Die gängigste Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen ist ihr Einsatz zum Färben von Fasern und Formkörpern. Jedoch wird die Fluoreszenzeigenschaft auch in der Analytik genutzt. So werden Fluoreszenzchromophore in der Biochemie z. B. zur Markierung von Antikörpern oder niedermolekularen Verbindungen im Rahmen von Imunoassays oder anderen immunologischen Nachweismethoden ein- gesetzt. Bei diesen Verfahren werden die Fluoreszenzfarbstoffe jedoch vor der Nachweisreaktion mit diesen Nachweisreagentien gekuppelt.

Eine Methode zur Analytik von Amingemischen wird in Anal. Chem.

1995,67,1742-1748 beschrieben, bei der Amingemische mit Fluoreszenzfarbstoffen, die einen Succinimidylesterrest haben, markiert werden, flüssigchromatographisch aufgetrennt werden und anhand von zuvor erstellten Referenzproben die qualitative und quantitative Zusammensetzung des Gemisches bestimmt wird.

Die Bestimmung der Adsorption von Aminen an Oberflächen hat eine andere Zielsetzung. Hier geht es nicht um die Detektion bestimm- ter Amine in Gemischen, sondern um die Fragestellung, welche Affinität ein Oligo-oder Polyamin zu bestimmten Materialien hat.

Bei der Entwicklung von Textil-, Leder-und Papierhilfsmitteln spielt es eine große Rolle, daß man den Adsorptionsgrad des Oligo-oder Polyamins bei seiner Anwendung auf den Substraten kennt. Besonders in Gemisch mit andersartigen Hilfsmitteln sind Untersuchungen im Hinblick auf die Affinität der speziellen Oligo-und Polyamine zu den Substraten wichtig.

Daher war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Markierungs- mittel zur Verfügung zu stellen, die eine qualitative und gegebe- nenfalls quantitative Aussage über die auf dem Substrat adsor- bierten Oligo-und/oder Polyamine ermöglichen.

Demgemäß wurde die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die mindestens eine reaktive Gruppe tragen, welche mit nucleophilen Gruppen reagieren kann, gefunden, zur qualitativen und quanti- tativen fluoreszenzanalytischen Bestimmung der Adsorption von Verbindungen, welche Amino-und/oder Iminogruppen tragen, an Oberflächen.

Bei den geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen kommt es auf die chemische Beschaffenheit des Chromophors nur in untergeordnetem Maße an. Wesentlich ist vielmehr seine reaktive Gruppe, die eine schnelle Bindung zu beliebigen adsorbierten Verbindungen mit Amino-und/oder Iminogruppen ausbildet. Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 5. Ed., Vol. All, S. 279 beschrieben. Geeignete Klassen solcher Farbstoffe sind Naphthal- imide, Cumarine, Xanthene, Thioxanthene, Naphtholactame, Azlactone, Methine, Stilbene, Oxazine und Thiazine.

Besonders gut haben sich in der Praxis Cumarine wie Derivate des 7-Dialkylaminocumarins, Xanthene wie Fluorescin und seine Ha- logenierungsprodukte Eosin, Erythrosin, Phloxin und Rose Bengal und Rhodamine sowie insbesondere Methinfarbstoffe wie Cyanine bewährt.

Sofern fluoreszenzanalytische Untersuchungen von Oberflächen vorgenommen werden, auf denen weitere Verbindungen haften, die selber fluoreszieren, wählt man einen solchen Farbstoff, der sich in seinem Fluoreszenzspektrum deutlich von denen der anderen adsorbierten Verbindungen unterscheidet. Im Fall von optischen Aufhellern, wie sie beispielsweise bei Papier verwendet werden, würde man einen im roten oder nahe infraroten Spektralbereich fluoreszierenden Farbstoff wählen.

Als reaktive Gruppen, von denen mindestens eine mit dem Chromo- phor verknüpft ist, sind Reste geeignet, die mit der nucleophilen Amino-oder Iminogruppe reagieren, beispielsweise Michael- Systeme, wie Vinylsulfonyl oder die Schwefelsäurehalbester, die unter basischen Bedingungen zu diesen eliminieren. Weiterhin sind aus der Peptidchemie bekannte reaktive Gruppen wie Acetylazid-, Arylhalid-, Dichlortriazin-, Isothiocyanat-, Sulfonylchlorid-und Sulfosuccinimidylesterreste geeignet. In den Fällen, in denen die Substrate mehrere nucleophil reagierende Verbindungen adsorbiert haben, die in Konkurrenz zu den Amino-und Iminogruppen treten können, wählt man Farbstoffe mit solchen reaktiven Resten, die selektiv gegenüber Amino-und Iminogruppen sind.

