La présente invention concerne le domaine du diagnostic, de la prévention et du traitement de l'obésité de la perte de poids, associé ou non à des désordres hormonaux et également au diabète chez l'homme ou l'animal.

L'invention vise plus particulièrement à offrir une nouvelle méthode de criblage de composés utiles pour traiter ou prévenir l'obésité ou la perte de poids, ou le diabète chez un sujet humain ou animal, basée sur l'utilisation des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP et le trafic des protéines codées par ces gènes, respectivement l'endospanine et OB-RGRP.

On a décrit dans l'art antérieur une famille de petites protéines hydrophobes dont les représentants humain et murin appelés OB-RGRP (leptin receptor gene related protein) proviennent d'un épissage alternatif au niveau du locus du récepteur de la leptine (OB-R), mais qui ne présentent pas de similarité de séquence avec les isoformes d'OB-R et dont la fonction n'a pas été élucidée (Bailleul, B. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25,2752-2758). Il a également été rapporté l'existence d'une protéine, nommée l'endospanine, très homologue à OB-RGRP, codée par le gène LEPROTL1 (leptin receptor overlapping transcript-like 1) (Huang, Y. et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1517,327- 331). Au niveau cellulaire, ces protéines à quatre domaines transmembranaires sont localisées dans des domaines membranaires riches en cholestérol et glyco-sphingolipides (les rafts) (Séron, K et al. ; poster de congrès). Ces protéines sont exprimées dans un grand nombre de tissus et notamment dans la plupart des tissus périphériques.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de suggérer le rôle d'OB-RGRP et de

l'endospanine sur l'expression d'OB-R à la surface des cellules. Ainsi, l'étude de l'expression des gènes codant ces protéines montre une co-expression de ces deux gènes, en particulier dans les cellules d'organes exprimant OB-R (Mercer, J. et al., 2000, J. Neuroendocrinolo, 12, 649-655) o Il a en outre maintenant été mis en évidence que le gène codant l'endospanine participe au trafic intracellulaire d'OB-R et ainsi régule le taux d'OB-R au niveau de la membrane externe de la cellule. Ces gènes jouent donc probablement un rôle sur la sensibilité de la cellule à la leptine et leur régulation permet de définir une nouvelle stratégie pharmacologique pour intervenir sur la sensibilité à la leptine par l'augmentation ou la réduction de l'expression d'OB-R au niveau de la membrane des cellules et de traiter ou prévenir la perte ou prise de poids par les individus humains ou animaux.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention permettent également maintenant d'expliquer le dimorphisme sexuel, au niveau du taux de masse graisseuse et du taux de leptine circulante. Il a en outre maintenant été mis en évidence que LEPROTL1 et OB-RGRP sont régulés par certaines hormones sexuelles. Plus particulièrement, une régulation hormonale de ces deux gènes permet de rendre compte du polymorphisme sexuel et des variations durant la vie de la femme, du taux de leptine circulant et donc de la répartition et de la prise de masse adipeuse.

La présente invention a donc pour objet une méthode d'identification de composés actifs sur la prise ou perte de poids ou le diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer l'effet de ces composés sur (a) l'expression de l'un au moins des gènes LEP. ROTU et OU-REAP ou partie de ceux-ci et/ou (b) le transport intracellulaire <BR> <BR> <BR> <BR> ju5gu'à la membrane cellulaire ettou (c) la presence au niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d)

l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci.

En effet, l'étude du trafic intracellulaire de l'endospanine, a permis de montrer que cette protéine passe à la surface cellulaire et est ensuite endocytosée puis dégradée dans les lysosomes. Il est probable que OB-RGRP participe au même trafic intracellulaire.

Plus particulièrement la méthode de l'invention comprend (i) la mise en contact d'un composé à tester avec des cellules exprimant l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou fragments de ceux-ci, puis (ii) la mesure de la quantité de protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci présente au niveau de la membrane desdites cellules et/ou leur internalisation.

