DOMAINE DE L’INVENTION

La présente invention concerne des composés dérivés de fluorescéine, et leur utilisation en tant que marqueurs fluorescents. Ils peuvent notamment être utilisés en biologie et en médecine, particulièrement dans le domaine de l’ophtalmologie. Les dérivés de fluorescéine non-fluorescents sont activés dans la cellule vivante permettant alors la détection des cellules vivantes ainsi que la quantification de la viabilité cellulaire grâce à la fluorescence, et en absence de toxicité cellulaire.

ARRIERE PLAN DE L’INVENTION

La greffe de cornée est la greffe la plus répandue dans le monde parmi toutes les greffes de cellules et d’organes avec plus de 100 000 greffes réalisées chaque année. La cornée, seul tissu transparent du corps, joue un rôle essentiel dans la réfraction de la lumière qui est dirigée vers la rétine. Une altération de celle-ci conduit à une baisse de l’acuité visuelle, voire à une perte de la vision. La greffe de cornée est ainsi nécessaire dans de nombreuses pathologies telles que la dystrophie de Fuchs et les dystrophies bulleuses, les kératites infectieuses et le kératocône, mais est aussi utilisée dans les cas de traumatisme perforant comme les accidents ou les brûlures.

Les cornées à greffer sont prélevées sur les donneurs et conservées dans des banques des yeux, également appelées banques de cornées. Avant d’effectuer la greffe, il est essentiel de vérifier la qualité du greffon, plusieurs facteurs pouvant être responsables d’une éventuelle altération tels que l’état de santé du donneur, les conditions de prélèvement et/ou les conditions de conservation. Dans ce but, il est essentiel que la viabilité des cellules endothéliales des greffons cornéens soit mesurée.

De nombreuses techniques pour la quantification de la viabilité cellulaire existent, mais ces tests sont en général destructifs, toxiques ou imparfaits, c’est-à-dire qu’ils ne permettent pas une estimation précise de qualité de la viabilité de l’échantillon.

Parmi les méthodes de mesure de viabilité de cellules, on peut citer l’utilisation de colorants comme le bleu de Trypan (CAS [75-57-1]) et les sels de tétrazolium (CAS [298-93- 1]), ou de fluorophores comme par exemple l’orange d’acridine (CAS [260-94-6]) et le DAPI ou Di Amido Phenyl Indol (CAS [28718-90-3]). D’autres composés encore permettent à la fois une coloration et une visualisation des cellules par fluorescence. Tel est le cas du composé résazurine (CAS [550-82-3]).

Cependant ces colorants ou fluorophores ne permettent pas une mesure de la viabilité cellulaire sans altérer les cellules et par conséquent les échantillons analysés. En effet, les colorants diffusent dans l’ensemble des cellules. Les cellules vivantes les excluent tandis que les cellules non-viables les absorbent et deviennent visibles. Une première limite à leur utilisation est par conséquent la surestimation de la proportion de cellules vivantes puisque seules les cellules à un stade de mort cellulaire avancé sont détectées. Une seconde limite est l’intensité de la coloration qui est souvent faible rendant les cellules peu, voire pas, visibles (Graefe’s Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology, 1986, 224, 428-434).

Les fluorophores permettent quant à eux de distinguer les cellules vivantes, mais leurs accumulations au sein des cellules conduisent à terme à la mort cellulaire.

Une autre approche de la mesure de la viabilité cellulaire est l’utilisation de sondes fluorescentes comprenant un ou des groupements fluorochromes qui sont libérés suite à une réaction de clivage. Les cellules deviennent alors visibles par fluorescence et peuvent être facilement étudiées sous microscopie en fluorescence {Anal. Chem., 2019, 91, 2255-2259 ; Biochemistry : Rottman and Papermaster, 1966, 55, 134-141). De tels composés sont aussi utilisés dans d’autres domaines techniques (JP 2009-006635, JP 2005-091802). L’utilisation de ces sondes fluorescentes présente de nombreux avantages. C’est une méthode sélective, rapide et facile à mettre en oeuvre. De plus, les sondes fluorescentes permettent de travailler sur des cellules vivantes de manière in vitro ou in vivo. Le signal émis est généralement de bonne qualité : il est spécifique, durable et fort. Un des exemples de sonde fluorescente largement utilisée pour la mesure de la viabilité cellulaire est la Calcéine- AM.

Calcéine-AM

Cette molécule pénètre dans les cellules, est hydrolysée par les estérases et le fluorochrome est libéré. Cependant, parallèlement à la libération du fluorochrome, des molécules de formaldéhyde sont produites, entraînant une toxicité pour la cellule. L’utilisation de la calcéine-AM est donc limitée, voire impossible, pour des applications où la préservation de la viabilité des cellules ou des tissus étudié(e)s est recherchée {IOVS, 2011 , 52, 6018- 6025). Il existe donc un besoin de développer de nouveaux marqueurs fluorescents pour la quantification de la viabilité cellulaire tout en préservant cette viabilité.

Les inventeurs ont ainsi développé un nouveau marqueur, appelé dans la présente invention « dicarbonate de fluorescéine ». Cette sonde fluorescente permet une mesure objective, précise, et non toxique de la viabilité cellulaire.

BREVE DESCRIPTION DE L’INVENTION

L’invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :

- R ¹ est choisi parmi

- un alkyle C3-C20,

- un polyéthylène glycol ou un polypropylène glycol,

- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,

- les sucres, et

- les polysaccharides naturels ;

- X ¹ est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;

- X ² est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH ₂ CC>2H)2 ;

- R ² est choisi parmi H, NCS et CO2R ³ ;

- R ³ est choisi parmi H ou un alkyle C ₁ -C ₃ ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables.

L’invention couvre aussi l’utilisation du composé de formule générale (I) comme marqueur cellulaire, et préférentiellement comme marqueur de la viabilité cellulaire.

L’invention concerne par ailleurs, une composition pharmaceutique comprenant le composé de formule générale (I) et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.

L’invention trouve son application dans le domaine de la biologie humaine, animale et végétale. Elle est préférentiellement utilisée dans le domaine de l’ophtalmologie.

Enfin, un procédé de préparation du composé de formule générale (I) est décrit, le procédé comprenant les étapes de : a) réaction entre un diphénol de formule (II) avec du phosgène ou un dérivé de celui-ci en présence de base, et b) réaction de l’intermédiaire obtenu (III), avec un alcool primaire ou secondaire de formule (IV) R ¹ OH, en présence de base, avec les groupements R ¹ , R ² , X ¹ , X ² tels que définis précédemment.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

L’invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :

- R ¹ est choisi parmi

- un alkyl C ₃ -C2 ₀ ,

- un polyéthylène glycol, un polypropylène glycol,

- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,

- les sucres, et

- les polysaccharides naturels ;

- X ¹ est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO2 ;

- X ² est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH ₂ CC>2H)2 ;

- R ² est choisi parmi H, NCS et CO2R ³ ;

- R ³ est choisi parmi H ou un alkyle C ₁ -C ₃ ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables.

