LES APICOMPLEXES CHEZ UN ANIMAL L'invention concerne l'utilisation d'un additif alimentaire comprenant au moins un phytonutriment , pour stimuler l'immunité vaccinale contre les apicomplexes chez un animal monogastrique tel que la volaille ou le porc, ou chez un ruminant tel qu'un bovin, un ovin ou un caprin.

Arrière plan de l' invention

Les apicomplexes ou sporozoaires sont des organismes unicellulaires qui sont des parasites des vertébrés ou des invertébrés. Ces parasites peuvent provoquer des pathologies diverses.

Par exemple, la coccidiose, qui est une maladie intestinale provoquée par plusieurs espèces distinctes du protozoaire Eimeria, est une infection parasitaire importante économiquement pour l'industrie de la volaille dans le monde.

Celles-ci sont généralement traitées par des médicaments qui sont des antibiotiques de la catégorie des sulfamides. Cependant, l'utilisation de cette chimio- prophylaxie n'est pas sans inconvénient, à cause notamment de l'émergence de souches d' Eimeria résistantes aux médicaments et de l'interaction compliquée entre les parasites de la coccidiose et les infections clostridiales . De plus, la réglementation sur les médicaments devient de plus en plus importante dans la production animale.

En raison de la complexité de l'immunité de l'hôte et du cycle de vie des parasites, il s'avère particulièrement difficile de mettre au point de nouvelles stratégies d' intervention ou de nouveaux vaccins contre les apicomplexes . Il n'existe pour l'heure aucun vaccin totalement efficace contre ces infections. La tendance actuelle est alors d'utiliser des vaccins à base de parasites vivants pour contrôler la coccidiose. Il y a dans le commerce, au niveau mondial, au moins dix vaccins de ce type. Tous ces vaccins recourent à des oocystes vivants pour produire une infection réelle destinée à déclencher une immunisation naturelle qui protège les volailles, .

Cette technique de vaccination a l'inconvénient majeur que les oocystes vivants ne peuvent être produits que par des poulets, ce qui demande beaucoup de travail et implique de nombreuses manipulations.

Une alternative à ce type de vaccins consiste à utiliser des vaccins de protéine recombinante contre la coccidiose, comme la profiline qui est une protéine immunogène d' Eimeria . Les vaccinations recombinantes en utilisant la profiline par immunisation sous-cutanée chez des poulets jeunes ou par immunisation d'embryons ont induit une certaine protection contre la coccidiose aviaire. Cependant, les vaccins de protéine ont une immunogénicité limitée et leur efficacité en tant que vaccin pour réduire les pertes de production dues à la coccidiose est moindre par rapport à celle des anti- coccidiostatiques traditionnels et au vaccin à base de d' oocystes vivants. Dans tous les cas, afin d'améliorer l'efficacité des vaccins diverses stratégies ont été examinées dont les adjuvants et les cytokines.

Des publications scientifiques récentes montrent les effets directs des phytonutriments dérivés de plantes sur les gènes impliqués dans l'immunité innée de l'hôte chez les volailles. Cependant, il existe de nombreux phytonutriments dans la nature et, pour ceux qui ont été étudiés, ils peuvent avoir des propriétés complètement différentes les uns des autres. Par exemple, parmi les phytonutriments utilisés dans la présente invention, on trouve :

- le carvacrol est l'un des composants les plus communs des huiles essentielles, il possède une activité antimicrobienne étendue, et il a été approuvé comme additif alimentaire sûr aux Etats-Unis d'Amérique et en Europe ;

le cinnamaldéhyde a montré une activité antifongique, anti-pyrétique, anti-oxydante, anti-microbienne et larvicide, en plus de moduler la différenciation des cellules T ;

- le piment {Capsicum spp) réduit les taux de cytokines pro-inflammatoires intestinales, il augmente la prise de poids et réduit la fécondité parasitaire chez les volailles infectées par E. acervulina ;

- les plantes du genre Curcuma, y compris C. longa, présentent des propriétés anti-oxydantes et antiinflammatoires, et les macrophages de poulet traités par des extraits de curcuma ont montré des taux accrus d'ARNm codant pour IL-6 et IFN-γ.