Besonders haben sich in diesen Fällen Succinimidylester bewährt, die sich zum einen durch eine hohe Selektivität und zum anderen eine gute Stabilität in wäßrigen Lösungen auszeichnen.

Dabei ist es möglich, solche Fluoreszenzfarbstoffe, wie sie als Markierungsreagenzien für Biomoleküle wie Proteine und Anti- körper im Handel sind, direkt zum Anfärben zu verwenden. Gängige kommerzielle Markierungsmittel sind z. B. Cyanine mit einem oder mehreren Succinimidylesterresten.

Succinimidylester sind im übrigen auch einfach durch Umsetzung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Carbonsäuregruppen tragen, mit N-Hydroxysulfosuccinimiden herzustellen.

Die Untersuchung der Oberfläche findet derart statt, daß eine Probe des zu untersuchenden Substrats mit einer Farbstofflösung behandelt wird. An den Stellen der Oberfläche, auf denen Amino- oder Iminogruppen tragende Verbindungen adsorbiert sind, findet eine Verankerung des Farbstoffs statt. Durch einen sich anschlie- ßenden Spülschritt wird nicht verankerter Farbstoff herunter- gewaschen. Auf diese Weise ist es möglich, mittels Fluoreszenz- mikroskopie ein Abbild der Belegung der Oberfläche zu bekommen.

Verbindungen mit Amino-und/oder Iminogruppen, die sich durch die Anfärbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen vorteilhaft bestimmen lassen, sind Oligo-und Polyamine, die Amino-oder Iminogruppen tragen. Die Amino-oder Iminogruppen sind mit aliphatischen oder aromatischen Ketten verknüpft und können neben den Aminogruppen weitere funktionelle Reste oder auch quartäre Ammoniumionen ent- halten. Solche Stoffe werden in den verschiedensten Anwendungen als Hilfsmittel verwendet.

Beispielhaft seien Polyvinylamine erwähnt, wie sie beispielsweise in der US-A-4 217 214, EP-A-071 050 und EP-A-0 216 387 beschrie- ben sind. Solche Verbindungen sind Polymere von N-Vinylcarbonsäu- reamiden oder ihre Copolymere mit ethylenisch ungesättigten Mono- meren, die im Anschluß an die Polymerisation durch Abspalten der Carbonsäurereste in die Polyvinylamine umgewandelt werden. Solche Polyvinylamine werden beispielsweise als Papierhilfsmittel zur Fixierung von wasserlöslichen und-unlöslichen Störstoffen verwendet und haben mittlere Molekulargewichte M, von 200 bis 10 Millionen.

Ebenfalls gut anfärbbare Oligo-und Polyamine sind Polyethylen- imine, wie in der US-A-21 82 306 oder US-A-32 03 910 beschrieben, die mit mittleren Molekulargewichten M, von 250 bis 2 Millionen, meist von 500 bis 10000 als Hilfsmittel vielfältig eingesetzt werden. Beispielhaft sei nur die Verwendung von Polyethyleniminen als Retentionsmittel bei der Papierherstellung genannt.

Natürlich sind auch Derivate von Polyvinylaminen und Polyethylen- iminen gut anfärbbar, solange nicht alle freien Aminogruppen derivatisiert sind. Als Derivatisierungsreaktionen seien bei- spielhaft Carboxymethylierungen sowie Umsetzungen mit Alkyl- epoxiden, wie sie in der WO-A-97/40087 und WO-A-97/42229 be- schrieben sind, erwähnt.

Weiterhin sind als Amine Oligoamine, die durch Kondensations- reaktion beispielsweise von primären Mono-oder Diaminen oder sekundären Diaminen mit Epichlorhydrin erhalten werden, gut nach- weisbar. Ebenfalls seien die Additionsprodukte dieser Amine mit Acrylnitril und anschließender Hydrierung beispielhaft erwähnt.