Ces composés, aussi appelés « dicarbonate de fluorescéine » dans le cadre de l’invention, sont constitués d’un fluorochrome, la fluorescéine (CAS [2321-07-5]) ou un dérivé correspondant, et de groupements carbonate de type R ¹ -0-C(=0)-0 qui confèrent aux molécules leurs propriétés de solubilité et de stabilité. Définitions

Les composés de formule générale (I) ou sels pharmaceutiquement acceptables peuvent comporter un ou plusieurs stéréocentres, chacun pouvant exister indépendamment des autres sous une configuration R ou S. Les composés décrits sont donc sous des formes racémiques ou optiquement actives.

Le terme « sels pharmaceutiquement acceptables » désigne des dérivés des composés de formule générale (I) pour lesquels les groupements acides et/ou basiques existent sous leur forme de sel. Les sels pharmaceutiquement acceptables dans le cadre de la présente invention comprennent des sels non-toxiques conventionnels. Les sels pharmaceutiquement acceptables selon l’invention apparaîtront de manière évidente pour l’homme du métier. Des exemples de sels pouvant être utilisés sont le chlorure de calcium, le chlorure de potassium, le chlorure de magnésium, l’hydrogénophosphate, le phosphate, l’édetate, le citrate, le lactate, le hyaluronate, le borate de sodium et le stéarate.

Le terme « alkyl » désigne une chaîne carbonée linéaire et/ou ramifiée. Le terme « C _a - C _{b »} , où a et b sont des entiers, correspond au nombre d’atomes de carbone. Ainsi le terme « alkyl C3-C20 » désigne une chaîne linéaire ou ramifiée comprenant de 3 à 20 atomes de carbone. Des exemples de groupements alkyl C3-C20, mais sans s’y limiter, sont propyl, iso- propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, iso-pentyl, hexyl, iso-hexyl, heotyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl et dodecyl.

Le terme « polyéthylènes glycol » désigne dans le cadre de la présente invention, les polyéthylènes glycols ou poly(oxyde d’éthylène)s de masse molaire moyenne allant de 200 à 8000 g/mol. Quant au terme « polypropylènes glycol », cette dénomination regroupe dans le cadre de la présente invention, les composés polymères de type propylène glycol ayant une masse molaire moyenne allant de 200 à 600 mol/g.

Par « dérivés de l’acide malique et esters correspondants », on entend dans le cadre de la présente invention un groupement défini par la formule générale (V), o , pour laquelle R ⁴ et R ⁴ ’ sont indépendamment choisis parmi un hydrogène ou un alkyl C1-C6.

Le terme « sucres » désigne les composés glucose, fructose, galactose, mannose, saccharose, lactose, maltose et sorbitol.

Par « polysaccharides naturels », on entend dans le cadre de la présente invention des polysaccharides d’origine végétale, telle que la cellulose, l’amidon, l’agarose, l’alginate et l’inuline, et des polysaccharides d’origine animale tels que l’acide hyaluronique ou hyaluronate, la chitine et le chitosane. La fluorescéine peut exister sous deux formes tautomères : une forme fermée et une forme ouverte (formules VI et VII).

Par « dérivé correspondant de la fluorescéine », on entend dans le cadre de la présente invention le groupement fluorochrome de la fluorescéine substitué par les groupements X ¹ , X ² et R ² tels que définis précédemment et représenté par la structure ci- dessous (formule VIII). Comme précédemment décrit pour la fluorescéine, il est entendu que les dérivés correspondant de la fluorescéine peuvent exister sous leur forme tautomère.

Composés

La présente invention concerne un composé de formule générale (I), caractérisé en ce que :

- R ¹ est choisi parmi

- un alkyle C3-C20,

- un polyéthylène glycol ou un polypropylène glycol,

- les dérivés de l’acide malique et les esters correspondants,

- les sucres, et

- les polysaccharides naturels ;

- X ¹ est choisi parmi H, Cl, F, Br et NO ₂ ;

- X ² est choisi parmi H, Cl, Br et N(CH ₂ CC> ₂ H) ₂ ;

- R ² est choisi parmi H, NCS et CO ₂ R ³ ; et

- R ³ est choisi parmi H ou un alkyle C ₁ -C ₃ ; et ses sels pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation, le groupement R ¹ est un alkyl C5-C10. Dans un mode de réalisation préféré, R ¹ est choisi parmi les groupements n-pentyl et n-décyl. Les groupements alkyles peuvent être linéaires ou ramifiés, ainsi dans un mode de réalisation particulier, le groupement R ¹ est un alkyl C3-C20 linéaire.

Dans un autre mode de réalisation, R ¹ est un dérivé de l’acide malique ou un ester correspondant, c’est-à-dire que R ¹ est définit par la formule , dans laquelle R ⁴ et R ⁴ ’ sont choisis parmi un hydrogène ou un alkyl C1-C6. Les groupements R ⁴ et R ⁴ ’ peuvent être différents ou identiques. Dans un mode de réalisation, les groupements R ⁴ et R ⁴ ’ sont identiques. Dans un mode de réalisation préférée, R ⁴ et R ⁴ ’ sont des hydrogènes. Dans un autre mode de réalisation préféré, R ⁴ et R ⁴ ’ sont un alkyl C1-C6, préférentiellement R ⁴ et R ⁴ ’ sont des éthyles.

Dans un mode de réalisation, le groupement R ² est un hydrogène.

Dans un mode de réalisation, le groupement X ¹ est un hydrogène.

Dans un mode de réalisation, le groupement X ² est un hydrogène.

Dans un mode de réalisation, les groupements R ² , X ¹ et X ² sont des hydrogènes.

Utilisations

Les composés de formule générale (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont utilisés pour le marquage cellulaire, en tant que marqueurs fluorescents, et plus particulièrement pour le marquage de la viabilité cellulaire.

Les composés de la présente invention comprennent au sein de leur structure un fluorochrome : la fluorescéine ou un dérivé correspondant. L’hydrolyse des groupements carbonate R ¹ -0-C(=0)-0 par les estérases après pénétration dans la cellule, libère le fluorochrome ainsi que des sous-produits notamment du dioxyde de carbone et l’alcool de type R ¹ -OH.

Les groupements R ¹ tels que définis pour les composés de formule (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont préférentiellement des groupements dépourvus de toxicité cellulaire.