Une des nouvelles approches sans médicament qui n'a pas été testée jusqu'à présent est la stratégie combinée d'utiliser un vaccin avec une immuno-modulation alimentaire médiée par la nutrition, en particulier par des phytonutriments comme suppléments nutritionnels .

Exposé sommaire de l' invention

L'invention a pour objectif principal de lutter contre les apicomplexes présents dans l'organisme d'animaux, tels que les volailles ou les ruminants, tels que les bovins ou les caprins.

Les inventeurs ont découvert avec surprise qu' il était possible de mieux lutter contre les apicomplexes en stimulant l'immunité induite chez l'hôte après vaccination contre l'agent infectieux grâce à l'utilisation d'additifs alimentaires .

De plus, ces additifs alimentaires ont l'avantage d'être des phytonutriments connus et généralement faciles à trouver dans le commerce, tels que ceux appartenant à la classe des terpénoïdes.

De plus, la stimulation obtenue s'est révélée n'être pas toxique.

L'utilisation de ces suppléments nutritionnels s'est révélée être particulièrement efficace puisqu'elle procure des effets synergiques stimulant l'immunité induite par la vaccination .

En particulier, deux mélanges constitués de carvacrol / cinnamaldéhyde / capsicum (VAC) , et de curcuma / caspicum (MC) ont été testés avec succès et ont permis de montrer que les animaux traités par supplémentation en ces phytonutriments, en l'occurrence des volailles infectées par la coccidiose, avaient notamment une immunité nettement renforcée, des prises de poids supérieures et des taux en oocystes excrétés nettement réduits par rapport aux animaux non traités.

Par ailleurs, ces phytonutriments n'ont pas montré de toxicité, ni d'effets indésirables comme c'est souvent le cas pour les anti-parasitaires classiques d'origine médicamenteuse .

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention vont maintenant être décrits en détail dans l'exposé qui suit et qui est donné en référence aux figures annexées, dont voici les légendes :

- la figure 1 présente les effets des suppléments en phytonutriments alimentaires, VAC et MC, sur le poids corporel et l'excrétion d' oocystes chez les poulets d'élevage après infection à E. tenella. Les colonnes n'ayant pas en commun les mêmes lettres sont significativement différentes (P < 0,05) selon le test de Duncan . ;

- la figure 2 présente les effets des suppléments en phytonutriments alimentaires, VAC et MC, sur les réponses anticorps sériques à la profiline chez les poulets d'élevage infectés par E. tenella ;

- la figure 3 présente les effets des suppléments en phytonutriments alimentaires, VAC et MC, sur la prolifération des lymphocytes spléniques chez les poulets d'élevage infectés par E. tenella ;

- la figure 4 présente les effets des suppléments en phytonutriments alimentaires, VAC et MC, sur les taux de cytokines intestinales produites. Pour cela, le taux en ARNm est quantifié pour chacune des cytokines suivantes : IFN-γ dans Fig.4A , IL-6 dans Fig.4B , IL-17F dans Fig.4C , et TNSF15 dans Fig.4D , et ces taux sont normalisés par rapport au taux d'ARNm codant pour GAPDH.

Dans les figures 2, 3 et 4, chaque colonne représente la moyenne ± l'écart-type avec 4 réplications par traitement (N = 4 poulets/groupe). Les colonnes n'ayant pas en commun les mêmes lettres sont significativement différentes (P < 0,05) selon le test de Duncan.

Exposé détaillé de l' invention

La présente invention se rapporte à un additif alimentaire pour stimuler l'immunité vaccinale chez des animaux non-humains infectés par un sporozoaire Apicomplexa, comprenant au moins un phytonutriment .

L'expression « stimuler l'immunité vaccinale » signifie que les animaux sont vaccinés contre l'agent infectieux en prévention de la maladie liée à un pathogène apicomplexe.