Ein Beispiel für den erstgenannten Oligoamintyp sind teilweise quaternierte Piperazinkondensate mit Epichlorhydrin, die ein mittleres Molekulargewicht von 200 bis 70 000 aufweisen. Diese Amine finden als Textilhilfsmittel in der Färberei von Baumwoll- fasern Anwendung.

Die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe ermöglicht den Nachweis von Amino-und/oder Iminogruppen tragenden Verbindungen, die an beliebigen Oberflächen von Substraten adsorbiert sind.

Beispielhaft seien Papier, Holz, Leder, Gewebe aus synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Fasern, Haare, Fell, Schicht- silikat, harten Oberflächen wie Glas, Metall, Keramik oder auch Katalysatoroberflächen genannt.

Die Belegung der Oberflächen mit den Oligo-oder Polyaminen kann dabei beispielsweise durch Behandlung mit Reinigungs-oder Pflegeformulierungen erfolgt sein. Sie kann jedoch auch im Rahmen eines Veredlungsschritts von Fasern und Geweben oder direkt während beispielsweise der Papierherstellung erfolgen.

Je nach Anwendungsbereich haben solche Oligo-und Polyamine entsprechend den Anforderungen der Anwendung unterschiedliche Molekulargewichte. Dies spielt jedoch für die Anfärbung der Oligo-und Polyamine auf dem Substrat keine Rolle, da sie an der Oberfläche adsorbiert sind. Die Nachweisgrenze ist erst dann erreicht, wenn sich die zu untersuchenden Amine so leicht von

der Oberfläche lösen, daß dies während des kurzen Anfärbe-und Spülschritts geschieht.

Für den Färbeschritt stellt man in der Regel eine wäßrige Lösung des Fluoreszenzfarbstoffs her. Dabei sind unter wäßriger Lösung auch solche Lösungen zu verstehen, die außer Wasser bis zu 20 Gew.-% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels wie C1-bis C4-Alkanolen, insbesondere Methanol, Ethanol, Iso- propanol oder einen cyclischen Ether wie Tetrahydrofuran ent- halten. Bevorzugt wird jedoch Wasser als alleiniges Lösungsmittel verwendet. Der pH-Wert der Lösung sollte sich im Bereich von 5-14 bewegen, vorzugsweise 6 bis 10. Da saurere Bedingungen eine Protonierung der Aminogruppen bewirken, würde dies zu einer Verlangsamung der Reaktion führen. Der pH-Wert kann dabei so- wohl mit Hilfe anorganischer Base wie den Hydroxiden, Oxiden und basischen Salzen von Alkali-und Erdalkalimetallen, also beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Calciumcarbonat oder mit Puffersystemen eingestellt werden.

Da die fluoreszenzspektroskopische Analytik sehr empfindlich ist, ist es nicht notwendig, einen äquimolaren Umsatz der Amino-oder Iminogruppen zu erzielen. Vielmehr ist es ausrei- chend bezogen auf ein Äquivalent einer freien Aminogruppe nur 0,1 bis 10-5 Äquivalente Fluoreszenzfarbstoff einzusetzen.

Die Konzentration des Farbstoffs kann von 10-3 bis 10-6 mol/1 Lösungsmittel betragen. Sofern man handelsübliche Markierungs- farbstoffe für Biopolymere verwendet, kann man diese in denselben wie für die Markierungsreaktion vorgeschriebenen Konzentrationen einsetzen.

Der Färbeschritt ist in der Regel innerhalb weniger Minuten beendet und wird bevorzugt bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Färbungen können sowohl durch Besprühen oder durch Eintauchen einer Substratprobe in die Färbelösung erzielt werden.

Im Anschluß an den Färbevorgang wird der nichtgebundene Farbstoff durch Spülen mit Wasser oder dem wäßrigen Lösungsmittelgemisch entfernt.

Fluoreszenzanalytische Bestimmungen werden in der Regel als fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, für welche bevorzugt Auflichtmikroskopen gewählt werden. Dabei können z. B.

Ein-oder Zweiphotonenanregungen, Laser-Scanning Einrichtungen sowie konfokale, das heißt tiefenauflösende, Aufstellung

verwendet werden. Ebenso ist eine spektral-oder zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion möglich, um Zweifachmarkierungen mit unter- schiedlichen Farbstoffen zu betrachten.

