Les dérivés coumariniques de formule (I) permettent ainsi de connaître le potentiel d’une ou plusieurs souches bactériennes à devenir multirésistante.

Dans l’invention, les dérivés coumariniques peuvent être utilisés in vitro ou ex vivo sur un milieu biologique comprenant des bactéries d’origine animale ou humaine.

L’invention a pour deuxième objet une méthode de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une résistance par efflux de bactéries, sur un échantillon liquide contenant des cellules bactériennes desdites bactéries, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes : i) l’ajout à l’échantillon liquide d’un dérivé coumarinique (I) tel que défini dans le premier objet de l’invention, ii) l’incubation de l’échantillon avec ledit dérivé coumarinique (I), iii) l’élimination du dérivé coumarinique (I) qui ne s’est pas accumulé dans les bactéries, iv) la lyse des cellules bactériennes pour obtenir un lysat bactérien, et v) la mesure d’une valeur de fluorescence du lysat bactérien F(l) et la comparaison avec au moins une valeur de fluorescence de référence d’un lysat bactérien de référence F(0).

Grâce à cette méthode de diagnostic, il est possible de détecter le dérivé coumarinique (I) qui s’accumule au sein des bactéries, de le localiser, de le quantifier en termes d’unités de fluorescence relative mais également de molécules de dérivé coumarinique (I) par bactérie ou cellule bactérienne, et enfin de déterminer si les bactéries de l’échantillon liquide présentent une résistance par efflux.

Cette méthode est particulièrement performante car les composés coumariniques (I) sont des composés faciles à obtenir et/ou à préparer, qui ne présentent pas ou peu de toxicité pour permettre une manipulation de routine clinique, et qui ont un influx qui ne dépend pas ou peu des porines.

La méthode de diagnostic de l’invention permet la détection et/ou la mise en évidence d’une résistance par efflux, de l’efflux bactérien, ou du niveau d’expression de l’efflux de bactéries ou de différentes souches bactériennes.

Cette méthode de diagnostic peut notamment permettre de suivre l’évolution de la résistance par efflux de bactéries au cours d’un traitement antibiotique.

Etape i)

L’échantillon est un échantillon liquide. En d’autres termes, c’est un échantillon en milieu liquide ou comprenant une phase liquide.

L’échantillon liquide comprend de préférence 1x10 ⁹ à 8x10 ⁹ UFC/ml, et de façon particulièrement préférée de 2x10 ⁹ à 6x10 ⁹ UFC/ml environ de cellules bactériennes.

L’échantillon liquide est de préférence une suspension de cellules bactériennes dans un tampon physiologique.

Lors de l’étape i), le dérivé coumarinique (I) est ajouté de sorte qu’il présente une concentration molaire allant de 0,5 à 20 pmol/l environ, de préférence de 0,5 à 10 pmol/l environ, et de façon particulièrement préférée de 1 à 5 pmol/l environ dans l’échantillon liquide comprenant les cellules bactériennes.

La concentration va dépendre notamment de la fluorescence intrinsèque du dérivé coumarinique (I). De manière générale, la concentration est telle que la fluorescence mesurée à l’étape v) ne soit pas supérieure à 100000 UFR.

L’échantillon liquide comprenant les cellules bactériennes peut être obtenu avant l’étape i) par mise en culture in vitro de cellules bactériennes d’origine animale ou humaine (e.g. mise en suspension in vitro de cellules bactériennes d’origine animale ou humaine dans un milieu de culture), centrifugation pour stopper la croissance bactérienne, élimination du surnageant et suspension du culot bactérien restant dans un tampon physiologique.

Etape ii) L’étape ii) d’incubation est généralement très rapide. Elle peut durer de 1 à 10 min, et de préférence de 1 à 5 min. Elle est généralement effectuée à une température allant de la température ambiante (i.e. 18-25°C) à une température de 37°C.

Etape iii)

L’étape iii) peut être effectuée par centrifugation. Le surnageant contenant l’excès de dérivé coumarinique (I) est alors éliminé et le culot bactérien restant mis en œuvre dans l’étape iv) suivante.

Etape iv)

L’étape iv) de lyse est effectuée préférentiellement dans un tampon de lyse.

Etape v)

L’étape v) est une étape de mesure d’une valeur de fluorescence du lysat bactérien F(l) (en UFR) et la comparaison avec au moins une valeur de fluorescence d’un lysat bactérien référence F(0) (en UFR).

Elle est de préférence effectuée par spectrofluorométrie.

La valeur de fluorescence du lysat bactérien F(l) à l’étape v) peut être déterminée selon l’équation 1 suivante : dans laquelle :

- F(LBexp)x(l) désigne la valeur de fluorescence dite « expérimentale », i.e. obtenue sur le lysat bactérien « expérimental » de l’étape iv), déterminée à la longueur d’onde d’excitation du dérivé coumarinique (I) mis en œuvre dans l’étape i),

- F(LBexp)xTrp désigne la valeur de fluorescence dite « expérimentale », i.e. obtenue sur le lysat bactérien « expérimental » de l’étape iv), déterminée à la longueur d’onde d’excitation du tryptophane (qui est de 275 nm),

- F(LBcontrôle)x(l) désigne la valeur de fluorescence dite « contrôle », i.e. obtenue sur un lysat bactérien « contrôle » sans dérivé coumarinique (I), déterminée à la longueur d’onde d’excitation du dérivé coumarinique (I) mis en œuvre dans l’étape i), et - F(LBcontrôle)/ p désigne la valeur de fluorescence dite « contrôle », i.e. obtenue sur un lysat bactérien « contrôle » sans dérivé coumarinique (I), déterminée à la longueur d’onde d’excitation du tryptophane (qui est de 275 nm).

En ce qui concerne le lysat bactérien « contrôle » sans dérivé coumarinique (I), il est obtenu directement par lyse des cellules bactériennes de l’échantillon liquide mis en œuvre dans l’étape i) [i.e. pas d’étapes i), ii) et iii)].

L’étape v) est une étape de comparaison d’une valeur de fluorescence F(l) avec une valeur de fluorescence de référence F(0).

La valeur de fluorescence F(0) de référence peut être obtenue sur un lysat bactérien de référence obtenu en mettant en œuvre tout ou partie de la méthode telle que définie dans le deuxième objet de l’invention :

- sur un échantillon liquide comprenant des cellules bactériennes ayant un niveau d’efflux connu, ou

- sur un échantillon liquide comprenant des cellules bactériennes délétées de pompes d’efflux, ou

- sur un échantillon liquide comprenant des cellules bactériennes identiques à celles mises en œuvre dans la méthode telle que définie dans le deuxième objet de l’invention ayant conduit à la valeur F(l), mais dans laquelle l’étape i) comprend en outre l’ajout d’un inhibiteur de pompes d’efflux.

Dans ce dernier cas, l’inhibiteur peut être le carbonyl cyanide m-chlorophényl hydrazone (également connu sous l’acronyme CCCP).

La méthode conforme au deuxième objet de l’invention permet également de déterminer le nombre de molécules de dérivé coumarinique (I) par cellule bactérienne.

Pour ce faire, une gamme de fluorescence corrélée à la concentration du dérivé coumarinique (I) peut être établie en utilisation l’équation 1 telle que définie ci-dessus sur un lysat bactérien comprenant des concentrations C1 , C2, C3, etc... en dérivé coumarinique (I). On obtient respectivement les valeurs de fluorescence Fci (I), Fc2(l), Fcs(l), etc... Cela permet alors de créer une courbe sensiblement linéaire de la fluorescence en fonction de la concentration et de déterminer une équation de la courbe de tendance linéaire ayant un coefficient directeur « CD » dont la linéarité est vérifiée par le coefficient de corrélation r ² dont la valeur doit être supérieure ou égale à 0,99.