Par le terme « phytonutriment », on entend tout composé bioréactif dérivé de plantes qui a des effets positifs sur la santé des animaux. Parmi les phytonutriments visés par la présente invention, on trouve en particulier ceux du groupe des terpénoïdes de plantes dont certains sont connus et utilisés en raison de leurs qualités aromatiques (comme les huiles essentielles), mais aussi pour leurs diverses propriétés antiseptique, anti-oxydante, anti-fongique, anti-microbienne et/ou larvicide.

Les inventeurs ont montré avec leurs travaux effectués sur plusieurs d'entre eux qu'ils pouvaient de façon surprenante amplifier la protection immunitaire contre les agents infectieux lorsqu'ils étaient utilisés conjointement avec une immunisation vaccinale.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la supplémentation est effectuée par l'ajout d'au moins un phytonutriment choisi parmi le carvacrol, le cinnamaldéhyde, le capsicum et le curcumin. Ces phytonutriments peuvent être utilisés seuls ou en association .

En tant que phytonutriments préférés selon l'invention, on peut citer en particulier l'association carvacrol / cinnamaldéhyde, ainsi que l'association curcuma / caspicum.

Comme capsicum, on utilise en général du piment {Capsicum annuum ou Capsicum frutescens) , habituellement sous forme d' oléorésine .

Les inventeurs de la présente invention ont montré lors de tests in vivo leurs effets synergiques par une stimulation de l'immunité protectrice après la vaccination contre l'agent infectieux, et ceci de façon surprenante étant donné leurs propriétés complètement différentes auparavant reconnues (mentionnées dans la partie « arrière plan de l'invention ») . Il en résultait que chez les hôtes ayant reçu la supplémentation comparativement à ceux qui ne l'avaient pas reçue, notamment une prise de poids bien supérieure, une réduction en oocystes excrétés, une augmentation de la réponse anticorps et des taux significativement réduits en plusieurs cytokines proinflammatoires, ce qui n'avait pas été montré dans l'art antérieur, ni même suggéré.

L'invention se rapporte également à un aliment pour animaux non-humains destiné à prévenir les maladies infectieuses liées au sporozoaire Apicomplexa comprenant, outre une ration alimentaire de préférence équilibrée, une supplémentation en au moins un phytonutriment .

Une ration alimentaire équilibrée consiste à fournir tous les nutriments dont les volailles (poussins, jeunes ou adultes) ont besoin au cours de leur croissance et engraissement, en termes de protéines, glucides, lipides mais aussi de vitamines et de minéraux. Généralement, elle est constituée par des farines de céréales, d'oléagineux et de protéagineux, auxquels des compléments comme des vitamines et oligoéléments peuvent être rajoutés.

Avantageusement, la supplémentation de la ration alimentaire est effectuée par au moins un phytonutriment choisi parmi le carvacrol, le cinnamaldéhyde, le capsicum et le curcumin, utilisés seul ou en association.

Encore plus avantageusement, elle est effectuée par l'association carvacrol / cinnamaldéhyde / capsicum, ou par l'association curcuma / caspicum.

Dans le cadre de l'invention, on utilisera les phytonutriments selon une concentration totale en phytonutriment (s) comprise entre 1 et 50 mg par kilogramme de ration alimentaire ou entre 0,5 et 20 mg par litre d'eau de boisson.

Selon l'invention, la supplémentation peut s'effectuer sous forme solide, c'est-à-dire par ajout dans la ration alimentaire, ou alors sous forme liquide par ajout dans l'eau de boisson. Avantageusement, l'aliment supplémenté pour animaux non-humains de l'invention se présente sous forme de poudre, de granules ou de comprimés.

Il est destiné préférentiellement aux volailles.

La vaccination est effectuée le plus tôt possible, de préférence dès le 1 ^er jour d'âge des animaux.

L'immunisation des hôtes, en particulier les volailles, est effectuée par vaccination. Le vaccin associé à la supplémentation en phytonutriments peut être issu de protéine recombinante. A titre d'exemple, le vaccin de protéine recombinante provient de la profiline qui est une protéine immunogène d'Eimeria et dont il a été montré préalablement qu'elle induit une protection significative contre la coccidiose aviaire et réduit la fécondité du parasite .