Eventuelle Anfarbbarkeit der nichtbelegten Oberfläche und dadurch verursachte Fluoreszenz sowie mögliche Eigenfluoreszenz der Substrate ist durch einfache Blindexperimente feststellbar und als Untergrundsignale leicht zu berücksichtigen.

Der Betrachter sieht eine Oberfläche, bei der die Oligo-oder Polyamine als Punkte erscheinen, so daß es für ihn möglich ist, die Orte starker Dichte beispielsweise auf einem Gewebe zu erken- nen. Es ist somit die qualitative Aussage, an welchen Stellen und mit welcher Stärke die Oberfläche mit Aminen belegt ist möglich.

Ebenso läßt sich so bei Untersuchung eines Querschnitts die Ein- dringtiefe der Amine feststellen.

Dieses Färbeverfahren bietet daneben auch die Möglichkeit durch vorheriges Erstellen einer Eichgerade, auch quantitative Aussagen über die Menge des adsorbierten Amins zu machen. Dies ist beson- ders bei der Produktentwicklung von Aminen sowie beim Herstellen neuer Formulierungen mit solchen Aminen eine einfachere, schnel- lere Untersuchungsmethode im Vergleich zu den herkömmlichen Ver- fahren.

Weiterhin ermöglicht die erfindungsgemäße Verwendung der Fluores- zenzfarbstoffe die parallele Bestimmung der Adsorption einer Gruppe von Amino-und/oder Iminogruppe tragenden Verbindungen an der zu untersuchenden Oberfläche und kann zur Auswahl von Aminen mit gutem Adsorptionsverhalten genutzt werden.

So ist es auf einfache Weise möglich, verschiedene. Oligo-und Polyamine gleichzeitig zu testen, indem sie auf einer Probenober- fläche als definierte Menge auf verschiedenen Feldern aufgetragen werden und die Oberfläche anschließend mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt wird. Nach Entfernen des nichtgebundenen Farbstoffs ermöglicht die anschließende quantitative Auswertung der einzel- nen Flecken mittels Fluoreszenzmikroskopie den Vergleich des Ad- sorptionsverhaltens der untersuchten Amine. Die hohe Empfindlich- keit der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine miniaturisierte Probe und damit die parallele Untersuchung einer großen Anzahl von Verbindungen hinsichtlich ihres Adsorptionsverhaltens.

Ferner ermöglicht diese Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, das Adsorptionsverhalten von Aminen auf Schichtsilikaten zu untersuchen, was eine große Rolle bei der Bewertung der Eliminierbarkeit von Aminen in der Umweltanalytik spielt.

Ein wichtiger Vorteil der Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe ist darin zu sehen, daß eine qualitative und quantitative Aussage über die adsorbierten Oligo-und Polyamine möglich ist, ohne daß durch eine vor der Adsorption vorgenommene Modifizierung der Adsorptionsprozeß beeinflußt wird.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Aminnachweis auf Leder : Eine Ampulle Cy5 (ca. 0,127 mg ; Fa. Amersham), eines Fluoreszenzfarbstoffs der Formel wurde in 200 ml destilliertem Wasser gelöst (Lösung 1).

Färbevorschrift : 1 ml der Fluoreszenzfarbstofflösung wurde auf das Lederstück auf- gebracht. Nach 1 Minute wurde das Substrat in eine Spülvorrich- tung gebracht, in der es von einem laminaren Strom aus destil- liertem Wasser umspült wurde. Das Lederstück wurde 5 min gespült und dann herausgenommen.

Probenpräparation : a) Polyethylenimin (Molmasse ca. 10000g/mol) wurde in einer Konzentration von lOg/1 in destilliertem Wasser gelöst, in einer Konzentration von ca. 0,02 mg/g auf ein Stück Narbenleder gegeben und unter fließendem Wasser abgespült (Probe 1). b) Ein zweites Stück Narbenleder wurde ohne Behandlung mit Polyethylenimin mit dem Fluoreszenzfarbstoff gemäß der Färbe- vorschrift angefärbt (Probe 2). c) Ein drittes Narbenlederstück wurde mit Polyethylenimin wie unter a) beschrieben behandelt und nachträglich gemäß der Färbevorschrift angefärbt (Probe 3).

