La présente invention a pour objet une méthode d'induction, de stimulation ou d'augmentation d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique chez un mammifère. Plus particulièrement, l'invention concerne la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique permettant de lutter contre des cellules malignes ou des cellules infectées par des agents pathogènes ou infectieux.

La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après"BVSMTM".

Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. Il s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur : -un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers ; -une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau, -une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.

Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux types, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.

Les demandes de brevet publiées sous les numéros WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM, leur fabrication, leur association à divers

principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques.

Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de ces vecteurs.

Des BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).

Ce polymère peut éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides, BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT W094/20078.

La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.

Les BVSM sont stérilisables par filtration et leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys.

Acta (1997), 1327, 32-40). Ceci permet de travailler les molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.

Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, N°6 pp. 511-520, « Combination of HCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of presentation to CD4+ T-cell clones in vitro »).

Il a aussi été montré que les BVSM augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc....

Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport substance active/BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 %.

La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM.

L'antigène est là aussi associé aux particules par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM utilisé (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, N°6 pp 511-520). Il faut noter que dans cette demande l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène concerne l'augmentation de la réponse CD4, T helper et/ou cytotoxique. Le mécanisme d'action soutenant cette propriété concerne 1'amélioration de la pénétration cellulaire notamment dans les cellules présentatrice d'antigène par la voie de l'endocytose, voie majoritairement décrite comme une voie de présentation par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, CMH II.

La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM permettent d'induire, de stimuler et d'augmenter l'expansion des lymphocytes TCD8 spécifiques d'un antigène, et présentent donc un intérêt remarquable pour la préparation de vaccins thérapeutiques. On entend par

induction, l'apparition de TCD8 spécifiques chez un individu naïf. On entend par stimulation, aussi désigné re- stimulation, l'augmentation du nombre de TCD8 spécifiques chez un individu qui de fagon naturelle ou par vaccination antérieure possède déjà des TCD8. Enfin, on entend par augmentation, aussi désignée potentialisation, le cas où l'association d'un antigène avec les BVSM permet d'augmenter le nombre de ces effecteurs TCD8 par rapport au nombre obtenu avec ce même antigène libre.

On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base entre autres de leur expression des antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules TCD4 sont généralement impliquées dans les fonctions « helper ». En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Les cellules TCD8 correspondent (majoritairement exprimés, par rapport au TCD4) aux cellules impliquées lors d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique dite de type CTL. En particulier une activité cytotoxique directe a été décrite pour certains lymphocytes TCD4+.

Il existe deux types de réponse immunitaire effectrice : la réponse humorale due aux anticorps et la réponse cytotoxique due majoritairement aux lymphocytes TCD8. Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL) en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilitê CMH de classe I, mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ en association avec les molécules de classe II du CMH.

Bien que les anticorps mucosaux et systémiques soient considérés comme jouant un rôle majeur dans la

prévention de certaines infections, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire, incluant l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique (CTL) est particulièrement nécessaire pour lutter contre les pathogènes intracellulaires (virus, bactéries ou parasites) et pour le contrôle des processus tumoraux. L'induction et la régulation des CTL sont dépendantes des cytokines (IL-2, etc) produites par la sous-population Thl des cellules helper CD4.

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouent un rôle critique dans la clearance des pathogènes intracellulaires aussi bien que dans le contrôle des tumeurs. Les lymphocytes TCD8 reconnaissent les fragments peptidiques, issus de la dégradation intracellulaire de l'antigène, sous forme d'un complexe avec les molécules du CMH de classe I exprimé à la surface de la cellule. Cette reconnaissance entraîne la lyse des cellules portant le complexe CMH-peptide antigénique. Les CTL génèrent également différentes lymphokines (IFN-y et TNF-a) qui peuvent en complément être directement cytolytiques.

L'induction de CTL est donc considérée comme une composante essentielle de vaccins conçus pour la prévention et le traitement de ces maladies.

Parmi les traitements actuellement proposés pour lutter contre les cancers et les infections virales chroniques, la vaccination prend une place de plus en plus importante. L'objectif d'une vaccination thérapeutique est d'induire ou de restimuler in vivo une réponse immunitaire spécifique capable de détruire des cellules infectées ou des cellules tumorales. La réponse immune des patients doit être modulée de telle sorte qu'elle devienne efficace et induise une réponse à médiation cellulaire spécifique d'antigènes exprimés par exemple par la tumeur et capable d'éliminer les cellules cancéreuses (Chestnut R. W. & al.

te Design and testing of peptide-based cytotoxic T-cell- mediated immunotherapeutics to treat infectious diseases and cancers » in : Vaccine design, Vol 6 (Eds Powell M. F. and Newman M. J.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 847- 874).

L'induction, la re-stimulation et l'expansion des CTL peuvent être obtenues par différentes approches, parmi lesquelles l'immunisation avec des peptides épitopes optimaux qui vont se lier aux molécules CMH classe I et être présentés aux récepteurs spécifiques des cellules T exprimés par les cellules TCD8. Cependant cette méthode ne s'adresse qu'à un seul peptide à la fois et nécessite la connaissance des épitopes dominants pour un antigène donné.

L'inclusion de ces épitopes dans des lipopeptides est une approche alternative qui permet, en plus de l'épitope TCD8+ l'introduction d'un peptide épitope TCD4+ dans le but d'apporter une réponse T auxiliaire pouvant jouer un rôle direct dans le contrôle d'une infection par exemple (cytokines anti-virales, activité cytotoxique directe) ou d'améliorer la réponse TCD8+ CTL, comme décrit dans les demandes de brevet européen No. 491 628 et PCT No. WO 99/51 630. La synthèse chimique de tels lipopeptides est cependant complexe et coûteuse.