La fluorescence émise par le fluorochrome ainsi libérée est visible par des techniques bien connues de l’homme du métier. La visualisation de la fluorescence peut se faire à l’œil nu ou à l’aide d’appareils tels que des lunettes ou des microscopes, et nécessite généralement l’application sur le fluorophore d’une lumière à une longueur d’onde comprise généralement entre 480 et 520 nm.

L’hydrolyse des composés de la présente invention s’effectue au niveau du cytoplasme. En absence de réactivité des estérases, aucune réaction de clivage ne se produit et aucune fluorescence ou coloration des cellules n’est par conséquent observée. Les composés de formule générale (I) ou les sels pharmaceutiquement acceptables sont ainsi utilisés pour la quantification de la viabilité cellulaire. En effet, l’activité des estérases ubiquitaires étant proportionnelle à la viabilité des cellules, l’intensité du signal émis par le fluorochrome libéré est elle aussi proportionnelle à l’activité cellulaire et seules les cellules vivantes sont détectées.

L’absence de toxicité cellulaire permet une utilisation des composés de la présente invention à la fois in vitro et in vivo sans altérer les cellules, et tout en permettant de conserver leur viabilité. Les produits libérés lors de l’hydrolyse des groupements carbonates R ¹ -0-C(=0)- O sont du dioxyde de carbone, des alcools de type R ¹ -OH ainsi que le fluorochrome : la fluorescéine ou un dérivé correspondant.

L’invention concerne aussi une méthode de marquage cellulaire d’un ensemble de cellules qui comprend les étapes de mettre en contact les cellules avec un composé de formule générale (I) selon l’invention, puis de vérifier la présence de coloration ou fluorescence dans l’ensemble de cellules.

L’invention concerne aussi une méthode de vérification de la viabilité cellulaire d’un ensemble de cellules qui comprend les étapes de mettre en contact les cellules avec un composé de formule générale (I) selon l’invention, puis de vérifier la présence de coloration ou fluorescence dans l’ensemble de cellules. La fluorescence ou coloration qui est le résultat de la lyse cellulaire du composé de formule générale (I) libérant le chromophore ou fluorophore dérivé de fluorescéine permet de conclure quant à la présence de cellules vivantes.

Dans un mode particulier de l’utilisation des composés de formule générale (I) selon l’invention, la mise en oeuvre de la méthode selon l’invention comprend l’identification et le comptage du nombre de cellules vivantes dans l’ensemble de cellules.

Les moyens d’identifier les cellules et de les compter sont bien connus de l’homme du métier. Les cellules, préalablement marquées à l’aide des composés de la présente invention, sont visualisées à l’aide d’un microscope ou d’un macroscope en fluorescence ou avec tout autre appareil permettant de détecter la fluorescence. Une source lumineuse excite le fluorophore à une longueur d’onde comprise entre 480 et 520 nm, préférentiellement entre 490 et 510 nm, plus préférentiellement entre 490 et 500 nm. De manière avantageuse, la source lumineuse excite le fluorophore à une longueur d’onde de 495 nm. Après excitation, le fluorophore libère de l’énergie sous forme de lumière fluorescente, dont la longueur d’onde est comprise entre 500 et 540 nm, préférentiellement entre 510 et 530 nm, encore plus préférentiellement à 520 nm. Les cellules marquées deviennent visibles et peuvent être comptabilisées.

L’ensemble des cellules peut être un échantillon prélevé dans un organisme vivant, en particulier un tissu biologique, ou encore un organe ou une partie d’organe dans le même organisme vivant. On citera à titre d’exemples les greffons, et notamment les greffons cornéens, les greffons de moelle osseuse et les greffons de rein. Les organismes vivants sont avantageusement des animaux, en particulier des mammifères, et plus particulièrement l’homme.

L’utilisation ou la méthode selon l’invention peuvent être mises en oeuvre avec le composé de formule générale (I) comme seul marqueur de la viabilité cellulaire. Alternativement, il peut être employé avec d’autres marqueurs connus ou à venir, en particulier des marqueurs qui permettent d’identifier les cellules mortes, de manière à augmenter le contraste et faciliter l’identification et le décompte des cellules viables. Parmi ces autres marqueurs connus, on peut citer par exemple le bleu de Trypan.

Les composés de la présente invention utilisés en tant que marqueur cellulaire et préférentiellement en tant que marqueur de la viabilité cellulaire trouvent des applications dans de nombreux domaines tels que la recherche scientifique, les unités de thérapie cellulaire et tissulaire, ou encore dans le domaine médical avec une utilisation pour les diagnostics cliniques. L’absence de toxicité cellulaire des composés de la présente invention permet ainsi une quantification de la viabilité cellulaire sans altérer les tissus et/ou les cellules analysé(e)s. Ils peuvent donc être utilisés pour des études in vitro, ex vivo ou encore in vivo.

En médecine vétérinaire ou humaine, les composés peuvent notamment être utilisés pour mesurer la viabilité d’un greffon cellulaire et/ou tissulaire avant son implantation, ou encore afin de suivre l’évolution d’un processus pathologique par exemple dans le domaine de l’oncologie.

Dans le cadre de la présente invention, les cellules visées par le marquage sont notamment les cellules endothéliales, et plus particulièrement les cellules endothéliales cornéennes. Dans un mode de réalisation, les cellules d’intérêt sont les cellules hématopoïétiques.

Dans le domaine de l’ophtalmologie, les composés de la présente invention trouvent une application particulière dans la mesure de la viabilité cellulaire endothéliale des greffons cornéens destinés à la greffe de cornée, par la coloration des cellules endothéliales cornéennes et le dénombrement des cellules vivantes.

Compositions et compositions pharmaceutiques

Bien qu’il soit possible que l’ingrédient actif soit employé seul, il peut aussi être utilisé sous la forme d’une composition, en particulier une composition pharmaceutique.

Les compositions selon l’invention comprennent un composé de formule générale (I) selon l’invention et un véhicule approprié pour l’usage qui sera fait du composé. Pour les usages et méthodes privilégiés que sont le marquage cellulaire in vitro ou in vivo, il est entendu que le véhicule approprié ne doit pas affecter la viabilité des cellules. Il est entendu que les compositions selon l’invention ne comprennent pas de substances toxiques, ou pour le moins à des doses toxiques, qui affecteraient la viabilité des cellules. L’homme du métier connaît bien les différents véhicules et excipients pouvant être employés pour permettre d’appliquer le composé de formule générale (I) sur les cellules, et saura les sélectionner pour favoriser la mise en oeuvre des méthodes de vérification de la viabilité cellulaire. Un véhicule préféré est l’eau.