La concentration du dérivé coumarinique (I) en nombre de molécules par cellule bactérienne ou par bactérie [notée C(l) ci-après] dans un lysat bactérien ayant une fluorescence F(l) telle que définie ci-dessus peut alors être déterminée selon l’équation 2 suivante : dans laquelle CD est le coefficient directeur explicité ci-dessus, NA désigne le Nombre d’Avogadro qui est égal à 6,022x10 ²³ mol’ ¹ , et NB désigne le nombre de bactéries dans le lysat bactérien (en bacténes/l).

De la même manière qu’explicité ci-dessus, la concentration du dérivé coumarinique (I) en nombre de molécules par cellule bactérienne ou par bactérie [notée C(0) ci-après] dans un lysat bactérien de référence tel que défini ci-dessus ayant une fluorescence de référence F(0) telle que définie ci-dessus peut être déterminée.

À l’issue de l’étape v), la comparaison des valeurs de fluorescence F(l) et F(0), ou des valeurs de concentration du dérivé coumarinique C(l) et C(0), et en particulier le rapport F(l)/F(0) ou C(l)/C(0), permet d’identifier le niveau d’efflux et/ou de déterminer si les bactéries testées sont plus ou moins résistantes par efflux.

Plusieurs valeurs de référence de fluorescence ou de concentration peuvent être utilisées pour établir une gamme de résistance par efflux et affiner le diagnostic.

L’invention a pour troisième objet un dérivé coumarinique, de préférence pour une utilisation conforme au premier objet de l’invention, répondant à la formule (I’) suivante :

(0 dans laquelle :

- R’ ¹ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, un groupe acide carboxylique -CO2H, un groupe ester -OCO2R ⁷ dans lequel R ⁷ est un groupe alkyle, un groupe nitrile -CEN, un groupe nitro -NO2, ou un groupe sulfonate -OSO2R ⁸ dans lequel R ⁸ est un groupe alkyle ;

- R’ ² représente un atome d’hydrogène, un groupe alkyle, un groupe hydroxyle -OH, un groupe fluoroalkyle, un groupe acide carboxylique -CO2H, un groupe ester - CO2R ⁹ dans lequel R ⁹ est un groupe alkyle, ou un groupe alkoxy -OR ¹⁰ dans lequel R ¹⁰ est choisi parmi les groupes alkyle, halogénoalkyle et alcényle ;

- R’ ³ représente un atome d’hydrogène, un groupe alkyle, un groupe alkoxy - OR ¹¹ dans lequel R ¹¹ est un groupe alkyle ;

- R’ ⁴ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, un groupe alkyle, un groupe alkoxy -OR ¹² dans lequel R ¹² est un groupe alkyle, un groupe amine - NR ¹³ R ¹⁴ dans lequel R ¹³ et R ¹⁴ , identiques ou différents, sont des groupes alkyles, un groupe sulfonate -OSO2R ¹⁵ dans lequel R ¹⁵ est un groupe alkyle ;

- R’ ⁵ représente un groupe alkyle, ou un groupe alkyle substitué par un groupe fonctionnel choisi parmi un atome d’halogène, un groupe ester -0C(=0)R ¹⁸ dans lequel R ¹⁸ est un groupe alkyle, un groupe thioéther -SR ¹⁹ dans lequel R ¹⁹ est un groupe alkyle, un groupe nitrile -CEN, un groupe succinimide, un groupe pyrrole, un groupe pyrazole, un groupe thiazole, un groupe oxazole, un groupe imidazole, un groupe triazole, et un groupe sélénié -SeR ²³ dans lequel R ²³ est un atome d’hydrogène ou un groupe alkyle ; et

- R’ ⁶ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène, ou un groupe alkyle, étant entendu que lorsque R’ ⁵ représente un groupe alkyle ou un groupe alkyle substitué par un atome d’halogène en tant que groupe fonctionnel, au moins l’un des groupes R’ ¹ ou R’ ² est différent d’un atome d’hydrogène, et de préférence au moins le groupe R’ ² est différent d’un atome d’hydrogène.

Les groupes R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² , R ¹⁵ , R ¹⁸ , R ¹⁹ et R ²³ sont tels que définis dans le premier objet de l’invention.

Les groupes alkyles en tant que groupes R ¹³ et R ¹⁴ sont tels que définis dans le premier objet de l’invention.

De préférence, le groupe R’ ¹ représente un atome d’halogène, un groupe acide carboxylique -CO2H, un groupe ester -OC(=O)R ⁷ ou un groupe nitrile -CEN.

De préférence, le groupe R’ ² représente un groupe alkyle, un groupe ester - OC(=O)R ⁹ ou un groupe alkoxy -OR ¹⁰ .

De préférence, les groupes R’ ³ et R’ ⁶ représentent un atome d’hydrogène.

De préférence, le groupe R’ ⁴ représente un atome d’hydrogène, un atome d’halogène ou un groupe alkoxy -OR ¹² .

Le dérivé coumarinique de formule (I’) convient pour une utilisation conforme au premier objet de l’invention.

Les dérivés coumariniques de formule (I’) conformes au troisième objet de l’invention sont choisis avantageusement parmi ceux de formules (1-1 ) à (I-8), (1-10) et (1-13)-(l-14) suivantes :

TABLEAU 2

Parmi ces dérivés coumariniques, ceux de formules (1-5), (1-10), (1-14) et (1-15) sont particulièrement préférés.

Brève description des dessins

Le dessin annexé illustre l’invention :

La figure 1 illustre l’accumulation de dérivés coumariniques (I) dans différentes souches sélectionnées d’ Escherichia edi AG102, AG100, AG100A, et AG102 avec un inhibiteur de pompes à efflux CCCP.

La figure 2 illustre l’accumulation de dérivés coumariniques (I) dans différentes souches sélectionnées de Klebsiella aerogenes CM064, Ea27, ATCC15038, Ea294, CM064 avec un inhibiteur de pompes à efflux CCCP, et Ea27 avec un inhibiteur de pompes à efflux CCCP.

La figure 3 illustre l’accumulation de dérivés coumariniques (I) dans différentes souches sélectionnées de Klebsiella pneumoniae KPBjl M3 Lev ramR, KPBjl Rev, KPBjl Rev acrb et KPBjl M3 Lev ram R avec un inhibiteur de pompes à efflux. CCCP.

D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description d’exemples présentés ci-après auxquels l’invention n’est cependant pas limitée.

Exemples

Les solvants et réactifs ont été obtenus auprès des fournisseurs VWR, Sigma- Aldrich et Alfa Aesar.

Le suivi des réactions a été réalisé à l’aide de plaques de chromatographie sur couche mince (CCM) de silice de type « 60 F254 » commercialisés par MERCK KGaA. L’élution a été faite dans des solvants au mélange approprié avec détection sous lampe ultraviolette (UV lointain à À = 365 nm) montée sur support avec une chambre d’observation fournie par VWR (Marque « CAMAG », modèle « 0229120 »).

Les produits intermédiaires et finaux ont été évaporés sous vide grâce à un évaporateur rotatif de chez BUCHI composé d’une pompe type « V-700 », d’un contrôleur « V-850 », d’un bain chauffant « B-491 » puis du portoir rotatif « R-210 » afin de les obtenir sous leur forme physique finale, débarrassée de toute trace de solvant.

Les purifications des produits intermédiaires ont été réalisées soit par recristallisation dans de l’hexane, de l’éthanol ou de l’acétate d’éthyle ; soit par chromatographie liquide sur gel de silice « 60 » (0,063-0.200 mm) ; soit par chromatographie flash sur une colonne à micro-silice « RedisepRf » 40g, 20g et 5g, débit : 48 ml/min à 5 ml/min avec un appareil « CombiflashRf teledyne ISCO ».