Avantageusement, l'endospanine et/ou OB-RGRP ou partie de celles-ci sont marquées de façon à pouvoir être détectées et ainsi réaliser la mesure de la méthode de l'invention.

Tout type de marquage peut être envisagé dans le cadre de la méthode de l'invention, mais on préfère un marquage de type tag peptidique.

La méthode de l'invention peut être mise en oeuvre in vitro sur un modèle de cellules en culture ou in vivo dans un modèle animal.

La méthode de l'invention peut comprendre également la mesure de l'expression et/ou du transport avantageusement jusqu'à la surface de la membrane des cellules d'OB-R, ou encore dans le cas d'un modèle animal, la mesure de la leptine circulante.

Les modèles cellulaires ou animaux mis en oeuvre dans le cadre de la méthode de l'invention peuvent être du type soit exprimant LEPROTL a et/ou OB-RGAP ou fragments de ceux- ci de façon endogène soit génétiquement modifié pour <BR> <BR> <BR> <BR> exprimer lesdits LEPROTH et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci sous la forme de protéines recombinantes.

A titre d'exemple de modèles cellulaires exprimant naturellement LEPROTL1 et/ou OB-RGRP on peut citer un modèle humain comme Hela, 293 ou HepG2 ou murin comme 3T3, des cultures primaires pourraient également être utilisées. Tout type de cellules peut être utilisé car la plupart des lignées et tissus expriment l'endospanine et OB-RGRP.

A titre d'exemple de modèles animaux exprimant naturellement LEP. ROTH et/ou OB-RG. RP on peut citer la souris, le rat et le lapin.

On préfère toutefois, une mise en oeuvre de l'invention sur des cellules transformées pour exprimer tout ou partie de l'un ou moins des gènes, LEPROTL1 et/ou OB-RGRP. Il s'agit avantageusement de cellules en culture, mais l'invention peut être aussi mise en oeuvre sur des animaux obtenus par transgénèse selon des techniques décrites dans la littérature à partir de LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci.

On préfère pour la mise en oeuvre de l'invention des cellules en culture qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer l'un au moins de LEPROTL1 et/ou OB-RGRP ou fragments de ceux-ci.

Les séquences de l'ADNc de LEPROTL1 humain et de l'endospanine humaine et de souris sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO. 3.

Les séquences de l'ADNc d'OB-RGRP humain et de la protéine humaine et murine sont données dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6.

Ces cellules génétiquement modifiées sont préparées par des techniques bien connues de l'homme du métier mettant en oeuvre des vecteurs d'expression.

Il peut, bien entendu, s'agir des formes humaines, murines, ou de toutes autres espèces dès lors que ceux-ci

présentent avantageusement au moins 80% d'homologie avec LEPROTL1 et OB-RGRP humains.

Il peut aussi s'agir de fragments ou de séquences modifiées par l'addition, la délétion ou le changement d'un ou plusieurs nucléotides, de ces gènes dès lors que la protéine codée par ses fragments ou séquences modifiées peut être transportée jusqu'à la membrane de la cellule et avantageusement être ensuite internalisée.

Une forme préférée de l'invention consiste à exprimer une forme modifiée de LEPROTL1, OB-RGRP ou fragments de ceux-ci de façon à produire des protéines marquées. Le marquage consiste avantageusement en un tag peptidique. On entend aussi par forme modifiée de ces gènes, des gènes codant pour des protéines tronquées, c'est-à-dire présentant une délétion d'un ou plusieurs acides aminés, utile notamment pour le marquage peptidique.

Comme indiqué précédemment l'endospanine et/ou OB- RGRP comprennent quatre domaines transmembranaires. Ainsi, à titre d'exemple préféré, un fragment et une forme modifiée de LEPROTL1 ou OB-RGRP code pour une protéine modifiée comprenant au moins deux des quatre domaines transmembranaires et un marqueur peptidique sous la forme de protéines de fusion.