Tel qu’utilisé dans le cadre de la présente invention, le terme « composition pharmaceutique » désigne un mélange d’au moins un composé actif avec au moins un excipient et/ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques sont appropriées pour un usage in vitro, ex vivo et in vivo des composés de formule générale (I) selon l’invention.

Ainsi, les compositions pharmaceutiques de l’invention comprennent un composé de formule générale (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable en tant que substance active et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.

L’excipient et le véhicule sont « pharmaceutiquement acceptables » dans le sens où ils sont compatibles avec les autres ingrédients de la composition et sont non-toxiques. Leur utilisation permet notamment de faciliter la préparation, la conservation et l’administration du composé actif. De tels excipients et véhicules sont bien connus de l’homme du métier, décrits notamment dans la pharmacopée française ou européenne.

Les excipients et véhicules pharmaceutiquement acceptables comprennent tous les solvants, les milieux de dispersion, les revêtements, les agents antibactériens et antifongiques, les agents isotoniques, les agents d’absorption, et autres qui sont physiologiquement compatibles.

Des exemples d’excipients et de véhicules pharmaceutiquement acceptables sont l’eau, les solutions salines, les alcools (le glycérol, les glycols), les polyéthers (les polyéthylène glycols, les propylène glycols, les poly(oxy)ethylène glycols et leurs dérivés), les dérivés polyéthoxylés de l’huile de ricin (Kolliphor® EL, Cremophor® EL, et dérivés), l’acide hyaluronique, le hyaluronate de sodium, le chondroïtine sulfate, et notamment le chondroïtine sulfate sodique, les carbomères, et notamment le carbomère 974P, les poloxamères, les poloxamines, les dextranes, les huiles végétales (huile de soja, huile de colza, huile de tournesol, huile d’olive, huile d’amande douce, huile de coton, huile de ricin) et les huiles minérales (vaseline, paraffine), les silicones, les gélatines, les agaroses (agar-agar), les alginates, les pectines, la tragacanthe, la gomme de karaya, la gomme de xanthane, la carraghénane, les carbohydrates (saccharose, lactose, l’amylose), les amidons (amidon de maïs, amidon de riz, amidon de pomme de terre, amidon de blé), les esters d’acides gras, la cellulose et ses dérivés (méthylcellulose, carboxyméthyl cellulose, hydroxyméthylcellulose, hydroxyéthylcellulose, hydroxypropylcellulose), etc. Dans un mode de réalisation préféré, l’excipient et/ou le véhicule pharmaceutiquement acceptables est choisi parmi l’eau, les dérivés polyéthoxylés de l’huile de ricin, l’acide hyaluronique, le hyaluronate de sodium, le chondroïtine sulfate sodique, et les carbomères.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées par n’importe quel procédé connu de l’homme du métier. Une quantité appropriée du composé de formule générale (I) est mélangée avec un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour obtenir la formulation souhaitée qui doit être compatible avec le mode d’administration.

La composition selon l’invention est avantageusement une solution comprenant le composé de formule générale (I), en particulier une solution, une suspension, une émulsion, un gel ou une pommade ou encore un film. De préférence, la composition selon l’invention est une composition aqueuse. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est sous la forme d’une solution, d’un gel ou d’un film.

Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est formulée pour une administration topique, et préférentiellement pour une administration ophtalmique. La composition pharmaceutique peut ainsi être formulée sous forme de gouttes oculaires, collyres ou instillations oculaires, crèmes, pommades, gels et hydrogels.

Les compositions liquides, pharmaceutiques ou non, peuvent aussi être préparées de manière extemporanée en mélangeant le composé de formule (I) selon l’invention, seul ou sous forme de composition, avec le véhicule liquide approprié pour son usage. Dans ce cas, la composition qui comprend le composé de formule générale (I) peut être sous forme solide (poudre ou comprimés en particulier) ou bien sous forme d’un liquide concentré.

La composition pharmaceutique de la présente invention se présente préférentiellement sous la forme d’une composition aqueuse. Elle est particulièrement adaptée pour une utilisation en ophtalmologie.

La composition pharmaceutique ou non présente ainsi un pH physiologiquement compatible, c’est-à-dire un pH compris entre 5 et 8. Elle comprend donc généralement un tampon approprié pour un usage ophtalmique, connu de l’homme du métier.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre d’autres adjuvants usuels mis en oeuvre pour la préparation de telles compositions pharmaceutiques tels que les co-solvants, les adoucissants, les antioxydants, les opacifiants, les stabilisants, les épaississants ioniques ou non ioniques, les surfactants, les agents de viscosité, les agents osmoprotecteurs, les agents de pénétration, les agents de gélification, les silicones, les agents anti-mousse, les agents hydratants, les vitamines, les parfums, les conservateurs, les charges, les séquestrants, les colorants, les bases ou les acides nécessaires à la régulation du pH, ou tout autre ingrédient habituellement utilisé pour la préparation de compositions ophtalmiques.

Les agents conservateurs généralement employés dans des compositions topiques (cosmétiques, pharmaceutiques, ophtalmiques, etc.) pour éviter leur contamination par des germes, sont bien connus de l’homme du métier, comme les ammoniums quaternaires, notamment le chlorure de benzalkonium, l’alkyl-diméthyl-benzylammonium, le cétrimide, le chlorure de cétylpyridinium, le bromure de benzododécinium, le chlorure de benzothonium, le chlorure de cetalkonium, les conservateurs mercuriels, comme le nitrate/acétate/borate phénylmercurique, le thiomersal, les conservateurs alcooliques, comme le chlorobutanol, l’alcool benzylique, le phényléthanol, l’alcool phényléthylique, les acides carboxyliques, tels que l’acide sorbique, les phénols, en particulier méthyl/propyl parabène, les amidines, par exemple le chlorhexidine digluconate et/ou des agents chélateurs comme l'EDTA seul ou en association avec au moins un autre conservateur.

En l’absence de conservateurs, la composition doit subir un traitement particulier au cours de sa préparation et de son conditionnement de manière à éviter et prévenir la contamination par des pathogènes. Ces traitements et procédures sont bien connus de l’homme du métier. En ce sens, une composition sans conservateurs selon l’invention se distingue d’une simple composition comprenant les mêmes ingrédients et obtenue sans montrer de précautions particulières ni décrivant d’étapes du procédé permettant d’obtenir cette stérilité caractéristique des compositions pharmaceutiques selon l’invention, en particulier des compositions ophtalmiques.