L'injection d'un plasmide contenant un ADN codant, un antigène contre lequel une réponse immune est attendue est une nouvelle approche qui peut induire la stimulation de réponses humorales et cellulaires. Des réponses immunes chez l'animal ont été induites avec les gènes d'une variété d'agents infectieux. On peut citer par exemple un ADN plasmidique contenant un gène codant l'hemagglutinine d'influenza (Robinson H. L. and al.

« Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a hemagglutinin-expressing plasmid DNA M,

Vaccine, 1993,11, pp. 957-960), mais l'efficacité des vaccins ADN chez l'homme reste à prouver.

On peut encore améliorer la réponse CTL en utilisant des adjuvants, des vecteurs viraux ou synthétiques.

Le seul adjuvant actuellement autorisé chez l'homme du fait de sa relative innocuité est l'alum. Des études comparatives ont montré qu'il est un adjuvant relativement peu efficace pour la production d'anticorps, mais également pour l'induction d'une immunité cellulaire (Gupta & al : « Adjuvant properties of aluminium and calcium compounds » in : Vaccine design, the subunit and adjuvant approach. Powell, M. F., Newman, M. J. Plenum Press pp 229-248.).

Un autre adjuvant est actuellement autorisé chez l'homme en Italie et pourrait faire 1'objet d'une autorisation plus large : il s'agit du MF59. Il semble cependant que cet adjuvant ne permette pas une induction des TCD8.

Les vecteurs viraux bien que les plus efficaces pour induire une réponse cellulaire TCD8+, présentent de nombreux désavantages. D'une part, il est difficile d'obtenir un stock viral complètement non-réplicatif. Les risques de recombinaison avec des séquences virales endogènes peuvent potentiellement rendre le vecteur réplicatif et hautement pathogène. D'autre part, il existe des risques non négligeables de cancérogénèse par mutagénèse insertionnelle. De plus ces vecteurs viraux induisent une réponse immunitaire contre les protéines virales les rendant relativement inefficace lors d'une administration ultérieure.

L'utilisation de particules synthétiques pour l'induction d'une réponse CTL a été testée. Les résultats semblent cependant non homogènes. Ainsi Cahill obtient des

résultats équivalents lors de l'administration intranasale de FHA (Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin) en solution saline ou encapsulée dans des particules biodégradables. Cependant ces auteurs n'ont pas évalué la réponse CTL dans leurs essais, seule la présence d'une sécrétion d'IL-2 lors des contrôles de prolifération laisse penser à un profil Thl nécessaire à l'induction de CTL (Cahill E. S. & al. « Immune responses and protection against Bordetella pertussis infection after intranasal immunization of mice with filamentous haemagglutinin in solution or incorporated in biodegradable microparticles)), Vaccine, 1995,13 (5), pp. 455-62). Partidos encapsule un épitope CTL du measles virus dans des particules de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)). La réponse CTL obtenue lorsque l'épitope est encapsulé est inférieure à celle obtenue avec l'épitope administré dans une solution saline ou avec la CTB comme adjuvant (Partidos C. D. & al.

« Mucosal immunization with a measles virus CTL épitope encapsulated in biodegradable PLG microparticles M, j.

Immun. Methods 1996,195 (1-2), pp. 135-8).

Pour Moore, par contre, les résultats obtenus en encapsulant une protéine recombinante HIV dans du PLGA également semblent positifs. Cependant ces auteurs n'ont pas réalisé de contrôle avec l'antigène (Gpl20) libre, rendant difficile l'évaluation de l'apport des microparticules dans la réponse CTL obtenue (Moore A. & al « Immunization with a soluble recombinant HIV protein entrapped in biodegradable microparticles induce HIV- specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes and CD4 Thl cells Vaccine 1995,13 (8), pp. 1741-9).

Il a aussi été décrit dans la demande de brevet PCT No. WO 96/01647, l'utilisation de BVSM pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène vis-à-vis de la stimulation de clones de lymphocytes TCD4.

Or, comme indiqué précédemment, la Demanderesse a mis en évidence que les mêmes BVSM sont capables d'induire et de stimuler la production de lymphocytes TCD8 spécifiques d'un antigène qui leur est associé.

L'invention a donc pour objet une composition de vaccin thérapeutique comprenant des particules ayant une taille comprise 20 et 200 nm et comprenant un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, lesdites particules étant associées dans la composition à un ou plusieurs antigènes.

L'invention concerne tout particulièrement une composition de vaccin thérapeutique. Une telle composition peut bien entendu comprendre également un ou plusieurs excipient ou adjuvants appropriés.

Les compositions de l'invention sont remarquables en ce que de manière inattendue, les particules permettent d'induire, de stimuler ou d'augmenter une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique majoritairement TCD8.

En effet, les systèmes particulaires sont plutôt connus pour induire une réponse TCD4 par le mécanisme de l'endocytose (présentation aux molécules du CMH de classe II). Cependant des réponses TCD8+ sont possibles si les antigènes sont captés par des cellules dendritiques immatures. Pour obtenir une induction de lymphocytes TCD8, les peptides doivent être présentés par les molécules du CMH de classe I ce qui nécessite la dégradation des antigènes dans le cytosol cellulaire. Il est surprenant que les BVSM soient capables d'induire ces deux réponses qui font appel à deux mécanismes différents Ainsi, le mécanisme d'action des BVSM semble être d'une part l'augmentation de la pénétration cellulaire des antigènes par la voie de 1'endocytose, la concentration

de l'antigène dans les endosomes mais aussi une amélioration du transfert des endosomes vers le cytosol cellulaire, celui-ci permettant une meilleure présentation des épitopes obtenus par dégradation cytoplasmique et/ou endosomale de l'antigène, au molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I présent sur le réticulum endoplasmique.