Le marqueur de l'endospanine et/ou d'OB-RGRP ou fragments de celles-ci peut être identique ou différent. A titre d'exemple de marqueurs peptidiques généralement utilisés, on peut citer : HA de séquence YPYDVPDYA (SEQ ID NO. 7) c-myc : séquence EQKLISEEDL (SEQ ID NO. 8) VSV-G : séquence YTDIEMNRLGK (SEQ ID NO. 9) His6 : séquence HHHHHH (SEQ ID NO. 10) FLAG AG séquence DYKDDDDK (SEQ ID N0. 11)

L'insertion d'un marqueur peptidique dans la protéine complète peut s'effectuer à tout niveau de la protéine ou fragment de celle-ci dès lors qu'il ne modifie pas l'expression de la protéine à la membrane de la cellule et avantageusement également son internalisation.

Ainsi dans le cas de l'endospanine et d'OB-RGRP, on peut citer les sites entre les acides aminés des positions 25 à 35 et des positions 82 à 100 de SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO. 5, c'est-à-dire les deux boucles extracellulaires.

L'extension en N ou C terminal par un marqueur peptidique sur une protéine tronquée est également possible en s'assurant que la délétion positionne l'extrémité terminale et le marqueur en position lumenale/extracellulaire.

Le cadre de lecture devra être intégré dans un vecteur d'expression de type, plasmide (pCI/pCIneo, Promega, pcDNA3, Invitrogen) ou virus (adéno, rétro, vaccine) pour des expressions soit transitoire ou stable.

Comme indiqué précédemment, l'endospanine et/ou OB- RGRP ou partie de celles-ci peuvent être marquées et l'on préfère un marquage de type tag peptidique. La mesure peut s'effectuer alors à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur peptidique, intégré par exemple dans l'une des deux boucles lumenales/extracellulaires de l'endospanine, OB-RGRP ou fragments de celles-ci ou en prolongation de ces boucles dans les formes tronquées des protéines, par mise en contact de l'anticorps avec les cellules.

La méthode de l'invention peut également être mise en oeuvre sur de l'endospanine et/ou OB-RGRP non marquées. Des anticorps dirigés contre l'une des deux boucles lumenale/extracellulaire de l'endospanine ou d'OB-RGRP permettent de détecter la protéine endogène par mise en contact avec les cellules.

A titre d'exemple, la position des polypeptides pour l'obtention de ces anticorps spécifiques, de préférence

monoclonaux, pour identifier l'endospanine et OB-RGRP endogènes au niveau membranaire se situent entre les acides aminés en positions 25 à 35 et les acides aminés en positions 82 à 100 de SEQ ID NO 2 et SEQ ID NO. 5.

La mesure peut alors comprendre la mise en oeuvre d'un anticorps secondaire selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

On peut citer plusieurs techniques de l'art antérieur pour quantifier les protéines susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention : - ELISA : secondaire couplé à la peroxydase, à la phosphatase alcaline ou à une autre enzyme, réaction colorée quantifiable et automatisable, - le Western Blot, - le comptage radioactif (Iode), -l'immunofluorescence : anticorps secondaire fluorescent utile pour une mesure de la morphologie.

D'autres techniques de mesures peuvent être mises en oeuvre, comme par exemple : - biotinylation de surface et streptavidine, - iodination de surface et immuno-précipitation L'effet du composé à tester selon la méthode de l'invention peut être réalisé par comparaison des mesures sur des cellules avec et sans la mise en contact avec ledit composé. Cet effet peut être mesuré après ou pendant un temps déterminé de mise en contact des cellules avec ledit composé.

La spécificité du composé à tester vis-à-vis de a) ltexpression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OBt P et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire des protéines et/ou (d) l'internalisation depuis

la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci peut être déterminé en mesurant l'effet du traitement sur d'autres gènes ou protéines.

Ainsi, selon la méthode de l'invention Méthode, l'effet du composé à tester sur le trafic intracellulaire de l'endospanine et/ou OB-RGRP est aussi mesuré à l'aide d'un anticorps dirigé contre une quelconque protéine membranaire de surface, une partie ou un marqueur de celles-ci.

