CALCIFICACIONES VASCULARES.

PRIMERA INVENCIÓN

USO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE PLAQUETAS PARA EL TRATAMIENTO DE LAS CALCIFICACIONES VASCULARES.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la farmacia, y se refiere a el uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica dirigida a combatir la calcificación de los vasos sanguíneos y especialmente al tratamiento de las calcificaciones vasculares asociadas al tratamiento con calcitriol.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad cardiovascular es la causa principal de muerte en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Los pacientes en hemodiálisis presentan aterosclerosis y arteriosclerosis. Estas enfermedades vasculares se empiezan a desarrollar en los estadios tempranos de la enfermedad renal, y conforme la enfermedad renal progresa, se produce un empeoramiento progresivo de la enfermedad cardiovascular. La afección cardiovascular de los pacientes con insuficiencia renal avanzada se caracteriza por calcificaciones en el ámbito de las capas íntima y media de la pared arterial. Las calcificaciones de las arterias producen disminución de la elasticidad de los vasos y el grado de calcificación se correlaciona con mortalidad.

Durante muchos años, se consideró que las calcificaciones vasculares de los pacientes con insuficiencia renal se debían a la deposición pasiva de sales de calcio, consecuencia de una sobresaturación por el aumento de las concentraciones plasmáticas de calcio y fósforo (aumento del producto Ca x P). Indudablemente, la hiperfosfatemia y el aumento del producto Ca x P contribuyen de forma importante a la calcificación vascular. La hiperfosfatemia es un predictor de mortalidad, posiblemente por su papel en la patogenia de las calificaciones. Para prevenir las calcificaciones vasculares en los pacientes renales, es esencial controlar el fosfato plasmático sin aportar un exceso de calcio, es decir, evitando utilizar quelantes intestinales de fósforo que contengan calcio. Sin embargo, en la actualidad, se sabe que la calcificación vascular es un proceso activo regulado en el ámbito celular y por ciertos componentes del plasma, como son ciertas proteínas y otros factores patogénicos.

Por tanto, hay proteínas que regulan la calcificación vascular, favoreciéndola o inhibiéndola. Es evidente que en los pacientes con patologías renales los mecanismos inhibidores son superados por los otros mecanismos que promueven la calcificación vascular, con lo que se produce un desequilibrio.

Entre las proteínas que modulan la calcificación extraósea se encuentran: Matrix gla-protein

Es una proteína extracelular que tiene afinidad por la hidroxiapatita. En el hueso, favorece la formación ósea y, en la arteria, inhibe la calcificación. La matrix gla-protein (MGP) es dependiente de la vitamina K y su función se afecta por la warfarina o acenocumarol. La MGP inhibe la actividad de la bone matrix protein 2a (BMP2a), que es una proteína procalcificante. Se ha comprobado que un ratón deficiente en MGP muestra calcificaciones arteriales difusas.

Fetuína

Es la glucoproteína a2-Heremans-Schmid (Ahsg) o fetuína A. Esta proteína sérica es un importante inhibidor de las calcificaciones extraóseas. La concentración de fetuína disminuye en situaciones de inflamación (respuesta celular inmunitaria). Esta proteína disminuye la precipitación de calcio y fósforo in vitro. Se ha visto que un ratón deficiente en fetuína muestra calcificaciones arteriales difusas. La importancia clínica de la fetuína quedó ilustrada en un trabajo que demostró una asociación entre mortalidad cardiovascular y valores bajos de fetuína en pacientes en hemodiálisis. Se ha descrito que el complejo proteico fetuína/MGP inhibe la precipitación de sales de calcio y la formación de hidroxiapatita. También parece que la inhibición de la calcificación por fetuína depende de la formación de complejos proteicos estables que incorporan los núcleos de mineral. Osteoprotegerina

En el hueso la interacción de osteoprotegerina (OPG-L) con su receptor RANK (del inglés receptor-activator of NF-κΒ) regula la diferenciación, la activación y la apoptosis de los osteoclastos. Se ha visto que en ratones deficientes en OPG, se produce osteoporosis y calcificación arterial.

Osteopontina

Es un potente inhibidor de la deposición de hidroxiapatita en cultivos de células de músculo liso vascular (VSMC). Además, protege a las células endoteliales de la apoptosis que se produce por deprivación de factores de crecimiento. Las proteínas más importantes que favorecen la calcificación son la fosfatasa alcalina, la osteonectina, la osteocalcina y el BMP2. Estas proteínas se expresan en abundancia en pared vascular calcificada y en cultivos de células de músculo liso vascular en los que se inducen calcificaciones.

Entre los factores patogénicos se encuentran: Hiperíosfatemia

El aumento de la concentración de fósforo en el medio en cultivos de VSMC induce la calcificación de estas células. Para que el fósforo induzca la calcificación de las VSMC, necesita que haya un transporte activo desde fuera al interior de la célula (Pit-1), y que subsecuentemente se induzca el Cbfa-1 , factor de transcripción específico de osteoblastos que regula la expresión de proteínas procalcificantes. Se ha observado que usando ácido fosfonomórfico (PFA) se puede evitar el transporte celular del fósforo. El efecto calcificante del fósforo, necesita una alteración previa de la pared vascular que facilite o promueva la transformación fenotípica de las VSMC hacia osteoblasto.

Uremia

Estudios realizados in vitro con VSMC demuestran que el suero urémico es capaz de inducir su calcificación, de forma independiente de la concentración de fósforo. En las arterias calcificadas de los pacientes urémicos, hay un aumento de expresión del Cbfa-1 en el ámbito de las capas media e íntima. Hipercalcemia

También se ha demostrado que un aumento de la concentración de calcio ejerce un efecto estimulador directo en la calcificación. En cultivos de VSMC, la concentración elevada de induce calcificación incluso cuando el fósforo no está aumentado. Al igual que el fósforo, el calcio elevado también estimula la expresión del transportador Na-P (Pit-1), y la inhibición de este transportador inhibe la calcificación inducida por el calcio. También el calcio elevado induce expresión de Cbfa-1. La hiperfosforemia y la hipercalcemia inducen calcificaciones vasculares de forma independiente, pero conjuntamente ejercen un efecto sinérgico que favorece las calcificaciones vasculares. Es importante señalar que, en presencia de un fósforo elevado, un pequeño aumento de calcio supone una calcificación exagerada.

Microvesículas

El primer paso en el proceso de calcificación es la acumulación de calcio y fósforo en vesículas que proceden de la apoptosis de VSMC (cuerpos apoptóticos), o que son liberadas por células de la pared vascular de estirpe osteoblástica que expresan el Cbfa-1 (matrix vesicles).

Además de estos factores, existen fármacos que inducen las calcificaciones vasculares. Así, el calcitriol (DCI) o 1-alpha,25-dihidroxicolecalciferol (abreviado 1 ,25-(OH)2D3) es la forma activa de la vitamina D que se encuentra en el cuerpo (vitamina D3). Se utiliza para tratar el hiperparatiroidismo secundario en los pacientes urémicos. Pero el calcitriol aumenta la absorción intestinal de calcio y fósforo, y produce hipercalcemia e hiperfosfatemia, lo cual puede favorecer la calcificación vascular. El peligro de calcificación por vitamina D es mayor si se administra a pacientes con hiperfosfatemia que se están tratando simultáneamente con quelantes de fósforo que contienen calcio. Además, algunos autores han encontrado que el calcitriol estimula la calcificación vascular por acción directa en la pared vascular.

En la actualidad, se pueden utilizar en el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario otros análogos de la vitamina D, como el paricalcitol o el 22-oxacalcitriol (OCT), que sin dejar de inhibir la PTH, parecen tener menos efecto en la absorción intestinal de calcio y fósforo. En un estudio reciente, se ha mostrado una mortalidad menor en pacientes en hemodiálisis que están siendo tratados con paricalcitol, comparados con los tratados con calcitriol. Una de las posibles razones que expliquen el efecto beneficioso del paricalcitol en la mortalidad puede ser un menor efecto hipercalcémico e hiperfosfatémico.

Una alternativa al tratamiento con calcitriol es el uso de calcimiméticos, activadores alostéricos del receptor de calcio (RCa), que desde hace unos años se utiliza para el control del hiperparatiroidismo secundario en pacientes urémicos. Se ha analizado el efecto del calcitriol y del calcimimético sobre las calcificaciones vasculares en ratas urémicas con hiperparatiroidismo secundario (López et al., 2006. J Am Soc Nephrol 17(3):795-804). La administración de calcitriol en dosis necesarias para controlar el hiperparatiroidismo, producía calcificaciones graves de la pared de los vasos; la administración de calcimiméticos controló el hiperparatiroidismo y no produjo calcificaciones. Además, lo más importante es que en ratas que recibían la combinación de calcitriol y calcimiméticos tampoco se observaron calcificaciones, es decir, que el calcimimético es capaz de evitar las calcificaciones inducidas por el calcitriol. Una posible explicación sería que en los animales tratados con calcimiméticos existe un moderado descenso de calcio y fósforo en comparación con los animales tratados con calcitriol, sin embargo las ratas tratadas con calcitriol y calcimiméticos tenían valores altos de calcio y fósforo. El hecho de que ratas tratadas con calcimiméticos tienen aumento de la MGP (proteína anticalcificante) hace pensar en un efecto directo del calcimimético sobre la pared vascular. En cultivos de VSMC bovinas (BVSMC) se ha demostrado la presencia del RCa y la calcificación se asocia a una disminución de los niveles de expresión de RCa, lo que podría ser inherente a la transformación osteoblástica (Block et al., 2004. N Engl J Med; 350:1516-25).

En los últimos años se viene caracterizando la implicación de la ruta Wnt^-catenina, en los procesos de calcificación. La activación de Wnt^-catenina conduce a un incremento de la proliferación y de la osteogénesis (Dahlóf 2010. Am J Cardiol. 4; 105(1 Suppl): SAGA). Su activación también se ha relacionado con la metilación e inhibición de promotores génicos.