Il n'est pas évident qu'un système choisi pour stimuler la production de TCD4 permette également la stimulation des TCD8. Ainsi, l'alum ne permet pas de stimuler la production de TCD8.

L'invention se rapporte donc tout particulièrement à l'utilisation de particules ayant une taille comprise 20 et 200 nm comprenant une noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, associées à des antigènes identiques ou différents, pour la préparation d'une composition de vaccin, lesdites particules induisant, stimulant ou augmentant une réponse immunitaire cellulaire T cytotoxique. L'invention a tout spécialement pour objet une composition de vaccin thérapeutique.

Les antigènes sont spécifiques de la ou des pathologies pour lesquelles une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique TCD8 est recherchée. Ainsi, la composition de vaccin thérapeutique selon l'invention peut être utile dans des méthodes pour prévenir et/ou traiter des infections chroniques d'origine virale, comme par exemple HSV, HIV, hépatite B et C, HPV, EBV, etc... ou d'origine bactérienne, comme Heliobacter pylori, tuberculose, etc... ou encore dues à des protozoaires, comme dans le cas de la malaria. La composition de vaccin thérapeutique selon l'invention est également utile pour

traiter des tumeurs, dans le cas de cancers (mélanome, cancer du sein, du colon, des ovaires etc...).

La taille des particules utilisées dans le cadre de l'invention est comprise entre 20 et 200 nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus préférentiellement entre 60 et 80 nm.

Le noyau hydrophile non liquide des particules est constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés.

Ces polysaccharides sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.

Avantageusement, des ligands ioniques sont greffés sur le noyau. Les ligands ioniques portent au moins sur une fonction choisie dans le groupe comprenant : phosphates, sulfates, acides carboxyliques, ammonium quaternaires, amines secondaires, amines primaires.

Une forme particulière de particules utilisées selon l'invention, comprend un noyau hydrophile non liquide tel que défini ci-dessus, recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles. Les composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs.

Une autre forme particulière de particules utilisées selon l'invention, comprend un noyau hydrophile non liquide tel que défini ci-dessus, recouvert en totalité ou en partie de deux couches de composés amphiphiles.

Avantageusement, le noyau hydrophile non liquide est couvert en totalité ou en partie d'une première couche d'acides gras, elle-même recouverte en totalité ou en partie d'un couche lipidique.

Les antigènes entrant dans les compositions de l'invention sont associés aux particules par des liaisons ioniques ou par des liaisons hydrophobes. Les antigènes peuvent être associés au noyau des particules ou à la couche externe de celles-ci.

L'invention est tout particulièrement adaptée à la préparation de compositions pour l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre mode d'administration, par exemple parentérale, peut être envisagé.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant : -Exemple 1 : l'association de la protéine chimérique IE1-pp65 aux BVSM.

-Exemple 2 : l'association de l'antigène HBS aux BVSM, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : . La figure 1 représente le sensorgramme obtenu lors de l'injection d'une suspension d'antigène HBS sur une sensorship saturé en BVSM visant à prouver l'association entre le BVSM et l'antigène (1 : injection de 20 pl de BVSM KY à 50 g/ml ; 2 : injection de 20 las de rHBsAg à 7,5 Fg/ml).

-Exemple 3 : la stimulation in vitro de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : . La figure 2 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées 2 fois par l'ALVAC-IE1 et re-stimulés in vitro soit par la vaccine-IE1, soit par la formulation IEl-pp65/BVSM, soit la chimère IE1-pp65.

. La figure 3 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant

de souris ayant été immunisées 2 fois par l'ALVAC-pp65 et re-stimulés in vitro soit par la vaccine-pp65, soit par la formulation IE1-pp65/BVSM soit la chimère IE1-pp65.

-Exemple 4 : la stimulation in vivo de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : . La figure 4 représente les résultats d'un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par l'ALVAC-pp65 et l'ALVAC- IE1 et « boostées)) soit par les formulations IE1- pp65/SMBV, soit par la protéine libre IE1-pp65. La stimulation in vitro est réalisée par les formulations IE1- pp65/SMBV. Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IE1 (figure 4A) L929-vacc-pp65 (figure 4B)/lyse L929-vacc-wt.).

. La figure 5 représente la réponse CTL anti- IE1, dans un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par les ALVAC-IE1 et ALVAC-pp65 et « boostées » soit par les formulations IE1-pp65/SMBV (figure 5A), soit par les ALVAC- IE1 et ALVAC-pp65 (Figure 5B). La stimulation in vitro est réalisée soit par les formulations IE1-pp65/SMBV, soit par les vaccines IE1, pp65 ou gB. Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IE1/lyse L929-vacc-wt.).

. La figure 6 représente la réponse CTL anti- pp65, dans un test de cytotoxicité obtenu pour les splénocytes provenant de souris ayant été immunisées par les ALVAC-IE1 et ALVAC-pp65 et « boostées M soit par les formulations IE1-pp65/SMBV (figure 6A), soit par les ALVAC- IE1 et ALVAC-pp65 (Figure 6B). La stimulation in vitro est réalisée soit par les formulations IE1-pp65/SMBV, soit par les vaccines IE1, pp65 ou gB. Les résultats présentés sont

les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-pp65/lyse L929-vacc-wt.).