Le type de vaccin utilisé dans les exemples a servi de modèle. Cependant, à l'heure actuelle, ce n'est pas le type principal de vaccins disponible. Les vaccins majoritairement utilisés sont issus d' oocystes atténués.

D'autres types de vaccins sont aussi possibles selon l'invention. Des essais concluants ont été effectués avec une combinaison « vaccin vivant atténué » et des phytonutriments .

La vaccination des hôtes peut être réalisée par diverses voies d'inoculation (sous-cutanée, systémique etc..) mais la voie orale est bien évidemment celle privilégiée puisque non seulement elle permet de bons résultats en termes d' immunogénicité mais ainsi pour son côté pratique ; il suffit simplement d'ajouter la solution vaccinale dans l'eau de boisson, comme c'est couramment le cas dans les élevages.

Les vaccins peuvent aussi se présenter sous forme de gel qui est pulvérisé directement sur les animaux, par exemple les poussins, qui l'ingèrent par contact. L'additif alimentaire ou supplément nutritionnel de la présente invention ainsi que l'aliment ou l'eau de boisson le contenant convient à la prévention, chez les animaux non-humains, de maladies infectieuses liées aux sporozoaires appartenant au genre Apicomplexa, parmi lesquels on trouve notamment les agents des coccidioses (coccidies) ; de la toxoplasmose (toxoplasme) ; la cryptosporidiose (cryptosporidies) ; la malaria

(plasmodium) ; la néosporose (Neospora) .

L'invention s'applique tout particulièrement à la lutte contre la coccidiose, qui peut être causée par diverses espèces d' Eimeria dont celles qui affectent le poulet / la poule pondeuse (E. tenella , E. acervulina , E. brunetti , E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox) ; celles qui affectent la dinde (E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. dispersa, E. gallopavonis) ; celles qui affectent l'oie (E. truncata , E. anseris) ; celles qui affectent le canard (E. tyzzeria perniciosa , E. mulardi) ; celles qui affectent la pintade (E. numidia , E. grenieri) ; ou celle qui affecte le pigeon (E. labbeana) .

L'invention s'applique aux animaux non-humains qui sont concernés par ces maladies liées aux apicomplexes et pour lesquels une immunisation vaccinale contre ces agents infectieux existe.

Ces animaux peuvent être des monogastriques tel que la volaille, le porc ou le lapin, ou chez un ruminant tel qu'un bovin, un ovin ou un caprin.

Elle s'applique en particulier aux volailles.

Parmi les volailles, on peut citer de préférence le poulet / la poule pondeuse, mais aussi la dinde, l'oie, le canard, la pintade, la caille, le faisant et le pigeon. Ce sont des animaux d'élevage destinés à l'alimentation humaine qui peuvent être maintenus dans des cages disposées en batteries ou au sol, dans des poulaillers ou vivant en plein air ou en liberté. L'important est de pouvoir leur fournir quotidiennement de la nourriture supplémentée en phytonutriments ; ces animaux ayant reçu une vaccination immunitaire contre les sporozoaires mentionnés ci-dessus.

Exemples

On a comparé deux mélanges différents de phytonutriments provenant de plantes en tant qu'additifs alimentaires afin de stimuler une réponse vaccinale de l'hôte lors d'une vaccination antigénique recombinante : VAC est composé de 5 mg de carvacrol, 3 mg de cinnamaldéhyde et 2 mg d'oléorésine de capsicum par kg de ration alimentaire, alors que MC est composé de 4 mg d'oléorésine de curcuma et 4 mg d'oléorésine de capsicum par kg de ration alimentaire.

L'effet synergique de la supplémentation alimentaire en VAC et en MC sur l'immunisation par la profiline contre la coccidiose aviaire a été évalué en examinant le poids corporel, l'excrétion d' oocystes fécaux, les sous- populations de splénocytes et les taux en cytokines.