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una proteína catiónica, estable frente al calor, que se halla en una diversidad de tipos de células, incluyendo los gránulos de plaquetas circulantes, células de músculos lisos vasculares, células endoteliales, macrófagos y queratinocitos, y es sabido que estimula la síntesis in vitro de proteínas y la producción de colágeno por fibroblastos. También es conocido que actúa como un agente mitógeno y quimiotáctico in vitro para fibroblastos, células de músculos lisos, osteoblastos y células gliales. El PDGF fue descrito inicialmente por Ross et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 71 , 1207- 1210 (1974), como un factor encontrado en el suero completo de sangre (pero no en el suero escaso en plaquetas) que es capaz de apoyar el crecimiento de los fibroblastos en el cultivo . El PDG F se aisló su bsig uientemente de las plaquetas y del suero, identificándose el PDGF no reducido natural como una proteína dimera de 27-35 kd de peso molecular. Se encontró que la reducción del PDGF proporcionaba dos o más bandas más pequeñas sobre geles, en un intervalo de peso molecular de 10-18 kd. Se creyó que estas bandas más pequeñas representaban dos subunidades monómeras distintas más pequeñas de aproximadamente 18 kd y 16 kd de pesos moleculares denominadas, respectivamente, las subunidades "A" y "B", o alternativamente, la cadena A de PDGF y la cadena B de PDGF. Las secuencias de aminoácidos de las dos subunidades del PDGF ya han sido descritas, identificándose la secuencia de aminoácidos de la cadena B del PDGF homologa en más del 90% al producto proteínico predicho de v-sis, el oncogen contenido en el virus de sarcoma de simio oncogénico (SSV); véase Doolittle et al., Science, 221 , 275-276 (1983), y Waterfield et al., Nature, 304, 2810-2814 (1983). Se ha encontrado que la cadena A es homologa en aproximadamente un 60% a la cadena B. Se cree que el PDGF es biológicamente activo sólo en forma dimera. Estos dimeros de PDGF biológicamente activos pueden tomar forma de un heterodímero PDGF-AB, un homodímero PDGF-BB o un homodímero PDGF-AA. Cada subunidad monómera del dímero biológicamente activo, independientemente de si es un monómero de cadena A o un monómero de cadena B, contiene ocho residuos de cisteína. Algunos de estos residuos de cisteína forman enlaces disulfuro entre cadenas que mantienen juntos los dimeros.

La secuencia homologa de v-sis de 109 aminoácidos (PDGF B ₁₀ g), identificada por Johnsson et al. 1984. EMBO Journal, 3(5), 921-928 como la forma madura de PDGF B, se ha utilizado en tecnología recombinante empleando levadura y otros sistemas de células hospedantes eucariotas para obtener PDGF recombinante activo (rPDGF) (US 4.766.073).

Se ha mostrado que un PDGF-BB humano recombinante (=rhPDGF-BB) estimula la curación de heridas y la regeneración de huesos tanto en animales como en seres humanos. Ha sido aprobado tanto en los Estados Unidos de América como en Europa para el uso humano en aplicaciones por vía tópica con el fin de acelerar la curación de llagas de pies diabéticos crónicos. Se ha mostrado también que un hPDGF-BB recombinante es efectivo, o bien a solas o en combinación con otros factores de crecimiento, para mejorar la regeneración periodontal, es decir el crecimiento renovado de hueso, cemento y ligamento alrededor de los dientes (US 5.124.316).

La presencia de calcificaciones vasculares altera la estructura y la función vascular, siendo éstas las responsables de la aparición de eventos cardiovasculares potencialmente mortales como la cardiopatía isquémica, la insuficiencia cardíaca, los accidentes cerebrovasculares y la enfermedad vascular periférica. Estudios clínicos han mostrado asociación entre la presencia de calcificación en la íntima y/o en la media arterial y mayor riesgo de mortalidad cardiovascular y global.

Hasta ahora, la CV se ha considerado un proceso irreversible, y el esfuerzo se ha encaminado a enlentecer la progresión de las mismas. Dado que en la última década diversos estudios epidemiológicos han identificado la calcificación vascular como un factor pronóstico independiente de mortalidad cardiovascular, tanto en la población general como en la población urémica, es necesario encontrar un tratamiento adecuado para la misma, que permita la regresión de la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han demostrado que el uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas, así como sus composiciones farmacéuticas, es útil para el tratamiento de la patología calcificación vascular.

Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por platelet derived growth factor), o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o también alternativamente, al factor de crecimiento derivado de plaquetas, o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

Se conocen cinco isoformas diferentes de PDGF que activan la respuesta celular a través de dos receptores. Ligandos conocidos incluyen A, B, C y D y un heterodímero AB y receptores alfa (PDGFRA) y beta (PDGFRB). A menos que se especifique otra cosa, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es cualquier combinación de monómeros y/o dímeros de PDGF, preferiblemente, pero sin limitarse, de PDGF B, incluyendo sus análogos, reducidos o sin reducir, biológicamente activos, o inactivos, recombinantes o no. Preferiblemente, los análogos del PDGF son biológicamente activos o capaces de hacerse biológicamente activos por técnicas de replegamiento u otras manipulaciones similares. Más preferiblemente aún, se refiere a análogos de rPDGF B homogéneos, altamente expresados, que son biológicamente activos y que se parecen mucho al PDGF B que existe en la naturaleza.

Las expresiones "monómero de PDGF" y "PDGF monómero" significan una sola molécula de PDGF monómera que no está unida por enlaces disulfuro a ninguna otra molécula de PDGF. Se apreciará que "PDGF reducido" será necesariamente PDGF monómero.

Las expresiones "dímero de PDGF" o "PDGF dímero" significan una molécula de PDGF que comprende dos subunidades monómeras de PDGF que están unidas entre sí por enlaces disulfuro.

La expresión "dímero de PDGF biológicamente activo" significa PDGF dímero que tiene sustancialmente la misma actividad que el PDGF natural.

La expresión "monómero de PDGF biológicamente activo" significa PDGF monómero que tiene una actividad mitógena específica de al menos aproximadamente uno a mil de la actividad mitógena específica del PDGF dímero natural.

La expresión "conformación biológicamente activa", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la conformación de un dímero de PDGF biológicamente activo o un monómero de PDGF biológicamente activo.

Preferiblemente, en esta memoria se entiende por factor de crecimiento derivado de plaquetas una proteína de secuencia aminoacídica de Fórmula (I):

P-R ¹ -C-V-R ² -R ³ -R ⁴ -R-C-R ⁵ -G-C-C

Fórmula (I):

Donde R ¹ es S ó P;

R ² es P, E, T, A, S, L, N;

R ³ es V, L ó A;

R ⁴ es M, L, Q, K, F, Y ó S;

R ⁵ es G, S, T ó A. El término "calcificación vascular", en la presente memoria, se refiere a alteraciones en la pared vascular que se caracterizan por la aparición de depósitos de sales de calcio a nivel de las capas íntimas y media. Dentro del término calcificación vascular se incluye la calcificación coronaria.

Para la cuantificación de la calcificación coronaria, el algoritmo más empleado es el creado por Agatston (Agatston score), basado en estudios de TC con haz de electrones (TCHE) obtenidos con sincronización cardiaca prospectiva.

En función de la cantidad total de calcio observada, el riesgo de padecer enfermedad coronaria puede clasificarse en cinco categorías distintas:

Los activadores o agonistas del receptor de la vitamina D (activadores del RVD), suprimen efectivamente la hormona paratiroidea y son usados rutinariamente para controlar el desarrollo y la progresión del hiperparatiroidismo secundario relacionado con la enfermedad renal crónica (ERC). Entre ellos se encuentra el 1 ,25-(OH)2D3 (calcitriol), el 19-nor-1 a,25(OH)2D2 (paricalcitol), el 1a-(OH)D2 (doxercalciferol). Y el 22-oxa- 1 a,(OH)2D3 (maxacalcitol). Estos activadores tienen un efecto calcémico y fosfatémico, siendo el de los tres últimos menor en comparación con el calcitriol.

Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la calcificación vascular es producida y/o inducida por el tratamiento con al menos un agonista del receptor de la vitamina D. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el agonista del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

El calcitriol (DCI) o 1-alpha,25-dihidroxicolecalciferol (abeviado1 ,25-(OH)2D3) es la forma activa de la vitamina D que se encuentra en el cuerpo (vitamina D3). Lo producen los ríñones que hidrolizan del 25-hidroxicolecalciferol (25-OH D, o calcifediol) el cual es previamente hidrolizado en el hígado y regula los niveles de calcio, incrementando la absorción de calcio en el tracto gastrointestinal. Es un compuesto de fórmula (II):

Fórmula (II)

Al regular el nivel de calcio en la sangre, ayuda a mantener el calcio en los huesos y en el equilibrio químico en el cuerpo. Cuando el riñon no puede eliminar correctamente sustancias tóxicas por la orina, entonces tampoco expulsa fósforo. Al no eliminar los fosfatos en el organismo automáticamente baja el calcio; cuando esto sucede, la glándula paratiroidea lo detecta y empieza a segregar más cantidad de parathormona. Como lo hace constantemente, se transforma en una enfermedad que se llama hiperparatiroidismo secundario.

Se ha observado que la actividad de la Parathormona (PTH) está íntimamente ligada a la presencia de Calcitriol, en ausencia de esta vitamina la acción de la PTH es sustancialmente menor.

El 19-nor-1 ,25-(OH)2-vitamina D2 o 19-nor-1 ,25-dihidroxivitamina D2 o paracalcitol, es un análogo del 1 ,25-dihydroxyergocalciferol, la forma activa de la vitamina D2. También se emplea para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundarios (secreción excesiva de parathormona). Es un compuesto de fórmula (III):

Fórmula (III)

El (1 S,3 ,5Z,7E,22E)-9, 10-secoergosta-5,7,10,22-tetraeno-1 ,3-diol, o doxercalciferol también se emplea para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario y para el tratamiento de la enfermedad metabólica ósea. Es un análogo sintético del ergocalciferol (vitamina D), de fórmula (IV):

Fórmula (IV)

El 1-alfa, 25-dihidroxi-22-oxacalcitriol o maxacalcitol es un análogo de la vitamina D3, de fórmula (V).

Fórmula (V)

En otra realización preferida de esta invención, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, puede administrarse en una forma substancialmente puro a un mamífero, y preferiblemente a un humano, o puede administrarse como parte de una composición más compleja. Cuando se administra formando parte de una composición, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas, o sus análogos, es tal que alcanza el efecto deseado, siendo por tanto una cantidad efectiva. Ejemplos de mezclas que pueden contener estos compuestos son, pero sin limitarse, soluciones o suspensiones para su administración por vía intradérmica, parenteral, y preferiblemente vía intravenosa. Ejemplos de vehículos farmacéuticos o vectores, pero sin limitarse, son los aptámeros.

Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla (ssDNA y RNA), aislados de genotecas de oligonucleótidos por selección in vitro, mediante enriquecimiento exponencial en presencia del ligando (método SELEX), denominados anticuerpos químicos (del inglés chemical antibodies). Aptámeros capaces de vehiculizar el PDGF son conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo, pero sin limitarnos, los que se describen en la solicitud de patente US2012171304.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende factor de crecimiento, o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en l a el aboraci ón de u n medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. Alternativamente, también se refiere a una composición que comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, o un análogo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, y al menos un agonista de los receptores de vitamina D, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agonista de los receptores de vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol. Aún más preferiblemente es el calcitriol.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición además comprende angiotensina, y aún más preferiblemente angiotensina II, compuesto que podría tener una actividad similar al factor de crecimiento derivado de plaquetas.

Otro aspecto se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en la prevención o tratamiento de la calcificación vascular, o alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de la calcificación vascular.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende la composición farmacéutica de la invención. Para las vías intradérmica, parenteral o intramuscular, las formas farmacéuticas son, preferiblemente pero sin limitarse, la solución y la suspensión.