Sauf mention contraire, les réactifs commerciaux et solvants ont été utilisés tels quels sans purification supplémentaire.

Pour la caractérisation des produits obtenus, les analyses RMN du proton et du carbone ( ¹ H, ¹³ C) ont été effectuées sur un spectromètre RMN « BRUKER Ascend Avance NEO 400 MHz » (analyses ¹ H à une fréquence de 400 MHz et analyses ¹³ C à une fréquence de 100 MHz). Les solvants deutérés tels que le DMSO-de, CDCh et MeOH-d4 ont été obtenus chez Sigma Aldrich, VWR et Eurisotop. Sur les spectres RMN, les déplacements chimiques (5) relatifs aux pics de résonnance sont déterminés à partir de l’intégration du nombre de protons et des figures de couplage qui sont reportées en parties par million (ppm) en prenant comme référence le pic des solvants suivants : DMSO-de: 5 ¹ H 2,50 ppm et 5 ¹³ C 39,52 ppm ; CDCI3 : 5 ¹ H 7,26 ppm et 5 ¹³ C 77,16 ppm et MeOH-d4: 5 ¹ H 3,31 ppm et 5 ¹³ C 49,00 ppm. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et la multiplicité des signaux est reportée de la manière suivante : s : singulet ; d : doublet ; t : triplet ; q : quadruplet ; qu : quintuplet ; sx : sextuplet ; h : heptuplet ; m : multiplet ; dd : doublet de doublet ; dt : doublet de triplet ; dq : doublet de quadruplet et ddt : doublet de doublet de triplet.

Les analyses de pureté ont été réalisées sur un appareil de chromatographie liquide haute performance « Accela Autosampler High Speed LC system », comportant une colonne en phase inverse « Thermo Hypersil Gold C18 » (1 ,9 pm de diamètre pour les particules) dont le volume d’injection est de 1 pL, commercialisé par Thermo Scientific. Un couplage a été effectué avec un spectromètre de masse « Thermo MSQ Plus » simple quadripole avec ionisation par électronébulisation (bien connu sous l’anglicisme « Electrospray Ionization », ou ESI) avec, comme phases mobiles, un mélange acétate d’ammonium : isopropanol (90:10) pour les dérivés coumariniques (1-1 ) à (I-3), et (1-11 ) ; un mélange de méthanol : eau (95:05) et méthanol pour les dérivés coumariniques (I-4) et (1-12) : acide formique (95:05) pour les dérivés coumariniques (I-5) à (1-10), et (1-13). Les rapports masse/charge (m/z) et les temps de rétention (TR) ont pu être mesurés pour un temps d’analyse total de 8 minutes. La pureté de tous les produits a été validée comme supérieure à 95%.

Les points de fusion des produits finaux ont été déterminés à l’aide d’un appareil « BUCHI Melting point B-450 ».

Exemple 1 : Synthèse des dérivés coumariniques de formules (1-1 ) à (1-13)

Préparation générale des composés (1-1 ) à (I-4) et (1-11 ) à (1-13) par synthèse de Williamson

Une solution comprenant de l’Ombelliférone ou 7-hydroxycoumarine (1 g, 1 ,0 équivalent) dans 10 ml de DMF anhydre est préparée dans un ballon à fond rond de 100 ml. Une solution de K2CO3 (1 ,5 à 4,2 équivalents dans 10 à 20 ml de DMF) est ajoutée à la solution précédente puis l’ensemble est laissé pendant 30 minutes sous agitation à température ambiante. Ensuite, un réactif halogéné de formule R ⁵ -X, X étant un atome d’halogène (entre 2 et 2,2 équivalents dissous dans 10 ml de DMF) est ajouté puis l’ensemble est laissé sous agitation entre 60 et 130°C pendant 5 à 20 heures selon la nature du réactif employé. À la fin de la réaction, suivie par chromatographie sur couche mince, le mélange réactionnel est refroidi sous agitation jusqu’à température ambiante puis évaporé sous vide. Enfin, on réalise une extraction liquide-liquide dans une ampoule à décanter avec de l’acétate d’éthyle (100 ml). La phase organique est ensuite lavée 3 fois avec de l’eau distillée (30 ml). La phase organique résultante est séchée sur MgSC anhydre puis filtrée sur verre fritté avant d’être évaporée pour obtenir le produit brut sous forme huileuse ou solide. Les purifications nécessaires sont alors réalisées en fonction des résultats de chromatographie sur couche mince et de chromatographie liquide couplée avec la spectrométrie de masse.

Composé (1-1) : 7-(2-(Acétyloxy)éthoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2,2 équivalents de réactif halogéné de formule CH3C(O)OCH2CH2Br ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 85°C pendant 12 heures. Après chromatographie sur micro-silice éther de pétrole / acétate d’éthyle (7:3) et recristallisation dans l’éthanol, le composé (1-1 ) a été obtenu sous la forme d’une poudre blanche cotonneuse, avec un rendement de 50 % (m/z = 249,18 (M+H) (TR = 4,40 min), Pf = 99°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,64 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 7,39 (H-Ar, 1 H, d, J =8,4 Hz), 6,85 (H-Ar, 1 H, dd, J = 2,3 et 8,6 Hz) , 6,83 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,5 Hz) , 6,27 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz) , 4,46 (CH2-O-C-O-CH3, 2H, t, J =4,6 Hz), 4,24 (CH ₂ -O-Ar, 2H, t, J = 4,8 Hz), 2,12 (CH ₃ , 3H, s). ¹³ C RMN (CDCh) 5 : 170,84 (CH3-COOR), 161 ,57 (C=O), 161 ,04 (C-O-R), 155,77 (O-C=CH), 143,27 (CH-Ar), 128,65 (CH-Ar), 113,43 (CH-Ar), 112,89 (CH-Ar), 112,80 (C-Ar), 101 ,58 (CH-Ar), 66,39 (CH2-O), 62,30 (CH2-O-C-O-CH3), 20,83 (CH ₃ ).

Composé (I-2) : 7-(2-(éthylthio)éthoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2,2 équivalents de réactif halogéné de formule CH3CH2SCH2CH2CI ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 85°C pendant 12 heures. Après chromatographie sur micro-silice éther de pétrole / acétate d’éthyle (8 :2) et recristallisation dans l’éthanol, le composé (I-2) a été obtenu sous la forme de cristaux blancs, avec un rendement de 35 % (m/z = 251 ,18 (M+H) (TR = 5,41 min), Pf = 69°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,64 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 7,38 (H-Ar, 1 H, d, J =8,6 Hz), 6,85 (H-Ar, 1 H, dd, J = 2,4 et 8,5 Hz) , 6,81 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,4 Hz) , 6,26 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz) , 4,20 (CH ₂ -O-Ar, 2H, t, J = 6,8 Hz), 2,95 (CH ₂ -S, 2H, t, J = 6,8 Hz), 2,1 (CH2-S, 2H, q, J = 7,4 Hz), 1 ,31 (CH ₃ , 3H, t, J = 7,4 Hz).

¹³ C RMN (CDCI3) 5 : 161 ,75 (C=O), 161 ,08 (C-O-R), 155,81 ( O-C=CH), 143,31 (CH-Ar), 128,80 (CH-Ar), 113,25 (CH-Ar), 112,80 (CH-Ar), 112,72 (CH-Ar), 101 ,50 (CH-Ar), 68,29 (CH2-O), 30,32 (CH ₂ -S), 26,63 (CH ₂ -S), 14,84 (CH ₃ ).

Composé (I-3) : 4-((2-Oxo-2H-1-benzopyran-7-yl)oxy)butanenitrile

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2,2 équivalents de réactif halogéné de formule NCCH2CH2CH2Br ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 120°C pendant 12 heures. Après chromatographie sur micro-silice éther de pétrole / acétate d’éthyle (7:3) et recristallisation dans l’éthanol, le composé (I-3) a été obtenu sous la forme d’une poudre blanche, avec un rendement de 64 % (m/z = 230,24 (M+H) (TR = 4,22 min), Pf = 89°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI ₃ )5 : 7,64 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,4 Hz), 7,39 (H-Ar, 1 H, d, J =8,6 Hz), 6,85 (H-Ar, 1 H, dd, J = 2,4 et 8,5 Hz) , 6,81 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,3 Hz) , 6,27 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz) , 4, 15 (CH ₂ -O-Ar, 2H, t, J = 5,7 Hz), 2,62 (CH ₂ -CN, 2H, t, J = 7,1 Hz), 2,2 (CH ₂ - CH _2I 2H, qu, J = 6,4 Hz).

¹³ C RMN (CDCI ₃ )5 : 161 ,39 (C=O), 160,98 (C-O-R), 155,76 ( O-C=CH), 143,26 (CH-Ar), 128,90 (CH-Ar), 118,83 (CN), 113,45 (CH-Ar), 112,92 (C-Ar), 112,55 (CH- Ar), 101 ,52 (CH-Ar), 65,84 (CH ₂ -O), 25,15 (CH ₂ -CH ₂ -CN), 14,16 (CH ₂ -CN).

Composé (I-4) : 2-((2-Oxo-2H-benzopyran-7-yl)oxy)éthylpyrrolidine-2,5- dione

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 1 ,5 équivalents de K ₂ CO ₃ dans 15 ml de DMF. 1 ,5 équivalents de réactif halogéné de formule succinimide-CH ₂ CH ₂ Br ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 130°C pendant 9 heures. Après chromatographie sur silice hexane / acétate d’éthyle (6:4), le composé (I-4) a été obtenu sous la forme de cristaux blancs, avec un rendement de 45 % (m/z = 287,12 (M+H) (TR = 3,78 min), Pf = 178°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI ₃ ) 5 : 7,62 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 7,36 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,6 Hz), 6,82 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,6 Hz , 2,4 Hz ), 6,77 ( H-Ar, 1 H, d, J = 2,4 Hz), 6,26 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 4,21 ( O-CH ₂ , 2H, t, J = 5,88 Hz), 3,97 ( CH ₂ -N, 2H, t, J = 5,8 Hz), 2,76 (CH ₂ -C=O), 4H, S).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) 5: 176,89 (2x N-C=O), 161 ,28 (C=O), 160,98 (C- O), 155,71 (C-O), 143,22 (CH Ar), 128,81 (CH Ar), 113,46 (CH Ar), 112,91 (C Ar), 112,76 (CH Ar), 101 ,58 (CH Ar), 64,41 (CH ₂ -O), 37,71 (CH ₂ -N), 28, 14 (2x CH ₂ -C=O).

Composé (1-11) : 7-Pentyloxy-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 1 ,9 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2,2 équivalents de réactif halogéné de formule CH3CH2CH2CH2CH2I ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 80°C pendant 3 heures. Après chromatographie sur micro-silice hexane / acétate d’éthyle (8, 5: 1 ,5), le composé (1-11 ) a été obtenu sous la forme de cristaux blancs, avec un rendement de 60 % (m/z = 233,34 (M+H) (TR = 6,05 min), Pf = 30,5°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,63 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 7,36 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,5 Hz), 6,83 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,6 Hz ; 2,4 Hz ), 6,79 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,4 Hz), 6,23 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,4 Hz), 4,01 (CH2-O, 2H, t, J = 6,6 Hz), 1 ,82 (CH ₂ -CH ₂ -O, 2H, qu, J = 6,75 Hz), 1 ,42 (CH3-CH2-CH2-CH2-O, 4H, m), 0,94 (CH ₃ , 3H, t, J = 7,13 Hz).

¹³ C RMN (100 MHZ,CDCI ₃ ) 5 : 162,41 (C=O), 161 ,25 (C-O), 155,89 (C-O), 143,42 (CH-Ar), 128,65 (CH-Ar), 112,95 (CH-Ar), 112,86 (CH-Ar), 112,35 (C-Ar), 101 ,28 (CH-Ar), 68,62 (CH ₂ -O), 28,68 (CH ₂ -CH ₂ -O), 28,05 (CH ₂ -CH ₂ -O), 22,37 (CH ₂ - CH ₃ ), 13,95 (CH ₃ ).

Composé (1-12) : 7-Hexyloxy-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 20 ml de DMF. 2,2 équivalents de réactif halogéné de formule CH3CH2CH2CH2CH2CH2I ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 80°C pendant 5 heures. Après chromatographie sur micro-silice éther de pétrole / acétate d’éthyle (8:2), le composé (1-12) a été obtenu sous la forme d’une huile beige, avec un rendement de 55 % (m/z = 247,28 (M+H) (TR = 6,39 min), Pf = température ambiante).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,63 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 7,36 (H-Ar, 1 H, d, J =8,5 Hz), 6,83 (H-Ar, 1 H, dd, J = 2,4 et 8,5 Hz) , 6,8 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,4 Hz) , 6,24 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,4 Hz) , 4,01 (CH ₂ -O-Ar, 2H, t, J =6,6Hz), 1 ,81 (CH2-CH2, 2H, qu, J = 6,6 Hz), 1 ,47 (CH ₂ - CH ₂ , 2H, qu, J = 6,7Hz), 1 ,35 (2x CH ₂ -CH ₂ , 2H, m, J =7 Hz), 0,92 (CH ₃ , 3H, t, J = 6,7 Hz).

¹³ C RMN (CDCI ₃ ) 5 : 162,41 (C=O), 161 ,26 (C-O), 155,89 (C-0), 143,33 (CH- Ar), 128,65 (CH-Ar), 112,95 (CH-Ar), 112,86 (CH-Ar), 112,32 (C-Ar), 101 ,29 (CH-Ar), 68,64 (CH ₂ -O), 31 ,47 (CH ₂ -CH ₂ -O), 28,9 (CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -O), 25,59 (CH ₂ -CH ₂ -CH ₃ ), 22,53 (CH ₂ -CH ₃ ), 13,98 (CH ₃ ).

Composé (1-13) : 7-(4-Bromobutoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7- hydroxycoumarine, 1 ,9 équivalents de K ₂ CO ₃ dans 20 ml de DMF. 3 équivalents de réactif halogéné de formule BrCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ Br ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 90°C pendant 4 heures. Après chromatographie sur silice éther de pétrole / acétate d’éthyle (8,75:1 ,25), le composé (1-13) a été obtenu sous la forme de cristaux jaunes fluorescents, avec un rendement de 50 % (m/z = 297,8 (M+H) (TR = 5,8 min), Pf = 67,5°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI ₃ ) 5 : 7,64 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,4 Hz), 7,35 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,5 Hz), 6,83 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,5 Hz ; 2,4 Hz), 6,8 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,4 Hz), 6,25 (H-Ar, 1 H, d, J = 9,5 Hz), 4,06 (CH ₂ -O, 2H, t, J = 5,9 Hz), 3,50 (CH ₂ -Br, 2H, t, J = 6,4 Hz), 2,13-1 ,96 (CH ₂ -CH ₂ , 4H, m).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) 5: 162,04 (C=O), 161 ,16 (C-O), 155,85 (C-O), 143,36 (CH-Ar), 128,74 (CH-Ar), 113,10 (CH-Ar), 112,83 (CH-Ar), 112,55 (C-Ar), 101 ,32 (CH-Ar), 67,49 (CH ₂ -O), 33,15 (CH ₂ -Br), 29,27 (CH ₂ -CH ₂ -Br), 27,62 (CH ₂ -CH ₂ - O).

Préparation générale des composés (I-5) à (1-10)

Une solution de dérivé de coumarine ayant les groupes R ¹ et/ou R ² appropriés (1 ,0 équivalent dans 15 ml de DMF anhydre) est préparée dans un ballon à fond rond de 100 ml. Une solution de K ₂ CO ₃ (2,0 à 4,0 équivalents dans 10 à 20 ml de DMF) est ajoutée à la solution précédente puis l’ensemble est laissé pendant 30 minutes sous agitation à température ambiante. Ensuite, l’iodopentane (entre 1 et 2 équivalents) est ajouté goutte-à-goutte puis l’ensemble est laissé sous agitation entre 60 et 130°C pendant 5 à 25 heures selon la nature du dérivé de coumarine de départ employé. À la fin de la réaction, suivie par chromatographie sur couche mince, le mélange réactionnel est refroidi sous agitation puis à température ambiante puis évaporé sous vide. Enfin, on réalise une extraction liquide-liquide dans une ampoule à décanter avec de l’acétate d’éthyle (100 ml). La phase organique contenant l’acétate d’éthyle est alors lavée 3 fois avec de l’eau distillée (30 ml). La phase organique résultante est séchée sur MgSC anhydre puis filtrée sur verre fritté avant d’être évaporée pour obtenir le produit brut sous forme huileuse ou solide. Les purifications nécessaires sont alors réalisées en fonction des résultats de chromatographie sur couche mince et de chromatographie liquide couplée avec la spectrométrie de masse.

Composé (I-5) : 4-Méthyl-7-(pentoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7-hydroxy- 4-méthyl coumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 90°C pendant 12 heures. Après chromatographie sur silice hexane / acétate d’éthyle (8,5:1 ,5), le composé (I-5) a été obtenu sous la forme de cristaux jaunes-clairs, avec un rendement de 70 % (m/z = 247,16 (M+H) (TR = 6,22 min), Pf = 45°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,48 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,9 Hz), 6,85 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,8 Hz, 2,5 Hz ), 6,79 ( H-Ar, 1 H, d, J = 2,5 Hz), 6,12 (H-Ar, 1 H, d, J = 1 ,1 Hz), 4,01 (O-CH2, 2H, t, J = 6,6 Hz), 2,39 (CH ₃ -Ar, 3H, d, J = 1 ,1 Hz), 1 ,82 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J =8 Hz), 1 ,42 (CH2-CH2, 4H, m), 0,94 (CH ₃ , 3H, t, J = 7,13 Hz).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI3) 5 : 162,20 (C=O), 161 ,32 (C-O), 155,26 (C-O), 155,54 (C-CH3 Ar), 125,41 (CH-Ar), 113,33 (CH-Ar), 112,61 (CH-Ar), 111 ,74 (C-Ar), 101 ,28 (CH-Ar), 68,55 (O-CH ₂ ), 28,64 (O-CH2-CH2), 28,05 (CH2-CH2), 22,37 (CH ₂ - CH ₂ ), 18,61 (CH ₃ -CH ₂ ), 13,95 (CH ₃ ).

Composé (I-6) : 7-(Pentoxy)-4-(trifluorométhyl)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 7-hydroxy- 4-trifluorométhyl coumarine, 2 équivalents de K2CO3 dans 15 ml de DMF. 2 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 90°C pendant 8 heures. Après recristallisation dans l’éthanol, le composé (I-6) a été obtenu sous la forme de cristaux jaunes-clairs, avec un rendement de 65 % (m/z = 300,96 (M+H) (TR = 6,80 min), Pf = 53°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI3) 5 : 7,61 (H-Ar, 1 H, dd, J = 9,21 ,2,76 Hz), 6,91 (H-Ar, 1 H, dd, J = 9,5, 2,5 Hz), 6,86 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,5 Hz), 6,61 (CF3-C-CH, 1 H, s), 4,04 (O-CH2, 2H, t, J =6,6), 1 ,84 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J = 8 Hz), 1 ,44 (CH2-CH2, 4H, m), 0,94 (CH ₃ , 3H, t, J = 7,13 HZ).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI3) 5 : 163,13 (C=O), 159,47 (C-O), 156,36 (C-O), 141 ,77-141 ,44 (C-CF3), 126,22 (CH-Ar), 122,97-120,24 (CF ₃ ), 113,74 (CH-Ar), 112,02 (CH-Ar), 106,80 (C-Ar), 101 ,80 (CH-Ar), 68,84 (O-CH ₂ ), 28,55 (O-CH2-CH2), 28,02 (CH2-CH2), 22,36 (CH3-CH2), 13,95 (CH ₃ ).

Composé (I-7) : 4-Hydroxy-7-(pentoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 4,7- dihydroxy coumarine, 1 ,1 équivalents de K2CO3 dans 20 ml de DMF. 1 ,5 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 90°C pendant 8 heures. Après chromatographie sur silice hexane / acétate d’éthyle (8,5:1 ,5), le composé (I-7) a été obtenu sous la forme de cristaux blancs, avec un rendement de 35 % (m/z = 249,23 (M+H) (TR = 5,84 min), Pf = 177°C).

¹ H RMN (400 MHz DMSOd ₆ ) 5 : 10,53 (Ar-OH, 1 H, s), 7,59 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,6 Hz), 6,78 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,7, 2,2 Hz), 6,68 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,3 Hz), 5,63 (CH=COH, 1 H, s), 4,14 (O-CH _2I 2H, t, J =6,4), 1 ,78 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J = 6,31 Hz), 1 ,39 (CH ₂ - CH ₂ , 4H, m), 0,94 (CH ₃ , 3H, t, J = 8,21 Hz).

¹³ C RMN (100 MHz, DMSOd ₆ ) 5 : 165,63 (C-OH), 162,22 (C=O), 161 ,65 (C-O), 154,65 (C-O), 124,09 (CH-Ar), 112,81 (CH-Ar), 107,19 (C-Ar), 102,27 (CH-Ar), 87,12 (CH-COH), 69,11 (O-CH2), 27,70 (O-CH2-CH2), 27,59 (CH2-CH2), 21 ,79 (CH3-CH2), 13,86 (CH ₃ ).

Composé (I-8) : 3-Chloro-4-méthyl-7-(pentoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de 3-chloro- 7-hydroxy-4-méthyl coumarine, 2 équivalents de K2CO ₃ dans 20 ml de DMF. 2 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 90°C pendant 9 heures. Après recristallisation dans l’éthanol, le composé (I-8) a été obtenu sous la forme d’une poudre beige clair, avec un rendement de 75 % (m/z = 281 ,06 (M+H) (TR = 6,54 min), Pf = 70°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI ₃ ) 5 : 7,51 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,9 Hz), 6,89 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,9, 2,5 Hz), 6,8 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,5 Hz), 4,01 (O-CH ₂ , 2H, t, J =6,6), 2,54 (CH ₃ - Ar, 3H, s), 1 ,82 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J = 8 Hz), 1 ,44 (CH2-CH2, 4H, m), 0,94 (CH ₃ - CH ₂ , 3H, t, J = 7,13 Hz).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI ₃ ) 5 : 161 ,81 (C-0), 157,13 (C=O), 152,78 (C-O), 147,66 (CH-Ar), 125,44 (CH-Ar), 117,23 (C-CI), 112,98 (C-Ar), 112,71 (CH-Ar), 100,86 (CH-Ar), 68,37 (O-CH2), 28,30 (O-CH2-CH2), 27,73 (CH2-CH2), 22,06 (CH ₃ -CH ₂ ), 15,79 (CH ₃ -CH ₂ ), 13,63 (CH ₃ -Ar).