Les abréviations utilisées dans le texte sont les suivantes :

EO = phytonutriments ;

CON = animaux témoins, c'est-à-dire non infectés, non vaccinés, non nourris avec des extraits de plantes ;

CON infectés par Eimeria tenella = animaux n'ayant pas eu de vaccination, non nourris avec des phytonutriments mais infectés par Eimeria tenella ; CON-V infectés par Eimeria tenella = animaux ayant eu une vaccination, non nourris avec des phytonutriments mais infectés par Eimeria tenella ; CON-VAC-V infectés par Eimeria tenella = animaux ayant eu une vaccination, nourris avec du carvacrol, du cinnamaldéhyde et de l'oléorésine de capsicum et infectés par Eimeria tenella ;

CON-MC-V infectés par Eimeria tenella = animaux ayant eu une vaccination, nourris avec des oléorésines de curcuma et de capsicum et infectés par Eimeria tenella.

Expérimentation animale et rations alimentaires

Toute l'expérimentation a été approuvée par Agriculture Research Service Institutional Animal Care de l'USDA et par le comité d'utilisation (ARS IACUC) . Des jeunes poulets âgés d'un jour (Ross/Ross, couvoir de Longenecker, Elizabethtown, PA) ont été placés dans des couveuses de type Petersime et répartis de façon aléatoire dans 4 groupes (12 poulets/groupe). Ils avaient libre accès à une ration alimentaire standard (CON et CON-V) ou à des rations alimentaires standards supplémentées par du VAC ou du MC pendant 27 jours après éclosion.

Les poulets étaient maintenus dans un environnement thermiquement contrôlé (29°C) . Toutes les rations alimentaires contenaient 24,2% de protéine brute, 54,0% de glucides, 15% d'un mélange de vitamines et de minéraux, 4,7% de graisses et 2,4% de fibres (USDA/FeedMill , Beltsville, MD) .

Les poulets des groupes vaccinés ont été immunisés par de la profiline (CON-V, VAC-V, MC-V) à l'âge de 7 jours, les animaux ont été infectés par des coccidies à l'âge de 17 jours par inoculation par voie orale de 2,0 x 10 ⁴ oocystes sporulés d' Eimeria tenella tel que précédemment décrit dans la littérature. Les poulets étaient au préalable élevés dans des installations dépourvues d' Eimeria pendant 2 semaines puis transférés dans des cages (2 poulets/cage) et maintenus jusqu'à la fin de la période expérimentale dans des lieux séparés de ceux dans lesquels ils avaient été infectés.

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel SPSS® (SPSS 15.0 pour Windows®, Chigaco, IL) et toutes les données ont été exprimées en moyennes ± écart-type moyen. Les comparaisons des valeurs moyennes ont été réalisées par l'analyse de la variance à un facteur, suivie par le test de signification de l'étendue multiple de Duncan, et les différences ont été considérées statistiquement significatives à P < 0,05.

Exemple 1 : Effet de la supplémentation en VAC et MC sur le poids corporel

Méthode

Le poids corporel a été mesuré aux Jour 0 et 9 après infection (DPI) . Pour le dosage des oocystes fécaux excrétés, les poulets ont été placés dans des cages spéciales pour collecter les oocystes (2 poulets/cage, 12 poulets/groupe) et des échantillons fécaux ont été collectés du jour 5 au jour 9 après infection.

Résul ta ts

L'alimentation des poulets d'élevage avec une ration supplémentée en VAC et en MC ne présentait aucun effet toxique chez l'hôte d'après les modifications de poids corporel et autres caractéristiques physiques aux doses utilisées lors de cet essai. Au cours des 17 premiers jours après éclosion, les poulets qui avaient reçu les rations supplémentées n' ont pas montré de changement au niveau de leur poids corporel, comparativement à ceux qui avaient reçu la ration standard seule. Après infection avec E. tenella (Jour 10 après infection) , cependant, les poulets immunisés par le vaccin contre la profiline (CON-V, VAC-V, MC-V) présentaient des poids corporels plus élevés de 8 à 21% par rapport aux témoins infectés qui avaient reçu la ration non supplémentée (CON, Figure 1A) . Par rapport au groupe CON, une différence significative a été observée seulement dans les groupes VAC-V et MC-V vaccinés par la profiline et supplémentés en phytonutriments , qui ont montré des poids corporels plus élevés respectivement de 20% et de 21%. Ces résultats démontrent clairement les effets synergiques de la supplémentation nutritionnelle en phytonutriments sur la vaccination par la profiline contre la coccidiose aviaire chez les jeunes poulets d'élevage.