En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.

U na "solución" es una forma farmacéutica que consiste en un preparado líquido, transparente y homogéneo, obtenido por disolución de él o los principios activos y aditivos en agua, y que se utiliza para el uso externo o interno. En el caso de soluciones inyectables, oftálmicas y óticas deben ser soluciones estériles.

Una "suspensión" es una forma farmacéutica que consiste en un sistema disperso, compuesto de dos fases, las cuales contienen el o los principios activos y aditivos. Una de las fases, la continua o la externa es generalmente un líquido o un semisólido y la fase dispersa o interna, está constituida de sólidos (principios activos) insolubles, pero dispersables en la fase externa. En el caso de inyectables deben ser estériles.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, ... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas o de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o de sus combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general , vendrá determi nada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

Como se emplea aquí, el térmi no "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es la calcificación vascular.

Otro aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende como principios activos: (i) el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, y

(ii) al menos un agonista de los receptores de vitamina D.

En una realización preferida de este aspecto, el al menos un agonista de los receptores de vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, d oxe rea Icif eral y maxacalcitol. En una realización aún más preferida, el al menos un agonista de los receptores de vitamina D es el calcitriol. En otra realización aún mucho más preferida, la preparación combinada de la invención, además comprende angiotensina II.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento. Alternativamente, también se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento, o a la preparación combinada de la invención para su uso como medicamento.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. Alternativamente, también se refiere a la composición de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o a la preparación combinada de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

Otro aspecto se refiere al uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas, de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica. Alternativamente, también se refiere al factor de crecimiento derivado de plaquetas o a la com posición de la i nvención para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica, o a la preparación combinada de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica.

La enfermedad metabólica ósea asociada con la enfermedad renal crónica, ERC (EMO- ERC) se define como un trastorno sistémico progresivo y multifactorial, que incluye el conjunto de alteraciones bioquímicas, anomalías óseas y calcificaciones extraesqueléticas anormales que acontecen en los pacientes con ERC. Cada una de estas complicaciones da como resultado importantes consecuencias clínicas que condicionan, a su vez, elevada morbimortalidad en los pacientes urémicos

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1.A) Imagen de las CMLV provenientes de aorta humana al microscopio invertido B) Cultivo de Células del Músculo Liso Vascular

Fig. 2. Cámara de Neubauer.

Fig. 3. Procesamiento de los cultivos de CMLV transcurrido el tiempo del experimento, para su desmineralización y cuantificación de calcio.

Fig. 4. Curva dosis-efecto de Angiotensina II (10 ^"11 M-10 ^"4 M) sobre los niveles de Calcio en CMLV incubadas en presencia de niveles elevados de P (3.3mM) durante 9 días. Los resultados se expresan como media ± SE. n=1 1. T-test: * p<0.01 vs P.

Fig. 5. Efecto de la Angiotensina I I (10 ^"5 M) sobre el proceso de calcificación (niveles de calcio) inducida por P (3.3mM) en CMLV, en presencia de calcitriol (10 ^"8 M) o de paricalcitol (3x10 ^"8 M) durante 9 días de tratamiento. Los resultados se expresan como media ± SE. n=12. T-test: a pO.01 vs Control;* p<0.01 vs P; #p<0.01 vs P+CTR 10 ^"8 M. Fig. 6. Curva dosis-efecto de PDGF (20ng/ml-80ng/ml) sobre los niveles de Calcio en CMLV incubadas en presencia de niveles elevados de P (3.3mM) durante 9 días. Los resultados se expresan como media ± SE. n=18. T-test: a p<0.01 vs Control;* p<0.01vs P. Fig. 7. Efecto del PDGF (20ng/ml) sobre el proceso de calcificación (niveles de calcio) inducida por P (3.3mM) en CMLV, en presencia de calcitriol (10 ^"8 M) o de paricalcitol (3x10 ^" 8M) durante 9 días de tratamiento. Los resultados se expresan como media ± SE. n=18. T-test: a p<0.01 vs Control;* p<0.01vs P; #p<0.01 vs P+CTR 10-8M.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del uso factor de crecimiento derivado de plaquetas, en el tratamiento de calcificación vascular de forma individual y en presencia de los fármacos calcitriol y paricalcitol.

ANGIOTENSINA II

Se ha evaluado el papel de angiotensina II, sobre el desarrollo de las calcificaciones vasculares.

Se llevaron a cabo estudios in vitro con células de músculo liso vascular (de aorta) de origen humano. Las Células de Músculo Liso Vascular (CMLV) provenientes de aorta humana se obtuvieron de una línea celular (Clonetics- Lonza Waikersville, Inc., EE.UU.). Las células se estudiaron entre el 5 ^o y el 8 ^o pase. El medio utilizado en las células en crecimiento fue SmBm (Smooth muscle Basal médium), suplementado con SmGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (Clonetics- Lonza Waikersville, Inc., EE.UU.) que contiene: Suero Fetal Bovino (15%), hEGF (Factor de crecimiento epidermal recombinante, humano), insulina, hFGF-B (Factor de crecimiento de fibroblastos β, humano), gentamicina y anfotericina-B. Las células en crecimiento se cultivaron en frascos de 75 cm ² (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Al alcanzar el 80% de confluencia, las células fueron subcultivadas de la siguiente manera: se retiró el medio de cultivo y las células adheridas al frasco fueron lavadas con suero fisiológico. Posteriormente, las células se levantaron añadiendo una solución de Tripsina/EDTA (Sigma Aldrich Inc, MO, EE. U U .) al frasco y se incubaron durante 5 minutos. Transcurrido el período de incubación, se añadió medio de crecimiento (15% FBS), para inhibir la acción de la tripsina. La suspensión celular fue centrifugada a 1.500 rpm, durante 5 minutos, a 20°C. El pellet se resuspendió en medio de crecimiento, y se extrajo una alícuota para contar las células. Para los estudios con CMLV, las células se cultivaron en placas de 6 pocilios (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU. )(Fig. 1).

Recuento y medida de la viabilidad celular.

Para contar las células en cada subcultivo se añadió a la alícuota de suspensión celular la misma cantidad de Trypan Blue (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), se colocaron unos microlitros en una Cámara de Neubauer (Fig. 2) y se contaron las células vivas en cada cuadrante de 1 mm ² , en el microscopio.

El Tripan Blue es una molécula coloreada de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las células que tienen la membrana alterada. Por tanto una célula viva en perfecto estado se observará incolora mientras que una célula muerta o muy alterada se observará azul. De este modo se puede determinar la viabilidad celular.

(Células incoloras / células totales) x 100 = % viabilidad celular

La cámara de Neubauer (Fig, 2) es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. Tiene grabadas en su parte central, dos cuadrículas microscópicas con cuatro áreas de 4x4 cuadrados.

El volumen de cada zona es 1 x 1 x 0, 1 mL. Si contamos las células que hay en cada área, se puede calcular la concentración de la suspensión celular según la siguiente fórmula:

Media de contajes de las cuatro zonas x 104 x 10 = núm. células/mL

Cuando las células en cultivo alcanzaron el 80% de confluencia, se inició el tratamiento con Fosfato. Para la inducción de calcificación en el modelo de CMLV se utilizó Fosfato Monobásico y Dibásico para preparar el medio alto fósforo. Los estudios de calcificación se llevaron a cabo durante 9 días, con una concentración de fósforo de 3,3 mM. Cuantificación de Calcio.

Tras finalizar el tiempo del experimento, el medio de los pocilios fue retirado y los pocilios se lavaron dos veces con PBS (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.). Después las células se descalcificaron con HCI 0,6 N (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas, a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de C0 ₂ .

El contenido de calcio en el extracto ácido obtenido se determinó colorimétricamente por el método o-Cresoftaleína Complexona (Calcium C Test, WAKO Chemicals GmbH, Neuss, Alemania). Después de la descalcificación, las células fueron solubilizadas con NaOH 0,1 M (Panreac Química, SA, Barcelona, España) y SDS 0,1 % (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), y levantadas por el método de raspado. El contenido de proteína en la suspensión de células obtenida fue cuantificado por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Los pasos realizados tras finalizar el experimento se esquematizan en la Fig. 3.

Se evaluó el efecto de angiotensina II sobre la calcificación vascular independientemente, así como en presencia de calcitriol y paricalcitol, tras 9 días de tratamiento. Se utilizó la prueba de la t de student, para comprobar si las diferencias en el grado de calcificación vascular eran estadísticamente significativas.

Se realizó una curva dosis-efecto (Figura 4) para optimizar la dosis a emplear en los estudios posteriores. Así, las células de músculo liso vascular fueron mantenidas durante 9 días a diferentes dosis de angiotensina II: 10 ^"11 M-10 ^"4 M.

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos fueron (n=11):

0.35±0.04 (control);

2.70±0.23 (P), p<0.01 vs. control;

1.92±0.15 (P + All 10 ^"11 ); p<0.01 vs. P

1.94±0.10 (P + All 10 ^"9 ); p<0.01 vs. P

1.89±0.20 (P + All 10 ^"7 ); p<0.01 vs. P

1.06±0.13 (P + All 10 ^"5 ) p<0.01 vs. P

1.34±0.20 (P + All 10 ^"4 ); p<0.01 vs. P La adición de ninguna de las concentraciones de angiotensina II por sí solas produjo efecto alguno sobre los controles. Se eligió la concentración 10 ^"5 M, concentración a la que se obtiene una mayor inhibición de la calcificación.

El siguiente paso fue evaluar el efecto de angiotensina II sobre la calcificación inducida por P en presencia de calcitriol 10 ^"8 M (inductor de la calcificación) y paricalcitol 3x10 ^"8 M (inhibidor parcial de la misma).

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos, tras 9 días de tratamiento se representan en la figura 5 y en valores absolutos fueron (n=12):

0.55±0.05 (control);

3.20±0.38 (P), p<0.01 vs. control;

0.69±0.02 (All 10 ^"5 );

1.86±0.38 (P + All 10 ^"5 ); pO.01 vs P

5.26±0.61 (P + CTR 10 ^"8 ); p<0.01 vs P.

3.66±0.69 (P + CTR 10 ^"8 + All 10 ^"5 ); p<0.01 vs P + CTR.

2.13±0.38 (P + PC 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.45±0.46 (P + PC 10 ^"8 + All 10-5); pO.01 vs P

Estos datos sugieren que, angiotensina II reduce la calcificación inducida por niveles elevados de P así como por el tratamiento con calcitriol; sin embargo, no produjo una reducción adicional de la calcificación a la producida por el paricalcitol.

PDGF

Se ha evaluado el papel del factor de crecimiento derivado de plaquetas, sobre el desarrollo de las calcificaciones vasculares.