Les composés de la présente invention peuvent être utilisés en association avec un ou plusieurs agents thérapeutiques. L’administration de différentes substances actives peut être simultanée, séquentielle ou espacée dans le temps. Procédé de préparation

La synthèse des composés de formule générale (I) est réalisée en deux étapes

Xf Xj successives a partir du diphenol (II), , sans isoler le compose intermédiaire (III)

La première étape est la réaction du diphénol (II) avec du diphosgène (chloroformiate de trichlorométhyle, CAS [503-38-8]), ou un dérivé tel que le phosgène (dichlorure de carbonyle, CAS [75-44-5]) ou le triphosgène (carbonate de bis(trichlorométhyle), CAS [32315- 10-9]). Dans un mode de réalisation préféré, le diphénol réagit avec du diphosgène.

La température de la réaction est comprise entre 40 et 80 °C. La température de réaction est préférentiellement comprise entre 50 et 70°C, plus préférentiellement entre 55 et 65 °C. Dans un mode de réalisation, la température de réaction est comprise entre 57 et 63 °C, et plus préférentiellement la température de la réaction est d’environ 60 °C.

La réaction est effectuée dans un solvant organique anhydre, et préférentiellement dans un solvant chloré, tel que le chlorométhane, le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrachlorométhane, le trichloréthylène, le 1 ,1 ,1 -trichloroéthane, le 1 ,2-dichloroéthane, etc. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant de la réaction est le 1 ,2-dichloréthane. D’autres solvants sous forme anhydre tel que le diéthyléther, le dibutyléther, le tétrahydrofurane (THF) et le dioxane peuvent aussi être employés.

Une base peut éventuellement être utilisée pour cette réaction. On choisira des bases de type amine tertiaire et ou secondaire encombré (non nucléophile), telle que la triéthylamine, l’isopropylamine, la diisopropylamine, la N,N-diisopropyléthylamine, la pyrrolidine, la pyridine, etc. Dans un mode de réalisation, l’utilisation de la triéthylamine ou de la diisopropyléthylamine sera préférée.

Le composé intermédiaire (III), , est ainsi obtenu après évaporation du milieu réactionnel.

Dans une deuxième étape, ce dernier réagit avec un alcool de formule générale (IV),

R ¹ OH, pour former le composé de formule générale les sels pharmaceutiquement acceptables.

La réaction de condensation s’effectue à une température comprise entre 50 et 90 °C, préférentiellement entre 60 et 80 °C. Dans un mode de réalisation, la température de la réaction est comprise entre 65 et 75 °C, préférentiellement entre 68 et 72 °C. Dans un mode de réalisation préféré, on choisira une température d’environ 70 °C.

Le solvant de la réaction est un solvant organique anhydre, préférentiellement un solvant chloré, tel que le chlorométhane, le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrachlorométhane, le trichloréthylène, le 1 ,1 ,1 -trichloroéthane, le 1 ,2-dichloroéthane, etc. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant de la réaction est le 1 ,2-dichloréthane. D’autres solvants sous forme anhydre tel que le diéthyléther, le dibutyléther, le THF et le dioxane peuvent aussi être employés.

La réaction s’effectue en présence de base. Une base de type amine tertiaire sera préférentiellement utilisée, telle que la triéthylamine, l’isopropylamine, la diisopropylamine, la N,N-diisopropyléthylamine, la pyrrolidine, la pyridine, etc. Dans un mode de réalisation, la triéthylamine ou la diisopropyléthylamine seront les bases sélectionnées pour la réaction.

Les produits de formule générale (I) ou sels pharmaceutiquement acceptables sont obtenus après des étapes d’extraction et/ou purification.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Test de dosage de la LDH par réaction enzymatique

Figure 2 : Cytotoxicité de la calcéine-AM (4 mM) et du composé 1 en solution dans le CremophorOEL [CAS 61791 -12-6] (ratio molaire 1 / 1) désigné par la référence F4267 (40 mM et 1000 mM) sur les cellules HCE-2, exprimée en % en fonction du temps après mise en contact unique (0 =45 min, 24 h et 48 h).

Figure 3 : Images des cellules HEL-299 obtenues à l’aide du macroscope MVX10 sous le filtre FITC suite à une coloration : A : Calcéine-AM (4 mM) ; B : F4267 (4 mM) ; C : F4267 (40 mM) (objectifs x2.5 et x6.3 respectivement pour la première et deuxième ligne).

Figure 4 : Perte cellulaire endothéliale de cornées humaines conservées en organoculture et mises en contact avec le produit F4267 (40 mM) soit de manière répétée tous les jours pendant 7 jours soit de façon unique à J0, avant d’être exposée chacune quotidiennement à la lumière sous le filtre FITC

Figure 5 : Viabilité mesurée en % par analyse de la fluorescence sur des cornées humaines dont l’une est incubée quotidiennement avec le produit F4267 (images A et A’) et l’autre de façon unique (images B et B’) à J0, mais toutes deux exposées quotidiennement à la lumière sous le filtre FITC. Les images A et B représentent la fluorescence après incubation avec le produit F4267 à J0 et les images A’ et B’ représentent la fluorescence après incubation avec la Calcéine-AM en fin d’expérience à J7 pour mesurer la viabilité cellulaire.

Figure 6 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal FITC et après marquage avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM) avec et sans rinçage au PBS selon l’exemple 5.

Figure 7 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal FITC après marquage pendant 5 jours avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM), avec et sans rinçage au PBS, selon l’exemple 5.

Figure 8 : Images des cellules B4G12 obtenues à l’aide d’un microscope à épifluorescence sous le canal DAPI (405 nm) après marquage pendant 5 jours avec de la calcéine-AM (4 mM) et le produit F4267 (40 mM), avec et sans rinçage au PBS, selon l’exemple 5.

EXEMPLES

Les exemples donnés dans la présente demande sont illustratifs et ne limitent pas la portée de l’invention. Exemple 1 : Synthèse des composés

1. Abréviations

AcOEt Acétate d’éthyle

DCE 1 ,2-dichloroéthane

DCM Dichlorométhane

DMAP 4-Diméthylaminopyridine

DMSO Diméthylsulfoxyde

EP Ether de pétrole

HRMS Spectrométrie de masse de haute résolution

NMR Résonance magnétique nucléaire

2. Modes opératoires

La synthèse générale des composés « dicarbonates de fluorescéine » est réalisée à partir de fluorescéine ou de dérivés correspondants. La synthèse se fait en 2 étapes : a) la fluorescéine ou le dérivé correspondant réagit avec un réactif générant du phosgène (phosgène, diphosgène ou triphosgène) en présence de base et le solvant est évaporé, b) l’intermédiaire de synthèse obtenu réagit avec un alcool en présence de base pour obtenir le composé final de formule générale (I). a) Protocole de synthèse en présence d’alcools primaires

A une suspension de fluorescéine (1 eq.) dans du DCE sont successivement ajoutés du diphosgène (6 eq.) puis de la triéthylamine (1 eq.) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est chauffé à 60 °C pendant 2 heures. Le solvant est évaporé avec une ligne de Schlenk et le produit est séché pendant plusieurs heures dans le noir. Dans un autre tube de Schlenk, l’alcool primaire (2 eq.) est dissout dans du DCE et de la triéthylamine (2 eq.) est ajoutée goutte à goutte. Le résidu de fluorescéine, précédemment obtenu, est dissout dans du DCE et la solution alcoolique est ajoutée au goutte à goutte pendant 10 minutes. Le mélange réactionnel est chauffé pendant 3 heures à 70 °C.