-Exemple 5 : la re-stimulation de cellules TCD8+ cytotoxiques anti-pp65 de donneurs séropositifs vis à vis du CMV, où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : . La figure 7 représente la re-stimulation de CTL anti-I9Y à partir de PBMC d'un donneur HLAB35 séropositif en présence soit de la formulation BVSM/IEl- pp65, soit de la chimère IE1-pp65, par comparaison aux résultats obtenus par administration i. m. d'un ADN HBS (référence).

-Exemple 6 : l'induction in vivo de lymphocytes TCD8+ spécifiques de l'hépatite B par administration nasale, où il sera fait référence au dessins en annexe dans lesquels : . La figure 8 représente la réponse CTL spécifique HBS chez les souris immunisées par voie intranasale avec l'antigène Rhbs libre ou associé au BVSM.

Exemple 1 : Association de la protéine chimérique IE1-pp65 aux BVSM.

La protéine chimérique IEl-pp65 est décrite dans le brevet WO 98/26074. Les deux protéines IE1 et pp65 appartiennent au cytomégalovirus humain (HCMV). La protéine recombinante IE1-pp65 a été produite et purifiée à partir de cellules d'insectes Sf9 infectées par un baculovirus recombinant codant la protéine chimère IE1-pp65.

Les BVSM cationiques sont décrits dans le brevet WO 94/20078. Ils sont composés d'un noyau polysaccharidique (NPS) réticulé et fonctionnalisé (avec une charge de 2mEq/g) associé à une bicouche lipidique, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) et cholestérol (70/30 w/w), dans un rapport lipide/NPS de 30/100 (w/w).

La chimère est diluée en PBS (Phosphate Buffered Saline de composition 2.5 mM de NaH2PO4 et Na2HPO4, 30 mM NaCl, 0,7 mM de KC1, pH 7,4) + 10% glycérol à une concentration de 1224pg/ml. Le BVSM sont dilués en eau à une concentration de 20,4mg/ml en NPS et de 6.06mg/ml en lipides. Plusieurs formulations ont été réalisées : Les formulations IE1-pp65/BVSM (rapport 1/10 en NPS) sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IE1-pp65 pour une administration parentérale. La formulation est réalisée par un mélange de 81,7y1 (soit10µg) de IEl-pp65 à 1224pg/ml avec le BVSM KY7125 (lmg de NPS soit 49µl). Les formulations sont diluées à raison de 19,3p1 de tampon PBS + 10% glycérol afin d'administrer un volume final de 150µlo par souris.

Les formulations IE1-pp65/BVSM (rapport 1/1 en NPS) sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IE1-pp65. Celles-ci sont réalisées pour les études in-vitro. La formulation est réalisée par un mélange de 81, 7u1 (soit 10µg) de IE1-pp65 à 1224µg/ml avec le BVSM (10pg de NPS soit 5µl de BVSM à 2mg/ml) Les formulations sont diluées à raison de 913,3u1 de tampon PBS + 10% glycérol soit lOpg/ml (67nM) en protéine.

La caractérisation de l'association est réalisée soit par électrophorèse en condition native soit par résonance plasmonique de surface (Biacore X, Pharmacia). Dans ces deux techniques une association supérieure à 85% peut-ère démontrée.

Exemple 2 : Association d'une protéine recombinante, l'antigène HBS, aux BVSM.

La protéine recombinante (rHBsAg de Rhein Biotech) correspond à la protéine de surface du virus de

l'hépatite B. La protéine recombinante a été produite et purifiée à partir de cellules de Hansenula polymorpha par une technique de DNA recombinant codant pour la protéine de surface. La protéine est fournie à 1310 pg/ml en NaCl 154mM, phosphate de sodium pH 7,0 10 mM.

Les BVSM cationiques sont décrits dans le brevet WO 94/20078. Ils sont composés d'un noyau polysaccharidique (NPS) réticulé et fonctionnalisé avec une charge de 2mEq/g associé à une bicouche lipidique, Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPPC) et cholestérol (70/30 w/w), dans un rapport lipide/NPS de 30/100 (w/w).

Deux types de formulation ont été réalisées par ajouts successifs : -suspension de BVSM KY, -suspension de rHBsAg.

La préparation est"vortexée"après chacun des ajouts.

Ces deux formulations permettent d'obtenir un ratio rHBS/BVSM de 1/40 etl/72 (W : W) respectivement.

Les formulations sont caractérisées par mesure de taille des particules obtenues sur les formulations diluées en PBS de façon à ce que leur concentration en BVSMTM KY soit de 1 g/l, sur une suspension de rHBsAg diluée en eau ou en NaCl 150 mM de façon que la concentration en rHBsAg soit de 0,19 g/1.

Le tableau I ci-dessous représente les mesures des tailles moyennes des particules de deux formulations.

Tableau 1 Caractéristiques Taille Polydispersité (nm) 500 jug rHBsAg/20000 pg BVSMTM KY/ml 194 0,46 500 jug rHBsAg/36000 Ug BVSMTM KY/ml 162 0, 49

Les mesures réalisées sur Granulomètre Zetasizer 3000 (MALVERN) montrent que la taille moyenne des particules est de 40 nm environ pour l'antigène libre.

A l'inverse les tailles moyennes de partcicules sont d'environ 200nm (Table 1) pour les formulation rHBsAg/BVSM.

Les formulations sont caractérisées par résonance plasmonique de surface. Dans un premier temps l'existence d'interactions rHBsAg/BVSMTM KY est mise en évidence lors d'injections de solutions de rHBsAg sur sensor chip HPA (Sensor chip HPA, BR-1000-30, BIAcore, Uppsala, Suède) saturée en BVSMTM KY. Un exemple de tracé obtenu est présenté en figure 1.