Se llevaron a cabo estudios in vitro con células de músculo liso vascular (de aorta) de origen humano. Las Células de Músculo Liso Vascular (CMLV) provenientes de aorta humana se obtuvieron de una línea celular (Clonetics- Lonza Waikersville, Inc., EE.UU.). Las células se estudiaron entre el 5 ^o y el 8 ^o pase. El medio utilizado en las células en crecimiento fue SmBm (Smooth muscle Basal médium), suplementado con SmGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (Clonetics- Lonza Waikersville, Inc., EE.UU.) que contiene: Suero Fetal Bovino (15%), hEGF (Factor de crecimiento epidermal recombinante, humano), insulina, hFGF-B (Factor de crecimiento de fibroblastos β, humano), gentamicina y anfotericina-B. Las células en crecimiento se cultivaron en frascos de 75 cm ² (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Al alcanzar el 80% de confluencia, las células fueron subcultivadas de la siguiente manera: se retiró el medio de cultivo y las células adheridas al frasco fueron lavadas con suero fisiológico. Posteriormente, las células se levantaron añadiendo una solución de Tripsina/EDTA (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.) al frasco y se incubaron durante 5 minutos. Transcurrido el período de incubación, se añadió medio de crecimiento (15% FBS), para inhibir la acción de la tripsina. La suspensión celular fue centrifugada a 1.500 rpm, durante 5 minutos, a 20°C. El pellet se resuspendió en medio de crecimiento, y se extrajo una alícuota para contar las células. Para los estudios con CMLV, las células se cultivaron en placas de 6 pocilios (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Recuento y medida de la viabilidad celular.

Para contar las células en cada subcultivo se añadió a la alícuota de suspensión celular la misma cantidad de Trypan Blue (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), se colocaron unos microlitros en una Cámara de Neubauer (Fig. 2) y se contaron las células vivas en cada cuadrante de 1 mm ² , en el microscopio.

El Tripan Blue es una molécula coloreada de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las células que tienen la membrana alterada. Por tanto una célula viva en perfecto estado se observará incolora mientras que una célula muerta o muy alterada se observará azul. De este modo se puede determinar la viabilidad celular.

(Células incoloras / células totales) x 100 = % viabilidad celular

La cámara de Neubauer (Fig. 2) es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. Tiene grabadas en su parte central, dos cuadrículas microscópicas con cuatro áreas de 4x4 cuadrados.

El volumen de cada zona es 1 x 1 x 0, 1 mL. Si contamos las células que hay en cada área, se puede calcular la concentración de la suspensión celular según la siguiente fórmula: Media de contajes de las cuatro zonas x 104 x 10 = núm. células/mL

Cuando las células en cultivo alcanzaron el 80% de confluencia, se inició el tratamiento con Fosfato. Para la inducción de calcificación en el modelo de CMLV se utilizó Fosfato Monobásico y Dibásico para preparar el medio alto fósforo. Los estudios de calcificación se llevaron a cabo durante 9 días, con una concentración de fósforo de 3,3 mM.

Cuantificación de Calcio.

Tras finalizar el tiempo del experimento, el medio de los pocilios fue retirado y los pocilios se lavaron dos veces con PBS (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.). Después las células se descalcificaron con HCI 0,6 N (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas, a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de C0 ₂ .

El contenido de calcio en el extracto ácido obtenido se determinó colorimétricamente por el método o-Cresoftaleína Complexona (Calcium C Test, WAKO Chemicals GmbH, Neuss, Alemania). Después de la descalcificación, las células fueron solubilizadas con NaOH 0,1 M (Panreac Química, SA, Barcelona, España) y SDS 0,1 % (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), y levantadas por el método de raspado. El contenido de proteína en la suspensión de células obtenida fue cuantificado por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Los pasos realizados tras finalizar el experimento se esquematizan en la Fig. 3.

Se observó el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas sobre la calcificación vascular independientemente, así como en presencia de calcitriol y paricalcitol tras 9 días de tratamiento. Se utilizó la prueba de la t de student, para comprobar si las diferencias en el grado de calcificación vascular eran estadísticamente significativas.

Se realizó una curva dosis-efecto (Fig. 6) para optimizar la dosis a emplear en los estudios posteriores. Así, las células de músculo liso vascular fueron mantenidas durante 9 días a diferentes dosis de factor de crecimiento derivado de plaquetas:

- 20 ng/ml.

40 ng/ml.

- 80 ng/ml.

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos fueron (n=18):

0.52±0.04 (control); 3.34±0.08 (P), p<0.01 vs. control;

1.15±0.21 (P + PDGF 20), p<0.01 vs. P;

1.83±0.13 (P + PDGF 40), p<0.01 vs P;

1.61 ±0.08 (P + PDGF 80) p<0.01 vs P.

La adición de ninguna de las concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas por sí solas produjo efecto alguno sobre los controles. Se eligió la concentración 20 ng/ml, concentración a la que se obtiene una mayor inhibición de la calcificación. El siguiente paso fue evaluar el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas sobre la calcificación inducida por P en presencia de calcitriol 10 ^"8 M (inductor de la calcificación) y paricalcitol 10 ^"8 M (inhibidor parcial de la misma).

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos, representados en la Fig. 7, fueron (n=18):

0.33±0.05 (control);

2.88±0.3 (P), pO.01 vs. control;

0.41 ±0.04 (PDGF 20);

0.66±0.18 (P + PDGF 20); p<0.01 vs P

4.32±0.6 (P + CTR 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.92±0.18 (P + CTR 10 ^"8 + PDGF 20); p<0.01 vs P + CTR

1.90±0.3 (P + PC 3 x 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.5±0.18 (P + PC 3 x 10 ^"8 + PDGF 20); p<0.01 vs P

Estos datos sugieren que, el factor de crecimiento derivado de plaquetas reduce la calcificación inducida por niveles elevados de P así como por el tratamiento con calcitriol; sin embargo, no produjo una reducción adicional de la calcificación a la producida por el paricalcitol. CLÁUSULAS

1. - Uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

2. - El uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas según la reivindicación anterior, donde la calcificación vascular es inducida por el tratamiento con al menos un agonista de los receptores de vitamina D.

3. - El uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas según la reivindicación 2, donde el agonista de los receptores de vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

4. - El uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas se encuentra unido a un aptámero.

5. - El uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas se encuentra en una solución o suspensión, y la vía de administración es la vía parenteral.

6. - El uso del factor de crecimiento derivado de plaquetas según la reivindicación anterior, donde la vía de administración es la vía intravenosa.

7. - El uso de una composición farmacéutica que comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas según se describe en las reivindicaciones 1-6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

8. - Una composición farmacéutica que comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, y al menos un agonista de los receptores de vitamina D, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el agonista de los receptores de vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, d oxe rea Icif eral y maxacalcitol.

10. - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde el agonista de los receptores de vitamina D es el calcitriol.

1 1. - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que además comprende angiotensina II.

12. - Forma farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7-11.

13. - Una preparación combinada que comprende como principios activos el factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquiera de sus análogos, fragmentos o variantes biológicamente activas, y al menos un agonista de los receptores de vitamina D.

14. - La preparación combinada según la reivindicación 13, donde el agonista de los receptores de vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, d oxe rea Icif eral y maxacalcitol.

15. La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde el agonista de los receptores de vitamina D es el calcitriol.

16. - La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que además comprende angiotensina II.

17. - El uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en la elaboración de un medicamento.

18. - El uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. INVENCIÓN 2

USO DE UN AGONISTA SELECTIVO DEL RECEPTOR AT2 EN EL TRATAMIENTO DE

LAS CALCIFICACIONES VASCULARES.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la farmacia, y se refiere al uso de un agonista selectivo del receptor AT2, preferiblemente de la angiotensina, y aún más preferiblemente de la angiotensina II, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica dirigida a combatir la calcificación de los vasos sanguíneos, y especialmente al tratamiento de las calcificaciones vasculares asociadas al tratamiento con agonistas del receptor de la vitamina D.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad cardiovascular es la causa principal de muerte en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Los pacientes en hemodiálisis presentan aterosclerosis y arteriesclerosis. Estas enfermedades vasculares se empiezan a desarrollar en los estadios tempranos de la enfermedad renal, y conforme la enfermedad renal progresa, se produce un empeoramiento progresivo de la enfermedad cardiovascular. La afección cardiovascular de los pacientes con insuficiencia renal avanzada se caracteriza por calcificaciones en el ámbito de las capas íntima y media de la pared arterial. Las calcificaciones de las arterias producen disminución de la elasticidad de los vasos y el grado de calcificación se correlaciona con mortalidad.

Durante muchos años, se consideró que las calcificaciones vasculares de los pacientes con insuficiencia renal se debían a la deposición pasiva de sales de calcio, consecuencia de una sobresaturación por el aumento de las concentraciones plasmáticas de calcio y fósforo (aumento del producto Ca x P). Indudablemente, la hiperfosfatemia y el aumento del producto Ca x P contribuyen de forma importante a la calcificación vascular. La hiperfosfatemia es un predictor de mortalidad, posiblemente por su papel en la patogenia de las calificaciones. Para prevenir las calcificaciones vasculares en los pacientes renales, es esencial controlar el fosfato plasmático sin aportar un exceso de calcio, es decir, evitando utilizar quelantes intestinales de fósforo que contengan calcio.

Sin embargo, en la actualidad, se sabe que la calcificación vascular es un proceso activo regulado en el ámbito celular y por ciertos componentes del plasma, como son ciertas proteínas y otros factores patogénicos. Por tanto, hay proteínas que regulan la calcificación vascular, favoreciéndola o inhibiéndola. Es evidente que en los pacientes con patologías renales los mecanismos inhibidores son superados por los otros mecanismos que promueven la calcificación vascular, con lo que se produce un desequilibrio.

Entre las proteínas que modulan la calcificación extraósea se encuentran: Matrix gla-protein

Es una proteína extracelular que tiene afinidad por la hidroxiapatita. En el hueso, favorece la formación ósea y, en la arteria, inhibe la calcificación. La matrix gla-protein (MGP) es dependiente de la vitamina K y su función se afecta por la warfarina o acenocumarol. La MGP inhibe la actividad de la bone matrix protein 2a (BMP2a), que es una proteína procalcificante. Se ha comprobado que un ratón deficiente en MGP muestra calcificaciones arteriales difusas.

Fetuína

Es la glucoproteína a2-Heremans-Schmid (Ahsg) o fetuína A. Esta proteína sérica es un importante inhibidor de las calcificaciones extraóseas. La concentración de fetuína disminuye en situaciones de inflamación (respuesta celular inmunitaria). Esta proteína disminuye la precipitación de calcio y fósforo in vitro. Se ha visto que un ratón deficiente en fetuína muestra calcificaciones arteriales difusas. La importancia clínica de la fetuína quedó ilustrada en un trabajo que demostró una asociación entre mortalidad cardiovascular y valores bajos de fetuína en pacientes en hemodiálisis. Se ha descrito que el complejo proteico fetuína/MGP inhibe la precipitación de sales de calcio y la formación de hidroxiapatita. También parece que la inhibición de la calcificación por fetuína depende de la formación de complejos proteicos estables que incorporan los núcleos de mineral.