On peut citer à titre d'exemple préféré le récepteur à la transferine.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de la prise ou perte de poids ou du diabète comprenant au moins un composé capable de modifier l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci. Un tel composé est avantageusement un antagoniste ou un agoniste de l'une au moins des protéines endospanine et OB-RGRP.

L'invention concerne aussi le diagnostic de la prise ou perte de poids ou du diabète chez un sujet humain ou animal consistant à mesurer et avantageusement à comparer avec au moins un témoins, l'expression de l'un au moins des gènes LEPROTL1 et OB-RGRP ou partie de ceux-ci, et/ou (b) le transport intracellulaire jusqu'à la membrane cellulaire, et/ou (c) la présence au niveau de la membrane cellulaire, et/ou (d) l'internalisation depuis la membrane, des protéines codées par l'un au moins desdits gènes ou partie de ceux-ci

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, où il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente la séquence de l'ADNc du gène LEPROTL1 où le cadre de lecture est souligné.

La figure 2 représente l'alignement des séquences de l'endospanine et d'OB-RGRP humaine et murine. Les quatre domaines transmembranaires de ces protéines sont indiqués en ligne 1.

La figure 3 représente des cellules HeLa en double marquage en immunofluorescence indirecte, exprimant l'endospanine-HA-Bl, incubées en présence d'anticorps de souris anti-HA. La fluorescence verte révèle les anticorps anti-HA internalisés (A et C). La fluorescence rouge révèle l'endospanine,-HA-B1 et endogène, dans ces cellules (B et C).

La figure 4 représente la quantité de récepteur de la leptine en surface rapportée à la quantité totale de récepteur de la leptine cellulaire et normalisée à 100% pour le contrôle, de cellules HeLa co-infectées avec deux adénovirus recombinants afin d'exprimer une quantité constante de OBRa et des quantités croissantes d'endospanine (multiplicité d'infection de 0 à 80).

La figure 5 représente l'expression de l'ARNm de OB- RGRP (gauche) et de LEPROTL1 (droit) dans la lignée MCF7 sous traitement à l'oestradiol et à la progestérone par PCR en temps réel.

La figure 6 représente la distribution et l'intensité d'expression des ARNm, d'OB-RGRP (gauche) et de LEPROTL1 (droit) dans cerveau et fétus de souris.

La figure 7 montre que la surexpression de la protéine OB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface du récepteur de la leptine.

Exemple 1 : Transport d'une version marquée de l'endospanine de la membrane au cytoplasme 1) Méthodes.

Un epitope (ou'tag) HA (9 amino-acids PEDSP2YAY) a été introduit par mutagénèse dirigée dans la première boucle (Bl) extracellulaire de l'endospanine, entre les résidus Y30 et N31 (figure 1 et 2). Des résidus de liaison ont été inclus de chaque côté du tag (respectivement GAS et Go,).

Des cellules HeLa préalablement cultivées sur lamelles de verre ont été transfectées avec un plasmide permettant l'expression de la protéine ainsi marquée ; l'endospanine- HA-B1. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été incubées pendant deux heures dans du milieu de culture contenant un anticorps monoclonal anti-HA. Les cellules ont été ensuite rincées puis incubées dans du milieu de culture dépourvu d'anticorps. Les cellules ont été fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 3%. L'anticorps anti-HA internalisé a été révélé à l'aide d'un anticorps anti-IgG de souris marqué à l'alexa-488, après perméabilisation préalable des cellules par une incubation dans une solution contenant du triton X-100 à 0, 1%. L'endospanine a été révélé, à l'aide d'un antiserum de lapin anti-endospanine contre le dodecapeptide de la partie C- terminale et par un anticorps anti-IgG de lapin marqué à l'alexa-594. Les préparations ont été observées sur un microscope à immunofluorescence.

2) Résultats.