Messung und Analyse : Von allen drei Proben wurde wurde die Fluoreszenzintensität gemessen. Die Messungen wurden in einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog (D II) nach Anregung bei 620 nm durchgeführt. Durch Subtraktion der Fluoreszenzsignale der Probe 1 (Eigenfluoreszenz des Polyethylenimins) und der Probe 2 (Eigenanfärbbarkeit des Leders) von dem Signal der Probe 3 ließ sich die Belegung der Oberfläche bestimmen.

Beispiel 2 Aminnachweis an Polyestergewebe Probenpräparation : a) Ein teilweise quaterniertes Polypiperazin-Kondensat (Molmasse ca. 30000g/mol) wurde in einer Konzentration von lOg/1 in destilliertem Wasser gelöst und in verschiedener Konzen- tration von 0,01 bis 0,05 mg Polypiperazin/g Gewebe auf Poly- estergewebe gegeben und unter fließendem Wasser abgespült.

Danach wurde gemäß der Färbevorschrift des Beispiels 1 ange- färbt (Probe 4). b) Ein Stück Polyestergewebe wurde direkt ohne Behandlung mit dem Polypiperazin-Kondensat wie in Beispiel 1 beschrieben angefärbt (Probe 5).

c) Ein Stück Polyestergewebe wurde mit 0,05 mg Polypiperazin/g Gewebe behandelt (Probe 6). Die Probe zeigte keine erhöhte Fluoreszenz.

Die Fluoreszenzintensitäten der Proben 4,5 und 6 wurden bestimmt. Die Messungen wurden in einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX FluorologX II) nach Anregung bei 620 nm durchgeführt. Mit Probe 5 wurde die Eigenfluoreszenz des Gewebes, die Grundlinie, ermittelt, die durch nicht angefärbtes Piperazin-Kondensat unverändert blieb (Probe 6). Die nach obiger Methode mit unter- schiedlichen Konzentrationen Polymin belegten Stücke Polyester- gewebe wurden nun ebenfalls fluoreszenzoptisch untersucht. Die <BR> <BR> <BR> Adsorption des Piperazin-Kondensat konnt nach Abzug der Signale<BR> <BR> <BR> <BR> von Probe 5 und 6 durch eine verbleibendes Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensität korrelierte mit der angebotenen Menge quaterniertes Piperazin-Kondensat, ent- sprechend der Adsorptionsisotherme.

Beispiel 3 Aminnachweis auf Bentonit (Schichtsilikat) a) Färbevorschrift : 50 ml einer Suspension, die etwa 6 g Bentonit (mittlere Teil- chengröße 200 nm) enthält, wurden nach der Adsorption bei 15000 Umdrehungen/min 15 min zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde in 50 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt und erneut bei 15000 U/min 15 zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde erneut in destilliertem Wasser aufgenommen und mit 2 ml der in Beispiel 1 beschrieben Farbstofflösung versetzt. Die Probe wurde zentrifugiert, in 50 ml destilliertem Wasser aufge- schlämmt, zentrifugiert und auf eine Mikrotiterplatte auf- gebracht. b) Behandlung mit Polyethylenimin : 150 ml einer Suspension (Feststoffgehalt 2 gew. %) wurden mit 20 ml einer Polyethylenimin-Lösung (mittl. Molgewicht 10000 g/mol) (10 g/l) versetzt. Nach 20 min wurden 50 ml der Suspension bei 15000 U/min zentrifugiert und danach in Wasser aufgeschlämmt. Das zentrifugieren und in destilliertem Wasser aufnehmen wurde wiederholt, bevor die Anfärbung durchgeführt wurde.

Probenpräparation und Messung : Eine Bentonit-Suspension wurde wie unter b) beschrieben mit Poly- ethylenimin behandelt und wie unter unter beschrieben angefärbt. Die Fluoreszenzintensität wurde gemessen (Probe 7). Die Fluoreszenz wurde unter einem Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog II) nach Anregung bei 620 nm gemessen.

Eine Referenzprobe wurde unter identischen Bedingungen herge- stellt, aber ohne Polyethylenimin in Schritt b) (Probe 8). Die Fluoreszenzintensität dieser Probe wurde ebenfalls gemessen.

Zur Auswertung wurde das Signal der Referenzprobe 8 vom Signal der Probe 7 abgezogen. Die Adsorption von Polyethylenimin auf Bentonit konnte durch ein verbleibendes Fluoreszenzsignal nach- gewiesen werden.