Osteoprotegerina

En el hueso la interacción de osteoprotegerina (OPG-L) con su receptor RANK (del inglés receptor-activator of NF-κΒ) regula la diferenciación, la activación y la apoptosis de los osteoclastos. Se ha visto que en ratones deficientes en OPG, se produce osteoporosis y calcificación arterial. Osteopontina

Es un potente inhibidor de la deposición de hidroxiapatita en cultivos de células de músculo liso vascular (VSMC). Además, protege a las células endoteliales de la apoptosis que se produce por deprivación de factores de crecimiento. Las proteínas más importantes que favorecen la calcificación son la fosfatasa alcalina, la osteonectina, la osteocalcina y el BMP2. Estas proteínas se expresan en abundancia en pared vascular calcificada y en cultivos de células de músculo liso vascular en los que se inducen calcificaciones.

Entre los factores patogénicos se encuentran: Hiperíosfatemia

El aumento de la concentración de fósforo en el medio en cultivos de VSMC induce la calcificación de estas células. Para que el fósforo induzca la calcificación de las VSMC, necesita que haya un transporte activo desde fuera al interior de la célula (Pit-1), y que subsecuentemente se induzca el Cbfa-1 , factor de transcripción específico de osteoblastos que regula la expresión de proteínas procalcificantes. Se ha observado que usando ácido fosfonomórfico (PFA) se puede evitar el transporte celular del fósforo. El efecto calcificante del fósforo, necesita una alteración previa de la pared vascular que facilite o promueva la transformación fenotípica de las VSMC hacia osteoblasto.

Uremia

Estudios realizados in vitro con VSMC demuestran que el suero urémico es capaz de inducir su calcificación, de forma independiente de la concentración de fósforo. En las arterias calcificadas de los pacientes urémicos, hay un aumento de expresión del Cbfa-1 en el ámbito de las capas media e íntima.

Hipercalcemia

También se ha demostrado que un aumento de la concentración de calcio ejerce un efecto estimulador directo en la calcificación. En cultivos de VSMC, la concentración elevada de induce calcificación incluso cuando el fósforo no está aumentado. Al igual que el fósforo, el calcio elevado también estimula la expresión del transportador Na-P (Pit-1), y la inhibición de este transportador inhibe la calcificación inducida por el calcio. También el calcio elevado induce expresión de Cbfa-1. La hiperfosforemia y la hipercalcemia inducen calcificaciones vasculares de forma independiente, pero conjuntamente ejercen un efecto sinérgico que favorece las calcificaciones vasculares. Es importante señalar que, en presencia de un fósforo elevado, un pequeño aumento de calcio supone una calcificación exagerada.

Microvesículas

El primer paso en el proceso de calcificación es la acumulación de calcio y fósforo en vesículas que proceden de la apoptosis de VSMC (cuerpos apoptóticos), o que son liberadas por células de la pared vascular de estirpe osteoblástica que expresan el Cbfa-1 (matrix vesicles).

Además de estos factores, existen fármacos que inducen las calcificaciones vasculares. Así, El calcitriol (DCI) o 1-alpha,25-dihidroxicolecalciferol (abeviado1 ,25-(OH)2D3) es la forma activa de la vitamina D que se encuentra en el cuerpo (vitamina D3). Se utiliza para tratar el hiperparatiroidismo secundario en los pacientes urémicos. Pero el calcitriol aumenta la absorción intestinal de calcio y fósforo, y produce hipercalcemia e hiperfosfatemia, lo cual puede favorecer la calcificación vascular. El peligro de calcificación por vitamina D es mayor si se administra a pacientes con hiperfosfatemia que se están tratando simultáneamente con quelantes de fósforo que contienen calcio. Además, algunos autores han encontrado que el calcitriol estimula la calcificación vascular por acción directa en la pared vascular.

En la actualidad, se pueden utilizar en el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario otros análogos de la vitamina D, como el paricalcitol o el 22-oxacalcitriol (OCT), que sin dejar de inhibir la PTH, parecen tener menos efecto en la absorción intestinal de calcio y fósforo. En un estudio reciente, se ha mostrado una mortalidad menor en pacientes en hemodiálisis que están siendo tratados con paricalcitol, comparados con los tratados con calcitriol. Una de las posibles razones que expliquen el efecto beneficioso del paricalcitol en la mortalidad puede ser un menor efecto hipercalcémico e hiperfosfatémico.

Una alternativa al tratamiento con calcitriol es el uso de calcimiméticos, activadores alostéricos del receptor de calcio (RCa), que desde hace unos años se utiliza para el control del hiperparatiroidismo secundario en pacientes urémicos. Se ha analizado el efecto del calcitriol y del calcimimético sobre las calcificaciones vasculares en ratas urémicas con hiperparatiroidismo secundario (López et al., 2006. J Am Soc Nephrol 17(3):795-804). La administración de calcitriol en dosis necesarias para controlar el hiperparatiroidismo, producía calcificaciones graves de la pared de los vasos; la administración de calcimiméticos controló el hiperparatiroidismo y no produjo calcificaciones. Además, lo más importante es que en ratas que recibían la combinación de calcitriol y calcimiméticos tampoco se observaron calcificaciones, es decir, que el calcimimético es capaz de evitar las calcificaciones inducidas por el calcitriol. Una posible explicación sería que en los animales tratados con calcimiméticos existe un moderado descenso de calcio y fósforo en comparación con los animales tratados con calcitriol, sin embargo las ratas tratadas con calcitriol y calcimiméticos tenían valores altos de calcio y fósforo. El hecho de que ratas tratadas con calcimiméticos tienen aumento de la MGP (proteína anticalcificante) hace pensar en un efecto directo del calcimimético sobre la pared vascular. En cultivos de VSMC bovinas (BVSMC) se ha demostrado la presencia del RCa y la calcificación se asocia a una disminución de los niveles de expresión de RCa, lo que podría ser inherente a la transformación osteoblástica (Block et al., 2004. N Engl J Med; 350:1516-25).

En los últimos años se viene caracterizando la implicación de la ruta Wnt^-catenina, en los procesos de calcificación. La activación de Wnt^-catenina conduce a un incremento de la proliferación y de la osteogénesis (Dahlóf 2010. Am J Cardiol. 4; 105(1 Suppl): SAGA). Su activación también se ha relacionado con la metilación e inhibición de promotores génicos.

Hace casi un siglo, en 1898, se descubrió que el extracto del riñon produce un fuerte efecto vasopresor; a este principio se le dio el nombre de renina. Posteriormente se descubrió que la renina no era vasopresora por sí misma, sino que era una enzima que convertía a un producto inactivo del plasma, el angiotensinógeno, en uno activo, la angiotensina. La angiotensina es una hormona que descubrieron el doctor Braun- Menéndez y su grupo, en Argentina hacia 1939. Casi al mismo tiempo, el grupo de Page, hizo el mismo descubrimiento. Cada uno de estos grupos dio un nombre al compuesto generado en el plasma, el primero lo llamó "hipertensina" y el segundo "angiotonina". Fue necesario que pasaran casi 20 años, para que se pusieran de acuerdo los investigadores del campo en el nombre adecuado para la hormona, y en 1957 se le dio el nombre híbrido de angiotensina.

Actualmente se sabe que hay tres angiotensinas: la I , la I I y la I I I , las cuales son productos cada vez más pequeños; es decir, del angiotensinógeno se forma la angiotensina I, de ella la angiotensina II y de ésta a su vez la angiotensina III; la más activa es la angiotensina II.

A partir del angiotensinógeno, un péptido de 14 aminoácidos y por acción de una enzima proteolítica (renina) se forma la angiotensina I I por acción de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), este octapéptido estimula la sed, ingesta de líquido, aumento de la presión sanguínea y secreción de aldosterona.

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una proteína catiónica, estable frente al calor, que se halla en una diversidad de tipos de células, incluyendo los gránulos de plaquetas circulantes, células de músculos lisos vasculares, células endoteliales, macrófagos y queratinocitos, y es sabido que estimula la síntesis in vitro de proteínas y la producción de colágeno por fibroblastos. También es conocido que actúa como un agente mitógeno y quimiotáctico in vitro para fibroblastos, células de músculos lisos, osteoblastos y células gliales.

El PDGF fue descrito inicialmente por Ross et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 71 , 1207- 1210 (1974), como un factor encontrado en el suero completo de sangre (pero no en el suero escaso en plaquetas) que es capaz de apoyar el crecimiento de los fibroblastos en el cultivo . El PDG F se aisló su bsig uientemente de las plaquetas y del suero, identificándose el PDGF no reducido natural como una proteína dimera de 27-35 kd de peso molecular. Se encontró que la reducción del PDGF proporcionaba dos o más bandas más pequeñas sobre geles, en un intervalo de peso molecular de 10-18 kd. Se creyó que estas bandas más pequeñas representaban dos subunidades monómeras distintas más pequeñas de aproximadamente 18 kd y 16 kd de pesos moleculares denominadas, respectivamente, las subunidades "A" y "B", o alternativamente, la cadena A de PDGF y la cadena B de PDGF. Las secuencias de aminoácidos de las dos subunidades del PDGF ya han sido descritas, identificándose la secuencia de aminoácidos de la cadena B del PDGF homologa en más del 90% al producto proteínico predicho de v-sis, el oncogen contenido en el virus de sarcoma de simio oncogénico (SSV); véase Doolittle et al., Science, 221 , 275-276 (1983), y Waterfield et al., Nature, 304, 2810-2814 (1983). Se ha encontrado que la cadena A es homologa en aproximadamente un 60% a la cadena B. Se cree que el PDGF es biológicamente activo sólo en forma dimera. Estos dimeros de PDGF biológicamente activos pueden tomar forma de un heterodímero PDGF-AB, un homodímero PDGF-BB o un homodímero PDGF-AA. Cada subunidad monómera del dímero biológicamente activo, independientemente de si es un monómero de cadena A o un monómero de cadena B, contiene ocho residuos de cisteína. Algunos de estos residuos de cisteína forman enlaces disulfuro entre cadenas que mantienen juntos los dímeros.

La secuencia homologa de v-sis de 109 aminoácidos (PDGF B ₁₀ g), identificada por Johnsson et al. 1984. EMBO Journal, 3(5), 921-928 como la forma madura de PDGF B, se ha utilizado en tecnología recombinante empleando levadura y otros sistemas de células hospedantes eucariotas para obtener PDGF recombinante activo (rPDGF) (US 4.766.073).