Le milieu réactionnel est versé dans de l’eau et extrait avec du DCM. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec de l’eau, puis avec une solution aqueuse de NaCI saturée, séchés sur MgSC , et le solvant est évaporé par évaporation rotative. Le produit brut est finalement purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (AcOEt/EP) pour obtenir le produit désiré. b) Protocole de synthèse en présence d’alcools secondaires A une suspension de fluorescéine (1 eq.) dans du DCE sont successivement ajoutés du diphosgène (6 eq) puis de la diisopropyléthylamine (7 eq) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est chauffé à 60 °C pendant 2 heures. Le solvant est évaporé avec une ligne de Schlenk et le produit est séché pendant plusieurs heures dans le noir. Dans un autre tube de Schlenk, l’alcool secondaire (2 eq.) est dissout dans du DCE. Diisopropyléthylamine (2 eq.) et DMAP (1 eq.) sont ajoutés. Le résidu de fluorescéine, précédemment obtenu, est dissout dans du DCE et la solution alcoolique est ajoutée au goutte à goutte pendant 10 minutes. Le mélange réactionnel est chauffé pendant 3 heures à 70 °C. Le milieu réactionnel est versé dans de l’eau et extrait avec du DCM. Les extraits organiques sont combinés, lavés avec de l’eau, puis avec une solution aqueuse de NaCI saturée, séchés sur MgSC , et le solvant est évaporé par évaporation rotative. Le produit brut est finalement purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (AcOEt/cyclohexane, puis DCM/AcOEt) pour obtenir le produit désiré. 3. Composés synthétisés

Composé 1 : Dicarbonate de pentyle de fluorescéine

Le dicarbonate de pentyle de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 15:80) et isolé sous la forme d’une huile transparente (36 %). ¹ H NMR (500 MHz, CDCI ₃ ) d (ppm) : 8.04 (dt, ³ J = 7.5 Hz, ⁴ J= 1.0 Hz, 1 H), 7.69 (td, ³ J= 7.4 Hz, ⁴ J= 1.1 Hz, 1 H), 7.64 (td, ³ J= 7.4

Hz, ⁴ J= 1.1 Hz, 1 H), 7.22 - 7.14 (m, 3H), 6.91 (dd, ³ J= 8.7 Hz, ⁴ J= 2.3 Hz, 2H), 6.84 (d, ³ J = 8.7 Hz, 2H), 4.26 (t, ³ J= 6.7 Hz, 4H), 1.82 - 1 .70 (m, 4H), 1 .46 - 1 .31 (m, 8H), 0.94 (t, ³ J= 6.7 Hz 6H). ¹³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) d (ppm): 169.11 , 153.08, 152.93, 152.44, 151.56, 135.34, 130.12, 129.07, 126.10, 125.31 , 124.05, 117.26, 116.61 , 109.93, 81.54, 69.41 , 28.26, 27.81 , 22.30, 13.95.

Composé 2 : Dicarbonate de décyle de fluorescéine

Le dicarbonate de décyle de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 20:80) et isolé sous la forme d’une huile transparente (77 %). ¹ H NMR (500 MHz, DMSO-cfe) d (ppm): 8.07 (dt, ³ J = 7.6 Hz, ⁴ J = 1.0 Hz, 1 H), 7.83 (td, ³ J = 7.4 Hz, ⁴ J = 1 .1 Hz, 1 H), 7.77 (td, ³ J =

7.4 Hz, ⁴ J= 1.1 Hz, 1 H), 7.46 - 7.36 (m, 3H), 7.06 (dd, ³ J = 8.7 Hz, ⁴ J = 2.4 Hz, 2H), 6.91 (d, ³ J = 8.7 Hz, 2H), 4.22 (t, ³ J = 6.6 Hz, 4H), 1 .77 - 1 .59 (m, 4H), 1 .38 - 1 .21 (m, 28H), 0.85 (t, 3J = 6.6 Hz, 6H). ¹³ C NMR (126 MHz, DMSO) d (ppm): 168.85, 152.93, 152.60, 151.23, 136.52, 131.09, 129.75, 125.84, 125.55, 124.57, 118.52, 116.90, 110.48, 81.28, 69.39, 31.75, 29.38, 29.15, 29.04, 28.39, 25.59, 22.56, 14.42. HRMS (ESI-TOF) C ₄₂ H ₅₂ O ₉ found: 701.3644 [M+H] ⁺ , calculated : 701 .3684

Composé 3: Dicarbonate diéthyl (L-)malate de fluorescéine

Le dicarbonate diéthyl (L-)malate de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/cyclohexane 35:65, puis DCM/AcOEt 95:5) ¹ H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) d (ppm): 8.06 (d, ³ J = 7.1 Hz, 1 H), 7.78 - 7.60 (m, 2H), 7.27 - 7.12 (m, 3H), 6.97 (dd, ³ J = 8.7 Hz, ⁴ J = 2.4 Hz, 2H), 6.87 (d, ³ J = 8.8 Hz, 2H), 5.50 (t, ³ J = 6.1 Hz, 2H), 4.40 - 4.13 (m, 8H), 3.10 - 2.92 (m, 4H), 1.43 - 1.16 (m, 12H). ¹³ C NMR (101 MHz, CDCI ₃ ) 5 (ppm): 169.02, 168.74, 168.08, 152.87, 152.18, 152.13, 151.48, 151.48, 135.37, 130.14, 129.12, 125.98, 125.32, 123.98, 117.09, 116.89, 109.82, 77.33, 77.02, 76.70, 72.27, 62.30, 61.43, 36.02, 14.13, 14.08.