Un signal cytoplasmique ponctué a été observé, indiquant que des anticorps anti-HA avaient été internalisés depuis la membrane plasmique vers des compartiments endosomaux intra-cytoplasmiques (figure 3A et C). Pour

montrer que ce marquage correspondait bien à des protéines internalisées, un marquage total a été réalisé sur les mêmes cellules, après fixation, à l'aide d'un anticorps dirigé contre la partie C-terminale de l'endospanine. Le pattern de ce marquage total diffère considérablement de celui correspondant à la protéine internalisêe, d'une part, et reproduit le pattern de l'endospanine endogène (figure 3B et C). Ceci démontre que le marquage à l'anticorps anti-HA résulte bien d'une internalisation de la protéine de surface et indique que l'adressage en surface cellulaire de la protéine marquée d'un épitope HA ne résulte pas d'un artefact de surexpression, et qu'elle se comporte donc probablement comme la protéine endogène.

Comme contrôle, la même expérience a été effectuée en parallèle avec l'endospanine porteuse du même épitope HA dans sa boucle cytosolique (entre les résidus M62 et S63).

Cette boucle n'est pas exposée vers l'extérieur de la cellule. Elle est par conséquent inaccessible aux anticorps anti-HA présents dans le milieu de culture. Comme prévu, cette construction n'a pas permis d'observer d'internalisation de l'anticorps anti-HA.

Ces résultats démontrent que l'endospanine dans laquelle un épitope HA a été inseré (dans sa première boucle extracellulaire) est adressée vers la membrane plasmique de la cellule, puis internalisée dans des endosomes. Quatre à cinq heures après internalisation, le signal correspondant à l'anticorps anti-HA ne pouvait plus être détecté. Cette perte du marquage montre que l'endospanine a été transportée vers des compartiments intracellulaires, probablement des lysosomes, où les anticorps internalisés ont été dégradés.

Exemple 2 : Modulation de l'expression du récepteur de la leptine à la surface des cellules par l'endospanine.

1) Méthodes.

Des adénovirus recombinants exprimant une isoforme courte (OB-Ra) d'OB-R murin, d'une part, et l'endospanine humaine ont été construits par recombinaison homologue. OB-R exprimé par ce vecteur viral comporte un épitope HA à son extrémité N-terminale. Des cellules HeLa ont été co- infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant l'endospanine. Après 24 heures d'expres$ionf les protéines de surface ont été biotinylées à 4°C. Les cellules ont ensuite été lysées puis les lysats cellulaires clarifiés par centrifugation. Les niveaux relatifs de récepteurs biotinylés (surface) ont été quantifiés par immunoblot à partir du matériel purifié par billes de streptavidine-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Les récepteurs totaux (surface + interne) ont été quantifiés en parallèle par la même méthode à partir d'un dixième de chaque lysat cellulaire. OB-Ra a été révélé avec un anticorps anti-HA. Les mêmes immunoblots ont ensuite été révélés grâce à un anticorps dirigé contre le récepteur de la transferrine. Les quantités de récepteurs de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de récepteur dans la fraction biotinylée sur la quantité de récepteur présente dans les lysats cellulaires totaux.

2) Résultats et conclusions.

L'expression en surface d'OB-R est affectée par la surexpression de l'endospanine. La surexpression de l'endospanine induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface d'OB-R (figure 4) sans aucun impact sur l'expression en surface du récepteur de la transferrine.

Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur l'expression en surface d'OB-R et suggèrent que

l'endospanine participe à la régulation de l'expression en surface de ce récepteur.

Exemple 3 : Régulation hormonale de LEPROTL1 et OB- I P e 1) Méthodes.