Se ha mostrado que un PDGF-BB humano recombinante (=rhPDGF-BB) estimula la curación de heridas y la regeneración de huesos tanto en animales como en seres humanos. Ha sido aprobado tanto en los Estados Unidos de América como en Europa para el uso humano en aplicaciones por vía tópica con el fin de acelerar la curación de llagas de pies diabéticos crónicos. Se ha mostrado también que un hPDGF-BB recombinante es efectivo, o bien a solas o en combinación con otros factores de crecimiento, para mejorar la regeneración periodontal, es decir el crecimiento renovado de hueso, cemento y ligamento alrededor de los dientes (US 5.124.316).

La presencia de calcificaciones vasculares altera la estructura y la función vascular, si endo éstas las res ponsables de la aparici ón de eventos cardi ovascu lares potencialmente mortales como la cardiopatía isquémica, la insuficiencia cardíaca, los accidentes cerebrovasculares y la enfermedad vascular periférica. Estudios clínicos han mostrado asociación entre la presencia de calcificación en la íntima y/o en la media arterial y mayor riesgo de mortalidad cardiovascular y global.

Hasta ahora, la calcificación vascular se ha considerado un proceso irreversible, y el esfuerzo se ha encaminado a enlentecer la progresión de las mismas. Dado que en la última década diversos estudios epidemiológicos han identificado la calcificación vascular como un factor pronóstico independiente de mortalidad cardiovascular, tanto en la población general como en la población urémica, es necesario encontrar un tratamiento adecuado para la misma, que permita la regresión de la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han demostrado que el uso de un agonista selectivo del receptor AT2, y en particular de la angiotensina II, así como de sus composiciones farmacéuticas, es útil para el tratamiento de la calcificación vascular. Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un agonista selectivo del receptor AT2 en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o también alternativamente, a un agonista selectivo del receptor AT2 para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina, un análogo de angiotensina, una variante o un fragmento biológicamente activo de la angiotensina o del análogo de angiotensina. En una realización aún más preferida, es la angiotensina II (A II), una variante o un fragmento biológicamente activo de la angiotensina II.

Los análogos de la angiotensina pueden ser agentes peptídicos o agentes no peptídicos (p. ej., peptidomiméticos) que presentan el requisito de la actividad agonista de AT2.

El término "selectivo" en esta memoria hace referencia a que el agonista prefiere actuar frente a los receptores de tipo AT2 frente a otros, aunque esta preferencia no implica una exclusión absoluta, pudiendo actuar también sobre otros receptores, aunque en menor medida.

La a n g i ote n s i n a e s u n a h o rm o n a pe ptídica que causa vasoconstricción y subsiguientemente incrementa la presión sanguínea. Es parte del sistema renina- angiotensina. La angiotensina también estimula la liberación de aldosterona, otra hormona, del córtex adrenal. La aldosterona promueve la retención de sodio en la nefrona distal, en el riñon, lo que también origina un aumento de la presión sanguínea. Existen varios tipos de angiotensina (I, II, III, IV). La angiotensina I parece no tener actividad biológica, y existe solamente como precursor de la angiotensina II.

La angiotensina I se convierte en angiotensina II (Al I) a través de la eliminación de los residuos C-terminal por la enzima convertidora de angiotensina (ECA).

LA angiotensina II es un octapéptido que actúa como una hormona endocrina, autocrina/paracrina, e intracrina y que presenta la secuencia SEQ ID NO: 1.

Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 1)

Los análogos activos de Al l , los fragmentos de Al l y los análogos de los mismos de especial interés según la presente invención comprenden una secuencia constituida por al menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R ¹ a R ⁸ en la secuencia de fórmula general (I):

R ¹ -R ² -R ³ -R ⁴ -R ⁵ -R ⁶ -R ⁷ -R ⁸

Fórmula (I) en la que R ¹ se selecciona de manera adecuada de entre H, Asp, Glu, Asn, Acpc (ácido 1-aminociclopentanocarboxílico), Ala, Me ² Gly, Pro, Bet, Glu(NH ₂ ), Gly, Asp(NH ₂ ) y Suc, R ² se selecciona de manera adecuada de entre Arg, Lys, Ala, Orn, Ser(Ac), Sar, D-Arg y D-Lys,

R ³ se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu, norLeu, lie, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr, mientras que Lys se ha observado que también es eficaz en este resto;

R ⁴ se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(P0 ₃ ) ₂ , Thr, Ser, homoSer, azaTyr, y Ala;

R ⁵ se selecciona de entre el grupo constituido por lie, Ala, Leu, norLeu, Val y Gly;

R ⁶ es His, Arg o 6-NH ₂ -Phe;

R ⁷ es Pro o Ala; y

R ⁸ está ausente o se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), lie y Tyr, excluyendo las secuencias que incluyen a R ⁴ como un grupo Tyr terminal.

Los compuestos comprendidos dentro de la categoría de agonistas de AT2 útiles en la puesta en práctica de la invención incluyen los análogos de Al l indicados anteriormente sometidos a la restricción de que R ⁶ es p-NH ₂ -Phe.

Secuencias preferidas de análogos incluyen las siguientes: AHI o AII(2-8), Arg-Val-Tyr-lle- His-Pro-Phe; AII(3-8), conocido también como desl-AIII o AIV, Val Tyr-lle-Pro-Phe; All(1- 7), Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro; AII(2-7), Arg-Val-Tyr-lle His-Pro; AII(3-7), Val-Tyr-lle-His- Pro; AII(5-8), lle-His-Pro-Phe; AII(1-6), Asp Arg-Val-Tyr-lle-His; AII(1-5), Asp-Arg-Val-Tyr- lle; Al 1(1 -4), Asp-Arg-Val-Tyr; y Al 1(1 -3), Asp-Arg-Val. Otras formas de realización preferidas comprenden: Arg-norLeu-Tyr-lle-His-Pro-Phe y Arg-Val-Tyr-norLeu-His-Pro Phe. Todavía otra forma de realización preferida comprendida dentro del alcance de la invención es un péptido que presenta la secuencia Asp-Arg-Pro Tyr-lle-His-Pro-Phe. AII(6-8), His-Pro-Phe y AII(4-8), Tyr-lle His-Pro-Phe.

Otra clase de compuestos especialmente preferidos según la presente invención consiste en los que presentan la estructura general siguiente:

Asp-Arg-R ¹ -Tyr-lle-His-Pro en la que R ¹ se selecciona de entre el grupo constituido por Lys, Leu, norLeu, Val, lie y Ala.

Otra clase de compuestos de especial interés según la presente invención es la de la de fórmula general (II):

R ² -R ³ -R ⁴ -R ⁵ -R ⁶ -R ⁷ -R ⁸

Fórmula (II)

en la que

R ² se selecciona de entre el grupo constituido por H, Arg, Lys, Ala, Orn, Ser(Ac), Sar, D- Arg y D-Lys;

R ³ se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu, norLeu, lie, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr;

R ⁴ se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(P0 ₃ ) ₂ , Thr, Ser, homoSer, azaTyr, y Ala;

R ⁵ se selecciona de entre el grupo constituido por lie, Ala, Leu, norLeu, Val y Gly;

R ⁶ es His, Arg o 6-NH ₂ -Phe;

R ⁷ es Pro o Ala; y

R ⁸ está ausente o se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), lie y Tyr.

Una subclase especialmente preferida de compuestos de fórmula general (II) presenta la Fórmula (III):

R ² - R ³ -Tyr- R ⁵ -His-Pro-Phe

Fórmula (III) en la que R ² , R ³ y R ⁵ son como se definieron anteriormente. Especialmente preferida es la angiotensina III de fórmula Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe. Otros compuestos preferidos incluyen los péptidos que presentan las estructuras Arg-Val-Tyr-Gly-His-Pro-Phe y Arg- Val-Tyr-Ala-His Pro-Phe.

Otras formas de realización especialmente preferidas comprenden: 1 GD Ala4-AII-(1-7) DRVAIHP

2GD Pro3-AII-(1-7) DRPYIHP

5GD Lys3-AII-(1-7) DRKYIHP

9GD Norl_eu-AII-(1-7) DR-(nor)-YIHP

GSD 28 lle ^a -AII DRVYIHPI

Ala3aminoPhe6 All DRVYIF*PF

Ala3-AIII RVAIHPF

Gly1-AII GRVYIHPF

NorLeu4-AIII -RVYnLHPF

Acpc3-AIII DR-(Acpc)-YIHPF

GSD3 37B Om2-AII D-(Om)-VYIHPF

GSD38B Citron2-AII D-(Citron)-VYIHPF

3GD Pro3Ala4-AII-(1-7) DRPAIHP

En las fórmulas anteriores, se emplean las abreviaturas habituales de tres letras para los restos de aminoácidos. En ausencia de una indicación para lo contrario, se propone la forma L del aminoácido. Otros restos se abrevian de la forma siguiente:

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos y los derivados de la angiotensina II. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad de la angiotensina II, cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Por calcificación vascular, en la presente memoria, nos referimos a alteraciones en la pared vascular que se caracterizan por la aparición de depósitos de sales de calcio a nivel de las capas íntimas y media. Dentro del término calcificación vascular se incluye la calcificación coronaria.

Para la cuantificación de la calcificación coronaria, el algoritmo más empleado es el creado por Agatston (Agatston score), basado en estudios de TC con haz de electrones (TCHE) obtenidos con sincronización cardiaca prospectiva.

En función de la cantidad total de calcio observada, el riesgo de padecer enfermedad coronaria puede clasificarse en cinco categorías distintas:

Los agonistas o activadores del receptor de la vitamina D (Activadores del RVD), suprimen efectivamente la hormona paratiroidea y son usados rutinariamente para controlar el desarrollo y la progresión del hiperparatiroidismo secundario relacionado con la enfermedad renal crónica (ERC). Entre ellos se encuentra el 1 ,25-(OH)2D3 (calcitriol), el 19-nor-1 a,25(OH)2D2 (paricalcitol), el 1a-(OH)D2 (doxercalciferol). Y el 22-oxa- 1 a ^' (OH)2D3 (maxacalcitol). Estos activadores tienen un efecto calcémico y fosfatémico, siendo el de los tres últimos menor en comparación con el calcitriol.

Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la calcificación vascular es producida o es inducida por el tratamiento con al menos un agonista o activador del receptor de la vitamina D. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el agonista o activador del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

El calcitriol (DCI) o 1-alpha,25-dihidroxicolecalciferol (abeviado1 ,25-(OH)2D3) es la forma activa de la vitamina D que se encuentra en el cuerpo (vitamina D3). Lo producen los ríñones que hidrolizan del 25-hidroxicolecalciferol (25-OH D, o calcifediol) el cual es previamente hidrolizado en el hígado y regula los niveles de calcio, incrementando la absorción de calcio en el tracto gastrointestinal. Es un compuesto de fórmula (IV):

Fórmula (IV)

Al regular el nivel de calcio en la sangre, ayuda a mantener el calcio en los huesos y en el equilibrio químico en el cuerpo. Cuando el riñon no puede eliminar correctamente sustancias tóxicas por la orina, entonces tampoco expulsa fósforo. Al no eliminar los fosfatos en el organismo automáticamente baja el calcio; cuando esto sucede, la glándula paratiroidea lo detecta y empieza a segregar más cantidad de parathormona. Como lo hace constantemente, se transforma en una enfermedad que se llama hiperparatiroidismo secundario.