Il apparaît clairement que la rHBsAg interagit avec les BVSMTM KY immobilisés sur la sensor chip HPA.

L'évaluation du taux d'association de rHBsAg aux BVSMTM KY est effectué par la même technique. Des injections de suspensions de rHBsAg à différentes concentrations (de 2,5 à 12,5 Hg/ml) sur Sensor chip HPA saturée en BVSMTM KY ont été réalisées. L'équation de la droite de régression est utilisée pour opérer un calcul du taux d'association à partir de la conversion des signaux obtenus en concentration de rHBsAg libre lors d'injections de formulations.

Les taux d'association déterminés par cette technique sont supérieurs à 95%.

Des injections de formulations à 500 jug rHBsAg/ ml présentant des rapports pondéraux rHBsAg/BVSMTM KY de 1/x avec x variant de 40 à 0, 1 ont été réalisées sur sensor chip HPA saturée en BVSMTM KY dans le but de vérifier que la présence de rHBsAg libre dans une formulation peut être détectée et quantifiée par résonance plasmonique de surface.

Pour x inférieur ou égal à 1 le taux d'association déterminé devient inférieur à 100% (40% environ pour x = 0,1 contre 99% pour x = 0,5).

La technique employée permet donc bien d'observer et de quantifier le rHBsAg libre dans une formulation.

Dans les formulations aux ratios pondéraux rHBsAg/BVSMTM KY de 1/72 et 1/40, le nombre de"sites" disponibles sur les BVMTM KY semble être très supérieur au nombre de"sites"nécessaires à l'association de la totalité du rHBsAg.

Ces études ont permis de montrer que l'antigène rHBsAg peut être formulé avec les BVSMTm KY. Les taux d'association déterminés par résonance plasmonique de surface dans des formulations rHBsAg/BVSMTM KY présentant des rapports pondéraux de 1/40 et 1/72 sont supérieurs à 95% et restent inchangés après 45 jours de conservation à 4°C.

Exemple 3 Stimulation in vitro de lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65.

1) Méthode.

Des souris femelles CBA (haplotype H-2K) (élevage Janvier) ont été immunisées à JO et éventuellement J15 avec des canarypox recombinant ALVAC-IE1 ou ALVAC-pp65 (Virogenetics). La dose administrée en intrapéritonéale (IP) par souris est de 2x105pfu diluée dans un volume final de 100p1 par souris.

15 jours après chaque immunisation, la rate est prélevée puis déposée dans un tube stérile de 45ml (Falcon) maintenu dans la glace et contenant du milieu de culture : RPMI 1640 (Gibco), 5% Sérum Veau Foetal (SVF), 2.10-5M 2- mercaptoethanol, 10mM Hépés, 2mM glutamine, Pénicilline, streptomycine, Pyruvate de Sodium.

Les splénocytes sont extraits stérilement, purifiés et repris à une concentration de 2.5x106 splénocytes/ml. Les splénocytes ainsi récupérés sont utilisés pour un test de cytotoxicité (relargage de chrome 51 par les cellules cibles).

Les cellules présentatrices d'antigènes « feeders » utilisées sont des splénocytes naïfs prélevés sur des souris CBA non immunisées. Après extraction et purification, ces splénocytes naïfs sont incubés (5x106 splénocytes/puits) pendant 90mn dans 500pl de milieu sans SVF en présence : -soit de vaccine-IE1 (Virogenetics) ; -soit de vaccine-pp65 (Virogenetics) ; -soit de chimère soluble IE1-pp65 Une solution est préparée : 67nM (10pg/ml) en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline de composition 2,5 mM de NaH2PO4 et Na2HPO4, 30 mM NaCl, 0,7 mM de KC1, pH 7,4) + 10% glycérol -soit avec la formulation IE1-pp65/BVSM : Les formulations IEl-pp65/BVSM à un rapport IE1-pp65/NPS de 1/1 (w/w) à 67nM (10µg/ml) en protéine sont formées par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène IE1-pp65 en tampon PBS (Phosphate Buffered Saline de composition 2,5 mM de NaH2Po4 et Na2HPO4, 30 mM NaCl, 0,7 mM de KC1, pH 7,4) + 10% glycérol ; Après l'incubation, 500p1 de milieu sont enlevés et remplacés par 2ml/puits de milieu avec SVF. On incube pendant 18h à 37°C et 5%CO2. Les splénocytes sont récoltés puis ils sont irradiés à 4000R.

La stimulation est réalisée en mélangeant par puits 2. 5X106 splenocytes/ml avec 1, 25x106 feeders/ml.

L'incubation se déroule pendant 5 jours à 37°C et 5% de CO2.

L'activité cytotoxique des cellules non adhérentes est testée par un test de relargage de 51Cr.

Pour ce test, les cellules cibles utilisées sont soit des L929 (H-2K) soit des P815 (H-2d) utilisées comme contrôle infectées par la vaccine-IE1, ou la vaccine-pp65 ou la vaccine-WT à une moi de 2,5 pendant 4h. Après lavage dans du milieu de culture, elles sont marquées au chrome (100pCi) pendant lh. Ces cellules chromées sont lavées 3 fois dans du milieu de culture, puis mélangées avec les cellules effectrices à différents rapports effecteurs/ cibles en réalisant des triplicates. L'incubation de 4h est réalisée à 37°C et 5% CO2. La radioactivité contenue dans le surnageant prélevé est comptée dans un compteur-cobra (Packard).

Le pourcentage de lyse spécifique correspond au rapport [cpm relargage expérimental-cpm relargage spontané/cpm relargage total-cpm relargage spontané]xl00.