Exemple 2 : Effet de la supplémentation en VAC et MC sur l' excrétiond' oocystes fécaux

Méthodes

Les nombres d' oocystes ont été déterminés tel que précédemment décrit dans la littérature en utilisant une cellule de Mac Master et selon la formule suivante : oocystes totaux / poulet = [nombre d' oocystes x facteur de dilution x (volume de l'échantillon fécal / volume de la cellule de comptage)] / 2.

Résultats

Comme on peut le voir sur la figure 1B, l'excrétion d' oocystes fécaux a été réduite de façon significative de 31 à 51% dans les groupes immunisés contre la profiline et supplémentés en phytonutriments. Les oocystes excrétés totaux ont été de 4, 9 x 10 ⁷ , 4, 6 x 10 ⁷ et 3,7 x 10 ⁷ / poulet, respectivement dans les groupes CON-V, VAC-V et MC-V comparativement au groupe de la ration standard CON qui a produit 9,5 x 10 ⁷ oocystes / poulet. Aucun oocyste n'a été détecté chez les poulets témoins non infectés. Ces résultats ont montré que la supplémentation en phytonutriments chez les jeunes poulets stimule la réponse immunitaire vaccinale protectrice de l'hôte contre Eïmeria tennella . Exemple 3 : Effet de la supplémentation en VAC et MC sur les réponses anticorps à la profiline

Méthodes

Des échantillons sanguins (4 poulets/groupe) ont été collectés par ponction cardiaque immédiatement après euthanasie au Jour 10 après infection, les sérums ont été obtenus par centrifugation et ont été analysés par ELISA afin de mesurer les réponses anticorps spécifiques à la profiline tel que décrit précédemment dans la littérature. Succinctement, des plaques de microtitration à 96 puits ont été recouvertes toute la nuit par 1,0 g/puits d'une profiline recombinante purifiée. Les plaques ont été rincées avec du tampon salin phosphate contenant 0,05% de Tween® (PBS-T) et bloquées par du PBS contenant 1% de BSA. Les sérums dilués (1 :50) ont été ajoutés (100 μΐ/puits) , incubés sous agitation pendant 2 heures à température ambiante et rincés avec du PBS-T. Les anticorps liés ont été détectés à l'aide de IgGs anti-poulet de lapin conjuguées à la péroxydase et du substrat 3, 3', 5,5'- tétraméthylbenzidine (Sigma®, St Louis, MO) . La densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm (DO 450) par un lecteur de microplaques automatisé (Bio-Rad®, Richmond, CA) . Tous les échantillons ont été analysés en quatre exemplaires.

Résul tats

Au Jour 10 après infection, les taux d'anticorps sériques ont augmenté dans les groupes vaccinés par la profiline (de 0,61 ± 0,03 à 1,36 ± 0,04) comparativement au groupe CON non-vacciné (0,35 ± 0,03), et une différence significative par rapport à CON-V a été trouvée dans les groupes VAC-V et MC-V qui ont présenté une DO respectivement de 0,71 ± 0,02 et 1,36 ± 0,04 après vaccination par le vaccin contre la profiline (Figure 2). Le groupe MC-V a présenté la valeur la plus élevée.