Se ha observado que la actividad de la Parathormona (PTH) esta íntimamente ligada a la presencia de Calcitriol, en ausencia de esta vitamina la acción de la PTH es sustancialmente menor.

El 19-nor-1 ,25-(OH)2-vitamina D2 o 19-nor-1 ,25-dihidroxivitamina D2 o paracalcitol, es un análogo del 1 ,25-dihydroxyergocalciferol, la forma activa de la vitamina D2. También se emplea para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundarios (secreción excesiva de parathormona). Es un compuesto de fórmula (V):

Fórmula (V)

El (1 S,3 ,5Z,7E,22E)-9, 10-secoergosta-5,7,10,22-tetraeno-1 ,3-diol, o doxercalciferol también se emplea para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario y para el tratamiento de la enfermedad metabólica ósea. Es un análogo sintético del ergocalciferol (vitamina D), de fórmula (VI):

Fórmula (VI)

El 1-alfa, 25-dihidroxi-22-oxacalcitriol o maxacalcitol es un análogo de la vitamina D3, de fórmula (VII).

Fórmula (VII)

En otra realización preferida de esta invención, angiotensina II, o sus sales, profármacos, derivados o análogos, variantes o fragmentos biológicamente activos pueden administrarse en una forma substancialmente pura a un mamífero, y preferiblemente un humano, o puede administrarse como parte de una composición más compleja. Cuando se administra formando parte de una composición, la cantidad de angiotensina II, o sus sales, profármacos, derivados o análogos, es tal que alcanza el efecto deseado, siendo por tanto una cantidad efectiva. Ejemplos de mezclas que pueden contener estos compuestos son, pero sin limitarse, soluciones o suspensiones para su administración por vía intradérmica, parenteral, y más preferiblemente, intravenosa.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende un agonista selectivo del receptor AT2, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. Alternativamente, también se refiere a una composición que comprende un agonista selectivo del receptor AT2, o cualquiera de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o cualquiera de sus combinaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina, un análogo o una variante biológicamente activa de la misma. Más preferiblemente, el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina II, o un análogo o una variante biológicamente activa de la misma. Preferiblemente, el agonista selectivo del receptor AT2 se encuentra en una solución o suspensión, y la vía de administración es la vía parenteral. Más preferiblemente, la vía de administración es la vía intravenosa.

U n "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquel las sustancias , o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agonista selectivo del receptor AT2, al menos un agonista del receptor de la vitamina D, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agonista del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol. En otra realización aún más preferida, el agonista o activador del receptor de la vitamina D es el calcitriol.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición además comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, un análogo, una variante, o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Otro aspecto se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en la prevención o tratamiento de la calcificación vascular, o alternativamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de la calcificación vascular.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende la composición farmacéutica de la i nvención . Para las vías intradérmica, parenteral o intramuscular, las formas farmacéuticas son, pero sin limitarse, la solución y la suspensión.

En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.

U na "solución" es una forma farmacéutica que consiste en un preparado líquido, transparente y homogéneo, obtenido por disolución de él o los principios activos y aditivos en agua, y que se utiliza para el uso externo o interno. En el caso de soluciones inyectables, oftálmicas y óticas deben ser soluciones estériles.

Una "suspensión" es una forma farmacéutica que consiste en un sistema disperso, compuesto de dos fases, las cuales contienen el o los principios activos y aditivos. Una de las fases, la continua o la externa es generalmente un líquido o un semisólido y la fase dispersa o interna, está constituida de sólidos (principios activos) insolubles, pero dispersables en la fase externa. En el caso de inyectables deben ser estériles.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, ... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agonista selectivo del receptor AT2, o de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o de sus combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es la calcificación vascular.

Otro aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende como principios activos un agonista selectivo del receptor AT2, y un activador del receptor de la vitamina D. En una realización preferida de este aspecto, el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo de la misma. Más preferiblemente, el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina II, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo de la misma. En otra realización preferida de este aspecto, el activador del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol. En una realización aún más preferida, el activador del receptor de la vitamina D es el calcitriol. En otra realización aún mucho más preferida, la preparación combinada de la invención, además comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial . De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" i mplica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento. Alternativamente, también se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento, o a la preparación combinada de la invención para su uso como medicamento.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular. Alternativamente, también se refiere a la composición de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, o a la preparación combinada de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica, o al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica. Alternativamente, también se refiere al agonista selectivo del receptor AT2, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo del mismo, o a la composición de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica, o a la preparación combinada de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de la enfermedad renal crónica.

La enfermedad metabólica ósea asociada con la enfermedad renal crónica, ERC (EMO- ERC) se define como un trastorno sistémico progresivo y multifactorial, que incluye el conjunto de alteraciones bioquímicas, anomalías óseas y calcificaciones extraesqueléticas anormales que acontecen en los pacientes con ERC. Cada una de estas complicaciones da como resultado, importantes consecuencias clínicas que condicionan, a su vez, elevada morbimortalidad en los pacientes urémicos

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del uso factor de crecimiento derivado de plaquetas, en el tratamiento de calcificación vascular de forma individual y en presencia de los fármacos calcitriol y paricalcitol.

ANGIOTENSINA II

Se ha evaluado el papel de angiotensina II, sobre el desarrollo de las calcificaciones vasculares.

Se llevaron a cabo estudios in vitro con células de músculo liso vascular (de aorta) de origen humano. Las Células de Músculo Liso Vascular (CMLV) provenientes de aorta humana se obtuvieron de una línea celular (Clonetics- Lonza Walkersville, Inc., EE.UU.). Las células se estudiaron entre el 5 ^o y el 8 ^o pase. El medio utilizado en las células en crecimiento fue SmBm (Smooth muscle Basal médium), suplementado con SmGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (Clonetics- Lonza Walkersville, Inc., EE.UU.) que contiene: Suero Fetal Bovino (15%), hEGF (Factor de crecimiento epidermal recombinante, humano), insulina, hFGF-B (Factor de crecimiento de fibroblastos β, humano), gentamicina y anfotericina-B. Las células en crecimiento se cultivaron en frascos de 75 cm ² (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Al alcanzar el 80% de confluencia, las células fueron subcultivadas de la siguiente manera: se retiró el medio de cultivo y las células adheridas al frasco fueron lavadas con suero fisiológico. Posteriormente, las células se levantaron añadiendo una solución de Tripsina/EDTA (Sigma Aldrich Inc, MO, EE. U U .) al frasco y se incubaron durante 5 minutos. Transcurrido el período de incubación, se añadió medio de crecimiento (15% FBS), para inhibir la acción de la tripsina. La suspensión celular fue centrifugada a 1.500 rpm, durante 5 minutos, a 20°C. El pellet se resuspendió en medio de crecimiento, y se extrajo una alícuota para contar las células. Para los estudios con CMLV, las células se cultivaron en placas de 6 pocilios (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.) (Fig. 1).

Recuento y medida de la viabilidad celular.

Para contar las células en cada subcultivo se añadió a la alícuota de suspensión celular la misma cantidad de Trypan Blue (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), se colocaron unos microlitros en una Cámara de Neubauer (Fig. 2) y se contaron las células vivas en cada cuadrante de 1 mm ² , en el microscopio.

El Tripan Blue es una molécula coloreada de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las células que tienen la membrana alterada. Por tanto una célula viva en perfecto estado se observará incolora mientras que una célula muerta o muy alterada se observará azul. De este modo se puede determinar la viabilidad celular.

(Células incoloras / células totales) x 100 = % viabilidad celular

La cámara de Neubauer (Fig. 2) es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. Tiene grabadas en su parte central, dos cuadrículas microscópicas con cuatro áreas de 4x4 cuadrados.

El volumen de cada zona es 1 x 1 x 0, 1 mL. Si contamos las células que hay en cada área, se puede calcular la concentración de la suspensión celular según la siguiente fórmula: Media de contajes de las cuatro zonas x 104 x 10 = núm. células/mL

Cuando las células en cultivo alcanzaron el 80% de confluencia, se inició el tratamiento con Fosfato. Para la inducción de calcificación en el modelo de CMLV se utilizó Fosfato Monobásico y Dibásico para preparar el medio alto fósforo. Los estudios de calcificación se llevaron a cabo durante 9 días, con una concentración de fósforo de 3,3 mM.

Cuantificación de Calcio.

Tras finalizar el tiempo del experimento, el medio de los pocilios fue retirado y los pocilios se lavaron dos veces con PBS (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.). Después las células se descalcificaron con HCI 0,6 N (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas, a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de C0 ₂ .

El contenido de calcio en el extracto ácido obtenido se determinó colorimétricamente por el método o-Cresoftaleína Complexona (Calcium C Test, WAKO Chemicals GmbH, Neuss, Alemania). Después de la descalcificación, las células fueron solubilizadas con NaOH 0,1 M (Panreac Química, SA, Barcelona, España) y SDS 0,1 % (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), y levantadas por el método de raspado. El contenido de proteína en la suspensión de células obtenida fue cuantificado por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Los pasos realizados tras finalizar el experimento se esquematizan en la Fig. 3.

Se evaluó el efecto de angiotensina II sobre la calcificación vascular independientemente, así como en presencia de calcitriol y paricalcitol, tras 9 días de tratamiento. Se utilizó la prueba de la t de student, para comprobar si las diferencias en el grado de calcificación vascular eran estadísticamente significativas.

Se realizó una curva dosis-efecto (Figura 4) para optimizar la dosis a emplear en los estudios posteriores. Así, las células de músculo liso vascular fueron mantenidas durante 9 días a diferentes dosis de angiotensina II: 10 ^"11 M-10 ^"4 M.

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos fueron (n=11):

0.35±0.04 (control);

2.70±0.23 (P), p<0.01 vs. control;

1.92±0.15 (P + All 10 ^"11 ); p<0.01 vs. P 1.94±0.10 (P + All 1CP); p<0.01 vs. P

1.89±0.20 (P + All 10 ^"7 ); p<0.01 vs. P

1.06±0.13 (P + All 10 ^"5 ) p<0.01 vs. P

1.34±0.20 (P + All 10 ^"4 ); p<0.01 vs. P

La adición de ninguna de las concentraciones de angiotensina II por sí solas produjo efecto alguno sobre los controles. Se eligió la concentración 10 ^"5 M, concentración a la que se obtiene una mayor inhibición de la calcificación.

El siguiente paso fue evaluar el efecto de angiotensina I I sobre la calcificación inducida por P en presencia de calcitriol 10 ^"8 M (inductor de la calcificación) y paricalcitol 3x10 ^"8 M (inhibidor parcial de la misma).