Composé (I-9) : 2-Oxo-7-(pentoxy)-2H-1-benzopyran-3-carboxylic acid

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g d’acide 7- hydroxycoumarine-3-carboxylique , 1 ,5 équivalents de K2CO ₃ dans 5 ml de DMF. 3 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 80°C pendant 16 heures. Une forme estérifiée en position 3 par un groupement pentyle.du composé (I-9) est obtenue (3-pentanoate de méthyle-7-pentoxycoumarine). Une solution de cette forme estérifiée (100 mg, 1 ,0 équivalent) dans 20 ml d’éthanol, dans un ballon à fond rond de 100 mL est mise en présence de soude (1 ,5 équivalents soit 5 ml) pour une saponification. La réaction est ensuite agitée 5 heures à 70°C. À la fin de la réaction, suivie par chromatographie sur couche mince, la solution résultante est acidifiée avec de l’acide chlorhydrique 1 M goutte-à-goutte et sous agitation, jusqu’à atteindre un pH de 1 . Enfin, l’extraction liquide-liquide avec de l’acétate d’éthyle et de l’eau distillée suivie d’une recristallisation dans l’éthanol est faite de la même manière que décrite précédemment afin d’obtenir le composé (I-9) sous la forme d’une poudre blanche, avec un rendement de 50 % (m/z = 277,10 (M+H) (TR = 6,0 min), Pf = 152°C).

¹ H RMN (400 MHz CDCI ₃ ) 5 : 12,22 (COOH, 1 H, s), 8,85 (H-Ar, 1 H, s), 7,64 (H- Ar, 1 H, d, J = 8,8 Hz), 7,01 (H-Ar, 1 H, dd, J =8,8 ; 2,4 Hz), 6,91 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,1 Hz), 4,01 (O-CH2, 2H, t, J = 6,5 Hz), 1 ,86 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J = 6,02 Hz), 1 ,44 (CH2-CH2, 4H, m), 0,95 (CH3-CH2, 3H, t, J = 7,36 Hz).

¹³ C RMN (100 MHz, CDCI3) 5 : 165,91 (COOH), 164,60 (C-O), 163,14 (C=O), 157,09 (C-O), 151 ,22,35 (CH-Ar), 131 ,65 (CH-Ar) 115,46 (CH-Ar), 112,12 (C-COOH), 110,61 (C-Ar), 101 ,16 (CH-Ar), 69,36 (CH ₂ -O), 28,47 (O-CH2-CH2), 27,97 (CH2-CH2), 22,32 (CH3-CH2), 13,93 (CH3-CH2).

Composé (1-10) : 4-Méthoxy-7-(pentoxy)-2H-1-benzopyran-2-one

Une solution de 4,7-dihydroxycoumarine (1 g, 1 ,0 équivalent) est solubilisée dans 56 ml de méthanol, servant de réactif et de solvant, dans un ballon à fond rond de 100 ml. 0,12 équivalent d’acide sulfurique (soit 36 pl pour 1 g de 4,7- hydroxycoumarine) est ajouté dans le ballon puis l’ensemble est laissé sous agitation à 60°C pendant 7 heures. À la fin de la réaction, suivie par chromatographie sur couche mince, le mélange réactionnel est refroidi dans un bain de glace et filtré sur verre fritté, rincé avec du méthanol froid pour être ensuite évaporé afin d’obtenir le produit brut sous forme de solide. Le composé 7-Hydroxy-4-méthoxy-2/-/-1 - benzopyran-2-one intermédiaire de formule suivante : est obtenu sous la forme de cristaux blancs, avec un rendement de 80 % (m/z = 193,03 (M+H) (TR = 3,93 min), Pf = 210°C).

¹ H RMN (400 MHz DMSOd ₆ ) 5 : 10,55 (Ar-OH, 1 H, s), 7,60 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,6 Hz), 6,77 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,7, 2,3 Hz), 6,69 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,3 Hz), 5,66 (CH=CO- CH ₃ , 1 H, S), 3,96 (O-CH3, 3H, s).

¹³ C RMN (100 MHz, DMSOd ₆ ) 5 : 166,46 (C-O-CH3), 162, 19 (C=O), 161 ,68 (C- OH), 154,63 (C-O), 124, 13 (CH-Ar), 112,84 (CH-Ar), 107,08 (C-Ar), 102,04 (CH-Ar), 86,91 (CH=CO-CH ₃ ), 56,75 (O-CH ₃ ).

Le protocole tel que décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec 1 g de composé 7-Hydroxy-4-méthoxy-2/-/-1-benzopyran-2-one intermédiaire tel que préparé précédemment, 2 équivalents de K2CO ₃ dans 25 ml de DMF. 2 équivalents de iodopentane ont été utilisés, et la réaction a été conduite à 80°C pendant 16 heures. Après recristallisation dans l’éthanol, le composé (1-11 ) a été obtenu sous la forme d’une poudre beige, avec un rendement de 70 % (m/z = 263,22 (M+H) (TR = 6,31 min), Pf = 78°C).

¹ H RMN (400 MHz CD ₃ OD) 5 : 7,7 (H-Ar, 1 H, d, J = 8,9 Hz), 6,88 (H-Ar, 1 H, dd, J = 8,9, 2,4 Hz), 6,81 (H-Ar, 1 H, d, J = 2,3 Hz), 5,64 (CH=CO-CH ₃ , 1 H, s), 4,03 (O- CH ₂ , 2H, m), 4,01 (O-CH ₃ , 3H, s) 1 ,8 (O-CH2-CH2, 2H, qu, J = 7,55 Hz), 1 ,43 (CH ₂ - CH ₂ , 4H, m), 0,95 (CH3-CH2, 3H, t, J = 6,80 Hz).

¹³ C RMN (100 MHz, CD ₃ OD) 5 : 169,21 (C-O-CH ₃ ), 166,04 (C=O), 164,71 (C- O), 156,46 (C-O), 125,35 (CH-Ar), 114,06 (CH-Ar), 109,95 (C-Ar), 101 ,98 (CH-Ar), 88,05 (CH=CO-CH ₃ ), 69,93 (O-CH ₂ ), 57,43 (O-CH ₃ ), 30,01 (O-CH2-CH2), 29,44 (CH ₂ - CH ₂ ), 23,65 (CH ₃ -CH ₂ ), 14,51 (CH3-CH2). Exemple 2 : caractérisation de fluorescence, de susceptibilité bactérienne directe et de détection de niveau d’efflux

Souches bactériennes et appareils utilisés

Dans les protocoles qui suivent, une ou plusieurs des souches bactériennes suivantes sont utilisées :

- des souches d’E. Coli : AG100 (Souche sauvage d’E coli K-12 TET ^S , AG100A (AacrB::KAN ^R ), AG102 (AG100 AmarA), et AGIOOAAPorine (AG100A AompC, ompF::KAN ^R ) (KAN : Kanamycine ; TET : tétracycline ; R : résistant ; S : sensible) ;

- des souches de K. aerogenes : ATCC15038 (Souche de reference (P+,E+)), Ea294 (EA289 acrA::KAN ^R (P+,E-)), CM064 (ATCC13048 CHL ^R surexprimant AcrAB- TolC (P+, E+++)), Ea27 (Isolat clinique MDR résistant par imperméabilité et efflux énergie-dependant de NFX et CHL, KAN ^R , AMP ^R , NAL ^R , STR ^R et TET ^R (P- E++)) ;

- des souches de K. pneumoniae : KPBjl Rev (Révertant phénotypique de KPBjl E+ (Isolat clinique MDR) sensible aux antibiotiques (P+,E+)), KPBjl Rev acrb (KPBJ1 Rev acrB::Kan ^R (P+,E-)), KPBjl M3 Lev ramR (KPBJ1 Rev ramR (P+.E++).