Composé 4 : Dicarbonate d’acide (L)-malique de fluorescéine

Le dicarbonate d’acide (L-)malique de fluorescéine est purifié sur gel de silice (AcOEt/EP 75:25, puis DCM/AcOEt 97:3) ¹ H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) d (ppm): 8.08 - 8.01 (d, ³ J = 7.1 Hz 1 H), 7.73 - 7.58 (m, 2H), 7.17 (d, ³ J= 7.1 Hz, 1 H), 7.13 (d, ⁴ J= 2.2 Hz, 2H), 6.86 (dd, ³ J= 8.7 Hz, ⁴ J = 2.2 Hz, 2H), 6.81 (d, ³ J = 8.6 Hz, 2H), 4.36 (hept, ³ J= 6.7 Hz, 2H), 3.35 (d, ³ J = 7.4 Hz, 4H).

Exemple 2 : Etude in vitro sur cellules adhérentes de type « test de laboratoire de recherche »

1. Matériel et méthodes

Cytotoxicité

La cytotoxicité d’une solution du composé 1 dans le CremophorOEL [CAS 61791-12- 6] (ratio molaire 1 / 1), désigné sous la référence F4267, comparée à celle de la calcéine-AM, a été évaluée sur la lignée cellulaire d’épithélium cornéen humain immortalisée par SV40, HCE-2 (ATCC CRL-11135) en utilisant deux solutions de F4267 de concentrations [40 mM] et [1000 mM] ou de calcéine-AM (FP-FI9820, Interchim) [4 mM] diluées dans de l’optiMEM (11058021 , Gibco, ThermoFisher) et déposées pendant 45 minutes sur les cellules (100 pL par puits ensemencés 24 h avant à 1 .10 ⁵ cellules/mL [3788, Corning, surface : 0.32cm ² ]. Après les 45 minutes de mise en contact avec le composé 1 ou avec la calcéine-AM, les cellules ont été rincées avec leur milieu de culture, puis remises en culture en étuve avec 5% de CO2, à 37°C. La cytotoxicité a été mesurée en dosant les lactates déshydrogénases (LDH) relarguées dans le surnageant en utilisant le kit CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay (C20301 , ThermoFisher, voir test de cytotoxicité ci-dessous) et exprimée en % de cellules mortes grâce à un étalon interne. La cytotoxicité était évaluée 45 minutes (avant rinçage), 24 h et 48 h après le début de l’incubation (3 puits par conditions, n=1 expérimentations).

Test de cytotoxicité

Les Lactates DésHydrogénases (LDH) sont une famille d’enzymes cytosoliques ubiquitaires présentes dans presque tous les types cellulaires. Les dommages membranaires provoquent un relargage de LDH dans le milieu extérieur. Il y a une corrélation directe entre la cytotoxicité cellulaire qui provoque des dommages membranaires et la quantité de LDH présente dans le milieu extracellulaire. Dans le test de cytotoxicité, la LDH est dosée par la réaction enzymatique représentée dans la figure 1 . La LDH transforme le pyruvate en lactate en même temps qu’il y a réduction du NAD+ en NADH. Le NADH ainsi produit réagit avec des molécules fluorescentes ou luminescentes.

Le test de cytotoxicité a été réalisé avec le sel de tétrazolium (INT) qui est converti en formazan. La coloration a alors été étudiée à l’aide d’un spectrophotomètre. La concentration de formazan étant proportionnelle à la quantité de LDH présente dans le milieu, celle-ci a été quantifiée par une lecture d’absorbance à 555 nm, contre une mesure à blanc à 650 nm pour éliminer l’absorbance parasite du milieu. Le pourcentage de cellules mortes est ensuite calculé à partir de la formule ci-après, avec l’activité LDH maximale étant celle d’un puits dont toutes les cellules ont été lysées, et l’activité LDH basale, celle d’un puits non traité.

Qualité du marquage

La qualité du marquage cytoplasmique par le composé 1 sur cellules a été évaluée sur la lignée adhérente de fibroblastes pulmonaires foetaux normaux humains HEL299 [ATCC CCL-137], car elles forment une monocouche cellulaire (une seule épaisseur facilitant l’évaluation de la morphologie cellulaire et le dénombrement). Des cellules ont été ensemencées à 1.10 ⁵ cellules/mL 72 h avant marquage, puis marquées avec la solution de composé 1 désignée par la référence F4267 à [4 mM] et [40 mM] ou avec une solution de Calcéine-AM [4 mM], puis observées en boite de Pétri stérile sous le filtre FITC d’un macroscope (macro-zoom microscope, MVX10, Olympus, Tokyo, Japon) (2 puits par condition, n=1 expérimentations).

2. Résultats Cytotoxicité A 45 min, la cytotoxicité (%) provoquée sur HCE-2, était très faible : 0.6±0.5% pour la calcéine-AM, 0.8±0.5% pour F4267 à 40 mM et 2.2±0.6% pour F4267 1000 mM.

A 24 h, les cytotoxicités étaient de 26.4±14.1% pour la calcéine-AM, de 7.3±3.4% pour F4267 à 40 mM et de 21 .6±2.7% pour F4267 à 1000 mM.

A 48 h, les cytotoxicités étaient de 18.8±11.1% pour la calcéine-AM, de 6.1 ±0.9% pour F4267 à 40 mM et de 22.3±3.8% pour F4267 à 1000 mM (Figure 2).

Qualité du marquage

Le marquage des cellules FIEL299 permettait de visualiser les cytoplasmes cellulaires de façon similaire avec la solution de Calcéine-AM [4 mM] et avec la solution F4267 respectivement à [4 mM] et [40 mM] (Figure 3).

Exemple 3 : Etude ex vivo sur endothélium de cornées entières, de type « test en banque de cornées »

1. Matériel et méthodes

Cytotoxicité

La cytotoxicité du composé 1 (solution F4267) a été évaluée sur l’endothélium de cornées entières, en utilisant des paires de cornées humaines, conservées en organoculture et récusées pour la greffe par une banque de cornées. Les 2 cornées d’un même donneur ont les mêmes caractéristiques biologiques et constituent le meilleur comparateur l’une de l’autre. La Densité Cellulaire Endothéliale (DCE) a d’abord été évaluée avant expérimentation grâce à un comptage cellulaire par analyse d’image [Cell Tissue Bank, 2017, 18 ( 2 ), 185-191 , Jumelle et al.], puis l’endothélium des deux cornées a été mis au contact d’une solution de F4267 [40 mM] pendant 45 minutes à température ambiante, en conditions stériles [Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 (8), 6018-6025, Pipparelli et al.]. Les cornées ont ensuite été observées au macroscope MVX10 avec l’objectif x0.8 sous le filtre FITC, puis remises en organoculture. Afin d’évaluer la toxicité par incubation répétée, la cornée de l’œil droit (OD) a été mise en contact quotidiennement avec une solution de F4267 [40 mM en OptiMEM, 45 minutes, température ambiante] pendant 7 jours tandis que la cornée de l’œil gauche (OG) a été seulement incubée avec de l’optiMEM (solvant seul). Les cornées ont été exposées quotidiennement à la lumière bleue du filtre FITC (même intensité de lampe XCite à 12/100) sous l’objectif x0.8 du macroscope MVX10. La DCE a été mesurée à nouveau à J7 à l’aide de la coloration Floechst-Ethidium-Calcéine-AM ( Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 (8), 6018- 6025, Pipparelli et al) (1 paire de cornées, n =1).

Qualité du marquage

La qualité du marquage cytoplasmique par le composé 1 (solution F4267) sur endothélium cornéen a été comparée à celle de la Calcéine-AM en colorant des cornées appariées. La face endothéliale des cornées a été incubée 45 minutes soit avec la solution F4267 (40 mM sur l’œil gauche, OG) soit avec la Calcéine-AM (4 mM sur l’œil droit, OD) en suivant un protocole de coloration validé ( Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 , 52 ( 8 ), 6018-6025, Pipparelli et al.) (n =2 paires de cornées).

2. Résultats

Cytotoxicité

La DCE en cellules viables à J7, après mise en contact quotidienne de la cornée de l’OD avec le produit F4267 suivie d’une observation à faible grossissement pendant 7 jours, était de 1832 cellules/mm ² . Cette DCE était de 1612 cellules/mm ² pour une mise en contact unique de la cornée de l’OG mais avec également une exposition quotidienne à la lumière La perte cellulaire est donc comparable indiquant que l’incubation répétée est bien tolérée (Figure 4).

Les images de la figure 5 illustrent la viabilité mesurée en % après marquage à la Calcéine-AM à j7 par analyse d’image de la fluorescence : cornée A (OD) mise en contact tous les jours de manière répétée pendant 7 jours avec le produit F4267, cornée B (OG) mise en contact de façon unique à J0 mais toutes deux exposées de façon quotidienne à la lumière sous le filtre FITC.

Qualité du marquage

Le produit F4267 [40 mM] permet un marquage démarquant les cellules mortes des cellules vivantes (Figures 5A et 5B, à J0). De plus, il a été montré que le produit F4267 [40 mM] permet un marquage démarquant les cellules mortes des cellules vivantes de façon similaire à la Calcéine-AM [4 mM] sur cornée entière.

Exemple 4 : Marquage de différents types cellulaires

Des cellules endothéliales cornéennes (B4G12), des fibroblastes (Hel-299) et des cellules épithéliales cornéennes (FICE-2) ont été mises en culture sur une lame de culture 8 puits (LabTek, 177445) pendant 5 jours dans des milieux de cultures correspondants et décrits ci-dessous.

Milieu de culture B4G12 \ Gentamycine, OptiMEM, SVFD, CaICh, Acide ascorbique, EGF, Chondroïtine sulfate, SB203580, Y27632.

Milieu de culture HCE-2 : DMEM GlutaMax, F12-FIAM, SVFD, Antibiotique/mycotique, EGF. Milieu de culture Hel-299 : DMEM GlutaMax, SVFD, AT B/M

Lors de la confluence, le marquage cellulaire est réalisé pendant 45 minutes avec les solutions comprenant de la calcéine-AM ou le produit F4267 à différentes concentrations (solutions A, B, C et D), avant un rinçage au PBS. Puis les puits de culture sont enlevés, et la lame est montée avec une lamelle et du Vectashield.

Solution A : calcéine-AM (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)

Solution B\ F4267 (40 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)

Solution C: F4267 (4 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500) Solution D: F4267 (400 mM), Hoescht (1/200), ethydium (1/500)

Les lames sont ensuite observées au macroscope avec un grossissement x0,8 et x6,3 et au microscope à épifluorescence avec un grossissement x10 et x60. Les différents puits sont observés dans les mêmes conditions à chaque grossissement pour permettre une comparaison des intensités et de la qualité du marquage avec des traitements d’image identiques.

Les cytoplasmes des cellules vivantes, quel que soit le type de cellule, sont bien visibles avec le composé F4267.

Exemple 5 : Evaluation de l’impact du marquage cellulaire sur la viabilité cellulaire

L’expérience est réalisée avec des cellules endothéliales cornéennes FICEC-B4G12 (CVCL 2065). Les cellules sont décongelées et mises en culture dans leur milieu de culture. Les cellules sont trypsinées une fois par semaine avant d’être ensemencées dans des puits de plaque 24 puits à une concentration de 1.10 ⁵ cellules/mL. Les cellules sont ensuite incubées pendant 5 jours à 37°C, 5% CO2 jusqu’à 90% de confluence.

Les différents puits sont colorés quotidiennement avec de la calcéine-AM (4 mM) ou du produit F4267 (40 mM), selon les conditions suivantes : marquage pendant 45 minutes, puis rinçage au PBS ou marquage pendant 45 minutes sans rinçage. L’étape de marquage et éventuellement de rinçage est répété tous les jours pendant 4 jours successifs, puis après 2 jours sans marquage, le marquage est de nouveau répété pendant 2 jours consécutifs.

Les étapes de marquage sont réalisées en double. Après, chaque marquage un puit pour chacune des conditions est observé en microscopie à épifluorescence (Microscope Olympus 1X81 , canal FITC, objectif x4, L :25, Texp : 142.7ms), tandis que le second puit (témoin) est conservé dans l’obscurité afin d’évaluer l’impact de l’observation en fluorescence à la fin de l’étude. Le dernier jour de l’étude, le marquage est réalisé avec de la calécine-AM (4 mM) en présence de Floescht (1/500) ou le produit F4267 (40 mM) en présence de Floescht (1/500), et les puits sont imagés en MIA x4 (reconstitution de plusieurs champs pour obtenir une image complète du puit).

Les étapes de marquage sont effectuées dans une salle blanche sous PSM afin d’assurer la stérilité, et les boites de cultures sont parafilmées lors de l’observation pour limiter la contamination possible.

Les figures 6 et 7 représentent les tapis cellulaires observés à J0, donc le premier jour de marquage et à J5, soit le dernier jour du marquage. Il apparaît que les tapis cellulaires des cellules marqués avec la calcéine-AM sont moins denses que ce soit pour les expériences en présence ou en absence de rinçage, au contraire des tapis cellulaires dont les cellules ont été marquées avec F4267. La figure 8 correspondant aux images des cellules sous le canal DAPI confirme l’absence de tapis cellulaire pour les cellules marquées avec la calcéine-AM.

Ces différentes observations concluent que le produit F4267 apparaît comme non- toxique, ou du moins, moins toxique que la calcéine-AM pour les cellules, puisque aucune influence négative du marqueur F4267 sur le tapis cellulaire n’est mis en évidence.