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos, tras 9 días de tratamiento se representan en la figura 5 y en valores absolutos fueron (n=12):

0.55±0.05 (control);

3.20±0.38 (P), p<0.01 vs. control;

0.69±0.02 (All 10 ^"5 );

1.86±0.38 (P + All 10 ^"5 ); p<0.01 vs P

5.26±0.61 (P + CTR 10 ^"8 ); p<0.01 vs P.

3.66±0.69 (P + CTR 10 ^"8 + All 10 ^"5 ); p<0.01 vs P + CTR.

2.13±0.38 (P + PC 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.45±0.46 (P + PC 10 ^"8 + All 10-5); pO.01 vs P

Estos datos sugieren que, angiotensina II reduce la calcificación inducida por niveles elevados de P así como por el tratamiento con calcitriol; sin embargo, no produjo una reducción adicional de la calcificación a la producida por el paricalcitol.

PDGF

Se ha evaluado el papel del factor de crecimiento derivado de plaquetas, sobre el desarrollo de las calcificaciones vasculares.

Se llevaron a cabo estudios in vitro con células de músculo liso vascular (de aorta) de origen humano. Las Células de Músculo Liso Vascular (CMLV) provenientes de aorta humana se obtuvieron de una línea celular (Clonetics- Lonza Walkersville, Inc., EE.UU.). Las células se estudiaron entre el 5 ^o y el 8 ^o pase. El medio utilizado en las células en crecimiento fue SmBm (Smooth muscle Basal médium), suplementado con SmGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors (Clonetics- Lonza Walkersville, Inc., EE.UU.) que contiene: Suero Fetal Bovino (15%), hEGF (Factor de crecimiento epidermal recombinante, humano), insulina, hFGF-B (Factor de crecimiento de fibroblastos β, humano), gentamicina y anfotericina-B. Las células en crecimiento se cultivaron en frascos de 75 cm ² (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Al alcanzar el 80% de confluencia, las células fueron subcultivadas de la siguiente manera: se retiró el medio de cultivo y las células adheridas al frasco fueron lavadas con suero fisiológico. Posteriormente, las células se levantaron añadiendo una solución de Tripsina/EDTA (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.) al frasco y se incubaron durante 5 minutos. Transcurrido el período de incubación, se añadió medio de crecimiento (15% FBS), para inhibir la acción de la tripsina. La suspensión celular fue centrifugada a 1.500 rpm, durante 5 minutos, a 20°C. El pellet se resuspendió en medio de crecimiento, y se extrajo una alícuota para contar las células. Para los estudios con CMLV, las células se cultivaron en placas de 6 pocilios (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.).

Recuento y medida de la viabilidad celular.

Para contar las células en cada subcultivo se añadió a la alícuota de suspensión celular la misma cantidad de Trypan Blue (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), se colocaron unos microlitros en una Cámara de Neubauer (Fig. 2) y se contaron las células vivas en cada cuadrante de 1 mm ² , en el microscopio.

El Tripan Blue es una molécula coloreada de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las células que tienen la membrana alterada. Por tanto una célula viva en perfecto estado se observará incolora mientras que una célula muerta o muy alterada se observará azul. De este modo se puede determinar la viabilidad celular.

(Células incoloras / células totales) x 100 = % viabilidad celular

La cámara de Neubauer (Fig. 2) es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. Tiene grabadas en su parte central, dos cuadrículas microscópicas con cuatro áreas de 4x4 cuadrados.

El volumen de cada zona es 1 x 1 x 0, 1 mL. Si contamos las células que hay en cada área, se puede calcular la concentración de la suspensión celular según la siguiente fórmula: Media de contajes de las cuatro zonas x 104 x 10 = núm. células/mL

Cuando las células en cultivo alcanzaron el 80% de confluencia, se inició el tratamiento con Fosfato. Para la inducción de calcificación en el modelo de CMLV se utilizó Fosfato Monobásico y Dibásico para preparar el medio alto fósforo. Los estudios de calcificación se llevaron a cabo durante 9 días, con una concentración de fósforo de 3,3 mM.

Cuantificación de Calcio.

Tras finalizar el tiempo del experimento, el medio de los pocilios fue retirado y los pocilios se lavaron dos veces con PBS (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.). Después las células se descalcificaron con HCI 0,6 N (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas, a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de C02.

El contenido de calcio en el extracto ácido obtenido se determinó colorimétricamente por el método o-Cresoftaleína Complexona (Calcium C Test, WAKO Chemicals GmbH, Neuss, Alemania). Después de la descalcificación, las células fueron solubilizadas con NaOH 0,1 M (Panreac Química, SA, Barcelona, España) y SDS 0,1 % (Sigma Aldrich Inc, MO, EE.UU.), y levantadas por el método de raspado. El contenido de proteína en la suspensión de células obtenida fue cuantificado por el método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Los pasos realizados tras finalizar el experimento se esquematizan en la Fig. 3.

Se observó el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas sobre la calcificación vascular independientemente, así como en presencia de calcitriol y paricalcitol tras 9 días de tratamiento. Se utilizó la prueba de la t de student, para comprobar si las diferencias en el grado de calcificación vascular eran estadísticamente significativas.

Se realizó una curva dosis-efecto (Fig. 6) para optimizar la dosis a emplear en los estudios posteriores. Así, las células de músculo liso vascular fueron mantenidas durante 9 días a diferentes dosis de factor de crecimiento derivado de plaquetas:

- 20 ng/ml.

40 ng/ml.

- 80 ng/ml.

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos fueron (n=18): 0.52±0.04 (control);

3.34±0.08 (P), p<0.01 vs. control;

1.15±0.21 (P + PDGF 20), p<0.01 vs. P;

1.83±0.13 (P + PDGF 40), p<0.01 vs P;

1.61 ±0.08 (P + PDGF 80) p<0.01 vs P.

La adición de ninguna de las concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas por sí solas produjo efecto alguno sobre los controles. Se eligió la concentración 20 ng/ml, concentración a la que se obtiene una mayor inhibición de la calcificación. El siguiente paso fue evaluar el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas sobre la calcificación inducida por P en presencia de calcitriol 10 ^"8 M (inductor de la calcificación) y paricalcitol 10 ^"8 M (inhibidor parcial de la misma).

Los niveles de calcificación ^grCa/mgrProt) obtenidos, representados en la Fig. 7, fueron (n=18):

0.33±0.05 (control);

2.88±0.3 (P), pO.01 vs. control;

0.41 ±0.04 (PDGF 20);

0.66±0.18 (P + PDGF 20); p<0.01 vs P

4.32±0.6 (P + CTR 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.92±0.18 (P + CTR 10 ^"8 + PDGF 20); p<0.01 vs P + CTR

1.90±0.3 (P + PC 3 x 10 ^"8 ); p<0.01 vs P

1.5±0.18 (P + PC 3 x 10 ^"8 + PDGF 20); p<0.01 vs P

Estos datos sugieren que, el factor de crecimiento derivado de plaquetas reduce la calcificación inducida por niveles elevados de P así como por el tratamiento con calcitriol; sin embargo, no produjo una reducción adicional de la calcificación a la producida por el paricalcitol. CLÁUSULAS

1. - Uso de un agonista selectivo del receptor AT2 en la elaboración de un medicamento, para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

2. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según la reivindicación anterior, donde el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina, o cualquiera de sus análogos, variantes o fragmentos biológicamente activos, o cualquiera de sus combinaciones.

3. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina II (A II), o cualquiera de sus análogos, variantes o fragmentos biológicamente activos, o cualquiera de sus combinaciones.

4. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el agonista selectivo del receptor AT2 es un péptido cuya secuencia está constituida por al menos tres aminoácidos contiguos de los grupos R ¹ a R ⁸ en la secuencia de fórmula general (I):

R ¹ -R ² -R ³ -R ⁴ -R ⁵ -R ⁶ -R ⁷ -R ⁸

Fórmula (I) en la que R ¹ se selecciona de manera adecuada de entre H, Asp, Glu, Asn, Acpc (ácido 1-aminociclopentanocarboxílico), Ala, Me ² Gly, Pro, Bet, Glu(NH ₂ ), Gly, Asp(NH ₂ ) y Suc,

R ² se selecciona de manera adecuada de entre Arg, Lys, Ala, Orn, Ser(Ac), Sar, D-Arg y D-Lys,

R ³ se selecciona de entre el grupo constituido por Val, Ala, Leu, norLeu, lie, Gly, Pro, Aib, Acpc y Tyr, mientras que Lys se ha observado que también es eficaz en este resto;

R ⁴ se selecciona de entre el grupo constituido por Tyr, Tyr(P0 ₃ ) ₂ , Thr, Ser, homoSer, azaTyr, y Ala;

R ⁵ se selecciona de entre el grupo constituido por lie, Ala, Leu, norLeu, Val y Gly;

R ⁶ es His, Arg o 6-NH ₂ -Phe;

R ⁷ es Pro o Ala; y R está ausente o se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Phe(Br), lie y Tyr, excluyendo las secuencias que incluyen a R ⁴ como un grupo Tyr terminal.

5. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la calcificación vascular es inducida por el tratamiento con al menos un agonista del receptor de la vitamina D.

6. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según la reivindicación 5, donde el agonista del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

7. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el agonista selectivo del receptor AT2 se encuentra en una solución o suspensión, y la vía de administración es la vía parenteral.

8. - El uso de un agonista selectivo del receptor AT2 según la reivindicación anterior, donde la vía de administración es la vía intravenosa.

9. - El uso de una composición farmacéutica que comprende un agonista selectivo del receptor AT2 según se describe en las reivindicaciones 1-8 , y u n ve h ícu l o farmacéuticamente aceptable, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.

10. - Una composición farmacéutica que comprende un agonista selectivo del receptor AT2, y al menos u n ago n ista del receptor de la vitam i na D , y u n veh ícu lo farmacéuticamente aceptable.

1 1. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el agonista del receptor de la vitamina D se seleccionan de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

12. - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 , donde el agonista del receptor de la vitamina D es el calcitriol.

13. - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que además comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, un análogo, una variante, o un fragmento biológicamente activa del mismo. 14. - Forma farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-13.

15. - Una preparación combinada que comprende como principios activos un agonista selectivo del receptor AT2, un agonista del receptor de la vitamina D.

16. - La preparación combinada según la reivindicación 15, donde el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo de la misma.

17. - La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde el agonista selectivo del receptor AT2 es la angiotensina II, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo de la misma.

18. - La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde el agonista del receptor de la vitamina D se selecciona de la lista que consiste en calcitriol, paricalcitol, doxercalciferol y maxacalcitol.

19. La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde el agonista del receptor de la vitamina D es el calcitriol.

20. - La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-19, que además comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas, un análogo, una variante o un fragmento biológicamente activo del mismo.

21. - El uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-20, en la elaboración de un medicamento.

22. - El uso por separado, simultáneo o secuencial de los principios activos de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 15-20, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular.