Titre de l'invention : Utilisation d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

Domaine Technique

La présente invention est relative au domaine de la microbiologie. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema. Elle concerne également un milieu de culture in vitro comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange d'un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genre Treponema ainsi qu'un procédé de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

Technique antérieure

Les bactéries appartenant au genre Treponema font partie de la famille des Spirochaetaceae, au sein de l'embranchement des Spirochaetes (1). Ces bactéries sont Gram-négatives et peuvent être micro aérophiles ou strictement anaérobies (2). Les bactéries appartenant au genre Treponema font partie de la flore normale, et certaines espèces appartenant à ce genre sont des pathogènes tels que Treponema paiiidum, l'agent pathogène causal de la syphilis chez l'homme (3). En outre, des études ont montré une association de certaines bactéries appartenant au genre Treponema avec diverses formes d'infections et de maladies bucco-dentaires humaines (4, 5).

Ces bactéries ont une paroi mince, en forme de spirale et sont très mobiles, ce qui permet de les distinguer facilement des autres bactéries par observation microscopique (6), en revanche ces bactéries sont peu sensibles aux colorants habituellement utilisé pour détecter des bactéries (2).

Ainsi, leur détection s'obtient essentiellement par microscopie à fond noir grâce à leur motilité spécifique et à la morphologie cellulaire (7, 8).

Les bactéries appartenant au genre Treponema sont des organismes fastidieux qui ne sont pas sensibles aux cultures en utilisant des milieux ordinaires (9). Les difficultés à cultiver ces microorganismes sont liées à leurs besoins nutritionnels complexes, en particulier l'existence d'une divergence des besoins nutritifs pour croître d'une espèce à l'autre et à leur très faible tolérance à l'oxygène (2, 9, 10).

En conséquence, il existe un nombre important de milieux de culture in vitro chacun étant spécifique d'une espèce donnée de tréponèmes. Certains milieux de cultures permettent de cultiver plus d'une espèce de tréponèmes, on peut par exemple faire référence au milieu Omiz-Pat (11), ou au milieu OTEB (12, 13) ou encore au milieu Spirochaetae medium (14). Cependant, ces milieux de culture in vitro ne correspondent pas à un milieu de culture dit standard pour l'ensemble des espèces de tréponèmes, dans le sens où ils nécessitent d'être modifiés, adaptés par l'ajout ou le retrait d'un ou plusieurs produits en fonction de la ou des espèces de tréponèmes dont la culture in vitro est recherchée. Par exemple le milieu Omiz-Pat est préparé sans lécithine pour cultiver Treponema iecithinoiyticm (15).

De plus, le milieu Omiz-Pat est très difficile à préparer puisqu'il continent plus d'une centaine de produits dont la présence de certains doit être adaptée tel qu'indiqué précédemment.

Enfin, les milieux de culture in vitro existants à ce jour permettent tout au plus la culture de certaines espèces de Tréponèmes mais ne permettent pas d'en améliorer significativement la croissance de ces bactéries de sorte à faciliter leur isolement et éventuellement leur identification en vue du diagnostic d'une pathologie.

Il existe donc un besoin de disposer d'une solution permettant d'améliorer, d'augmenter la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema pour améliorer notamment leur identification et in fine la capacité et la précision d'un diagnostic médical. Il existe également un besoin de disposer d'un milieu de culture in vitro qui soit standard, rapide, facile à préparer, peu coûteux, qui soit capable d'assurer la culture de l'ensemble des espèces de bactéries appartenant au genre Treponema présentes dans un échantillon, ou du moins de la majorité d'entre elles tout en améliorant leur croissance in vitro.

La vincristine et la Vinblastine sont des toxines extraites de la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). Ce sont des poisons du fuseau mitotique inhibant la polymérisation de la tubuline et bloquant la division cellulaire. Ces toxines sont communément utilisées à des fins médicales, dans un traitement de chimiothérapie pour la lutte contre le cancer. Ces composés ont également été décrits comme antimicrobiens à l'égard de certains microorganismes (16) et comme inefficaces en tant qu'antimicrobiens à l'égard d'autres (17). En revanche, la capacité de ces composés au sein d'un milieu de culture à améliorer la croissance de microorganismes n'a jamais été décrite dans l'art antérieur et notamment pas pour la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

Les inventeurs se sont aperçus que la présence de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange au sein d'un milieu de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema permettait d'améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

A cet effet, la présente demande propose l'utilisation d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema ainsi qu'un milieu de culture particulier comprenant la Vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange et un procédé de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema h partir d'un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie.

Exposé de l'invention

Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

Un deuxième objet de l'invention concerne un milieu de culture in vitro d'un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genre Treponema, ledit milieu comprenant outre de l'eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d'infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine Kl, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine, un ou plusieurs antibiotiques sans activité à l'égard d'une bactérie appartenant au genre Treponema et de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange.

Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema à partir d'un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie, comprenant successivement: a) une étape dans laquelle l'échantillon est inoculé dans un milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C et pendant 4 à 7 jours dans un compartiment supérieur d'un dispositif composé dudit compartiment et d'un compartiment inférieur comprenant ledit milieu de culture stérile, sous forme liquide, lesdits compartiments étant séparés par un micro-filtre de 0,22 pm b) une étape de récupération et de dilution en cascade du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur du dispositif et comprenant la bactérie appartenant au genre Treponema. c) une étape dans laquelle chaque dilution est inoculée dans un milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10 complété par une quantité suffisante d'agar de sorte à être solide et dans laquelle la culture est effectuée sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C, pendant 3 à 5 jours d) une étape de prélèvement de chaque colonie individuelle développée à l'étape c) puis de transfert de chaque colonie dans un tube contenant le milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, de sorte à obtenir des cultures pures de bactérie appartenant au genre Treponema, après 5 jours d'incubation sous une atmosphère anaérobie et à une température de 37°C e) optionnellement une étape d'identification de l'espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice.

Description détaillée

Ainsi, le premier objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

En effet, la Demanderesse s'est aperçue que la présence de la Vinblastine ou de la vincristine, connues dans l'art antérieur comme antimitotiques et dans certains cas isolés comme antimicrobiens, à l'égard de certaines bactéries, seule ou en mélange au sein d'un milieu de culture d'une bactérie appartenant au genre Treponema permettait d'améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema. La présente invention décrit en effet pour la première fois que la présence de ces composés permet en effet d'améliorer la croissance bactérienne, cette amélioration pouvant se traduire par une augmentation de la croissance et/ou une augmentation de la rapidité de croissance de ces bactéries.

On entend par « améliorer la croissance in vitro », la capacité d'un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange à augmenter la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema et/ou à augmenter la vitesse de croissance in vitro de ces bactéries, donc à réduire leur temps de croissance.

La capacité à améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema peut être évaluée en mesurant la densité cellulaire d'une culture par exemple en mesurant la densité optique par spectrophotomètre et en la comparant à des standards de McFarland. On peut également évaluer la capacité à améliorer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema en mesurant les CFU (colony-forming unit) par la technique des dilutions en cascade.

Dans le cadre de la présente invention, une augmentation de 1 log de la densité cellulaire en utilisant un milieu de culture comprenant de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange en comparaison à un milieu de culture dépourvu de Vinblastine ou de vincristine, est considérée comme une amélioration de la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema.

La Vinblastine et la vincristine sont des toxines extraites de la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). Elles appartiennent à la classe des alcaloïdes et ont la capacité de bloquer la division cellulaire en inhibant la polymérisation de la tubuline. Ces composés sont utilisés en tant qu'antimitotiques, antinéoplasiques pour traiter différents cancers. Dans le cadre de la présente invention, ces composés peuvent être utilisés sous forme d'extrait pur, ou encore sous forme de sel par exemple sous forme de sel de sulfate à 97% (Sigma Aldrich, France) ou encore sous forme d'une solution injectable (lOmg / 10ml). Ces composés peuvent par exemple être obtenus par extraction à l'aide de différents solvants à partir des feuilles, tiges et/ou fleurs de la pervenche de Madagascar, ou par exemple par biosynthèse à partir de la catharanthine et la vindoline présents en quantité élevée dans la pervenche de Madagascar ou encore par synthèse chimique. Des extraits commerciaux de Vinblastine ou de vincristine sont disponibles dans le commerce (Sigma Aldrich, France). De préférence dans le cadre de la présente invention la Vinblastine et la vincristine sont utilisées sous forme de de sel de sulfate à 97%( Sigma Aldrich, France) ou encore sous forme d'une solution injectable (lOmg / lOmL).

La formule chimique de la Vinblastine et de la vincristine sont reproduites ci-dessous.

[Chem. 1] Vincristine

Les Tréponèmes sont un genre de bactéries appartenant à la famille des Spirochaetaceae, elles sont de forme hélicoïdale, très mobiles, leur paroi est Gram négatif, et peuvent être micro aérophiles ou strictement anaérobies. Ces bactéries sont commensales chez l'Homme et l'animal, et vivent sur les muqueuses, dans les mucus, au niveau de la bouche, du tractus intestinal et de l'appareil urogénital. L'introduction de certaines d'entre elles dans l'organisme par des points d'inoculation peut être pathogène comme par exemple le Treponema pallidum qui est l'agent responsable de la syphilis. Tel qu'énoncé ci-dessus ces bactéries sont difficiles à cultiver, étant donné que leurs besoins nutritifs diffèrent d'une espèce à l'autre. Cette difficulté de culture explique pourquoi il existe de nombreuses espèces de Tréponèmes non identifiées à ce jour, car non cultivées efficacement ou du moins en quantité insuffisantes.