La radioactivité totale a été comptée sur la suspension de cellules cibles incubées seules.

Le relargage spontané a été mesuré dans le surnageant des cellules cibles incubées seules. La déviation standard (SD) des triplicates est inférieure à 10% et le relargage spontané est inférieur à 25%.

2) Résultats.

La figure 2 donne les résultats de cytotoxicité obtenus pour les souris immunisées par l'ALVAC-IE1 et re- stimulés in vitro soit par la vaccine-IE1, soit par la formulation IE1-pp65/BVSM, soit par la chimère soluble.

La figure 3 donne les résultats de cytotoxicité obtenus pour les souris immunisées par l'ALVAC-pp65 et re- stimulés in vitro soit par la vaccine-pp65, soit par la formulation IE1-pp65/BVSM, soit par la chimère soluble.

Les résultats rassemblés dans le tableau 2 ci- dessous montrent l'apport des BVSM sur la stimulation des

CTL in-vitro avec une lyse spécifique anti IE1 de 39,9% lorsque les splénocytes sont restimulés in vitro par la formulation IE1-pp65/BVSM, 11,7% par la protéine chimère soluble et 34.9% par la vaccine-IE1 (figure 1).

Ces résultats sont confirmés avec une lyse spécifique anti pp65 de 31,9%, 12,2% et 22,3% respectivement lorsque les splénocytes provenant d'animaux immunisés avec ALVAC-pp65 sont stimulés in vitro par la formulation IE1-pp65/BVSM, par la protéine chimère soluble et par la vaccine-pp65 (figure 2).

Tableau 2 Restimulation in vitro 1 2 immunisation immunisations ALVAC-IE1 -FormulationIE1-pp65/BVSM 17,7% 39,9% -Chimère IE1-pp65 12, 2% 11, 7% -vaccine-IE1 20,5% 34,9% ALVAC-pp65 -FormulationIE1-pp65/BVSM 13, 80 31, 90 -Chimère IE1-pp65 0% 12,2% -vaccine-pp65 13,6% 22,3% Dans le tableau 2, les résultats de cytotoxicité sont obtenus pour les splénocytes provenant de souris immunisées 1 ou 2 fois par l'ALVAC-IE1 ou pp65 en fonction du mode de re-stimulation in vitro (ratio effecteurs/cibles 100/1). Les résultats présentés sont les pourcentages de lyse spécifique (delta pourcentage de lyse L929-vacc-IE1 ou L929-vacc-pp65/lyse L929-vacc-wt.) Ce tableau permet également de comparer les résultats obtenus lorsque les souris ont reçu une ou deux immunisations avec ALVAC-pp65 ou IE1. Dans tous les cas on obtient un meilleur pourcentage de lyse spécifique par une stimulation in vitro réalisée avec la formulation IE1- pp65/BVSM ou la vaccine (IE1 ou pp65). Par contre, ce

pourcentage reste faible lors de la stimulation avec la protéine chimère soluble IE1-pp65 seule.

Ces résultats montrent la capacité des formulations IE1-pp65/BVSM à permettre une présentation des épitopes de IE1 et de pp65 par les molécules du CMH de classe I et donc la capacité de ces formulations à stimuler et à expandre in vitro des effecteurs T CD8+ spécifiques de IE1 et pp65 induits in vivo par 1'ALVAC-IE1 et-pp65.

On peut également conclure de ces résultats que ces formulations IE1-pp65/BVSM permettent la stimulation in vitro des lymphocytes T CD8+ spécifiques de IE1 ou de pp65 de manière similaire à des systèmes vivant (vaccine IE1 ou pp65).

Exemple 4 : Stimulation in vivo de lymphocytes T CD8+ spécifiqueS de IE1 ou de pp65.

1) Méthode.

Une primo immunisation des souris CBA (souris femelles CBA (haplotype H-2K) (élevage Janvier) est réalisée par une administration par voie intrapéritonéale d'un mélange de deux poxvirus recombinants ALVAC-IE1 et ALVAC-pp65 (Virogenetics). La dose administrée en intrapéritonéal (IP) par souris est de lxl0Bpfu/souche diluée dans un volume final de 100pl par souris.

Deux rappels identiques in vivo par voie IP sont réalisés après la primo immunisation à J28 et J56 : -soit avec la protéine IE1-pp65 libre à raison de lOOpg/souris ou de 20pg/souris dans un volume final de 100p1/souris, -soit avec. la formulation IE1-pp65/BVSM : Les formulations sont des complexes formés par association de BVSM cationiques (type KY) et de l'antigène chimérique IE1-pp65 pour une administration IP, ces complexes sont en

suspension dans du PBS + 10% glycérol. Deux formulations sont utilisées. Pour la première, le rapport chimère/lipides est de 1/3 et chimère/NPS de 1/10. La dose est de 100pg de protéine IE1-pp65 dans un volume final de 150p1 par souris. Pour la seconde formulation, le rapport chimère/lipides est de 1/15 et chimère/NPS de 1/50. La dose est de 100µg de protéine IE1-pp65 dans un volume final de 100pl par souris, -soit avec les deux ALVAC recombinants (témoin positif), -soit avec du BVSM (témoin négatif). Celui-ci est administré à raison de lmg de BVSM (équivalent NPS) dans un volume final de 100pl par souris.

La réponse TCD8 est évaluée sur les splénocytes prélevés 15 jours après la dernière administration. Ce test de cytotoxicité par la technique de relargage de 51Cr est réalisé comme décrit dans 1'exemple précédent.

La stimulation in vitro est effectuée soit avec les formulations IE1-pp65/BVSM, soit avec la protéine chimère IE1-pp65, soit avec la vaccine-IE1,-pp65 et-gB.

2) Résultats.

La figure 4 résume les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IE1 et pp65) à J0, puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 avec divers antigènes : soit la formulation IE1n-pp65/BVSM à lOOpg/souris ou 20pg/souris correspondant à des rapports protéine/NPS de 1/10 ou 1/50 respectivement, soit la chimère soluble IE1-pp65 à 100µg/souris ou 20pg/souris, soit le BVSM. Les résultats obtenus sont présentés en fonction de la spécificité de la réponse : IE1 ou pp65.

2.1) Réponse contre la protéine IE1 : Les résultats obtenus montrent qu'une réponse spécifique contre la protéine IE1 est observée lorsque les

souris sont immunisées par la formulation IE1-pp65/BVSM à un rapport 1/10 et 1/50 (w/w). Ceci s'observe notamment lors de la stimulation in vitro par la formulation IE1- pp65/BVSM (lyse spécifique de 45 et 40% respectivement pour les souris immunisées par la formulation à 1/10 et 1/50 (w/w) alors que les souris immunisées par la chimère IE1- pp65 libre à lOOpg ou 20pg donnent 20% de lyse spécifique.

Ce résultat étant équivalent au témoin négatif (BVSM)) (Figure 4A).

Ce résultat est confirmé lors de la stimulation in vitro avec la chimère IE1-pp65 libre (15% et 3% respectivement pour la formulation IEl-pp65/SMBV et la chimère IE1-pp65). Ces résultats ne sont pas montrés.

La figure 5 compare les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IE1 et pp65) à J0, puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 soit la formulation IEl-pp65/BVSM à 100pg (figure 5A), soit les deux ALVAC-IE1 et-pp65 (figure 5B). Les résultats obtenus sont présentés en fonction du type de stimulation réalisée in-vitro (formulation IE1-pp65/SMBV, vaccine-IE1, pp65 ou gB). Dans ces conditions un peu saturantes, aucune différence significative ne peut être observée entre 1'ALVAC et les formulations IE1-pp65/SMBV.

Ainsi pour la réponse TCD8 dirigée contre la protéine IE1, les résultats permettent de conclure que : -La formulation IE1-pp65/BVSM stimule in vivo des T CD8+ spécifiques de IE1 après un priming par 1'ALVAC de façon similaire à la stimulation obtenue par un système vivant (les ALVAC). A l'inverse, la chimère IE1-pp65 libre ne permet pas d'obtenir cette stimulation in vivo quelle que soit la quantité administrée (100pg ou 20µg par souris).

-On observe une meilleure stimulation in vitro de T CD8+ spécifiques de IE1 par la formulation IE1-

pp65/BVSM par comparaison avec la chimère IE1-pp65 libre ainsi qu'avec la vaccine-IE1.

2.2) Réponse contre la protéine pp65 : Les résultats obtenus montrent qu'une réponse spécifique contre la protéine pp65 est observée lorsque les souris sont immunisées par la formulation IE1-pp65/BVSM à un rapport 1/10 et 1/50 (w/w). Ceci s'observe notamment lors de la stimulation in vitro par la formulation IE1- pp65/BVSM (lyse spécifique de 20 et 15% respectivement pour les souris immunisées par la formulation à 1/10 et 1/50 (w/w) alors que les souris immunisées par la chimère IE1- pp65 libre à 100pg ou 20pg ne permette pas d'obtenir de lyse significative (<10%) (figure 4B).

La figure 6 compare les résultats obtenus pour les souris ayant été immunisées avec les deux ALVAC (IE1 et pp65) à J0, puis ayant reçu deux rappels à J28 et J56 soit avec la formulation IE1-pp65/BVSM à 100pg (figure 6A), soit avec les deux ALVAC-IE1 et-pp65 (figure 6B). Les résultats obtenus sont présentés en fonction du type de stimulation réalisée in vitro (formulation IE1-pp65/SMBV, vaccine-IE1, pp65 ou gB). Dans ces conditions les ALVAC à l'inverse des formulations IE1-pp65/SMBV ne permettent pas l'obtention d'une lyse spécifique quelque soit le mode de stimulation in vitro (notamment avec la formulation IE1-pp65/BVSM et la vaccine-pp65).

Ces résultats démontrent l'apport du BVSM pour la stimulation du système immunitaire et notamment la réponse cellulaire T CD8+ spécifique de 2 protéines cibles majeures du HCMV, IE1 et pp65.

Exemple 5 : Re-stimulation de cellules TCD8+ cytotoxiques anti-pp65 à partir des PBMC de donneurs séropositifs vis à vis du CMV.

1) Méthodes.

1.1) Re-stimulation des CTL.

4 x 106 PBMC de donneurs de phénotype HLA connu (HLA-A2 ou HLA-B35 ou HLA-B7) ont été incubées en plaques 24 puits en présence de RPMI complémenté en sérum humain avec différentes sources d'antigènes : soit un peptide épitope connu issu de la protéine pp65 (CMV AD169) NLVPMVATV (N9V, HLA-A2) IPSINVHHY (I9Y, HLA-B35) RPHERNGFTV (R10V, HLA-B7), soit un peptide non-épitope, soit la protéine chimère IE1-pp65 soluble soit la formulation constituée de l'association entre le BVSM et la protéine IE1-pp65 soit les BVSM seuls. Aux jours 3 et 7 de 1'IL-7 est ajoutée (100U/ml, Biosource). Au jour 12, la restimulation est effectuée en utilisant des PBMC allogéniques irradiées (2000Rad) en présence des mêmes antigènes. Aux jours 13 et 15, de 1'IL-2 (20U/ml, Sanofi- Synthelabo, Labège) et de 1'IL-7 (10OU/puits) sont ajoutés.

1.2) Test de cytotoxicité.

Un test de relargage de chrome 51 est effectué 5 jours plus tard en utilisant comme cible des cellules B/EBV de phénotype HLA identique. 5 x 105 cellules cibles en 24 puits sont incubées en RPMI-10% SVF pendant 18 h avec avec un peptide relevant ou non relevant. Les cellules sont marquées avec du (51Cr) Na2CrO4 (100uCi par puits, ICN) pendant 2 h et lavées 3 fois en RPMI-SVF. Les cellules effectrices sont incubées avec 5 x 103 cellules cibles à des rapports effecteur/cible variable, en triplicate dans des plaques 96 puits et incubées pendant 5h. Le pourcentage de lyse est calculé selon la formule : (cpm de l'expérience

moins cpm relargués spontanément) divisé par (cpm maximal relargués moins cpm spontanés) x 100. Le relargage spontané représente toujours moins de 25% du relargage maximal. La déviation standart était inférieure à 5%.

2) Résultats.

La figure 7 montre les résultats obtenus lorsque des PBMC d'un donneur HLA-B35 ont été utilisés pour restimuler des CTL anti-pp65 en utilisant soit le peptide relevant I9Y, soit le peptide non relevant N9V, soit la protéine IE1-pp65, soit la formulation IE1-pp65/BVSM, soit le BVSM seul. La spécificité des CTLs obtenus a été testée en utilisant comme cibles des lymphocytes B transformés par EBV d'haplotype HLA-B35 incubés en présence du peptide I9Y.

Les résultats d'un test de re-largage de chrome 51 par les cibles révèlent que des CTL ont été re-stimulés en présence du peptide relevant I9Y et pas avec le peptide N9V. De plus, la protéine soluble IE1-pp65 a permis une re- stimulation améliorée lorsqu'elle est incluse dans la formulation puisque 4 fois moins de cellules effectrices sont nécessaires pour obtenir un niveau de lyse équivalent.

Ce résultat suggère que la formulation IE1-pp65/BVSM a permis de re-stimuler et d'expandre un nombre de CTL anti- I9Y de façon plus important qu'avec la protéine soluble et qu'avec le peptide seul.

Des résultats similaires ont été obtenus à partir de PBMC de donneurs possédant des haplotyppes HLA-A2 et HLA-B7 pour lesquels des peptides épitopes sont connus (voir protocole expérimental).

Il faut noter que cette potentialisation semble dépendre de la fréquence d'effecteurs présents au moment du test. En particulier, elle est d'autant plus importante que l'activité de re-stimulation de la protéine IE1-pp65 soluble est faible.

Outre cet effet potentialisateur, il est remarquable de noter que la formulation IE1-pp65 a permis la délivrance de la protéine dans le cytosol des cellules présentatrices contenues dans les PBMCs du donneur et la génération du peptide I9Y capable de se lier aux molécules du CMH de classe I.

De plus, l'utilisation de la formulation offrirait outre l'avantage de protéger l'antigène de la protéolyse, de re-stimuler des CTL spécifiques de plusieurs épitopes correspondant à des haplotypes HLA différents, contrairement à un peptide.

Exemple 6 : Induction in vivo de lymphocytes TCD8+ spécifiques de l'hépatite B par administration nasale.

1) Méthode.

Des souris BALB/c (5 souris par groupe) sont utilisées dans les expériences d'immunisation contre l'hépatite B. On administre par voie nasale l'antigène recombinant Hépatite B (Rhein Biotech) soit sous forme libre, soit en association avec les BVSM. La dose est de 8pg/souris à J0. Un boost est réalisé avec le même matériel à J21 et J42. Un autre groupe de souris est immunisé par voie intramusculaire avec le plasmide HBs (50pg). Ce groupe est utilisé comme contrôle positif. A un autre groupe, on administre également le BVSM seul. Enfin un dernier groupe est constitué de souris naïves jouant le rôle de contrôle négatif.

Deux semaines après la dernière immunisation, les souris sont tuées, on prélève les rates qui seront analysées pour la réponse lymphocytaire T cytotoxique (TCD8+).

Dans ce but, les cellules de rate des souris immunisées et des souris contrôle sont re-stimulées in vitro pendant 5 jours. L'activité cytotoxique des cellules non adhérentes est testée par un test de re-largage de Cr51 (comme décrit dans les exemples précédents). On utilise comme cellules cibles des cellules P815 (cellules possédant le même haplotype) incubées avec un épitope spécifique CTL.

Le pourcentage de lyse spécifique correspond au rapport : (cpm re-largage expérimental-cpm re-largage spontané/cpm re-largage total-cpm re-largage spontané) * 100.

2) Résultats.

La figure 8 représente les résultats obtenus.

Elle montre clairement la capacité des formulations de BVSM à induire une forte réponse TCD8 après immunisation intranasale. En particulier, quelque soit le ratio utilisé entre l'antigène et le BVSM (1/40 et 1/72 w/w correspondant respectivement à rHBsAg/SMBV1 et rHBsAg/SMBV2) les formulations rHBs/BVSM sont capables d'induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques HBs chez 5 des 5 souris immunisées. Le niveau d'activité des lymphocytes T cytotoxiques semble fort comparé au contrôle positif (administration intramusculaire de plasmide libre HBs). Au contraire l'antigène libre n'induit aucune réponse cytotoxique significative.