L'expression des gènes LEPROTE1, OB-RGRP, ß-Actine et GAPDH a été étudié par PCR quantitatif en temps réel sur l'appareil LightCycler (Roche) dans la lignée humaine de cancer du sein MCF7 soumis ou non au traitement soit par la progestérone, soit par l'estradiol. Les cellules MCF7 cultivées dans un milieu DMEM sans rouge de phénol, à 37°C sous 5% de CO2, sont privées de sérum pendant une nuit, puis traitées (lpM de progestérone ou d'estradiol) pendant 6 heures. Les ARN totaux ont été préparés en utilisant les kits : QIAGEN, RNeasy@. Les cDNA (2pg d'ARN dans un volume de 25pL), sont obtenus à l'aide de la Reverse Transcriptase (M-MLV, Promega) et d'oligonucléotides Random p (dN6) (Roche) comme amorces et par la méthode recommandée par le fournisseur.

Nous avons utilisé le kit et les matériels de la société Roche ; (LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I, LightCycler Capillaries). Les quantifications ont été effectuées avec des ADNc correspondant à 100ng d'ARN par la méthode recommandée par le fournisseur.

Les oligonucléotides pour les PCR en temps réel sont les suivants.

LEPROTL1 : 5'CAAATACTGGCCCCTCTTTGTTCATT3' (SEQ ID NO. 12) 5'TCAGTAATTTCTTTTCACCACTGCTGC3' (SEQ ID NO. 13) OB-RGRP : 5'AGCAGCCGCGGCCCCAGTTC3' (SEQ ID NO. 14) 5'AAGGCCGCAGGCTCCCCATTT3' (SEQ ID NO. 15) ß-Actine :

2) Résultats Les valeurs d'expression d'OB-RGRP (ARNm) et de LEPROTL1 (ARNm), (normalisées par les ARNm de ß-Actine et GAPDH) pour le traitement solvant seul et les deux traitements hormonale incluant l'intervalle de confiance à 95% sont représentées dans la figure 5.

Les réductions d'expression d'OB-RGRP (ARNm) par les deux hormones et l'augmentation d'expression de LEPROTL1 (ARNm) par la progestérone sont significatives (p<0,05 pour N=46 pour OB-RGRP/3-Actine ou OB-RGRP/GAPDH, N=24 pour LEPROTLl/-Actine ou LEPROTL1/GAPDH). Une réduction d'expression d'OB-R (ARNm) par ces mêmes hormones a été décrite (Duggal, P. S. et al., 2002, Reproduction 123 (6), 899-905, Kitawaki, et al., 2000, J Clin Endocrinol Metab 85 (5), 1946-50, Koshiba, et al., 2001, Mol Hum Reprod 7 (6) : 567-72. Ceci suggère que ce soit probablement le promoteur commun à OB-RGRP et OB-R qui est régulé par ces hormones.

La régulation de ces gènes par les hormones et leur rôle dans le trafic intracellulaire de la leptine pourraient rendre compte du dimorphisme sexuel humain dans le taux de masse graisseuse et le taux de leptine circulant (Hickey, M.

S. et al., 1996, Biochem Mol Med 59 (1) : 1-6.) Exemple 4 : Expression de LEPROTL1 et OB-RGRP dans cerveau et fétus de souris.

L'expression de LEPROTL1 (ARNm) par Northern blots (Huang, Y. et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta, 1517,327- 331) observée dans de nombreux tissus est analogue à l'expression d'OB-RGRP (ARNm) (Bailleul, B. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 2752-2758). Nous avons analysé par hybridation in situ l'expression des ARNm de LEPROTL1 et OB- RGRP, dans cerveau et fétus de souris.

1) Méthodes La distribution de LEPROTL1 (ARNm) et OB-RGRP(ARNm) sur des coupes de cerveau et de fétus a été étudiée par hybridation in situ par une technique décrite en détail précédemment, en utilisant des sondes marquées au 35S d'ARN antisens reconnaissant les exons 3 et 4 d'OB-RGRP, (Mercer, J. et al., 2000, J. Neuroendocrinol., 12,649-655) ou les 415 paires de bases de LEPROTL1 (ADNc) de souris, générées par PCR utilisant les primers suivants : ACGAATTCACCGCCATGGCAGGCATC, (SEQ ID NO. 20) et ACTCTAGACCACTGCTGCCAGCTGAAG (SEQ ID NO. 21).

Les deux sondes ont été hybridées sur des 20µm coronales adjacentes sections du cerveau de souris au niveau de l'hypothalamus (A ; bregma 0.82mm B ; bregma 1.46mm) ou de fétus de 13.5 jours p. c. avec le placenta (C).

2) Résultats Les signaux auto-radiographiques générés par hybridation in situ avec la sonde LEPROTL1 sont plus intenses que ceux observés avec la sonde OB-RGRP, à un même taux de radioactivité et une identique radioactivité spécifique. L'expression de LEPROTL1 est similaire en distribution et en abondance relative à l'expression d'OB- RGRP (Figure 6). Dans les coronales sections à travers l'hypothalamus, les deux, OB-RGRP et LEPROTL1 anti-sens sondes hybrident avec un nombre de structures définies, avec

un signal d'intensité plus faible, largement distribué. La sonde sens montre un faible et uniforme signal (donnée non montrée). Les deux ARNm sont largement exprimés dans l'hippocampe, incluant le gyrus denté (DG). D'autres structures avec des signaux ARNm distincts incluant le plexus choroïde (CP), le cortex piriforme, les noyaux paraventriculaire (PVN), arqué (ARC), ventromédian (VMH) et l'hypothalamus latéral (LH) (figure 6 ans les aires du système nerveux central décrit ci-dessus, la localisation au microscope des grains d'argent de l'épreuve est identique aux neurones colorées au bleu de toluidine.

Les sondes de LEPROTL1 et d'OB-RGRP montrent un profil similaire d'hybridation dans les coupes de fétus et de placenta. Dans les tissus embryonnaires, LEPROTL1 est plus fortement exprimé dans le cerveau en développement et les poumons, où un enrichissement de signal est observé pour la sonde OB-RGRP.

Ces données suggèrent que, comme décrit pour OB-RGRP, l'expression de LEPROTL1 est répartie d'une manière étendue dans le cerveau et le fétus avec des régions de plus forte expression dans quelques régions incluant les noyaux hypothalamiques et les régions du cerveau qui expriment l'ARNm et la protéine d'OB-R.

Exemple 5 : Modulation de l'expression du récepteur de la leptine à la surface des cellules par la protéine OB- RGRP.

1) Méthodes Des adenovirus recombinants exprimant une isoforme courte (oB-Ra) du récepteur de la leptine murin, d'une part, et la protéine OB-RGRP humaine ont été construits par recombinaison homologue. Le récepteur de la leptine exprimé par ce vecteur viral comporte un épitope HA à son extrémité

N-terminale. Des cellules HeLa ont été co-infectées avec le virus exprimant le récepteur et des doses croissantes de virus exprimant la protéine OB-RGRP. L'expression en surface du récepteur de la leptine a été quantifiée par biotinylation des protéines de surface, lyse des cellules, précipitation du matériel biotinylé par des billes de streptavidine-agarose et révélation par immunoblot après séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Le récepteur de la leptine a été révélé avec un anticorps anti-HA. Une portion du lysat cellulaire a également été soumise à la même analyse afin de déterminer la quantité totale de récepteurs (surface + interne). Les quantités de récepteur de surface ont été exprimées par le rapport de la quantité de protéine dans la fraction biotinylée sur la quantité de protéine présente dans les lysats cellulaires totaux.

2) Résultats L'expression en surface du récepteur de la leptine est affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. La surexpression de la protéine OB-RGRP induit une diminution dose-dépendante de l'expression en surface du récepteur de la leptine (Figure 7). La quantité totale de récepteur de la leptine (surface + interne) n'est pas affectée par la surexpression de la protéine OB-RGRP. Ces résultats démontrent la spécificité des effets observés sur l'expression en surface du récepteur de la leptine et suggèrent que la protéine OB-RGRP participe à la régulation de l'expression en surface du récepteur de la leptine.