La présente invention s'applique à l'ensemble des espèces de Tréponèmes. En particulier la présente invention s'applique aux espèces de Tréponèmes suivantes :

Treponema pallidum, Treponema denticuta, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema mattophiium, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponema lecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticuta, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la présente invention s'applique aux espèces de Tréponèmes suivantes : Treponema pallidum, Treponema denticuta, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encore Treponema denticuta, Treponema pectinovorum, Treponema pedis.

En référence aux bactéries appartenant au genre Treponema présentes ou susceptibles de l'être dans un échantillon, la présente demande utilise le singulier pour des raisons de clarté bien que la présente invention concerne la culture in vitro de plusieurs bactéries appartenant au genre Treponema présentes ou susceptibles de l'être dans un échantillon, notamment clinique.

Dans le cadre de la présente invention, on fait référence par « échantillon » à un échantillon clinique par exemple de la salive, un frottis de la cavité buccale, des selles, des sécrétions vaginales, de la sueur, des larmes, des urines, ou encore des prélèvements bucco-dentaires réalisés sur des patients atteints de parodontite ou de maladies parodontales aussi appelés prélèvements prodontopathiques. De préférence dans le cadre de l'invention l'échantillon clinique est de la salive, ou des prélèvements bucco-dentaires réalisés sur des patients atteints de parodontite ou de maladies parodontales.

Pour l'utilisation selon la présente invention, le milieu de culture peut être mis en oeuvre sous forme liquide ou solide par exemple par l'ajout d'une quantité suffisante d'agar. De préférence le milieu de culture est mis en oeuvre sous forme liquide.

En particulier, pour l'utilisation selon l'invention la Vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange sont présentes dans le milieu de culture à une concentration d'au moins 20 mg/L.

De préférence la Vinblastine ou la vincristine seules ou en mélange sont présentes dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 20 mg/L et 150 mg/L, de préférence encore à une concentration comprise entre 20 mg/L et 100 mg/L.

Selon un premier mode de réalisation la Vinblastine ou la vincristine est utilisée seule dans le milieu de culture. Selon un autre mode de réalisation la Vinblastine et la vincristine sont utilisées ensemble dans le milieu de culture. En particulier pour l'utilisation selon l'invention, le milieu de culture comprend un ou plusieurs antibiotiques, sans activité à l'égard d'une bactérie appartenant au genre Treponema. De préférence ces antibiotiques sont choisis parmi les composés suivants : acide nalidixique, polymyxine B, fosphomycine, rifampicin ou un mélange de ceux-ci.

Le milieu de culture mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprend également outre de l'eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d'infusion cœur-cervelle.

Plus particulièrement, le milieu de culture mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend outre de l'eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d'infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine Kl, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine.

Plus particulièrement encore, le milieu de culture mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :

-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml

-acide valérique : 0.1 ml

-glucose : 0.4g

-maltose : 0.4g

-xylose : 0.4g

-arabinose : 0.4g

-mannose : 0.4g

-acide isobutyrique : 0.1 ml

-extrait de levure : 5.0 g

-sérum de veau: 100 mL

-acide isovalérique : 0.1 ml

-L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g

-peptone : 5.0 g

-bouillon d'infusion cœur-cervelle : 5.0 g -vitamine Kl : 1 mg

-vitamine B12 : 5 mg -biotine : 5 mg -acide folique : 5 mg -acide folinique : 10 mg -nicotinamide : 5 mg -nicotinique : 10 mg -riboflavine : 1 mg

-pyrophosphate de thiamine : 0.08mg -acide nalidixique : 30 mg -polymyxine B : 5mg -fosphomycine : lOOmg -rifampicin : 2mg

-Vinblastine et/ou vincristine : 20 mg -eau distillée : QSP

Le milieu de culture mis en oeuvre dans l'utilisation selon la présente invention peut comprendre en outre les composés suivants : acide casamino, phosphate de potasium, sulfate d'ammonium, chlorure de calcium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, thioglycolate de sodium, sulfate de magnésium, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide caproïque, glutathion, acide urique, acide ascorbique, sulfure de sodium, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, amidon soluble, pectine.

En particulier dans l'utilisation selon la présente invention, l'échantillon est inoculé avec une quantité suffisante du milieu de culture pour assurer la croissance in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema. Plus précisément, après avoir été inoculé avec ladite quantité de milieu de culture, l'échantillon est incubé sous une atmosphère microaérophile ou anaéorobie, de préférence anaérobie, à une température de 37°C pour assurer la croissance de ladite bactérie. De préférence, l'échantillon est incubé pendant 2 à 7 jours en présence dudit milieu de culture, de préférence encore pendant 3 jours. De préférence la bactérie appartenant au genre Treponema appartient à une ou plusieurs des espèces de Tréponèmes suivantes :

Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maitophiium, Treponema medium, Treponema amyiovorum, Treponemalecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la bactérie appartient à l'une des espèces de Tréponèmes suivantes : Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encore Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis.

Un second objet de la présente invention concerne un milieu de culture in vitro d'un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genre Treponema, ledit milieu comprenant outre de l'eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L- cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d'infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine Kl, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine, un ou plusieurs antibiotiques sans activité à l'égard d'une bactérie appartenant au genre Treponema et de la Vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange.

Le milieu de culture selon l'invention peut être sous forme liquide ou solide par exemple par l'ajout d'une quantité suffisante d'agar. De préférence le milieu de culture selon l'invention est sous forme liquide

En particulier dans le milieu de culture selon l'invention, la Vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange est présente dans ledit milieu à une concentration d'au moins 20 mg/L. De préférence la Vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange est présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 20 mg/L et 150 mg/L, de préférence encore à une concentration comprise entre 20 mg/L et 100 mg/L.

Les antibiotiques sans activité à l'égard d'une bactérie appartenant au genre Treponema peuvent par exemple être sont choisis parmi les composés suivants : acide nalidixique, polymyxine B, fosphomycine, rifampicin ou un mélange de ceux-ci.

Plus particulièrement, le milieu de culture in vitro selon l'invention, comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :

-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml

-acide valérique : 0.1 ml

-glucose : 0.4g -maltose : 0.4g

-xylose : 0.4g -arabinose : 0.4g -mannose : 0.4g -acide isobutyrique : 0.1 ml -extrait de levure : 5.0 g -sérum de veau: 100 mL -acide isovalérique : 0.1 ml -L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g -peptone : 5.0 g

-bouillon d'infusion cœur-cervelle : 5.0 g -vitamine Kl : 1 mg -vitamine B12 : 5 mg -biotine : 5 mg -acide folique : 5 mg -acide folinique : 10 mg -nicotinamide : 5 mg -nicotinique : 10 mg -riboflavine : 1 mg -pyrophosphate de thiamine : 0.08mg -acide nalidixique : 30 mg -polymyxine B : 5mg -fosphomycine : lOOmg

-rifampicin : 2mg -Vinblastine et/ou vincristine : 20 mg -eau distillée : QSP

Plus particulièrement encore, le milieu de culture selon l'invention comprend en outre les composés suivants : acide casamino, phosphate de potasium, sulfate d'ammonium, chlorure de calcium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, thioglycolate de sodium, sulfate de magnésium, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide caproïque, glutathion, acide urique, acide ascorbique, sulfure de sodium, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, amidon soluble, pectine.

Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema h partir d'un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie, comprenant successivement: a) une étape dans laquelle l'échantillon est inoculé dans un milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C et pendant 4 à 7 jours dans un compartiment supérieur d'un dispositif composé dudit compartiment et d'un compartiment inférieur comprenant ledit milieu de culture stérile, sous forme liquide, lesdits compartiments étant séparés par un micro-filtre de 0,22 pm b) une étape de récupération et de dilution en cascade du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur du dispositif et comprenant la bactérie appartenant au genre Treponema c) une étape dans laquelle chaque dilution est inoculée dans un milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10 complété par une quantité suffisante d'agar de sorte à être solide et dans laquelle la culture est effectuée sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C, pendant 3 à 5 jours d) une étape de prélèvement de chaque colonie individuelle développée à l'étape c) puis de transfert de chaque colonie dans un tube contenant le milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, de sorte à obtenir des cultures pures de bactérie appartenant au genre Treponema, après 5 jours d'incubation sous une atmosphère anaérobie et à une température de 37°C e) optionnellement une étape d'identification de l'espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice.

Le procédé de culture selon l'invention permet avantageusement d'isoler les bactéries appartenant au genre Treponema présentes dans un échantillon donné.

De préférence l'échantillon mis en oeuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention comprend une ou plusieurs espèces de bactéries appartenant au genre Treponema, de préférence choisies parmi :

Treponema paiiidum, Treponema denticuia, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maitophiium, Treponema medium, Treponema amyiovorum, Treponemalecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la bactérie appartient à l'une des espèces de Tréponèmes suivantes : Treponema paiiidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encore Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis.

Par « atmosphère anaérobie » on fait référence à une atmosphère comprenant une proportion molaire d'oxygène strictement inférieure à 1%, de préférence inférieure à 0,1% et de préférence encore de 0%. Cette atmosphère anaérobie peut être obtenue dans des étuves ne comportant pas d'oxygène soit dans des compartiments désoxygénés. Plus précisément, le dispositif mis en oeuvre à l'étape a) comprend deux compartiments séparés par un micro-filtre de 0,22 pm, avec i) un compartiment supérieur qui comprend le milieu de culture selon l'invention sous forme liquide inoculé avec un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre une bactérie appartenant au genre Treponema et ii) un compartiment inférieur qui comprend le milieu de culture selon l'invention stérile, sous forme liquide, et destiné à collecter les bactéries appartenant au genre Treponema initialement présentes dans le compartiment supérieur, lesdites bactéries ayant rejoint le compartiment inférieur depuis le compartiment supérieur par filtration passive.

Ce dispositif permet donc d'assurer une culture et un isolement primaire des bactéries appartenant au genre Treponema présentes dans le milieu de culture selon l'invention inoculé avec l'échantillon, par filtration passive à travers le filtre de 0,22 pm depuis le compartiment supérieur vers le compartiment inférieur. En effet, le microfiltre présentant des ouvertures de 0,22 pm permet de ne laisser passer essentiellement que les bactéries appartenant au genre Treponema.

De préférence, la présence de bactéries appartenant au genre Treponema dans le compartiment inférieur est évaluée chaque jour par microscopie électronique et le milieu de culture présent dans le compartiment inférieur est récupéré pour procéder à l'étape b) dès que la présence de bactéries appartenant au genre Treponema est détectée dans le milieu. Cela permet en effet de limiter la contamination du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur par des bactéries n'appartenant pas au genre Treponema.

De préférence le milieu de culture présent dans le compartiment inférieur est récupéré au bout de 3 à 7 jours d'incubation et de préférence encore au bout de 5 jours d'incubation.

En particulier, la présence d'une bactérie du genre Treponema peut être vérifiée par observation au microscope optique ou électronique avant l'étape a) au sein de l'échantillon, et/ou après l'étape a) au sein du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur. De préférence cette étape de vérification est effectuée par microscope électronique.

A l'étape c), la quantité suffisante d'agar pour solidifier le milieu de culture est déterminée par la quantité de milieu de culture dilué considéré, par exemple pour 25 mL de milieu de culture dilué considéré on ajoutera de préférence 0.35g/L d'agar. La culture de chaque dilution réalisée à l'étape c) est effectuée pendant 3 à 7 jours, de préférence pendant 5 jours.

L'étape optionnelle d'identification de l'espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) permet avantageusement de pouvoir identifier l'espèce de bactérie présente dans l'échantillon testé en vue d'améliorer les bases de données existantes, d'identifier éventuellement une nouvelle espèce, souche, ou encore de pouvoir établir un diagnostic médical.

Cette étape d'identification peut être effectuée classiquement par technique de MALDI-TOF MS et la comparaison du spectre obtenu, à une base de données comprenant l'ensemble des spectres existants pour une espèce voire une souche donnée.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un milieu de culture selon la présente invention pour le transport des bactéries appartenant au genre Treponema.

L'invention sera davantage illustrée par les exemples suivants. Cependant, ces exemples ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé de culture in vitro d'une bactérie appartenant au genre Treponema h partir d'un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie selon l'invention

Matériel et méthodes

1) Echantillons

Les échantillons biologiques ont été prélevés dans la cavité buccale de 23 femmes et 21 hommes âgés de 25 à 38 ans. Les donneurs sont des volontaires en bonne santé qui ne présentent pas de symptômes de gingivite et/ou de parodontite. Les échantillons oraux ont été prélevés à l'aide d'une brosse à dents stérile avant le brossage du matin. Après l'échantillonnage, chaque brosse à dents a été placée dans un tube contenant 10 mL de milieu de culture des tréponèmes selon l'invention. Ensuite, les tubes sont fermés et placés dans un sac plastique contenant un générateur anaérobie (Thermo Scientific, Dardilly, France) et les échantillons sont analysés en laboratoire immédiatement après réception.

2) Milieux de culture testés

Milieu de culture A (selon l'invention)

Le milieu de culture A comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :

-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml -acide valérique : 0.1 ml -glucose : 0.4g -maltose : 0.4g -xylose : 0.4g -arabinose : 0.4g -mannose : 0.4g

-acide isobutyrique : 0.1 ml -extrait de levure : 5.0 g -sérum de veau: 100 mL -acide isovalérique : 0.1 ml -L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g -peptone : 5.0 g

-bouillon d'infusion cœur-cervelle : 5.0 g -vitamine Kl : 1 mg -vitamine B12 : 5 mg -biotine : 5 mg

-acide folique : 5 mg -acide folinique : 10 mg -nicotinamide : 5 mg -nicotinique : 10 mg -riboflavine : 1 mg

-pyrophosphate de thiamine : 0.08mg -acide nalidixique : 30 mg -polymyxine B : 5mg -fosphomycine : lOOmg -rifampicin : 2mg

-Vinblastine et/ou vincristine : 20 mg -eau distillée : QSP

Milieu de culture B Le milieu de culture B comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :

-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml -acide valérique : 0.1 ml -glucose : 0.4g -maltose : 0.4g -xylose : 0.4g -arabinose : 0.4g -mannose : 0.4g -acide isobutyrique : 0.1 ml -extrait de levure : 5.0 g -sérum de veau: 100 mL -acide isovalérique : 0.1 ml -L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g -peptone : 5.0 g

-bouillon d'infusion cœur-cervelle : 5.0 g -vitamine Kl : 1 mg -vitamine B12 : 5 mg -biotine : 5 mg -acide folique : 5 mg -acide folinique : 10 mg -nicotinamide : 5 mg -nicotinique : 10 mg -riboflavine : 1 mg -pyrophosphate de thiamine : 0.08mg -acide nalidixique : 30 mg -polymyxine B : 5mg -fosphomycine : lOOmg -rifampicin : 2mg -eau distillée : QSP

3) Préparation d'échantillons pour la microscopie électronique

Les frottis ont été réalisés sur des lames de microscopie directement à partir de chaque échantillon oral. Une goutte de solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2,5 % a été ajoutée et l'observation a été réalisée sans coloration supplémentaire.

Les images ont été prises directement par la suite, et 1% d'acide phosphotungstique (PTA) dans une solution aqueuse à (pH 2) pendant 2 minutes a parfois été ajouté, la lame a été délicatement lavée à l'eau, séchée à l'air et examinée au microscope électronique à balayage (SEM) sur ordinateur portable. Cette procédure a été réalisée afin d'augmenter le contraste des images SEM en cas de besoin.

4) Détection directe par microscopie électronique à balayage (MEB)

Chaque échantillon oral est traité directement sous le microscope électronique pour détecter la présence de Treponema sp. Après la détection et l'optimisation de la culture, les Treponema sp. en culture ont également été imagées par le même procédé afin de valider la croissance. L'échantillonnage et l'observation au microscope ont été effectués comme suit.

5) Observation et acquisition d'images

Un microscope électronique à balayage (MEB) de table (Hitachi TM4000) mesurant environ 60 centimètres de haut sur 33 cm de large a été utilisé pour évaluer les structures bactériennes. Ce microscope électronique à balayage a la capacité d'observer des échantillons à basse pression sous vide (100 Pa à 101 Pa) pour réduire la charge sur la surface de l'échantillon par les électrons irradiés. Le temps d'évacuation après le chargement de l'échantillon dans la chambre du MEB est d'environ quelques minutes, ce qui est beaucoup plus rapide que les MEB conventionnels avec une condition de vide élevé, installés directement dans le plancher, car la chambre du MEB sur table est plus petite que celle du type conventionnel. Les conditions d'observation optimisées de la tension d'accélération et du courant du faisceau d'électrons permettent de faire fonctionner facilement et rapidement le MEB de sorte qu'il ne faut que quelques minutes pour trouver et observer les régions d'intérêt, tandis que les MEB conventionnels à haute performance nécessitent des ajustements fins mais complexes de mise au point et de stigmatisation selon les microscopes. Les images SEM ont été obtenues avec un grossissement de 1000 à 10 000 fois. Des électrons rétrodiffusés (ESB) provenant de la surface de l'échantillon ont été détectés par un détecteur ESB à la tension d'accélération de 15 kV. Le vide autour de l'échantillon est d'environ 30 Pa.

6) Etape de culture et d'isolement primaire par filtration passive

L'isolement et l'enrichissement en milieu liquide ont été réalisés en anaérobiose dans une chambre anaérobie (Don Whitley Scientific Limited, West Yorkshire, Royaume-Uni) sous une atmosphère composée de 80% N2, 15% C02 et 5% H2. La culture des tréponèmes a été réalisée à l'aide d'un dispositif de culture composé de deux compartiments séparés par un micro-filtre 0.22pm (Dominique DUTSCHER, Brumath, France). Cette technique de culture est basée sur un principe de filtration passive permettant aux microorganismes mobiles ayant une taille inférieure à 0,22pm de passer à travers la paroi de filtre.

La culture est réalisée comme suit; dans des conditions stériles, le compartiment inférieur du dispositif de filtration est entièrement rempli avec le milieu de culture liquide stérile préalablement préparé et le compartiment supérieur avec 100 mL du même milieu de culture. L'unité préparée précédemment est transférée dans une enceinte anaérobie permettant de dégazer le milieu lh avant l'inoculation. Ensuite chaque échantillon est homogénéisé sur un mélangeur vortex pendant 10 secondes, le milieu de culture du compartiment supérieur de chaque unité de filtration est inoculé avec 200pL d'échantillon. Les unités de filtration inoculées sont incubées dans la chambre anaérobie à 37°C pendant 4 à 7 jours.

7) Détermination du temps d'incubation optimal de la culture liquide par filtration passive

Dans l'objectif de recueillir une culture de tréponèmes fraîche en pleine phase de croissance, et de limiter les contaminations liées à la dégradation du filtre avec la chaleur et le temps d'incubation allongé ou à l'ouverture quotidienne de l'unité de culture pour récupérer une quantité de milieu du compartiment inférieur, le temps d'incubation optimal a été déterminé.

Pour le même spécimen la culture a été réalisée sur six unités de filtration en même temps avec un dispositif comprenant un compartiment supérieur et un compartiment inférieur séparés par un filtre de 0,22 pm. Par la suite, une unité de culture est fermée toutes les 24h pour vérifier la présence et le passage des tréponèmes par microscopie électronique SEM (Hitachi TM4000) comme indiqué précédemment. Cette expérience est réalisée en triplicata sur un prélèvement de la cavité buccale positif au tréponème et préalablement cultivé et sur une détermination de temps d'incubation de la culture liquide par filtration passive.

8) Etape de récupération, de dilution, de culture solide et d'isolement secondaire

Après l'isolement primaire des tréponèmes dans le milieu de culture liquide, une culture en gélose a été réalisée en utilisant le même composition de milieu liquide préparé dans 800 ml de volume final filtré à 0.2pm, et complété par 7 g/L d'agar(Fisher Scientific, Illkirch, France), préparé dans 200ml d'eau stérile.

Apres obtention d'une culture liquide positive aux bactéries appartenant au genre Treponema dans le compartiment inférieur du dispositif mis en oeuvre précédemment, confirmée par microscopie électronique SEM (Hitachi TM4000), des dilutions en cascade allant jusqu'à 10E-10 pour chaque culture liquide positive ont été réalisées dans des conditions stériles. Par la suite la totalité de chaque dilution (900m1_) est inoculée dans un tube contenant 25 mL de milieu de culture supplémenté par 0.35g d'agar, préalablement préparé et maintenu à 56°C. Le mélange a été délicatement homogénéisé manuellement et versé directement dans des boîtes de Pétri. Après solidification, les boîtes de pétri inoculées ont été incubées dans la chambre anaérobie à 37 °C. Ensuite, après un temps d'incubation allant de 4-7 jours des colonies individuelles ont été prélevées dans la gélose à l'aide d'une pipette pasteur stérile (Biosegama, Brumath, France) et transférées dans des tubes Hungate contenant un milieu liquide afin d'obtenir des cultures pures de de bactéries appartenant au genre Treponema après une incubation à 37 °C.

9) Analyse MALDI-TOF MS

Pour une identification directe depuis le milieu de culture, 2mL de milieu de culture liquide a été centrifugé à 13000 rpm pendant 5 minutes. Le surnageant a été écarté et le culot comprenant les bactéries a été récupéré. Douze points ont ensuite été faits pour chaque culot bactérien et recouverts de lpL de solution de matrice, avant d'être analysé par désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDITOF MS). Après analyse du profil protéique de chaque isolat de Treponema, les spectres générés par MALDI-TOF MS sans identification initiale ont été récupérés pour contrôler leur qualité. Ensuite, après validation des spectres par le logiciel Bruker, le logiciel MALDI Biotyper 3.0 a été utilisé pour construire des dendrogrammes permettant la comparaison des différents isolats. Puis, un isolat de chaque échantillon a été retenu pour le séquençage de son génome. Grâce à cette procédure, seuls cinq isolats différents par analyse MALDI ont vu leur génome séquencé et analysé pour établir une identification basée sur la comparaison de chaque blast obtenu à partir de chaque séquence du gène ARNr 16s avec ceux présents sur la base de données NCBI.

Après l'identification de l'ARNr 16S, les spectres ont été ajoutés à notre base de données MALDI-TOF MS.

Résultats

1) Détection, observation et acquisition d'image par microscopie électronique

L'utilisation du microscope électronique a permis d'observer la présence de bactérie présentant la morphologie typique des bactéries appartenant au genre Treponema dans 14 échantillons sur 44. La taille des bactéries a été déterminée à l'aide du logiciel TM4000 et les bactéries identifiées présentaient une longueur moyenne de 9,15 pm et une largeur variant entre 383.7 +/-60 nm.

2) Détermination du temps d'incubation optimal de la culture liquide par filtration passive

La filtration a été interrompue le plus tôt possible après le premier passage des bactéries appartenant au genre Treponema et avant l'apparition d'une turbidité.

Tableau 1 au genre Treponema au sein du compartiment inférieur du dispositif, au fil des jours d'incubation compartiment inférieur du dispositif, au fil des jours d'incubation La période d'incubation optimale a été estimée à la 4ème journée d'incubation. Cette période d'incubation a donné les meilleures cultures fraîches de bactéries appartenant au genre Treponema e. t non contaminées.

3) Culture solide et isolement secondaire

Après l'isolement primaire des tréponèmes dans le milieu de culture liquide au sein du compartiment inférieur du dispositif, la technique d'inoculation sur un milieu de culture solide comprenant 7g/L d'agar a permis d'observer la présence de colonies sur l'ensemble des 14 échantillons, c'est-à-dire 100% des cultures liquides positives.