Exemple 4 : Effet de la supplémentation en VAC et MC sur la prolifération des lymphocytes spléniques

Méthodes

Au Jour 10 après infection, les poulets (4 poulets/groupe) ont été euthanasiés par dislocation cervicale, les rates ont été prélevées et placées dans des boites de Pétri avec 10 ml de solution saline équilibrée de Hank supplémentée par 100 U/ml de pénicilline et 100 μς/πιΐ de spectromycine (Sigma®, St Louis, MO) . Les suspensions cellulaires ont été préparées par un rinçage délicat sur tamis cellulaire et les lymphocytes ont été purifiés par centrifugation en gradient de densité sur une Histopaque- 1077 (Sigma®) . Le nombre de cellules a été ajusté à une concentration de 5,0 x 10 ⁶ cellules/ml ; celles-ci ont été placées dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum bovin fœtal, 100 U/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine et incubées dans 20 μς/πιΐ de profiline dans des plaques de 96 puits dans un incubateur humidifié (Forma, Marietta, OH) à 41°C et 5% de C0 ₂ pendant 24 heures. La prolifération cellulaire a été mesurée à l'aide du kit de comptage cellulaire WST-8® (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD) à 450 nm en utilisant un spectrophotomètre à microplaques (BioRad®, Hercules, CA) tel que décrit précédemment dans la littérature. La prolifération lymphocytaire a été exprimée comme index de stimulation qui est le rapport de la valeur moyenne de la DO du groupe stimulé par la profiline divisée par la valeur moyenne de la DO du groupe stimulé seulement par le milieu CON. Résultats

La réponse proliférative lymphocytaire des splénocytes provoquée par l'antigène telle qu'exprimée par l'index de stimulation a été augmentée dans les groupes vaccinés par la profiline (de 1,05 ± 0,05 à 1,21 ± 0,11) comparativement au groupe CON non immunisé (0,87 ± 0,01) au Jour 10 après infection (Figure 3) . Le groupe MC-V a présenté la valeur la plus élevée.

Exemple 5 ; Effet de la supplémentation en VAC et MC sur la production de cytokines

Méthodes

Des amygdales caecales ont été obtenues à partir de poulets non-infectés et infectés qui étaient nourris avec des rations alimentaires témoins (CON-V) et supplémentées en phytonutriments (VAC et MC-V) aux Jours 0 et Jour 6 après infection (4 poulets/groupe), et l'expression de leurs gènes codant pour les cytokines a été déterminée en utilisant le RTQ-PCR tel que précédemment décrit dans la littérature. Les intestins ont été prélevés, coupés en longueur, et lavés trois fois avec de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) glacée contenant 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. La couche mucosale a été éliminée par grattage minutieux en utilisant un scalpel chirurgical et le tissu a été lavé par du HBSS. A partir de la couche mucosale, les ARNs totaux ont été extraits en utilisant du TRIzol® ( Invitrogen®, Carlsbad, CA) . Cinq microgrammes d'ARNs totaux ont été traités par 1,0 U de DNAse I et 1,0 μΐ de tampon de réaction 10X (Sigma®) et incubés pendant 15 minutes à température ambiante. Après incubation, 1,0 μg de solution d'arrêt a été ajouté pour inactiver la DNAse I et le mélange a été chauffé à 70 °C pendant 10 minutes. L'ARN a subi une transcription inverse en utilisant le système de synthèse du 1 ^er brin StrataScript® (Statagene®, La Jolla, CA) selon les recommandations du fabricant. Les amorces d'oligonucléotide de RT-PCT pour les cytokines de poulet et le contrôle interne de la GAPDH sont indiquées dans le tableau ci-après.

L'amplification et la détection ont été réalisées en utilisant des quantités équivalentes d'ARN totaux grâce au système Mx3000P et le mélange Brilliant SYBR Green qPCR (Stratagene®) . Les courbes standards ont été générées en utilisant de l'ARN standard dilué au log de 10. Les taux de transcrits individuels ont été alors normalisés à ceux de la GAPDH et analysés par le programme Q-gene®. Chaque analyse a été réalisée en trois exemplaires. Pour normaliser les réplicas individuels, les valeurs du seuil de cycle (Ct) à l'échelle logarithmique ont été transformées en unités linéaires d'expression normalisée préalablement aux moyens de calculs et à l'ETM (erreur type sur la moyenne) pour les références et les cibles individuelles, suivi par la détermination de l'expression normalisée moyenne (ENM) en utilisant le programme Q-gene® tel que décrit dans l'art antérieur. Résultats