Par ailleurs, la densité optique des échantillons est mesurée à 600 nm à l’aide d’un spectromètre d’absorbance vendu sous la dénomination commerciale « Tecan Infinite Pro 200 ».

Les valeurs de fluorescence sont déterminées à l’aide d’un appareil vendu sous la dénomination commerciale « Tecan Infinite Pro 200 ».

Caractéristiques de fluorescence

Les tests de fluorescence décrits ci-après permettent de déterminer les caractéristiques spectrales des dérivés coumariniques (I) de l’invention.

Des tests de fluorescence sont ainsi réalisés sur un échantillon liquide contenant des cellules bactériennes de bactéries AG100A d’E. coli, en tant que bactérie de référence selon les étapes décrites ci-dessous (e.g. mise en suspension in vitro de cellules bactériennes d’origine animale ou humaine dans un milieu de culture). Un échantillon liquide contenant des cellules bactériennes provenant de bactéries AG100A d’E. coli est préparé. Pour ce faire, la croissance bactérienne est réalisée dans un milieu de culture « LB » ou bouillon lysogène (i.e. milieu préparé à partir de 10 g de Tryptone, 10 g de chlorure de sodium de Sigma-aldrich et 5 g d’extrait de levures de « BD Difco » pour 1 I d’eau milli-Q stérile dont le pH est ajusté à 7,5) et stoppée en phase exponentielle (pour une densité optique à 600 nm comprise entre 0,45 et 0,7). Le milieu bactérien obtenu est centrifugé à 2900 xg (force relative centrifuge) pendant 15 minutes à 20°C et le surnageant est éliminé. La densité bactérienne finale dans un tampon physiologique (i.e. tampon phosphate de sodium comprenant du chlorure de magnésium à 2 mmol/l à pH 7, également dénommé « NaPi-MgCl2 ») est de 4,8x10 ⁹ UFC/ml (culot).

800 pl du culot sont distribués dans des tubes Eppendorf de 1 ,5 ml afin de procéder à l’élimination du tampon physiologique par centrifugation à 11292 xg (correspondant à 10000 tours par minute) pendant 5 minutes à 4°C.

Le surnageant est éliminé.

500 pl de tampon de lyse (i.e. solution de chlorhydrate de glycine à une concentration de 0,1 mol/l à pH 3) sont alors ajoutés au culot et l’ensemble est laissé pendant au moins 4 heures afin de procéder à la lyse des cellules bactériennes. Puis, le milieu bactérien lysé obtenu est centrifugé à 14680 xg (ou 13000 tours par minutes) pendant 15 minutes à 4°C, pour obtenir et récupérer le surnageant correspondant au lysat bactérien.

45 pl de lysat bactérien sont distribués dans une plaque 96 puits avec, dans chaque puit, 45 pl de différents tampons correspondant à différents pH (i.e. tampon phosphate de sodium pour un pH neutre, tampon de lyse tel que défini ci-dessus pour un pH acide, et tampon comprenant du 2-amino-2-hydroxyméthylpropane-1 ,3-diol à une concentration de 3 mol/l à pH 8 environ, également dénommé tampon « tris ») pour un pH basique.

10 pl d’un dérivé coumarinique (I) à une concentration de 10 pmol/l sont ajoutés dans les puits, afin d’obtenir une concentration finale de 1 pmol/l.

La fluorescence du lysat bactérien notée F(l) est déterminée selon l’équation 1 telle que définie dans la description. Le protocole décrit ci-dessus est reproduit sans ajout de dérivé coumarinique (lysat bactérien « contrôle » sans dérivé coumarinique (I)). La fluorescence du lysat bactérien de contrôle notée F(0) est déterminée selon l’équation 1 telle que définie dans la description.

La valeur de fluorescence indiquée dans le tableau 3 correspond à la valeur de F(l) - F(0) (en UFR) et elle est définie comme étant la valeur la plus élevée obtenue en fonction des différents tampons testés.

Le tableau 3 ci-dessous répertorie les caractéristiques de fluorescence des composés (1-1 ) à (1-13) et à titre comparatif celles de deux composés connus : la CIP qui est une fluoroquinolone et un dérivé coumarinique de référence (sans groupe R ⁵ ) de formule suivante et noté ci-après A1 :

(*) ne faisant pas partie de l’invention TABLEAU 3

Les dérivés coumariniques (I) présentent tous une fluorescence suffisante pour être utilisés comme sondes fluorescentes dans le diagnostic de l’efflux bactérien.

Caractéristiques de susceptibilité bactérienne

Afin d’étudier les caractéristiques de susceptibilité bactérienne des composés coumariniques de l’invention, et à titre comparatif celles de deux composés connus de référence, une méthode basée sur la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) a été appliquée d’après les recommandations du « CLSI » (« Laboratory Standards for a Healthier World »), et conformément aux recommandations du comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM). Celle-ci comprend les étapes décrites ci-dessous.

Des échantillons liquides contenant des cellules bactériennes provenant de bactéries AG100, AG100A, AG102, ou AGI OOAAPorine d’E. coli sont préparés. Pour ce faire, la croissance bactérienne est réalisée dans un milieu de culture de type « Mueller-Hinton II » ou « MHII » (i.e. milieu préparé à partir de 22 g de poudre de « MHII » de « BD Difco » pour 1 I d’eau milli-Q stérile) et stoppée en phase exponentielle (pour une densité optique à 600 nm comprise entre 0,45 et 0,7. Le milieu bactérien obtenu est centrifugé à 2900 xg pendant 15 minutes et 20°C et le surnageant est éliminé. La densité bactérienne finale dans ledit tampon physiologique est de 2x10 ⁵ UFC/ml (culot) par ajustement dans du précité milieu de culture « MHII ».

Le culot est distribué dans une microplaque 96 puits, et un dérivé coumarinique (I) à une concentration de 0,004 à 2 mmol/l est ajouté dans chaque puit, afin d’obtenir des échantillons liquides comprenant une concentration finale en dérivé coumarinique (I) allant de 0,4 à 200 pmol/l.

Les échantillons liquides contenant ledit dérivé coumarinique (I) sont incubés pendant une durée de 18 à 20 heures à 37°C.

Un colorant, appelé chlorure d’iodonitrotétrazolium (« INT ») à une concentration de 0,2 mg/ml est ajouté dans les échantillons liquides contenant une concentration finale allant de 0,4 à 200 pmol/l en composés (I-6) et (I-9), dans les échantillons liquides contenant une concentration finale supérieure ou égale à 50 pmol/l en composés (I-5), (1-11 ) et (1-12), et dans les échantillons liquides contenant une concentration finale supérieure ou égale à 100 pmol/l en composés (1-1 ) à (I-4), (I-7), (I-8), (1-10), et (1-13).

L’ajout du colorant INT permet d’obtenir un résultat macroscopique grâce à une coloration plus ou moins rouge en présence de bactéries vivantes, et favoriser une bonne interprétation de la CMI dans le cas où le dérivé coumarinique (I) posséderait une longueur d’onde d’absorbance dans le visible, ou dans le cas où certaines colonies seraient encore présentes dans les puits alors qu’elles ne sont pas « métaboliquement » vivantes.

La densité optique à 600 nm des échantillons liquides obtenus est mesurée à l’aide d’un spectromètre d’absorbance tel que décrit dans l’exemple 2.