4) Analyse MALDI-TOF MS Après l'identification par ARN 16S, la base de données a été complétée avec 10 spectres correspondant à des bactéries appartenant à l'espèce T.pectinovorum, 5 spectres correspondant à des bactéries appartenant à l'espèce T.dentiœla, et d'autres spectres correspondant à des bactéries appartenant à l'espèce T. brennaborense, T. maltophilum, T.parvum, T.pedis, T.zuelzerae, T. succinifaciens, T.stenostreptum, T. saccharophilum, T.ruminis, T. rectale, T. caldarium et T.bryantii.

Conclusion : Les deux milieux de culture testés ont permis d'assurer la croissance des bactéries appartenant au genre Treponema.

Exemple 2 : Evaluation de la croissance d'une bactérie appartenant au genre Treponema en présence de différentes concentrations de Vinblastine et/ou vincristine dans le milieu de culture (milieu A) ou en absence de Vinblastine et/ou vincristine dans le milieu de culture (milieu B).

Les milieux de culture testés sont similaires à ceux mis en oeuvre dans l'exemple 1, mis à part que dans le milieu A testé dans le présent exemple, différentes concentrations de Vinblastine ou vincristine ont été testées (20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L). Le milieu B est identique à celui mis en oeuvre dans l'exemple 1, il est dépourvu de Vinblastine et vincristine.

A) Des tubes contenant une culture pure de bactéries appartenant à l'espèce T.denticola ont été considérés pour étudier la croissance bactérienne en présence du milieu A avec différentes concentrations de Vinblastine ou vincristine (20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L) ou en présence du milieu B après une incubation à 37 °C.

Après incubation de trois jours en anaérobiose et à 37°C, l'évaluation de la croissance a été réalisée en mesurant la densité optique par spectrophotomètre et en la comparant à des standards de McFarland.

Les deux types de milieux testés à savoir le milieu A avec les différentes concentrations de Vinblastine ou vincristine testées et le milieu B ne comprenant pas lesdits composés, ont permis d'assurer la croissance de la bactérie appartenant à l'espèce T.denticola.

Il a été observé, l'apparition d'un trouble plus important en présence du milieu A en comparaison avec le milieu B n'en comprenant pas.

La mesure de la densité cellulaire a permis de montrer qu'il n'y a pas de différence significative de la densité bactérienne observée pour le milieu A aux différentes concentrations de Vinblastine ou de vincristine, par contre une différence significative a été observée entre le milieu A et le milieu B.

En effet, le milieu A pour chacune des concentrations de Vinblastine ou de vincristine testée a permis d'assurer une croissance plus importante de la bactérie appartenant à l'espèce T.denticola en comparaison au milieu de culture B.

On note en particulier une augmentation de la croissance d'1 log avec le milieu A de Vinblastine ou vincristine en comparaison avec le milieu B, après 3 jours d'incubation.

Tableau 3 : Différences de croissance d'une bactérie appartenant à l'espèce T.dentiœla avec le milieu A ou le milieu B

B) Cette même étude a été réalisée à partir de tube contenant une culture pure de bactéries appartenant à l'espèce T.dentiœla, ou T. pectinovorum ou T.pedis pour étudier la croissance bactérienne en présence du milieu A comprenant 20 mg/L de Vinblastine ou de vincristine et en présence du milieu B après une incubation à 37 °C en anaérobiose après 3 jours d'incubation.

Tableau 4 : Différences de croissance d'une bactérie appartenant à l'espèce T.dentiœla, T. pectinovorum, T.pedis avec le milieu A comprenant 20 mg/L de Vinblastine ou de vincristine ou le milieu B.

Le milieu de croissance selon l'invention comprenant 20mg/L de vincristine ou de Vinblastine permet avantageusement d'augmenter de façon significative la croissance bactérienne des bactéries appartenant aux espèces suivantes T.dentiœla, T. pectinovorum, T.pedis en comparaison avec le milieu B dépourvu de Vinblastine ou de vincristine. C) Afin de déterminer la concentration minimale d'inhibition (CMI) de Vinblastine ou de vincristine différentes concentrations au sein du milieu A ont été testées (20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 pg/mL) sur trois espèces de tréponèmes : Treponema denticoia, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. La croissance est vérifiée par microscope électronique (Hitachi TM4000). Les résultats obtenus montrent que la croissance des bactéries n'est pas inhibée sur toutes les concentrations testées et cela pour les trois espèces.

Le milieu de culture selon l'invention permet donc avantageusement d'assurer une croissance améliorée des bactéries appartenant au genre Treponema et ce, sans effet inhibiteur de la croissance en présence d'une concentration élevée de Vinblastine ou de vincristine.

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