La Figure 4 démontre l'effet de la supplémentation de la ration alimentaire en VAC et en MC sur la production de cytokines caecales après immunisation par le vaccin à la profiline. Les groupes vaccinés par la profiline ayant reçus une alimentation avec du VAC et du MC ont montré dans l'ensemble une réduction des cytokines pro-inflammatoires IFN-γ, IL-6, IL-17F, et TNFSF15 dans le caeca comparativement au groupe CON non-vacciné (P < 0,05). Les taux en cytokines IFN-γ, IL-17F, et TNFSF15 caecales ont augmenté après infection de défi orale par l'E. tenella par rapport à leurs valeurs d'avant infection. Il est intéressant de noter que les taux en IFN-γ et IL-6 dans le groupe vacciné par la profiline et nourri avec l'alimentation supplémentée en MC ont été augmentés de façon significative comparativement au groupe CON-V au Jour 6 après infection. Le taux en IL-17F intestinale a diminué de façon significative dans les groupes VAC-V et MC-V alors que le taux en TNFSF15 a diminué de façon significative dans le groupe VAC-V comparativement au groupe CON-V.

Ces résultats ont montré que les mélanges en phytonutriments VAC et MC fonctionnent en synergie avec le vaccin de la profiline de sorte à impacter de façon significative les taux en cytokines locales produites. Exemple 6 : Effet de la supplémentation en VAC et MC sur les sous-populations de lymphocytes sanguins périphériques

Méthodes

Au Jour 10 après infection, les poulets ont été tués par dislocation cervicale et saignés par ponction cardiaque en utilisant une seringue héparinée. Les suspensions de cellules individuelles de lymphocytes sanguins périphériques (LSP) ont été préparées tel que décrit précédemment dans la littérature, mises en suspension dans du HBSS sans rouge de phénol supplémenté par 3% de sérum bovin fœtal (Thermo Scientific HyClone®, Logan, Utah) et 0,01% d'azoture sodique (tampon FCA) , et leur nombre a été ajusté à une concentration de lxl0 ⁷ /ml dans du tampon FCA. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes dans de la glace avec des anticorps monoclonaux de souris (mAbs) spécifiques du complexe majeur d' histocompatibilité (CMH) de classe II, des CD4, des CD8, des Kl, du récepteur 1 des cellules T (TCR1), ou du récepteur 2 des cellules T (TCR2) de poulet. En tant que témoin négatif, HB2, un anticorps spécifique des cellules T humaines (American Type Culture Collection, ARS-USDA) a été inclus et un anticorps contre C6B12, un antigène du CMH de classe 1 de poulet, a été utilisé comme témoin positif. Après incubation, les cellules ont été rincées trois fois avec du tampon FCA et incubées avec 100 μΐ d'anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre marqués par isothiocyanate de fluorescéine (Sigma®) pendant 45 minutes sur de la glace. Les cellules ont été rincées trois fois avec du tampon FCA et la fluorescence a alors été analysée sur 1 x 10 ⁴ cellules viables en utilisant un FACSCalibur® (BD Science, Boston) . Résultats

Les pourcentages des sous-populations de lymphocytes sanguins périphériques chez les poulets d'élevage sont reportés dans le tableau ci-après.

Dans le groupe vacciné par la profiline ayant reçu la ration alimentaire supplémentée en MC, les pourcentages des lymphocytes T exprimant le CMH de classe II, les CD4, les CD8, les TCR1 et les TCR2 étaient augmentés de façon significative comparativement à ceux des groupes CON-V et CON-VAC-V au Jour 10 après infection ; la plupart des valeurs étant le double de celles des groupes CON-V et CON- MC-V. Par contraste, le pourcentage de cellules exprimant un marqueur Klde macrophage, était accru de façon significative dans le groupe CON-VAC-V comparativement à celui des groupes CON-V et CON-VAC-V au Jour 10 après infection .