La CMI est représentée par la condition de concentration pour laquelle la densité optique est nulle ou équivalente à celle du contrôle négatif (i.e. précité milieu de culture « MHII » seul sans dérivé coumarinique (I) et sans cellules bactériennes).

La méthode précitée est également effectuée dans les mêmes conditions que ci-dessous avec ajout d’un inhibiteur de référence des pompes d’efflux AcrAB-TolC (i.e. PAI3.N ou Phenylalanine-Arginine-R>-naphtylamide) présent à une concentration de 20 pg/ml dans les différents puits avant incubation, selon les normes de la CA-SFM et du CLSI.

À titre d’assurance-qualité de l’expérience, la méthode précitée est également effectuée dans les mêmes conditions que ci-dessus, avec ou sans ajout d’un inhibiteur de référence des pompes d’efflux AcrAB-TolC, en remplaçant le dérivé coumarinique (I) par le solvant de la solution de stockage dudit dérivé coumarinique (I) (i.e. une solution de diméthylsulfoxyde ou DMSO à 0,2 %).

Le tableau 4 ci-dessous répertorie les caractéristiques de susceptibilité bactérienne des composés (1-1 ) à (1-13) et à titre comparatif celles de la CIP et dudit dérivé coumarinique de référence A1 .

TABLEAU 4

Tests d’accumulation

Les tests d’accumulation permettent de vérifier la prise en charge des dérivés coumariniques par les pompes d’efflux.

Des tests d’accumulation sont réalisés sur un échantillon liquide contenant des cellules bactériennes de bactéries d’E. coli, de K. aerogenes ou de K. pneumoniae présentant des niveaux de résistance par efflux différents et représentatifs. Les étapes sont décrites ci-dessous.

Un échantillon liquide contenant des cellules bactériennes provenant de bactéries AG102A d’E. coli est préparé. Pour ce faire, la croissance bactérienne est réalisée dans du milieu de culture « LB » ou bouillon lysogène (i.e. milieu préparé à partir de 10 g de Tryptone, 10 g de chlorure de sodium de Sigma-aldrich et 5 g d’extrait de levures de « BD Difco » pour 1 L d’eau milli-Q stérile dont le pH est ajusté à 7,5) et stoppée en phase exponentielle (pour une densité optique à 600 nm comprise entre 0,45 et 0,7). Le milieu bactérien est centrifugé à 2900 xg (force relative centrifuge) pendant 15 minutes à 20°C et le surnageant est éliminé. La densité bactérienne finale dans un tampon physiologique (i.e. tampon phosphate de sodium comprenant du chlorure de magnésium à 2 mmol/l à pH 7, également dénommé « NaPi-MgCl2 ») est de 6x10 ⁹ UFC/ml (culot).

Le dérivé coumarinique (I-5) à une concentration de 50 pmol/l est ensuite ajouté au culot afin d’obtenir une concentration finale de 5 pmol/l.

L’échantillon obtenu contenant les cellules bactériennes et ledit dérivé coumarinique (I) est alors incubé pendant une durée de 10 minutes à 37°C.

800 pl de l’échantillon incubé est distribué dans des tubes Eppendorf de 2 ml contenant 1 ,1 ml de tampon physiologique tel que défini dans l’exemple 2, puis les tubes sont centrifugés à 11292 xg (ou 10000 tours par minute) pendant 5 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé afin de procéder à l’élimination du dérivé coumarinique (I-5) qui ne s’est pas accumulé dans les bactéries.

500 pl de tampon de lyse tel que défini dans l’exemple 2 sont ajoutés au culot et l’ensemble est laissé pendant au moins 4 heures afin de procéder à la lyse des cellules bactériennes.

Le milieu lysé est ensuite centrifugé à 14680 xg (ou 13000 tours par minute) pendant 15 minutes à 4°C pour récupérer le surnageant correspondant au lysat bactérien.

50 pl de lysat bactérien sont distribués dans une plaque 96 puits avec 50 pl de tampon neutre, acide, ou basique correspondant au dérivé coumarinique (I) testé déterminé lors des tests de caractéristiques de fluorescence décrits dans l’exemple 2 ci-dessus.

La fluorescence du lysat bactérien F(l-5) est alors déterminée selon l’équation 1 comme explicité dans la description.

Le nombre de molécules de dérivé coumarinique (I-5) par cellule bactérienne C(l-5) peut ensuite être calculé grâce à la détermination de la concentration du dérivé coumarinique (I-5) à partir de la gamme de fluorescence dudit dérivé coumarinique (I- 5) transformé en nombre de molécules par cellule bactérienne, comme explicité dans la description générale.

La valeur de fluorescence de référence du lysat bactérien de référence F(0) ainsi que la concentration de référence correspondante C(0) est obtenue en reproduisant les étapes ci-dessus avec un échantillon liquide contrôle ne comprenant pas de dérivé coumarinique (1-5).

Le protocole détaillé ci-dessus est reproduit avec les composés coumariniques (1-10), (1-11 ), (1-12) et/ou (1-13), et à titre comparatif avec CIP et A1 .

Il est également reproduit avec d’autres souches bactériennes d’E. coli, et d’autres types de bactéries K. aerogenes et K. pneumoniae.

Pour certaines souches bactériennes, l’échantillon liquide comprenant en outre un inhibiteur de pompes d’efflux RND (i.e. le CCCP) à une concentration de 10 pmol/l.

En fonction du niveau d’efflux connu des souches bactériennes testées, la comparaison des valeurs de concentration du dérivé coumarinique en nombre de molécules par cellule bactérienne à partir des valeurs de F(l) déterminées permet d’obtenir le niveau d’accumulation dudit dérivé coumarinique (I) au sein de souches présentant un haut niveau d’efflux (noté E+++ ou E++) ou basal (noté E+) par rapport à celles ne présentant aucun efflux ou dont l’efflux a été inhibé par l’ajout du CCCP (notés E-). Il est alors possible de déterminer la sensibilité d’un dérivé coumarinique à l’expression des pompes d’efflux d’une souche en déterminant le rapport entre une concentration C(l)-E+++ ou C(l)-E++ déterminée au sein d’une souche présentant un haut niveau d’efflux et une concentration C(l)-E- ne présentant aucun efflux ; et le rapport entre une concentration C(l)-E+ déterminée au sein d’une souche présentant un niveau d’efflux basal et une concentration C(l)-E- ne présentant aucun efflux.

En outre, la corrélation entre les valeurs de ces rapports et les niveaux relatifs d’efflux entre ces souches bactériennes, définis par rapport à une bactérie de type sauvage, renforce les propriétés dites de sensibilité dudit dérivé coumarinique (I) à l’expression des pompes d’efflux dans le contexte d’une utilisation en clinique.

La figure 1 montre l’accumulation des composés (I-5), (1-10), (1-11 ), (1-12), (I- 13) et à titre comparatif celle de la CIP et dudit dérivé coumarinique de référence A1 au sein de souches sélectionnées d’ Escherichia coli AG102, AG100, AG100A, et AG102 avec l’inhibiteur CCCP. De la même manière, l’accumulation des composés (1-5), (1-11 ), (1-12), et (1-13) et à titre comparatif celle de la CIP et dudit dérivé coumarinique de référence A1 a été réalisée et représentée dans les figures 2 et 3 sur des souches sélectionnées de Klebsiella aerogenes CM064, Ea27, ATCC15038, Ea294, CM064 avec l’inhibiteur CCCP, et Ea27 avec l’inhibiteur CCCP (figure 2) et de Klebsiella pneumoniae KPBjl M3 Lev ramR, KPBjl Rev, KPBjl Rev acrb et KPBjl M3 Lev ramR avec l’inhibiteur CCCP (figure 3).